DE69329540T2

DE69329540T2 - Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren

Info

Publication number: DE69329540T2
Application number: DE69329540T
Authority: DE
Inventors: Dr. Fuerst; Dr. Heim; Dr. Hottiger; Dr. Kuhla; Dr. Pohlig
Original assignee: UCP Gen Pharma AG; Novartis AG
Current assignee: UCP GEN-PHARMA AG ZUERICH CH
Priority date: 1992-09-04
Filing date: 1993-08-25
Publication date: 2001-06-07
Anticipated expiration: 2013-08-26
Also published as: GR3035201T3; NO933153D0; FI933821A; AU675071B2; DE69329540D1; ATE196927T1; IL106897A0; HU217094B; JP2004000288A; MX9305375A; EP1031628A1; NO933153L; KR940007180A; HUT67307A; FI933821A0; DK0592358T3; JP3949734B2; JPH06165691A; CA2105425A1; ZA936507B

Description

Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren

Die Erfindung betrifft das Feld der rekombinanten DNA Technologie und betrifft ein Verfahren zu Herstellung von Thrombininhibitoren, genauer gesagt Desulfatohirudine mit Hilfe von genetisch veränderten Hefezellen, die genetisch veränderten Hefezellen, Hybridvektoren, die die Gene für diese Desulfatohirudine enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Hefezellen und dieser Hybridvektoren.
Die Hirudine sind Antikoagulationsmittel, die natürlicherweise in Blutegeln vorkommen (beispielsweise im medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis). Die Hirudine sind vergleichbar wirkende Polypeptide, wobei sie eine Anhäufung von hydrophoben Aminosäuren am N-Terminus und von polaren Aminosäuren am C-Terminus, drei Disulfidbrücken und die Antikoagulansaktivität gemeinsam haben. Ein charakteristisches Merkmal der meisten Hirudine ist das Vorkommen eines Tyrosinsulatrests am C-terminalen Teil (Tyr&sup6;³) der Moleküle. Abgesehen von den gut bekannten Hirudinvarianten HV1, HV2 und HV3 wurden zusätzliche Hirudine als in der Natur vorkommend beschrieben, siehe beispielsweise M. Scharf et al., FEBS Lett. 255, 105-110 (1989), was das Konzept der Hirudine als Isoinhibitorenfamilie unterstützt.
Die Hirudine, beispielsweise die Hirudinvariante HV1, sind die stärksten und spezifischsten der bekannten Thrombininhibitoren, der Serinprotease, die den letzten Schritt bei der Blutgerinnung katalysiert (die Umwandlung des Zymogens Fibrinogen in gerinnendes Fibrin). Andere Enzyme der Blutgerinnungskaskade werden nicht von den Hirudinen gehemmt. Im Gegensatz zu Heparin, das das bevorzugte Antikoagulans in der herkömmlichen Antikoagulanstherapie ist, zeigen die Hirudine ihre hemmende Wirkung direkt bei Thrombin und wirken nicht wie das letztere durch Antithrombin III. Der einzige pharmakologisch detektierbare Effekt der gereinigten Hirudine ist die Hemmung der Blutgerinnung und die Prophylaxe von Thrombose. Es wurden keine Nebenwirkungen, wie auf die Herzrate, die Atmung, den Blutdruck, der Thrombozytenzahl, des Fibrinogens und Hämoglobins nach einer intravenösen Verabreichung von Hirudin an Hunden beobachtet, sogar bei hohen Dosen. In einer Reihe an Tiermodellen haben sich die Hirudine als wirksam bei der experimentellen Thrombose (entweder durch Blutstau oder durch die Injektion von Thrombin hervorgerufen), beim Endotoxinschock und auch bei DIC (disseminierte intravaskuläre Koagulation). Immer wenn direkte Vergleichstests ausgeführt wurden, erwiesen sich Hirudine gegenüber Heparin immer überlegen.
In den letzten Jahren wurden cDNAs und synthetische Gene, die für Hirudinvarianten kodieren, kloniert und in mikrobiellen Wirten exprimiert, wie Escherichia coli und insbesondere Saccharomyces cerevisiae. Obwohl den Expressionsprodukten die Sulfatmonoestergruppe an Tyr&sup6;³ fehlt und sie daher "Desulfatohirudine" genannt werden, stellte sich heraus, daß sie im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die natürlich sulfatierten Hirudine aufweisen. Es wurde einige Aufmerksamkeit auf die Expression von Desulfatohirudinvarianten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae gelegt. Stämme von S. cerevisiae, die episomale Vektoren mit einer Desulfatohirudinexpressionskassette enthalten, die einen starken konstitutiven oder induzierbaren Hefepromotor (beispielsweise PHO5-, GAP-, α-Faktor-Promotor), eine Hefesignal- oder -präsequenz (beispielsweise die Signalsequenz der Invertase oder PHO5 oder die Präsequenz des α-Faktors) und eine Desulfatohirudinkassette umfassen, liefern wenn auch in einem unterschiedlichen Ausmaß, die Expression und den Export von Desulfatohirudin in das Kulturmedium, von dem es isoliert werden kann (siehe beispielsweise EP 0 200 655 A, EP 0 225 633 A, EP 0 252 854 A, EP 0 340 170 A und EP 0 341 215 A). Die verfügbaren Expressionssysteme, die für S. cerevisiae entwickelt wurden, ergeben geringe bis zufriedenstellende Ausbeuten des pharmazeutisch anwendbaren Desulfatohirudins. In Anbetracht dessen und unter Betrachtung der Nachfrage für große Mengen an Desulfatohirudin in der klinischen Forschung und eventuell in der Therapie besteht ein Bedarf für verbesserte Methoden, die die ökonomische Bildung von pharmazeutisch anwendbaren Desulfatohirudinen in einem großen Maßstab möglich machen. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, solche Methoden bereitzustellen.
Metallothionine (MTs) sind kleine. Cystein-reiche metallbindende Polypetide, die unter Eukaryonten weit verbreitet sind. S. cerevisiae enthält ein einzelnes MT Protein, das durch das CUP1 Gen kodiert wird. Vom CUP1 Genort wurde gezeigt, daß er Hefezellen eine Kupferresistenz verleiht. Es sind in Hinblick auf Kupferresistenz zwei natürliche Varianten von S. cerevisiae bekannt: Stämme, die gegenüber 0,3 mM Kupfer sensitiv sind, enthalten eine einzelne Kopie des CUP1 Genorts (besteht aus zwei in Tandem angeordneten Kopien des CUP1 Gens) und werden als cup1s bezeichnet, während Stämme die gegenüber 0,3 mM Kupfer resistent sind, mehrere in Tandem wiederholte Kopien des CUP1 Genorts enthalten und als CUPI' bezeichnet werden. Die Kupferresistenz beruht auf einer Kombination der CUP1 Amplifizierung und der translationalen CUP1 Induktion nach der Zugabe von exogenem Kupfer. Eine in cis wirkende Aktivierungsstelle stromaufwärts (UASc), die für die Förderung der Kupferinduzierbaren Transkription des CUP1 Gens erforderlich ist, wurde zusammen mit einem Binden eines zellulären Faktors an UAS identifiziert. Die Bindungsfaktor ist das Produkt des ACE1 (= CUP2) Gens, das für die Kupfer-induzierte Transkription des CUP1 Gens essentiell ist. Das ACE1 Protein ist ein Transkriptionsaktivator, der an Kupferionen bindet und hierbei seine Konformation ändert und die DNA-Bindungsdomäne aktiviert. Die Konformationsänderung im ACE1 Protein erlaubt eventuell dem CUP1 Gen transkribiert zu werden. Ein wichtiges Merkmal des CUP1 Systems ist dessen Autoregulation. Diese hängt von der Fähigkeit des CUP1 Proteins ab, selbst an Kupferionen zu binden. So scheint das CUP1 Protein seine eigene Synthese durch die Komplexierung von freien Kupferionen in den Zellen zu reprimieren, das wiederum mit der ACE1 Aktivierung wechselwirkt.
Es finden sich wenige Beispiele in der Literatur über die Verwendung des induzierbaren CUP1 Promotors für die Expression der heterogenen Proteine durch Hefe (siehe T. R. Butt et al., Microbiol. Rev. 51, 351-364, 1987, T. Etcheverry, Methods Enzymol. 185, 319-329, 1990, US 4 940 661 A). Die beschriebenen Verfahren umfassen die Kultivierung eines transformierten Hefestamms, der einen Expressionsvektor mit einer CUP1 Expressionskassette trägt, in einem Hefeminimalmedium, das Kupferionen enthält. Es werden chemisch definierte Minimalmedien gewählt, da allgemein angenommen wird, daß Komponenten (Proteine usw.) von komplexen Medien mit den Kupferionen wechselwirken (komplexieren) und so die ACE1 Aktivierung verhindern. Die erreichbare Zelldichte (OD Wert) und daher die erreichbaren Titer sind dementsprechend niedrig. Die letzteren Ergebnisse haben bisher die weitverbreitete Anwendung des CUP1 Promotorsystems in biotechnologischer Forschung und Produktion beschränkt.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß im Gegensatz zu allen Erwartungen komplexe Hefemedien in Zusammenhang mit der Kupferinduzierten CUP1 Expressionskassette ohne nachteilige Effekte auf die beobachtbare Expressionsmenge oder die Effizienz verwendet werden können. Darüberhinaus wird überraschenderweise gefunden, daß bei einer Verwendung des CUP1 Promotors in einer pseudo-konstitutiven Art, das heißt das Kulturmedium wird schon zum Zeitpunkt der Inokulation mit Kupfer versetzt, um die Sekretion des Desulfatohirudins durch die Hefe in das Kulturmedium zu steuern, dieser Promotor starken konstitutiven Hefepromotoren gegenüber überlegen ist, wie dem verkürzten (konstitutiven) GAP ("GAPFL") Promotor, obwohl das heterologe Protein Desulfatohirudin für die Hefezellen nicht toxisch ist.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Desulfatohirudin, gekennzeichnet durch Kultivierung eines Hefestamms in einem komplexen Kulturmedium, der einen Hefeexpressionsvektor enthält, welcher eine Desulfatohirudinexpressionskassette umfaßt, die besteht aus dem Hefe CUP1 Promotor, der mit einer ersten DNA Sequenz funktionsfähig verbunden ist, die für ein Hefesignalpeptid kodiert, das im richtigen Leserahmen an eine zweite DNA Sequenz gebunden ist, die für Desulfatohirudin kodiert, und eine DNA Sequenz, die Hefetranskriptionsterminationssignale enthält, und Isolierung des gebildeten Desulfatohirudins aus der Kulturbrühe, worin das Kulturmedium zum Beimpfungszeitpunkt mit einer den CUP1 Promotor induzierenden Menge eines Kupfersalzes versetzt wird.
Der Ausdruck "Desulfatohirudin" soll alle Desulfatohirudinverbindungen umfassen, die in der Literatur beschrieben sind oder aus einem transformierten Mikroorganismenstamm erhalten werden können, der DNA enthält, die für ein Desulfatohirudin kodiert. Solche Desulfatohirudine sind beispielsweise die Desulfatohirudinvarianten HV1, HV2 und HV3 (PA), wie auch andere Hirudinproteine, die von M. Scharf (obige Literaturstelle) beschrieben werden. Es ist verständlich, daß Hirudinderivate mit Hirudinaktivität (das heißt mit einer Thrombin-hemmenden Wirkung) auch durch den Ausdruck "Desulfatohirudin" umfaßt werden. Solche Derivate sind beispielsweise Cterminal verkürzte Desulfatohirudine, das heißt Desulfatohirudine, denen ein bis sieben, vorzugsweise ein bis vier Aminosäuren am C-Terminus fehlen und Muteine von Hirudinen, die sich von den letzteren durch die Substitution einer einzelnen oder von mehreren beispielsweise ein bis fünf Aminosäuren anstelle der ursprünglichen Aminosäuren unterscheiden. Das bevorzugte Desulfatohirudin ist die Desulfatohirudinvariante HV1.
Geeignete Hefestämme gemäß der Erfindung sind Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die das endogene 2u Plasmid enthalten, oder solche Stämme, die von dem endogenen 2 u Plasmid befreit wurden (siehe EP 0 340 170 A). Die bevorzugten Hefestämme gemäß der Erfindung heben kein endogenes 2 u Plasmid (sogenannte "cir&sup0; Stämme"). Bevorzugte Hefestämme sind einzeln oder mehrfach Protease-defiziente Hefestämme, das heißt Hefestämme, denen speziell die proteolytische Aktivität der Carboxypeptidase yscα und yscY und wahlweise zusätzlich die Proteaseaktivität yscA und/oder yscB fehlen (siehe EP 0 341 215 A). Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Hefestämme enthalten 0-16, insbesondere 2-6 Kopien des chromosomalen CUPL Gens. Wahlweise enthalten die erfindungsgemäßen Hefestämme 1-3 zusätzliche Kopien des chromosomalen ACE1 Gens. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Hefestämme mit einer Mutation im endogenen Hitzeschockfaktorprotein verwendet. Solche Mutanten führen zu erhöhten CUP1 Transkriptionsmengen unter Streßbedingungen (siehe P. Silar et al., Mol. Cell. Biol. (1991) 11, 1232-1238).
Die Hefestämme, beispielsweise von der Gattung S. cerevisiae können haploid, diploid oder polyploid sein. Bevorzugte Hefestämme haben eine Ploidität von größer oder gleich zwei, wobei diese Stämme beispielsweise octaploid, tetraploid, triploid und speziell diploid sind. Ein diploider oder polyploider Stamm von S. cerevisiae wird beispielsweise durch Mating von zwei haploiden Stämmen der Matingtypen a und α oder durch Protoplastenfusion konstruiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die diploiden Hefestämme mittels haploiden und isogenen Hefestämmen gebildet, die sich nur im Matingtyp unterscheiden.
Die transformierten Hefestämme werden mittels Verfahren kultiviert, die in der Technik bekannt sind. Daher werden die erfindungsgemäß transformierten Hefestämme in einem flüssigen komplexen Kulturmedium kultiviert, das Komponenten enthält, die für den Hefestamm für das Überleben und Wachstum essentiell sind, wie assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff anorganische Salze, Vitamine, wachstumsfördernde Substanzen, wie zusätzliche Aminosäuren. Zucker und dergleichen.
Die entsprechenden komplexen Kulturmedien, die für die Kultivierung der Hefe verwendet werden, sind in der Technik bekannt. Beispielweise enthalten solche Kulturmedien Trypton, Pepton, Fleischextrakte, Malzextrakte, Hefeextrakte, Casaminosäuren, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl usw und speziell Gemische hiervon und werden wahlweise zusätzlich supplementiert mit Zuckern (beispielsweise Dextrose. Glucose, Saccharose usw.), Vitaminen (beispielsweise Biotin), einzelnen Aminosäuren, anorganischen Salzen (beispielsweise Sulfaten, Chloriden, Phosphaten und Carbonaten von Natrium. Kalium. Magnesium und Calcium, darüberhinaus entsprechende Salze von Spurenelementen, wie Eisen. Zink und Mangan) und dergleichen, wobei darauf geachtet werden muß, daß alle oben angegebenen essentiellen Komponenten im Medium vorkommen. Ein bevorzugtes Kulturmedium ist das im Handel erhältliche Medium YPD (Hefeextrakt. Pepton. Dextrose, siehe Methods Enzymol. 194, 13), das wahlweise mit anorganischen Salzen und Vitaminen supplementiert ist.
Die Kultivierung wird durch die Verwendung von herkömmlichen Techniken ausgeführt. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur. pH des Mediums und die Fermentationszeit werden so ausgewählt, daß maximale Mengen an Desulfatohirudin gebildet werden. Ein ausgewählter Hefestamm wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 25ºC bis 33ºC, vorzugsweise etwa 28ºC bei einem pH Wert von 4 bis 7, beispielsweise bei etwa pH 5 bis 6 und für mindestens 1 bis 3 Tage, vorzugsweise 3 bis 4 Tage in aerober und submerser Kultur unter Schütteln oder Rühren so angezogen, daß befriedigende Mengen an Desulfatohirudin erhalten werden. Die Kultivierung kann entweder als Batchverfahren, als Fed-Batchprozeß, als wiederholter Fed-Batchprozeß oder kontinuierlich ausgeführt werden.
Direkt zum Zeitpunkt der Beimpfung wird das Kulturmedium mit einer den CUP1 Promotor induzierenden Mengen an Kupfer-(II)-salz, vorzugsweise Kupfersulfat, versetzt. Die optimale Menge an Kupfer (die Menge, die den maximalen Titer an Desulfatohirudin liefert) hängt vor allem vom genetischen Hintergrund der Wirtszelle, der Komponenten des verwendeten Expressionsvektors und der Zusammensetzung des Kulturmediums ab und kann durch den Fachmann durch Anwenden von Routinetests, beispielsweise durch "Titration" (Bestimmung des Desulfatohirudintiters durch HPLC als Funktion der Mengen an zugegebenen Kupfer) bestimmt werden. Ein Routmetest wurde von T. Etcheverry (siehe angegebene Literaturstelle. Seite 324 hierin) beschrieben. Die Bestimmung der richtigen Kupferkonzentration ist wichtig, da unnötig hohe Kupfermengen eine Hemmung der metabolischen Maschinerie der Zelle verursachen können.
Unabhängig vom verwendeten Hefestamm, dem Promotor und dem Signalpeptid, wird das gebildete Desulfatohirudin vorwiegend (das heißt mehr als 90%) in das Kulturmedium sekretiert. Das Desulfatohirudin kann hieraus durch herkömmliche Mittel isoliert werden. Beispielsweise besteht der erste Schritt gewöhnlich in einer Abtrennung der Zellen aus der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation. Der entstehende Überstand kann durch die Behandlung mit Polyethylenimin unter Entfernung des meisten nicht-proteinartigen Materials und der Fällung der Proteine durch Sättigung der Lösung mit Ammoniumsulfat auf Desulfatohirudin angereichert werden. Wirtsproteine, falls sie vorkommen, können ebenfalls durch die Ansäuerung mit Essigsäure (beispielsweise 0,1%, pH 4-5) entfernt werden. Eine weitere Anreicherung von Desulfatohirudin kann durch Extraktion des Essigsäureüberstands mit n-Butanol erreicht werden. Andere Reinigungsschritte sind beispielsweise Entsalzung, chromatographische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Verteilungschromatographie, HPLC, Umkehrphasen HPLC und dergleichen. Die Trennung der Bestandteile des Gemisches wird auch bewirkt durch Dialyse, nach Ladung durch Gelelektrophorese oder Trägerfreie Elektrophorese, nach Molekulargröße durch eine geeignete Sephadexsäule, durch Affinitätschromatographie, beispielsweise mit Antikörpern, speziell monoklonalen Antikörpern, oder mit Thrombin, das zur Affinitätschromatographie an einen geeigneten Träger gebunden ist, oder durch andere Verfahren, speziell denen, die aus der Literatur bekannt sind. Im allgemeinen sind nur wenige Reinigungsschritte erforderlich, um ein Desulfatohirudinprodukt zu erhalten, das im wesentlichen frei von Kontamination ist.
Der Test mit Anti-Hirudin- oder Anti-Desulfatohirudin-Antikörpern (beispielsweise monoklonalen Antikörpern), der Thrombintest [M. U. Bergmeyer (Herausgeber, Methods in Enzymatic Analysis. Band II, Seiten 314- 316. Verlag Chemie. Weinheim. (FRG) 1983] oder der Blutkoagulationstest [F. Markwardt et al., Thromb. Haemost. 47, 226 (1982)) können zur Detektion der Hirudinaktivität während der Isolierungs- und Reinigungsschritte verwendet werden. Es ist auch möglich, chromatographische Mittel zu verwenden, wie HPLC.
Die erfindungsgemäßen transformierten Hefezellen können durch rekombinante DNA Techniken hergestellt werden, die die folgenden Schritte umfassen
- Bereitstellung eines Hefeexpressionsvektors, der eine Desulfatohirudinexpressionskassette umfaßt, die besteht aus dem Hefe CUP1 Promotor, der funktionsfähig an eine erste DNA Sequenz gebunden ist, die für ein Hefesignalpeptid kodiert und im richtigen Leserahmen an eine zweite DNA Sequenz gebunden ist, die für Desulfatohirudin kodiert, und eine DNA Sequenz, die Transkriptionsterminationssignale der Hefe umfaßt.
Transformation eines Hefestamms mit diesem Hefeexpressionsvektor und Selektion der transformierten Hefezellen von den nicht-transfonuierten Hefezellen.

Hefeexpressionsvektoren

Die DNA Sequenz des CUP1 Promotors ist bekannt (T. R. Butt et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 81 (1984) 3332-3336). Demnach kann der CUP1 Promotor durch chemische DNA Synthese bereitgestellt oder aus der genomischen S. cerevisiae DNA mittels geeigneter DNA Sonden isoliert werden, beispielsweise durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Der in der vorliegenden Erfindung verwendete CUP1 Promotor umfaßt die Transkriptionsinitiationssignale und die stromaufwärts liegende Aktivierungssequenz (UASc), die an den Positionen -105 bis -148 liegt (relativ zum Transkriptionsstart von CUP1. P. Fürst et al., Cell 55 (1988) 705-717). Vorzugsweise werden die existierenden Restriktionsschnittstellen 5' von UAS verwendet, beispielsweise die BamHI Schnittstelle, die an der Position -455 des CUP1 Gens liegt (T. R. Butt et al., siehe obige Literaturstelle) und eine Restriktionsschnittstelle 3' der Transkriptionssignale (beispielsweise eine EcoRI Schnittstelle), die künstlich durch chemische Synthese oder durch das Oligonukleotid eingeführt wird, das in der PCR verwendet wird. Das entstehende Restriktionsfragment, beispielsweise ein 0,4 kb BamHI-EcoRI Fragment, speziell das, das im in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Konstrukt enthalten ist, kann mit der DNA Sequenz verbunden werden, die für ein Hefesignalpeptid kodiert.
Die für ein Hefesignalpeptid kodierende DNA Sequenz ("Signalsequenz") stammt vorzugsweise von einem Hefegen, das für ein Polypeptid kodiert, das normal sekretiert wird. Hefesignalsequenzen sind beispielsweise die Signal- und Präprosequenzen der Gene der Hefeinvertase, des α-Faktors, der Pheromonpeptidase (KEX1), des "Killertoxins" und der reprimierbaren sauren Phosphatase (PHO5) und die Glycoamylasesignalsequenz von Asgergillus awamori. Zusätzliche Sequenzen, wie Pro- oder Spacersequenzen, die spezifische Prozessierungssignale tragen können, können ebenfalls in die Konstntktionen eingearbeitet werden, um die exakte Prozessierung der Vorläufermoleküle zu erleichtern. Beispielsweise enthalten die Prozessiernngssignale einen Lys-Arg Rest, der durch eine Hefeendopeptidase erkannt wird, die in den Golgi Membranen lokalisiert ist. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Signalsequenzen sind die des PHO5 Hefegens und des Hefeinvertasegens.
Die für Desulfatohirudin oder ein Derivat hiervon kodierende DNA Sequenz kann aus der genomischen Blutegel DNA isoliert werden oder es wird eine doppelsträngige Desulfatohirudin DNA (Desulfatohirudin ds cDNA) komplementär zur Desulfatohirudin mRNA hergestellt oder es wird ein Gen durch an sich bekannte chemische und enzymatische Prozesse hergestellt, das für die Aminosäuresequenz des Desulfatohirudins oder des Derivats hiervon kodiert.
Eine DNA Sequenz, die die Hefetranskriptionsterminationssignale enthält, ist vorzugsweise die 3' flankierende Sequenz des Hefegens, das die geeigneten Signale für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung enthält. Die bevorzugte flankierende Sequenz ist die des PHO5 Hefegens.
Der Hefe CUP1 Promotor, die für das Signalpeptid kodierende DNA Sequenz, die für Desulfatohirudin kodierende Sequenz und die DNA Sequenz, die die Hefetranskriptionsterminationssignale enthält, werden funktionsfähig miteinander verknüpft, das heißt sie werden so zusammengesetzt, daß ihre normalen Funktionen erhalten bleiben. Die Anordnung ist so, daß der CUP1 Promotor eine gute Expression des Signalsequenz-Desulfatohirudingenkomplexes bewirkt, die Transkriptionsterminationssignale die richtige Termination der Transkription und die Polyadenylierung bewirken und die Signalsequenz im richtigen Leserahmen zum Sulfatohirudingen so verbunden ist, daß das letzte Codon der Signalsequenz direkt mit dem ersten Codon des Gens für Desulfatohirudin verbunden ist und die Sekretion des reifen Desulfatohirudins stattfindet. Der CUP1 Promotor wird vorzugsweise mit der Signalsequenz zwischen dem hauptsächlichen mRNA Start und dem ATG des CUP1 Gens verbunden. Die Signalsequenz hat ihr eigenes ATG für die Translationsinitiation. Die Verbindung dieser Sequenzen kann beispielsweise mittels synthetischer Oligodesoxynukleotidlinker erreicht werden, die die Erkennungssequenz einer Endonuklease tragen.
Neben der Desulfatohirudinkassette enthalten die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren einen Hefereplikationsursprung. Demnach enthalten die Vektoren ein DNA Segment, das aus der 2 u DNA stammt, welches den Replikationsursprung enthält, oder, falls ein Hefestamm verwendet wird, der keine 2 u DNA enthält, die gesamte 2 u DNA. Der letztere Typ des Vektors ist bevorzugt. Beispielsweise enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren die vollständige 2 u DNA in einer nicht-unterbrochenen Form, das heißt die 2 u DNA wird einmal mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten und die ünearisierte DNA wird mit den anderen Komponenten des Vektors vor der Rezirkularisierung verbunden. Die Restriktionssclumittstelle wird so gewählt, daß die normale Funktion der REP1. REP2 und FLP Gene und die ORI, STB, IR1 und IR2 Stellen der 2 u DNA erhalten bleiben. Wahlweise wird die Restriktionsschnittstelle so gewählt, daß das D Gen der 2 u DNA ebenfalls intakt gehalten wird. Geeignete Restriktionsstellen sind beispielsweise die PstI Einzelschnittstelle, die innerhalb des D Gens liegt und die HpaI und SaBI Einzelschnittstellen, die außerhalb dieser Gene und Stellen liegen. Jedoch ist es genauso möglich, die Expressionskassette und weitere Komponenten (siehe später) bei verschiedenen (wie zwei) Restriktionsschnittstellen innerhalb der 2 u DNA zu inserieren, speziell den oben erwähnten.
Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren ein oder mehrere, speziell ein oder zwei Selektionsmarker für die Hefe, wie einen Marker und einen Replikationsursprung für bakteriellen Zellen, speziell Escherichia coli.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben die zwei Regionen zwischen den invertiert wiederholten FRT Stellen der zirkulären Form der 2 u DNA etwa dieselbe Länge.
Ein solches Plasmidderivat kann nur zwei invertiert wiederholte FRT Stellen oder eine dritte FRT Stelle enthalten. Die erste Plasmidart wird hierin später als "symmetrischer 2 u-ähnlicher Hybridvektor" bezeichnet. Die letztere Plasmidart wird hierin später als "symmetrischer 2 u ähnlicher Desintegrationsvektor" bezeichnet, obwohl es kein richtig symmetrisches Plasmid ist, aber zu einem symmetrischen 2 u ähnlichen Hybridvektor in der hiermit transformierten Hefezelle führt.
Ein erfindungsgemäßer symmetrischer 2 u ähnlicher Hybridvektor enthält vorzugsweise keine bakteriellen oder viralen DNA Sequenzen, das heißt DNA, die von einem bakteriellen Genom. Plasmid oder Virus stammt. jedoch kann ein erfindungsgemäßer 2 u ähnlicher Desintegrationsvektor zwischen den zwei direkt wiederholten FRT Stellen DNA Sequenzen prokaryontischen Ursprungs enthalten, die aus dem Vektor in der transformierten Hefezelle ausgeschnitten werden. In der der symmetrische 2 u ähnliche Hybridvektor aus dem Desintegrationsvektor erzeugt wird. Die DNA Sequenzen sind bakterielle Sequenzen, wie sie unten beschrieben sind, und können zu den essentiellen strukturellen oder funktionellen Merkmalen des Vektors beitragen oder können auch nur die Funktion haben, die zwei Regionen zwischen den zwei invertiert wiederholten FRT Stellen eines unsymmetrischen 2 u ähnlichen Plasmidderivats oder eines "unsymmetrischen" Desintegrationsvektors aufzufüllen, um einen symmetrischen 2 u ähnlichen Hybridvektor oder einen symmetrischen Desintegrationsvektor zu konstruieren.
In einem 2 u ähnlichen Hybridvektor, der innerhalb der Definition der vorliegenden Erfindung symmetrisch ist, oder in einem Desintegrationsvektor, der zu einem symmetrischen 2 u ähnlichen Hybridvektor führt, haben die Längen der zwischen den zwei invertiert wiederholten FRT Stellen liegenden Regionen ein Verhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 5 : 4, das heißt die größere Region ist bis zu etwa 20% größer als die kleinere.
Als Selektionsmarker für Hefe kann jeder Marker verwendet werden, der die Selektion für Transformanden aufgrund der phänotypischen Expression des Markergens erleichtert. Geeignete Marker für Hefe sind beispielsweise die, die eine Antibiotikumresistenz exprimieren oder im Fall von auxotrophen Hefemutanten Gene, die Wirtsdefekte komplementieren. Entsprechende Gene vermitteln beispielsweise eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418, Hygromycin oder Bleomycin, um die Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante bereitzustellen, beispielsweise das URA3, LEU2, LYS2 oder TRP1 Gen.
Da die Amplifizierung der Expressionsvektoren bequem in einem Prokaryonten ausgeführt wird, wie E. coli, wird ein genetischer Prokaryontenmarker, beispielsweise für E. coli und ein Prokaryontenreplikationsursprung, beispielsweise für E. coli, vorteilhafterweise eingebaut. Diese können von entsprechenden Prokaryontenplasmiden, beispielsweise E. coli Plasmiden, wie pBR322 oder einem pUC Plasmid, beispielsweise pUC18 oder pUC19 erhalten werden, die sowold einen prokaryontischen Replikationsursprung, beispielsweise für E. coli, und einen genetischen Marker enthalten, der gegenüber Antibiotika eine Resistenz verleiht, wie gegenüber Ampicillin.
Neben der CUP1-Desulfatohirudinexpressionskassette enthalten die Replikationsursprünge und genetischen Marker der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren wahlweise zusätzliche Expressionskassetten, wie 1 bis 3 zusätzliche Desulfatohirudinexpressionskassetten und/oder eine zusätzliche Transkriptionsaktivator ACE1 Expressionskassette. Die zusätzlichen Desulfatohirudinexpressionskassetten sind untereinander identisch oder verschieden und sind zur CUP1-Desulfatohirudinexpressionskassette identisch oder verschieden, die bereits auf dem Expressionsvektor vorhanden ist und umfassen jeweils einen Hefepromotor, der funktionsfähig mit einer ersten DNA Sequenz verknüpft ist, die für ein Signalpeptid kodiert, das im richten Leserahmen an eine zweite DNA Sequenz gebunden ist die für Desulfatohirudin kodiert und eine DNA Sequenz, die Hefetranskriptionsterminationssignale enthält. Ein geeigneter Hefepromotor in einer solchen zusätzlichen Desulfatohirudinexpressionskassette ist beispielsweise jeder konstitutive oder induzierbare Hefepromotor, der zur Expression von Desulfatohirudin durch Hefe in komplexen Medien geeignet ist. Solche Promotoren sind beispielsweise die CUP1, GAPDH (einschließlich der verkürzten Versionen hiervon, beispielsweise GAPFL usw.), GAL1(10), PYK, TPI, ADH und PGK Promotoren. Bevorzugt ist der konstitutive GAPFL Promotor. Geeignete Signalsequenzen und Transkriptionsterminationssignale sind speziell die oben beschriebenen. Entsprechende Desulfatohirudinexpressionskassetten sind beispielsweise beschrieben in EP 0 341 215 A. Eine zusätzliche ACE1 Expressionskassette umfaßt die eigenen Transkriptions- und Translationsinitations- und -terminationssignale oder wird alternativ hierzu durch einen konstitutiven oder induzierbaren Hefepromotor transkriptionell kontrolliert, der sich vom ACE1 Promotor unterscheidet, wie der CUP1 oder ein konstitutiver (verkürzter) GAPDH Promotor (beispielsweise GAPFL Promotor). Eine geeignete ACE1 Expressionskassette ist beispielsweise im 1.7 kb langen genomischen S. cerevisiae EcoRV Fragment enthalten (siehe P. Fürst et al., (1988), Cell 55. 705-717). Der ursprüngliche ACE1 Promotor kann hierin durch einen anderen Hefepromotor durch herkömmliche Verfahren und Methoden ersetzt werden, beispielsweise dem CUP1 Promotor. Die Transkriptionsrichtung der zusätzlichen Desulfatohirudin- und/oder ACE Expressionskassetten ist nicht entscheidend und kann dieselbe oder entgegengesetzt zur Transkriptionsrichtung der bereits auf den erfindungsgemäßen Vektoren vorkommenden CUP1 Desulfatohirudinexpressionskassette sein.
Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren werden durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Verbinden der CUP1 Desulfatohirudinexpressionskassette, die besteht aus dem CUP1 Hefepromotor in funktionsfähiger Verknüpfung zu einer ersten DNA Sequenz, die für ein Hefesignalpeptid kodiert, das wiederum im richtigen Leserahmen an eine zweite DNA Sequenz gebunden ist, die für Desulfatohirudin kodiert, und an eine DNA Sequenz, die Hefeterminationssignale enthält, der DNA Fragmente, die genetische Selektionsmarker der Hefe und einen bakteriellen Wirt enthalten, der Replikationsursprünge für Hefe und einen bakteriellen Wirt, und der wahlweise zusätzlichen Desulfatohirudin und/oder ACE1 Expressionskassetten in der vorbestimmten Reihenfolge mittels chemischer oder biologischer in vitro Syntheseverfahren. Vorzugsweise werden die Vektoren mittels rekombinanter DNA Techniken konstruiert und hergestellt. Zur Herstellung durch rekombinante DNA Techniken werden geeignete DNA Fragmente in vitro auf herkömmliche Weise ligiert. Das Ligationsgemisch wird dann in einen geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt in Abhängigkeit der Art der verwendeten Regulationselemente transformiert und eine Transformante, die den gewünschten Vektor enthält, wie gemäß herkömmlicher Verfahren ausgewählt. Die Vektoren können durch die transformierten Wirte vermehrt und auf herkömmliche Weise isoliert werden. Die Wahl des Wirts hängt von den auf dem Vektor liegenden Regulationssequenzen ab. Da die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren vorzugsweise Regulationssequenzen enthalten, die in Prokaryonten funktionsfähig sind, beispielsweise E. coli, ist ein prokaryontischer Wirt, beispielsweise E. coli. zur Konstruktion und Vermehrung des Vektors bevorzugt.

Transformierte Hefestämme

Die Transformation von Hefe mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren kann gemäß in der Technik bekannter Verfahren erreicht werden.
Bevorzugte Hefestämme sind die oben erwähnten, speziell Stämme von S. cerevisiae, die vom endogenen 2 u Plasmid befreit wurden ("cir&sup0; Stämme") und einzeln oder mehrfach defizient bezüglich Hefeprotease sind, wie Carboxypeptidase yscα und yscY. Verfahren zur Herstellung solcher Hefestämme sind beispielsweise in EP 0 340 170 A und EP 0 341 215 A beschrieben. Hefestämme, die 0-16, insbesondere 2-6 Kopien des chromosomalen CUP1 Gens enthalten, sind an sich bekannt oder können auf eine an sich bekannte Weise hergestellt werden. Beispielsweise können ausgehend von einem herkömmlichen Kupfer-sensitiven Hefestamm, der beispielsweise 2-4 chromosomale Kopien des CUP L Gens enthält, durch Einführung von Defizienzen in das Hefegenom Hefestämme hergestellt werden, die weniger Kopien des CUP1 Gens aufweisen, beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese oder Genzerstörung oder Genaustausch [sielte H. Rudolph et al., Gene. 36 (1985) 87-95]. Da die Sequenz des chromosomalen CUP1 Gens bekannt ist, kann das letztere durch Insertion. Substitution oderDeletion unter Verwendung des gut bekannten ortsspezifischen Mutageneseverfahrens zerstört werden [siehe beispielsweise M. J. Zoller und M. Smith (1983), Methods Enzymol. 100, 468], das die Herstellung eines geeignet entworfenen mutagenen Oligodesoxyribonukleotidprimers umfaßt. Alternativ dazu da zu kann das genomische CUP1 Gen durch Fremd-DNA ersetzt werden oder diese Fremd-DNA kann in eine geeignete Restriktionsschnittstelle des CUP1 Gens inseriert werden. Beispielsweise wird zur Herstellung einer Hefeutante, die in allen oder in einem Teil der existierenden chromosomalen CUP1 Gene defizient ist. Fremd-DNA in eine geeignete Restriktionsschnittstelle inseriert, die im CUP1 Gen vorkommt. Falls der verwendete Hefestamm einen Defekt in einem chromosomalen Gen aufweist, das für ein Enzym der Aminosäure- oder Purinbioynthese (beispielsweise Uracil) kodiert, kann ein entsprechendes intaktes Gen (wie URA3) in das chromosomale CUP1 Gen inseriert werden und so für die Prototrophie des auxotrophen Hefestamms sorgen und den Genotyp gleichzeitig von CUP1 zu cup1 verändern. Der Genaustausch oder die ortsspezifischen Mutageneseverfahren werden herkömmlich in der Technik verwendet und sind absolut reproduzierbar. Um die Kupferresistenz eines gegebenen Hefestamms zu erhöhen (das heißt die Anzahl der chromosomalen CUP1 Gene zu erhöhen), der gegenüber Kupfer moderat resistent ist, kann dieser Hefestamm höheren Kupferkonzentrationen im Medium ausgesetzt werden, was eine Amplifizierung des CUP1 Genorts verursacht. Entstehende überlebende Hefezellen enthalten mehr chromosomale CUP1 Gene (beispielsweise 10-16) als der Elternstamm und können aus dem Medium in einem an sich bekannten Verfahren isoliert werden.
Ein weiteres gängiges Verführen zur Herstellung von Hefestämmen mit einem gewünschten genetischen Hintergrund, die beispielsweise alle oder einen Teil der chromosomalen CUP1 Gene zerstört haben und/oder Defizienzen in bestimmten Proteasen aufweisen, bestehen aus der meiotischen Kreuzung von geeigneten Hefestämmen und der anschließenden Tetradenanalyse. Die Tetraden, die aus den diploiden Zellen stammen, werden gemäß genetischer Standardtechniken abgetrennt. Eine zufällige Anordnung unter den vier Sporen einer Tetrade erlaubt die Konstruktion von geeigneten Mutanten in anschließenden Kreuzungen. Eine zufällige Sporenanalyse kann auch als alternatives System verwendet werden.
Hefestämme, die 1-3 zusätzliche Kopien des chromosomalen ACE1 Gens enthalten, können auch auf herkömmliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die ACE1 Gene in geeignete Restriktionsschnittstellen von chromosomalen Genen inseriert werden, die eine Antibiotikaresistenz verleihen oder in Gene, die bei der Aminosäure- oder Purin- oder Pyrimidinbasensynthese beteilt sind, was zu Hefestämmen führt, die solche zusätzlichen Kopien des ACE1 Gens enthalten, die Antibiotikum-sensitiv und jeweils in Bezug auf die entsprechende Aminosäure, Purin- oder Pyrimidinbase auxotroph sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Im folgenden experimentellen Teil werden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben:
Die Fig. 1 ist eine schematische Darstellung von Plasmid pPFY56
Die Fig. 2 ist eine schematische Darstellung von Plasmid pPFY58
Die Fig. 3 ist eine schematische Darstellung von Plasmid pPFY59R
Die Fig. 4 ist eine schematische Darstellung von Plasmid pPFY79
Die folgenden Abkürzungen werden in den Figuren verwendet: term = PHO5 Transkriptionsterminator. p in CUP1p, GAPFLp und ACE1p = Promotor.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sollten nicht als Beschränkung hiervon aufgefaßt werden.

Experimenteller Teil

Stämme und Plasmide

E. coli DH5αF': Escherichia coli K12 F' endA1 hsdR17 (rm) supE44 thil recA1 pyrA relA1 PH1801acZde1M15 del(lacZYA-argF)U169. D. Hanahan (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 57 (Bethesda Research Laboratories).
S. cerevisiae H449: Saccharomyces cerevisiae MATa. ura3Δ15, leu2-3, leu2-112. prb1, cps1, [cir&sup0;]. DSM 4413, 18. Februar 1988.
S. cerevisiae HT462/TH3: MATα, cup1::URA3. kex1, prc1. leu2-3. leu2-212. DSM 7190, 22. Juli 1992.
S. cerevisiae Stamm 55.6B MATa. his3, leu2. trp1. ura3-52. cup1::URA3, siehe D. J. Thiele et al., Science 231 (1986), 854-856.
Plasmid pDP34: EP 0 340 170 A. Fig. 3 hierin, ein Hefe-E. coli Schaukelvektor mit dem Ampicillinresistenzmarker für E. coli und den Hefeselektionsmarkern URA3 und dLEU2. Es enthält die komplette 2 u Sequenz in der A Form und ist REP1, REP2 und FLP profizient. DSM 4473. 14. März 1988.
Plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR: Ein Hefeplasmid für die Expression der Desulfatohirudinvariante HV1 unter der Kontrolle eines kurzen, konstitutiven Promotors des Hefeglycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenasegens (GAPDH). Die kodierende Sequenz des Desulfatohirudins besteht aus den bevorzugten Hefecodons, siehe EP 0 340 170 A.
Plasmid pTZ18R: Ein von Plasmid pUC 18 abgeleitetes Plasmid, das einen M13 Replikationsursprung enthält und so einzelstrangig sverden kann und in M13 Phagenköpfen mit Hilfe eines M13 Helferphagens verpackt werden kann. D. A. Mead. E. Szczesna-Skorupa. B. Keniper. Single Stranded DNA 'blue' T7 promotor plasmids: A versatile tandem promotor system for cloning and protein engineering. Protein Engineering 1 (1986), 67-74 (Pharmacia).
Plasmid pFBY2: Dieses Plasmid wird durch die Insertion des 166 bp AluI Fragments, das die FRT Stelle des 2 u Plasmids von S. cerevisiae enthält, zwischen die HindIII und EcoRI Schnittstellen von pTZ18R und des gesamten mit XbaI geschnittenen 2 u Plasmids in die XbaI Einzelschnittstelle von pTZ18R konstruiert. DSM 6271, 14. Dezember 1990.
Plasmid pFBY4: Das Plasmid besteht aus einem 1,1 kb XbaI Fragment, das das gesamte URA3 Gen von S. cerevisiae kloniert in die XbaI Einzelschnittstelle von pTZ18R enthält. Dieses Plasmid dient als bequeme Quelle für ein 1,1 kb URA enthaltendes XbaI Fragment. DSM 6272. 14. Dezember L990,
Plasmid FBY5: pFBY5 leitet sich von einem großen Plasmid ab, das das gesamte 2 u Plasmid von S. cerevisiae plus den URA3 und LEU2 Genen von S. cerevisiae im bakteriellen Vektor pUC18 enthält. In die SaII Einzelsclutittstelle dieses Vektors wird ein 1,1 kb SaII Fragment inseriert, das eine Expressionskassette enthält, die aus einem Promotor besteht, der vom S. cerevisiae GAPDH Gen fusioniert mit der PHO5 Signalsequenz abgeleitet ist, die wiederum an ein synthetisches für Hirudin kodierendes DNA Fragment fusioniert ist, das vom PHO5 Terminator gefolgt wird. DSM 6273. 14. Dezember 1990.
Plasmid pFBY29: Dieses Plasmid besteh aus einem 2 kb BamHI/SaII Fragment, das das LEU2 Gen enthält. Das Fragment wird zwischen den BamHI und SaII Schnittstellen von pTZ18R inseriert, pFBY29 dient als Quelle eines 2,0 kb Fragments, das LEU2 enthält. DSM 6275. 14. Dezember 1990.
Alle DNA Manipulationen werden falls niclus anderes angegeben ist, gemäß Standardprotokollen ausgeführt. (beispielsweise T. Maniatis et al.: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York (1982)).

Beispiel 1: Konstruktion von Plasmid pPFY56. Ein Hybridgen, das den CUP1 Promotor, die PHO5 Signalsequenz und ein synthetisches Hirudingen enthält

Um eine induzierbare, starke Expression von sekretiertem Desulfatohirudin zu erreichen, werden DNA Sequenzen, die für HV1 und für die PHO5 Signalsequenz fusioniert und unter die Kontrolle des Kupferinduzierbaren Promotors CUP1 gestellt.
pDP34 (siehe EP 0 340 170 A. Fig. 3 hierin) ist ein Hefe-E. coli Schaukelvektor mit dem Ampicillinresistenzmarker für E. coli und den URA3 und dLEU2 Hefeselektionsmarkern. Es enthält die vollständige 2 u Sequenz in der A Form und ist REP1, REP2 und FLP profizient. Das Plasmid pDP34 wird mit BamHI verdaut. Die klebrigen Enden der Restriktionsschitstelle werden in einer Reaktion mit der Klenow DNA Polymerase aufgefüllt (T. Maniatis et al., in: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die DNA wird weiter mit SaII geschnitten und das 11.8 kb Vektorfragment wird auf einem präparativen 0,6% Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution und Ethanolfällung gewonnen.
Das Plasmid pJDB207/GAPFL-YHIR (ein Hefeplasmid zur Expression der Desulfatohirudinvariante HV1 unter der Kontrolle eines kurzen, konstitutiven Promotors des Hefeglycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenasegens (GAPDH), wobei die kodierende Sequenz des Desulfatohirudins aus bevorzugten Hefecodons besteht, siehe EP 0 340 170 A) wird mit HindIII verdaut. Die klebrigen Enden werden durch Klenow DNA Polymerase zu stumpfen Enden umgewandelt. Die DNA wird mit Ethanol gefüllt und weiter mit SaII verdaut. Das 1,1 kb SaII- [HindIII]/stumpfendige Fragment enthält die vollständige Expressionskassette mit pBR322 Sequenzen, den GAPFL Promotor, die PHO5 Signalsequenz, die im Leserahmen an die kodierende Sequenz (bevorzugte Hefecodons) von Desulfatohirudin fusioniert ist und das PHO5 Transkriptionsterminationssequenzfragment. Das 1,1 kb Fragment wird auf einem präparativen 0,8% Agarosegel isoliert, das aus dem Get durch Elektroelution gewonnen und durch DE52 Ionenaustauschchromatographie und Ethanolfällung gereinigt wird.
0,2 umol des 1,1 kb Fragments und 0,1 umol des 11,8 kb Vektorfragments werden in 10 ul 60 mM Tris- HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT. 3,5 mM ATP und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (Biolabs) für 16 h bei 15ºC ligiert. Ein Aliquot aus 1 ul wird zur Transformation von E. coli HB101 Ca²&spplus; Zellen verwendet. Es werden 5 transformierte. Ampicilin-resistente Kolonien analysiert. Die Plasmid DNA wird mit BamHI und SaII/ BamHI verdaut. Ein Klon mit den korrekten Restriktionsfragmenten wird ausgewählt und als pDP34/GAPFL-YHIR bezeichnet (für Details siehe EP 0 340 170 A).
Das synthetische Hirudingen, das all die PHO5 Signalsequenz fusioniert ist, wird aus dem Plasmid pDP34/GAPFL-YHir als 0.5 kb EcoRI Fragment isoliert, das auch PHO5 Transkriptionsterminationssequenzen enthält.
Der CUP1 Promotor (T. R. Butt et al. (198 = 4) Proc. Natl. Sci. USA 81. 3332-3336) wird von der genomischen DNA von S. cerevisiae durch Polymeraseketteureaktion (PCR) mittels des PCR Kits von Perkin Elmer und den folgenden zwei Oligonukleotidprimern kloniert:
5'-GGATCCATTACCGACATTTGGGCGCTAT SEQ ID Nr. 3
5'-GAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTA SEQ ID Nr. 4
100 ng genomischer DNA der Hefe (isoliert aus dem Hefestamm H449) werden in 0,1 ml mit 2,5 Einheiten Taq DNA Polymerase. 0,02 mM jedes Primers und 0,2 mM dATP, dCTP, TTP und dGTP in 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl. 1,5 mM MgCl&sub2; inkubiert. Die Reaktion wird für 30 Zyklen inkubiert: 30 Sekunden bei 92ºC, für 1 Minute bei 42ºC und bei 72ºC für 1 Minute. Das CUP1 Promotorfragment mit 0,4 kb wird nach Isolierung, Reinigung und Restriktion mit BamHI und EcoRI in BamHI und EcoRI geschnittenes Plasmid pBR322 inseriert.
Das entstehende Plasmid pBR322-CUP1 wird mit EcoRI geschnitten. Der 4, 4 kb große Vektor, der den CUP1 Promotor enthält, wird isoliert, gereinigt und mit dem 0,5 kb Hirudinfragment ligiert. E. coli HB101 wird mit dem entstehenden Plasmid pPFY53 transformiert, pPFY53 wird auf die richtige Orientierung des Hirudinfragments durch den Verdau mit SaII getestet. Das 1082 bp BamHI/SaII Fragment, das den CUP1 Promotor, die PHO5 Signalsequenz, das Hirudingen und den PHO5 Terminator enthält, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt.
Die CUP1 Hirudinexpressionskassette wird aus pPFY53 als 1,1 kb SaII Fragment isoliert. Dieses Fragment wird dann in das mit SaII linearisierte pDP34 inseriert. E. coli HB101 wird mit dem entstehenden Plasmid pPFY56 transformiert. Die Orientierung wird durch den Verdau mit KpnI getestet. Der transformierte E. coli Stamm wird als E. coli/PFY56 bezeichnet, pPFY56 ist in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 2: Konstruktion von Plasmid pPFY58. Co-Expression von Hirudin vom CUP1 Promotor und ACE1 vom ACE1 Promotor.

Das Ace1 Protein ist der auf Kupfer reagierende Transkriptionsfaktor, der die CUP1 Expression reguliert. Es wird konstitutiv exprimiert. Die Regulation erfolgt posttranslational.
Das ACE1 Gen (P. Fuerst et al., (1988) Cell 55. 705-717) wird aus der genomischen DNA von S. cerevisiae durch Polymerasekettenreaktion (PCR) mittels des PCR Kits von Perkin Elmer und den folgenden zwei Oligonukleotiden als Primer kloniert:
5'-GATATCGATCGTGAAAGAATATTTGCT SEQ ID Nr. 6
5'-GATATCATGAGGATGATGACAAAGAAGAC SEQ ID Nr. 7
100 ng genomische DNA der Hefe werden in 0,1 ml mit 2.5 Einheiten Taq DNA Polymerase. 0,02 mM jedes Primers und 0,2 mM dATP, dCTP, TTP und dGTP in 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl. 1,5 mM MgCl&sub2; inkubiert. Die Reaktion wird für 30 Akten inkubiert: 30 Sekunden bei 92ºC, für 1 Minute bei 42ºC und bei 72ºC für 1 Minute. Das ACE1 Genfragment mit 1.7 kb wird nach der Isolierung, Reinigung und Restriktion mit EcoRV in die SnaBI Einzelschnittstelle von pPFY5G (Beispiel I) inseriert, was zu Plasmid pPFY58 führt, das in E. coli HB101 transformiert wird. Die Orientierung wird durch Restriktion mit NcoI getestet. Der transformierte E. coli Stamm wird als E. coli / PFY58 bezeichnet. pPFY58 ist in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 3: Konstruktion von Plasmid pPFY59R. Co-Expression von Desulfatohirudin vom CUP1 Promotor und ACE1 vom CUP1 Promotor

Um eine streng regulierte, starke Expression von ACE1 zu erreichen, wird der konstitutive ACE1 Promotor, der auf dem 1.7 kb EcoRV Fragment (Beispiel 2) vorkommt, gegen den CUP1 Promotor ausgetauscht. Zur Fusion der für ACE1 kodierenden Sequenzen an den CUP1 Promotor wird eine EcoRI Schnittstelle stromaufwärts des ACE1 Startcodons durch ortsspezifische Mutagenese eingeführt.
Das 1.7 kb EcoRV Fragment (Beispiel 2), das das ACE1 Gen enthält, wird in die EcoRV Schnittstelle des Vektors pBlueskriptKS+ (Stratagene. La Jolla. CA. USA) unter Bildung von Plasmid pKSACE1 subkloniert. Um eine neue EcoRI Schnittstelle durch in vitro Mutagenese mittels des Uracil-DNA Verfahrens einzuführen (Bio-Rad Muta-Gene M13 Kit. Bio-Rad. Richmond. CA. USA) wird das folgende Oligonukleotid als Primer verwendet:
5'-CTGATAATCAGTGAATTCACAGAATG-3' SEQ ID Nr. 7
Zuerst wird pKSACE1 in E. coli CJ236 zum Uracileinbau transfiziert (Muta-Gene Kit, siehe oben). Die einzelsträngige DNA aus dem transfizierten CJ236 wird mittels des M13 Helferphagens isoliert (Strategene, siehe oben).
200 umol des Oligonukleotids werden in einem Volumen aus 0,03 ml phosphoryliert, worin 3 ul 1 M Tris- HCl pH 8,0, 0,3 ul 1 M MgCl&sub2;, 0,75 ul 0,2 M DTT. 0,6 ul 20 mM ATP und 5 Einheiten T4 Polynuldeotidkinase enthalten sind. Das Gentisch wird bei 37ºC für 60 Minuten und bei 65ºC für 15 Minuten inkubiert. Das phosphorylierte Oligonuleotid wird folgendermaßen an die Matrizen-DNA anneliert: 0,1 pmol Uracil enthaltende DNA, die von pKSACE1 stammt, werden mit 2 umol phosphoryliertem Primer in 10 ul Annelierungspuffer inkubiert (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl). Das Gemisch wird für 10 Minuten bei 80ºC inkubiert und kann dann langsam auf 25ºC abkühlen.
Anschließend wird der komplementäre Strang synthetisiert: 10 ul der Annelierungsreaktion werden mit 4 ul 2 mM dNTPs. 0,75 ul 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 0,75 ul 0,1 M MgCl&sub2;, 2,2 ul 0,2 M DTT, 1 Einheit T4 DNA Polymerase und 2 Einheiten T4 DNA Ligase inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird für 10 Minuten auf Eis, bei 25ºC für 10 Minuten und bei 37ºC für 9U Minuten inkubiert. Die entstehende doppelsträngige DNA wird in E. coli JM101 transformiert. Die Plasmide werden präpariert und auf die korrekte EcoRI Schnittstelle analysiert. Ein Plasmid mit der neuen EcoRI Schnittstelle wird als pKSACE I-Eco bezeichnet.
Das 1.5 kb EcoRI Fragment von pKSACE1-Eco, das die kodierenden Sequenzen und die Terminationssequenzen für ACE1 ohne ACE1 Promotor enthält, wird in die EcoRI Schnittstelle des Vektors pBR322-CUP1 (Beispiel 1) kloniert, um ACE1 unter die Kontrolle des CUP1 Promotors zu stellen. Das entstehende Plasmid pCup-ACE wird in E. coli HB101 transfiziert.
Das 1.2 kb BamHI/SnaBII Fragment von pCup-ACE wird in den Vektor pDP34 ligiert, der mit BamHI linearisiert ist. Die Ligation wird in 20 jd ausgeführt, die 10 finol mit BamHI linearisierte Vektor DNA, 30 fmol BamHI/SnaBI Fragment. 20 mM TRis pH 7,5, 5 mM MgCI, 1 mM DTT. 0,1 mM ATP und 1 Einheit T4 DNA Ligase enthält. Nach der Inkubation für 60 Minuten bei 25ºC werden die Moleküle in 50 ul stumpfendig gemacht, worin 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;. 1 zum DTT. 0,1 mM dNTPs und 1 Einheit Klenowfragment der E. coli DNA Polymerase enthalten sind. Das Gemisch wird für 10 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Die stumpfendigen Moleküle werden dann durch Ligation bei 15ºC für 18 Stunden in 100 ul zirkularisiert, worin 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;. 1 mM DTT. 0,1 mM ATP und 1 Einheit T4 DNA Ligase enthalten sind. Das entstehende Plasmid pPFY54 wird in E. coli HB101 transfiziert und auf die Orientierung durch Restriktion mit PvuII getestet.
Das 1,1 kb SaII Fragment von pPFY53, das die CUP1-Hirudinexpressionskassette (Beispiel 1) enthält, wird in den mit SaII linearisierten Vektor pPFY54 subkloniert. Das hieraus entstehende Plasmid pPFY59R wird in E. coli HB101 transfiziert. Die Orientierung wird durch einen Verdau mit KpnI getestet. Der E. coli Stamm, der pPFY59R trägt, wird als E. coli/PFY59R bezeichnet, pPFY59R ist in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 4: Konstruktion von pPFY79. Desulfatohirudinexpression von zwei verschiedenen Promotoren.

Um die Mengen an Hirudin mRNA zu erhöhen, können die für Hirudin kodierenden Sequenzen gleichzeitig von zwei unterschiedlichen Promotoren exprimiert werden.
Die CUP1-Hirudin-Expressionskassette wird als 1,1 kb SaII Fragment von Plasmid pPFY53 (Beispiel 1) isoliert. Dieses Fragment wird in die SaII Einzelschnittstelle des Vektors pDP34 / GAPFL-YHir kloniert. Die Orientierung des SaII Fragments im entstehenden Plasmid pPFY79 wird durch Restriktion mit BamHI getestet. E. coli HB101, der mit pPFY79 transfiziert ist, wird als E. coli / PFY79 bezeichnet. pPFY79 ist in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 5: Transformation des Saccharomyces cerevisiae Stamms Tr1456 mit den Plasmiden pPFY56, pPFY58, pPFY59R, pPFY79 und pDP34-GAPFL-YHir

Saccharomyces cerevisiae Stamm Tr1456 wird konstruiert, wie dies in EP 0 341 215 A beschrieben ist. Ausgehend vom Sacharomyces cerevisiae Stamm H449 werden in zwei aufeinanderfolgenden Experimentreihen die zwei Carboxypeptidasen yscα und yscY aus dem Stamm H449 durch die jeweilige Zerstörung ihrer kodierenden Gene KEXI und PRC1 konstruiert. Zuerst wird das für ysca kodierende Gen KEXI zerstört. Zu diesem Zweck wird der Stamm H449 mit einem DNA Fragment transformiert, das das KEXI Gen kodiert, wobei das gesamte URA3 Gen in die Mitte der für KEX1 kodierenden Region inseriert ist. Es werden für Uracil prototrophe Transformanden selektiert und auf die Abwesenheit der vsca Aktivität getestet. Als nächstes wird das am KEX1 Genort inserierte URA3 Gen durch die Transformation mit einem Plasmid zerstört, das eine zerstörte Version des URA3 Gens enthält, nämlich ura3Δ (siehe EP 0 341 215 A). Die Transformanden, die ura3 auxotroph sind, werden ausgewählt und im folgenden Schritt in ihrem endogenen PRC1 Gen zerstört das für die Carboxypeptidase yscY kodiert. Das Experiment wird auf eine vollkommen analoge Weise ausgeführt wie dies für die Zerstörung von KEXI beschrieben ist. Das schließlich resultierende isogene Derivat des des Stamms H449 wird Tr1456 genannt und hat den folgenden Genotyp:
Tr1456 = MATa leu2-3 112 ura3. prb1. kex1::ura3 prc1::ura3. [cir&sup0;]
Die Transformation von Stamm Tr1456 mit den Plasmiden pDP34 / GAPFL-YHir, pPFY56, pPFY58 pPFY59R und pPFY79 wird gemäß Dohmen et al ausgeführt [1989 Curr Genet 15, 319-325]. Die transformierten Hefezellen werden auf Hefeminimalmediumplatten selektiert die mit Leucin supplementiert sind und denen Uracil fehlt. Es werden einzelne transformierte Hefeklone isoliert und bezeichnet als:
Saccharomyces cerevisiae Tr1456/pDP34 / GAPFL-YHir
Saccharomyces cerevisiae Tr1456/pPEY56
Saccharomyces cerevisiae Tr1456/pPFY5R
Saccharomyces cerevisiae Tr1456/pPFY59R
Saccharomyces cerevisiae Tr1456/pPFY79

Beispiel 6: Desulfatohirudinexpression in Minimalmedium unter verschiedenen Kupferkonzentrationen

Zellen von Saccharomyces cerevisiae Tr1456 / pPFY56. Saccharomyces cerevisiae Tr1456 / pPFY58 und Saccharomyces cerevisiae Tr1456 / pPFY59R werden jeweils in zwei aufeinanderfolgenden Kulturen angezogen die sich zusammensetzen aus (g/l,)
Difco Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) 6,7
L-Asparagin 10
L-Histidin 1
L-Leucin 0,1
Glucose 20
Die ersten Kulturen werden für 60 h bei 30ºC und 180 Upm angezogen. Die zweiten Kulturen werden mit 2 % (Volumen pro Volumen) der ersten Kulturen beimpft und für 24 h bei 30ºC und 180 Upm angezogen. Nach 24 h werden die Kulturen zentrifugiert die Zellen werden einmal mit Kochsalzlösung gewaschen und im ursprünglichen Volumen frischen Medium (stehe oben) resuspendierten, wozu unterschiedliche Konzentrationen Kupfersulfat gegeben werden. Die Zellen werden für weitere 24 h bei 30ºC und 180 Upm angezogen wonach die Zellen durch Zentrifugation entfernt werden und die Menge an Desulfatohirudin im Überstand wird durch HPLC gemessen, wie dies in EP 0 340 170 A beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1: Desulfatohirudinexpression in Minimalmedium Desulfatohirudin (mg/l)
Unter den gewählten Bedingungen wird Desulfatohirudin in allen Transformanden exprimiert, die eine der Plasmidkonstruktionen enthalten. Die Expression ist stark Kupfer-abhängig, da in Abwesenheit von Kupfer nur sehr wenig Desulfatohirudin gefunden wird. Optimale Kupferkonzentrationen unter diesen Bedingungen liegen zwischen 0,05 und 0,25 mM.

Beispiel 7: Vergleich von Desulfatohirudintitern unter Kontrolle des GAPFL-Promotors gegenüber dem CUP1 Promotor in komplexem Medium

Vorher wurde die Desulfatohirudinexpression in vollem, komplexem Medium unter Kontrolle eines kurzen Fragments des starken GAPDH Promotors optimiert, wie dies in EP 0340170 A beschrieben ist. Daher werden CUP1 Promotor-enthaltende Plasmide unter den vorher beschriebenen Bedingungen +/- Kupferzugabe verglichen. Zusätzlich wird der optimale Zeitpunkt für die Kupferzugabe bestimmt.
Zellen von Saccharomyces cerevisiae TR1456 / pPFY56 oder TR1456 / pPFY58 oder TR1456 / pPFY59R oder TR1456 / pDP34 / GAPFL-YHir werden jeweils in zwei aufeinanderfolgenden Vorkulturen in 20 ml synthetischem Medium angezogen, das zusammengesetzt ist aus (g/l):
Difco Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) 6,7
L-Asparagin 10
L-Histidin 1
L-Leucin 0,1
Glucose 20
Der pH des Medium wird auf 5,8 eingestellt. Die erste Vorkultur wird für 60 h bei 28ºC und 180 Upm angezogen. Die zweite Vorkultur wird mit 2% (Volumen pro Volumen) der ersten Vorkultur beimpft und für 24 h bei 28ºC und 180 Upm inkubiert. Das Medium der Hauptkultur setzt sich zusammen aus (g/l):
Pepton 5
Hefeextrakt 10
Glucose 20
Saccharose 40
Ammoniumsulfat 3
Kaliumdihydrogenphosphat 2
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,5
Natriumchlorid 0,1
Calciumchlorid 0,1
Biotin 10&supmin;&sup5;
Die Hauptkultur (100 nM Medium) wird mit etwa 2 · 10&sup6; Zellen/ml beimpft und für 96 h bei 28ºC und 180 Upm inkubiert. Es wird steriles Kupfersulfat in einer Konzentration von 200 uM zu den Hauptkulturen 0 h, 7 h, 11 h, 14 h oder 24 h nach der Beimpfung der Hauptkultur zugegeben. Am Ende der Fermentation werden Aluiquots der Kulturen entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt und der Kulturüberstand wird wie oben beschrieben auf Desulfatohirudin untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Einfluß des Zeitpunkts der Promotorinduktion der CUP1-gesteuerten Bildung von Desulfatohirudin in komplexem Medium Desulfatohirudinsekretion (mg/l)
*kein Kupfersulfat zur Hauptkultur gegeben
Die höchste Expression des Desulfatohirudins vom CUP1 Promotor erhält man, wenn der Promotor auf eine "pseudo-konstitutive" Art verwendet wird (das heißt die Promotorinduktion findet zusammen mit dem Beimpfen der Hauptkultur statt) und wenn das ACE1 Gen attfdem Plasmid vorkommt, das die Hirudinexpressionskassette enthält. Unerwarteterweise werden unter den hierin beschriebenen Induktionsbedingungen höhere Hirudinmengen mit den Stämmen S. cerevisiae TR1456/pPFY58 und TR1456/pPFY59R als mit dem Stamm S. cerevisiae TR1456/pDP34/GAPFL-YHir erhalten, der eine Hirudinexpressionskassette unter der Kontrolle einer verbesserten Version des stark konstitutiven GAPDH-Promotors enthält.

Beispiel 8: Optimierung der Kupferkonzentration für die CUP1-gesteuerte Sekretion von Desulfatohirudin in komplexem Medium

Zellen von Saccharomyces cerevisiae TR145 G/pPFY5G oder TR1456 / pPFY58 oder TR1456 / pPFY59R oder TR1456 / pDP34 / GAPFL-YHir werden in zwei aufeinanderfolgenden Vorkulturen in 20 ml synthetischem Medium angezogen, wie dies im vorherigen Abschnitt beschrieben ist. Die Hauptkultur wird im oben beschriebenen komplexen Medium angezogen und wird mit etwa 2 · 10&sup6; Zellen/m angeimpft und für 96 h bei 28ºC und 180 Upm inkubiert. Unmittelbar nach der Beimpfung der Hauptkulturen wird steriles Kupfersulfat in folgenden Konzentrationen zum Medium gegeben: 0 uM, 50 uM, 200 uM, 500 uM, 1 mM, 2,5 mM oder 5 mM. Am Ende der Fermentation werden Aliquots der Kultur entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt und der Kulturüberstand wird wie oben beschrieben auf Desulfatohirudin analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Einfluß der Konzentration von Kupfersulfat auf die CUP1-gesteuerte Sekretion von Desulfatohirudin HV1 Desulfatohirudinsekretion (mg/l)
Bei optimalen Kupferkonzentrationen erhält man beträchtlich höhere Titer von Desulfatohirudin, wenn eine CUP1-YHir Expressionskassette verwendet wird, wie wenn die Hirudinexpressionskassette unter der Kontrolle des starken konstitutiven GAPFL-Fragments des GAPDH-Promotors steht. Bei Kupfersulfatkonzentrationen unter 200- 500 uM sind die Plasmide pPFY58 und pPFY59R, die das Gen des Transkriptionsaktivators ACE1 enthalten, besser als das Plasmid pPFY5G, dem das ACE1 Gen fehlt.

Beispiel 9: Konstruktion von Plasmid pDP34/[GAPFL-HIR]D mit zwei Hirudinexpressionskassetten in Tandemanordnung

Das Plasmid pDP341[GAPFL-HIR]D umfaßt ein DNA Insert, das aus zwei Hirudinexpressionskassetten in einer Tandem Kopf zu Schwanz Anordnung besteht. Die zwei Kassetten sind identisch und enthalten die kodierende Sequenz der PHO5 Signalsequenz und Desulfatohirudin HV1 unter der Kontrolle eines kurzen, konstitutiven GAP49 (TDH3) Promotor (GAPFL) und den PHO5 Transkriptionsterminator. Das Plasmid pJDB207/[GAPFL- HIR]D hat die Tandemexpressionskassette im Hefevektor pJDB207. Die Konstruktion ist in EP 0225633 A beschrieben.
pJDB207/[GAPFL-HIR]D wird an der HindIII Einzelschnittstelle geschnitten. Die klebrigen Enden der Restriktionsstellen werden durch Klenow DNA Polymerase zu stumpfen Enden umgewandelt. Ein partieller SaII Verdau in Gegenwart von 0.01 mg/ml Ethidiumbromid erlaubt die Isolierung des 2,1 kb SaII-stumpfendigen Fragments mit den zwei Expressionskassetten. Das Plasmid pDP34 (siehe Beispiel 1) wird mit BamHI geschnitten, mit Klenow DNA Polymerase behandelt und mit SaII verdaut. Das isolierte große Vektorfragment wird zur Klonierung des 2.1 kb SaII-stumpfendigen Fragments verwendet. Ein korrekter Klon wird als pDP34/[GAPFL-HIR]D bezeichnet, wobei die Tandentkassetten in einer Orientierung gegen den Uhrzeigersinn kloniert sind.

Beispiel 10: Vergleich von Desulfatohirudintitern, die mittels Plasmiden erhalten wurden, welche jeweils ein oder zwei Hirudinexpressionskassetten enthalten

Zellen von Saccharomyces cerevisiae TR1456 / pDP34 / GAPFL-YHir oder TR1456 / pPFY56 oder TR1456 / pPFY79 oder TR1456 / pDPJ4/[GAPFL-HIR]D werden jeweils in zwei aufeinanderfolgenden Vorkulturen gefolgt von einer Hauptkultur angezogen, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Die Hauptkultur wird mit etwa 2 · 10&sup6; Zellen /ml angeimpft und für 96 h bei 28ºC und 180 Upm inkubiert. Unmittelbar nach der Beimpfung der Hauptkultur wird steriles Kupfersulfat in Konzentrationen von 0 uM. 50 uM. 200 uM. 500 uM, 500 uM. 750 uM, 1 mM oder 2,5 mM zugegeben. Am Ende der Fermentation werden Aliquots aus den Kulturen entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt und der Kulturüberstand wird durch HPLC auf Desulfatohirudin analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 gezeigt: Tabelle 4: Desulfatohirudinsekretion (mg/l)
n.d. = nicht bestimmt
Unter der Bedingung des Experiments ist das Plasmid pPFY79, das eine konstitutive GAPFL-YHir Expressionskassette und eine zweite Kupfer-induzierbare CUP1-YHir Expressionskassette enthält besser als 1) ein Plasmid, wie pPD34/GAPFL-YHir, das nur eine konstitutive Expressionskassette enthält oder 2) ein Plasmid, wie pPFY56/CUP1-Hir, das nur eine Kupfer-induzierbare Expressionskassette enthält oder 3) ein Plasmid, wie pDP34/GAPFL-YHir + GAPFL-YHir, das zwei konstitutive Expressionskassetten enthält.

Beispiel 11: Konstruktion eines Kupfer-resistenten isogenen Derivats von Saccharomyces cerevisiae Stamm Tr1456

Saccharomyces cerevisiae Stamm Tr1456 ist, wie die meisten Hefelaborstämme, ein Stamm, der gegenüber der Kupferzugabe zum Medium moderat resistent ist. Diese Resistenz beruht auf dem Vorkommen eines 2 kb Segments chromosomaler DNA, das etwa 3 Kopien des endogenen CUP1 Lokus enthält [D. Hamer et al., Science 228 (1985), 685-69U]. In Gegenwart von großen Mengen an Kupfer im Medium erhält man sogar noch stärker resistente Derivate, die auf einer Wiederholung des oben erwähnten 2 kb CUP1-enthaltenden chromosomalen DNA Segments in Tandem beruhen. Um ein solches stärker resistentes Derivat zu konstruieren wird S. cerevisiae Tr1456 in des synthetische Minimalmedium geimpft, das in Beispiel 6 beschrieben ist und 1,2 mM Kupfersulfat enthält. Die Kultur wird für 8 Tage bei 30ºC und 180 Upm angezogen. Dann wird die Kultur auf synthetischem Minimalmedium ohne Kupferzugabe in einer geeigneten Dichte ausplattiert, um Einzelkolonien zu erhalten. Die DNA aus ausgewählten Einzelkolonien wird hergestellt, mit EcoRI verdaut, auf Agarosegelen aufgetrennt und auf das Vorkommen und die Länge des CUP1 Genorts durch Southern Blotting analysiert. Die experimentellen Bedingungen sind gemäß Hamer et al. [siehe oben]. Eine Kolonie mit einer Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität des CUP1 Genorts, die das Vorkommen von mindestens 10 Kopien des CUP1 Genorts anzeigt, wird ausgewählt und als S. cerevisiae Stamm Tr1631 bezeichnet.

Beispiel 12: Transformation von S. cerevisiae Stamm Tr1631 mit den Plasmiden pPFY56, pPFY58 und yPFY59R

Eine Transformation des S. cerevisiae Stamms Tr1631 mit den Plasmiden pPFY56, pPFY58 und pPFY59R wird wie oben beschrieben ausgeführt. Es werden einzelne transformierte Hefeklone isoliert und bezeichnet als:
Saccharomyces cerevisiae Tr1631/pPFY56
Saccharomyces cerevisiae Tr1631/pPFY58 und
Saccharomyces cerevisiae Tr1631/pPFY59R

Beispiel 13: Vergleich des transformierten Kupfer-resistenten S. cerevisiae Stamms Tr1631 mit dem transformierten Stamm Tr1456 bei höheren Kupferkonzentrationen

Zellen von S. cerevisiae Tr1631 / pPFY56. S. cerevisiae Tr1631 / pPFY58 und S. cerevisiae Tr1631 / pPFY59R und Zellen von S. cerevisiae Tr1456 / pPFY56. S. cerevisiae Tr1456 / pPFY58 und S. cerevisiae Tr1456 / pPFY56 werden wie in Beispiel 7 und 8 beschrieben kultiviert. Zur Hauptkultur werden 0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM oder 4 mM Kupfersulfat unmittelbar nach der Beimpfung der Hauptkultur zugegeben. Die Kulturen werden für 72 Stunden bei 30ºC und 180 Upm angezogen. Am Ende der Fermentation werden Aliquots der Kulturen entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt und der Kulturüberstand wird durch HPLC auf Desulfatohirudin analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt: Tabelle 5: Vergleich des transformierten Stamms Tr1631 mit dem transformierten Stamm Tr1456 Desulfatohirudin (mg/l)
Die Ergebnisse zeigen eine bessere Produktivität von Desulfatohirudin im transformierten Kupferresistenten Stamm S. cerevisiae Tr1631 bei höheren Kupferkonzentrationen im Kulturmedium

Beispiel 14: Kreuzung von S. cerevisiae Stamm 55,6B (cup1::URA3) mit S. cerevisiae Stamm TR1456 und Analyse der Sporen in Bezug auf Kupferempfindlichkeit

Der S. cerevisiae Stamm 55.GB (MATa. his3. leu2. trpl. ura3-52, cup1::URA3, siehe D. J. Thiele et al., Science 231 (1986), 854-856), der im CUP1 Genort deletiert ist, wird mit dem Stamm TR1456 (MATa, leu2-3, 212. ura3D5, kex1. prb1. prc1), der etwa 3 Kopien des CUP1 Genorts trägt (das heißt 6 Kopien des in Tandem angeordneten CUP1 Gens) gekreuzt. Diploide heterozygote Zellen des Genotyps cup1::URA3 / CUP1 werden aus dieser Kreuzung isoliert. Die Tetraden, die aus den diploiden Zellen stammen, werden gemäß genetischen Standardverfahren getrennt [Methods in Yeast Genctics, 198 h (F. Sherman. G. R. Fink. J. B. Hicks. Herausgeber) Cold Spring Harbor Laboratory. N.Y.]. Die Abkömmlinge der vier Sporen jeder Tetrade werden auf ihre Fähigkeit zum Wachstum auf YPD Agarplatten getestet (10 g Hefeextrakt. 20 g Pepton. 20 g Glucose und 25 g Agar pro Liter zweifach destilliertem Wasser), die mit 0 uM, 250 gM. 500 uM oder 1 mM Kupfersulfat versetzt sind. Sporen, die das intakte CUP1 Gen enthalten, haben Nachkommen, die stark auf Kupferagar wachsen, während Sporen, die das zerstörte CUP1::URA3 Gen enthalten. Nachkommen haben, die nur schwach auf Kupferagar wachsen. Die Abkömmlinge von zwei Kupfer-sensitiven Sporen von mehreren vollständigen Tetraden werden auf ihre Fähigkeit getestet, sich mit dem Stamm TR1456 zu paaren. Die Abkömmlinge einer Spore des geeigneten Paarungstyps werden mit TR1456 gekreuzt und diploide heterozygote Zellen des Genotyps cup1::URA3 / CUP1 werden aus dieser Kreuzung isoliert. Die Tetraden, die von den diploiden Zellen stammen, werden getrennt und die Sporen werden auf die Empfindlichkeit gegenüber Kupfersulfat getestet, wie dies oben beschrieben wurde. Die Kupfer-sensitiven Kolonien die aus etwa 50 vollständigen Tetraden erhalten wurden, werden auf SD Agar getestet (6,7 g Bacto Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren. 20 g Glucose und 25 g Agar pro Liter Wasser) und auf SD Agar, der mit 200 M Leucin supplementiert ist. Kolonien, die nicht auf den SD Platten wachsen, aber ein Wachstum auf SD Agar zeigen, der mit 200 M Leucin versetzt ist, haben den Genotyp cup 1::URA3, HIS3, TRP1, leu2-3, 212 und werden für die weiteren Arbeiten ausgewählt.

Beispiel 15: Klassifizierung der bestätigten cup1::IJRA3 Mutanten auf die zusätzliche Defizienz der Protease yscY und der Protease vscα. und Transformation von Mutanten

S. cerevisiae cup1::URA3 Mutanten, die wie in Beispiel 14 beschrieben erhalten wurden, werden in Bezug auf die Defizienz der durch die KEX1 und PRC1 Gene kodierten Proteasen klassifiziert. Kolonien, die im KEX1 Gen defizient sind, werden auf der Grundlage ihrer verringerten Fähigkeit zur Sekretion des α-Faktors identifiziert. Eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Unterscheidung zwischen Kolonien, die ein Wildtyp KEX1 Gen tragen und Kolonien die im kex 1 Gen mutiert sind, kann in EP 0 341 215 A im Beispiel 1 hierin gefunden werden. Kolonien, die im PRC1 Gen defizient sind, werden durch einen biochemischen Test identifiziert, der die proteolytische Aktivität des PRC1 Genprodukts mißt, nämlich der Protease yscY. Dieser Test wurde in EP 0 341 215 A beschrieben. Eine Einzelkolonie des Genotyps cup1::URA3 kex 1 prc1 leu2-3, 212 wird gepickt und als Saccharomyces cerevisiae HT462/TH3 bezeichnet. Zellen des Stamms HT462/TH3 werden jeweils mit Plasmid pDP34/GAPFL. YHir oder Plasmid pPFY56 oder Plasmid pPFY58 oder Plasmid pPFY59R transformiert. Das zur Transformation verwendete Verfahren wurde in EP 0 341 215 A beschrieben. Einzelne transformierte Hefekolonien.
die entweder Plasmid pPFY5G oder Plasmid pPFY58 oder Plasmid pPFY59R oder PIasmid pDP34/GAPFL-YHir enthalten, werden gepickt. Eine transformierte Kolonie jedes Typs wird für die weiteren Arbeiten ausgewählt und jeweils bezeichnet als
Saccharomyces cerevisiae TH3/pPFY56
Saccharomyces cerevisiae TH3/pPFY58
Saccharomyces cerevisiae TH3/pPFY59R und
Saccharomyces cerevisiae TH3/pDP34/GAPFL-YHir.

Beispiel 16: Fermentation des transformierten Stamms TH3 im Labormaßstab

Zellen von Saccharomyces cerevisiae TH3/pDP34/GAPFL-YHir oder Saccharomyces cerevisiae TH3/pPFY56 oder Saccharomyces cerevisiae TH3/pPFY58 werden jeweils in zwei aufeinanderfolgenden Vorkulturen aus 20 ml synthetischem Medium angezogen, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Die Hauptkultur wird in dem in Beispiel 7 beschriebenen komplexen Medium angezogen. Sie wird mit etwa 2 · 10&sup6; Zellen/ml angeimpft und für 66 h bei 28ºC und 180 Upm inkubiert. Unmittelbar nach der Beimpfung der Hauptkulturen wird steriles Kupfersulfat in den folgenden Konzentrationen zum Medium gegeben: 0 uM, 5 uM, 10 uM, 25 uM, 50 uM, 100 uM und 500 uM. Am Ende der Fermentation werden Aliquots der Kulturen entnommen, die Zellen werden durch Filtration entfernt und der Kulturüberstand wird durch HPLC auf Desulfatohirudin analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 gezeigt: Desulfatohirudinsekretion (mg/l)
In einem Wirtsstamm, wie TH3, dessen chromosomale Kopie des CUP1 Gens deletiert wurde, erhält man die beste Hirudinproduktion, wenn ein Plasmid eingeführt wird, das zusätzlich zur CUP1-YHir Expressionskassette eine Kopie des ACE1 Gens unter dem ACE1 Promotor enthält. Die optimale Konzentration an Kupfersulfat zur Promotorinduktion ist beträchtlich niedriger, wie wenn ein Stamm verwendet wird, der 3 oder mehr Kopien des CUP1 Genorts enthält.

Beispiel 17: Produktion der Desulfatohirudinvariante HV1 im 50 l Maßstab

Eine Arbeitszellbank des transformierten Stamms Saccharomyces cerevisiae Tr1456 / pPFY56 oder des Stamms Saccharomyces cerevisiae Tr1456 / pDP34 / GAPFL-YHir wird als Quelle des Inokulums zur Produktion von Desulfatohirudin in einem 50 l Maßstab verwendet.
Ampullen der Arbeitszellbank werden in der Dampfphase in einem Behälter mit flüssigem Stickstoffkonserviert. Der Inhalt einer Ampulle wird verwendet, um eine Schüttelkolbenkultur zu beimpfen, die ein Selektionsmedium enthält, das besteht aus (g/l):
Hefestickstoffbase 8,4
L-Asparaginmonohydrat 11,4
L-Histidin 1,0
L-Leucin 0,1
D-Glucosemonohydrat 20,0
Der 500 ml Kolben enthält 100 ml Medium und wird für 48 h bei 28ºC in einem Rundschüttler bei einer Schüttlergeschwindigkeit von 180 Umdrehungen/min inkubiert.
Die zweite Schüttelkolbenvorkultur enthält dasselbe Medium, wovon 600 ml in einem 2 l fassenden Kolben enthalten sind, der 4 Schikanen aufweist. Die Inokulummenge von der ersten Vorkultur beträgt 5% (30 ml) und die Kolben werden für 48 h bei 28ºC in einen Rundschüttler bei einer Geschwindigkeit von 120 Umdrehungen/ min inkubiert.
Es wird eine dritte Vorkultur in einem 50 l Edelstahlbioreaktor fermentiert, der mit 4 Schikanen und einem einfachen Scheibenblattrührer mit einem Durchmesser von 115 mm ausgestattet ist. Das obige Medium wird auch für diese Kultur verwendet, wobei das Ausgangsvolumen 30 l beträgt. Ein einzelner 2 l Kolben, der 600 ml Kultur enthält, wird zur Beimpfung des 50 l Bioreaktors verwendet (2.5%). Die Fermentation dauert 48 h bei einer Temperatur von 28ºC. Die Rührergeschwindigkeit beträgt 600 Umdrehungen/min, die Belüftungsrate 0,5 vvm und der Reaktor wird mit einem Überdruck von 0,3 bar gefahren.
Ein ähnlicher 50 l Bioreaktor, der zusätzlich für Fed-Batch Prozesse ausgelegt ist, wird für die Desulfatohirudinproduktionsstufe verwendet. Das Medium, das besteht aus (g/l):
Fleischpepton (Merck) 6,0
Hefeextrakt 37,5
Ammoniumsulfat 6,0
Magnesiumsulfatheptahydrat 1,0
Natriumchlorid 0,1
Kaliumdihydrogenphosphat 4,0
wird für diese Stufe verwendet. Das Ausgangsvolumen wird auf 24l verringert, um die Glucosemonohydratlösung zu kompensieren, die während der Fermentation zugegeben wird. Die Inokulummenge aus der dritten Vorkulturstufe beträgt 2,5%. Die Fermentation dauert 78 h bei einer Temperatur von 28ºC und einer auf 900 Umdrehungen/min eingestellten Rührergeschwindigkeit. Der Überdruck wird anfangs auf 0,3 bar eingestellt und nach 48 h auf 1,0 bar erhöht. Der anfängliche Luftstrom beträgt 0,25 vvm, wird aber nach 9 h auf 0,5 vvm, nach 24 h auf 0,75 vvm und schließlich weiter auf 1.0 vvm nach 48 h erhöht. Eine Erhöhung des Überdrucks und der Belüftungsrate während dem Verlauf der Fermentation wird ausgeführt, um eine angemessene Sauerstoffversorgung zu gewährleisten und den gelösten Sauerstoff über 20% Luftsättigung zu halten.
Nach der Beimpfung werden 10 g Kupfersulfatpentahydrat gelöst in 500 ml entionisiertem Wasser zur Kultur gegeben, um die Expression des Desulfatohirudins auszulösen, die unter der Kontrolle des CUP1 Promotors steht.
Der pH Wert fällt während dem frühen Teil der Fermentation auf einen Wert von 5,0, wonach er durch eine automatische Zugabe von Ammoniumhydroxid gehalten wird. Um eine übermäßige Produktion von Ethanol durch die wachsenden Hefezellen zu vermeiden, wird eine konzentrierte Glucosemonohydratlösung (70% G/V) mit einer konstanten anfänglichen Rate von 60 ml/h zugefüttert. Nach 18 h wird die Fütterrate linear mit einem Faktor von 5 ml/h erhöht, wobei am Ende der Fermentation ein Endwert von 360 ml/h erreicht wird. Diese beschränkte Versorgung mit der Kohlenstoffquelle (Fed-Batch Technologie) unterstützt eine beträchtlich höhere Endbiomassekonzentration und einen Desulfatohirudintiter, als es in einer einfachen Batch-Kultur möglich ist.
Kleine Zugaben von Silicon-basierteiu Antischaum werden verwendet, lull das Schäumen zu kontrollieren, wenn es erforderlich ist. Ein Teil des Abgases vom Bioreaktor wird online analysiert, um Information über die Sauerstoffaufnahme und die Kohlendioxidentwicklungsrate bereitzustellen. Der gelöste Sauerstoff wird auch online mittels einer sterilisierbaren Elektrode vom Clark-Typ gemessen.
In 6 Stunden dauernden Intervallen werden Proben während der Fermentation gezogen und es wird die optische Dichte (OD) bestimmt und die Glucose, das Ethanol, das Phopshat und das Magnesium analysiert. Der Desulfatohirudintiter wird durch HPLC verfolgt. Am Ende der Fermentation wird das sekretierte Desulfatohirudin aus dem Kulturüberstand gewonnen. Der Fermentationstiter des S. cerevisiae Stamms Tr1456 / pPFY56 wird mit einer identischen Fermentation des S. cerevisiae Stamms Tr1456 / pDP34 / GAPFL-YHIR ohne Kupferzugabe verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7: Vergleich zwischen der konstitutiven (GAPFL-Hir) und der regulierten (CUP1-Hir) Expression von Desulfatohirudin in Stamm Tr1456. OD: Optische Dichte. sp. Hir.: spezifische Desulfatohirudinproduktion
Mit dem CUP1 System wird nicht nur der schließliche Titer an Desulfatohirudin sondern auch die spezifische Produktivität von Desulfatohirudin verglichen mit dein konstitutiven GAPFL-YHIR System beträchtlich verbessert.

Beispiel 18: Isolation und Reinigung der Desulfatohirudinvariante HV1, die im 50 l Maßstab produziert wurde

Das Desulfatohirudin wird aus der Kulturbrühe einer 50 l Fermentation mit dem Hefestamm Tr1456 / pPFY56 (siehe Beispiel 17) isoliert. Es werden Kontrollen während des Prozesses ausgeführt, um die Reinheit durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie und analytische Anionenaustauschchromatographie zu verfolgen. Die erhaltenen Daten werden mit den Ergebnissen einer 50 l Fermentation mit einem Hefestamm Tr1456 / pDP34 / GAPFL-YHir verglichen.
Nach Beendigung der Fermentation wird der pH auf etwa 3 eingestellt und die Kulturbrühe wird auf ein hydrophobes Polymerharz aufgetragen. Das Harz mit dem adsorbierten Desufatohirudin wird mit 1 M NaCl Lösung gewaschen und mit Ammoniumacetatpuffer eluiert. In der die Proteinaktivität enthaltenden Fraktion werden der pH (pH 3) und die Leitfähigkeit eingestellt. Das Desulfatohirudin wird dann weiter mittels Kationenaustauschchromatographie (Macro-Prep S. Bio-Rad) gefolgt von Ultrafiltration gereinigt. Um hochmolekulare Verbindungen und gefärbte Verunreinigungen abzutrennen wird eine Gelfiltration angewendet. Nach dem Einstellen des pH auf 5 wird die Desulfatohirudin enthaltende Fraktion auf einem Anionenaustauscherharz (Macro-Prep Q, Bio-Rad) chromatographiert. Die erhaltene Desulfatohirudinlösung wird durch Umkehrphasen-HPLC und Anionenaustauschchromatographie analysiert. Der Kupfergehalt wird mittels Plasmaemissionsspektrometrie gemessen.
Die experimentellen Daten zeigen, daß die Produktion von Desulfatohirudin mit dem Stamm Tr1456 / pPFY56 zu einer mindestens gleichen Desulfatohirudinqualität bezüglich HPLC und FPLC Reinheit führt, wie sie mit dem Stamm Tr1456 / pDP34 / GAPFL-YHir hergestellt wird. Durch die höheren Titer, die in der kupferinduzierten Fermentation erhalten werden, erhält man höhere Ausbeuten an Desulfatohirudin für die Aufarbeitung. Die Zugabe von Kupfer zum Fermentationsmedium verursacht keine signifikante Veränderung im Nebenproduktmuster. Die Daten zeigen, daß Kupfer leicht bis auf ppm Mengen entfernt werden kann.

Beispiel 19: Konstruktion von pFBY23

2 ug von pFBY2 werden vollständig mit FspI in CA Puffer (20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 7 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit. 100 mM KCl, HCl auf pH 7,5) geschnitten. Die Restruiktionsendonuklease wird durch Erhitzen auf 65ºC für 10 Minuten inaktiviert. Das Volumen wird durch die Zugabe von Wasser verdoppelt und die DNA Fragmente werden mit 1 Einheit T4 Polymerase in Gegenwart von jeweils 0,05 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP für 30 Minuten bei 37ºC stumpfendig gemacht. Das Enyzm wird bei 65ºC für 10 Minuten hitzeinaktiviert. Nach der Ethanolfällung wird die DNA erneut mit HindIII und EcoRI geschnitten. Diese Fragmente werden auf einem 2% LGT Gel (Agarose mit niedriger Geliertemperatur) in TAE Puffer (40 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan. 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (Dinatriumsalz), Essigsäure auf pH 7,6) aufgetrennt. Die 170 bp und 523 bp langen Fragmente werden aus dem Gel ausgeschnitten und die DNAs werden durch ElutipD® Chromatographie geschnitten.
2 ug pTZ18R werden vollständig mit EcoRI und HindIII in CA Puffer geschnitten. Diese Fragmente werden auf einem 0,8% LGT Gel in TAE Puffer aufgetrennt. Die 2,5 kb Bande wird ausgeschnitten und die DNA wird durch ElutipD® Chromatographie gereinigt.
Etwa 20 ng jedes der präparierten Fragmente werden zusammen mit 10 pM unphosphoryliertem BamHI Linker der Sequenz GGGATCCC und 1 mM ATP und Ligationspuffer durch 0,5 Einheiten T4 Ligase für 3 h bei Raumtemperatur ligiert.
Dieses Ligationsgemisch wird zur Transformation von 40 ul kompetenten E. coli DH5αF' Zellen verwendet und auf 2YT Platten (16 g Trypton. 10 g Hefeextrakt. 10 g NaCl pro Liter H&sub2;O) plattiert, die Ampicillin, XGaI und IPTG enthalten. Um pFBY23 zu verifizieren, werden weiße Kolonien nach einer 16 h dauernden Inkubation bei 37ºC gepickt und mittels eines Doppelverdaus mit EcoRI und HindIII zur Bestätigung des korrekten Inserts und eines Doppelverdaus mit HindIII und BamHI zur Bestätigung des BamHI Linkers in der vorherigen FspI Schnittstelle einem Minitestverfahren unterzogen.

Beispiel 20: Konstruktion von pFBY24

2 ug pFBY23 werden vollständig mit HindIII und EcoRI in CA Puffer geschnitten. Diese Fragmente werden auf einem 0,8% LGT Gel in TAE Puffer aufgetrennt. Die 701 bp Bande wird ausgeschnitten und die DNA wird durch ElutipD® Chromatographie gereinigt.
2 ug pFBY2 werden vollständig mit HindIII und Pstl in CA Puffer geschnitten. Diese Fragmente werden auf einem 0,8% LGT Gel in TAE Puffer aufgetrennt. Das 3,8 kb Fragment wird ausgeschnitten und die DNA wird durch ElutipD® Chromatographie gereinigt.
2 ug pFBY2 werden vollständig mit Pstl und XbaI in CA Puffer geschnitten. Diese Fragmente werden auf einem 0,8% LGT Gel in TAE Puffer aufgetrennt. Das 1,95 kb Fragment wird ausgeschnitten und die DNA wird durch ElutipD® Chromatographie gereinigt.
2 ug pFBY2 werden vollständig mit XbaI und EcoRI in CA Puffer geschnitten. Diese Fragmente werden auf einem 0,8% LGT Gel in TAE Puffer aufgetrennt. Das 2,9 kb Fragment wird ausgeschnitten und die DNA wird durch ElutipD® Chromatographie gereinigt.
Etwa 20 ng jedes der hergestellten Fragmente werden in Gegenwart von 1 mM ATP und Ligationspuffer durch 0,5 Einheiten T4 Ligase für 3 Stunden bei Raumtemperatur zusammenligiert.
Dieses Ligationsgemisch wird zur Transformation von 40 ul kompetenter E. coli DHSocF' Zellen verwendet und auf 2 YT Platten plattiert, die Ampicillin. XGaI und IPTG enthalten. Nach 16 h Inkubation bei 37ºC werden die weißen Kolonien gepickt und mittels Doppelverdaus mit HindIII / EcoRI und Pstl / XbaI zur Bestätigung der korrekten Inserts und BamHI zur Bestätigung der neuen BamHI Schnittstelle einem Minitestverfahren unterzogen.
pFBY24 ist zu pFBY2 in Bezug auf die vollständigen Sequenzen der Plasmide pTZ18R und 2 u identisch, die durch direkt wiederholte FRT Stellen getrennt sind, außer der Insertion einer BamHI Schnittstelle in die FspI Schnittstelle am 3'-Ende des FLP Gens.

Beispiel 21: Konstruktion von pFBY74

2 ug pFBY29 werden vollständig mit BamHI in CA Puffer geschnitten. Diese Fragmente werden auf einem 0,8% LGT Gel in TAE Puffer aufgetrennt. Die 2,0 kb Bande wird ausgeschnitten und die DNA wird durch ElutipD® Chromatographie gereinigt.
2 ug pFBY24 werden vollständig mit BamHI in CA Puffer geschnitten. Die 5' Phosphatgruppen werden mit 500 Einheiten BAP in BAP Puffer (50 mM Tris(hydrovmethyl)aminomethan, 50 mM NaCl. HCl auf pH 8,0) bei 65ºC für 30 Minuten entfernt, zum eine Selbstligation des Vektors zu vermeiden. Diese Fragmente werden auf einem 0,8% LGT Gel in TAE Puffer aufgetrennt. Die 9,3 kb Bande wird ausgeschnitten und die DNA wird durch ElutipD® Chromatographie gereinigt.
Etwa 20 ng der präparierten Fragmente werden in Gegenwart von 1 mM ATP und Ligationspuffer mit 0,5 Einheiten T4 Ligase für 3 Stunden bei Raumtemperatur zusammenligiert.
Dieses Ligationsgemisch wird zur Transformation von 40 ul kompetenten E. coli DH5αF' Zellen verwendet und diese werden auf 2 YT Platten ausplattiert, die Ampicillin, XgaI und IPTG enthalten. Nach 16 h Inkubation bei 37ºC werden weiße Kolonien gepickt und mittels BamHI und einem SaII / XbaI Doppelverdau einem Minitest unterzogen, um die Anwesenheit und Orientierung der korrekten Inserts zu bestätigen. Das LEU2 Gen ist in derselben Orientierung, wie ampR von pFBY74.
pFBY74 ist ein symmetrisches LEU2 enthaltendes 2 u Plasmid, das die bakteriellen Sequenzen in der Hefe verliert.

Beispiel 22: Konstruktion der Plasmide pMK5x1 und pMK5x2: Zwei symmetrische 2 u Plasmide, die die bakteriellen Sequenzen in der Hefe verlieren und die CUP1p-Hirudinexpressionskassette enthalten

2 ug von Plasmid pFBY4 werden mit EcoRI geschnitten. Das erhaltene DNA Fragment läßt man auf einem präparativen 0,8% Agarosegel laufen, schneidet es aus und reinigt es durch EllutipD® Chromatographie (Schleicher und Schüll, Dassel. Germany). Das Fragment wird anschließend mit 1 Einheit T4 Polymerase in Gegenwart von jeweils 0,05 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP für 30 Minuten bei 37ºC stumpfendig gemacht. Die Polymerase wird bei 65ºC für 10 Minuten hitzeinaktiviert.
Etwa 30 ng des Fragments werden mit 0,4 ptnol eines unphosphorylierten SaII Linkers der Sequenz GGTCGACC und 1 mM ATP mit 0,5 Einheiten 14 Ligase für 3 Stunden bei Raumtemperatur zusammenligiert. Das Ligationsgemisch wird zur Transformation von kompetenten E. coli DH5αF' Zellen (D. Hanahan. J. Mol. Biol. 166 (1983), 557 verwendet und die Zellen werden auf LB Medium mit Ampicillin plattiert. Ampicillin-resistente Kolonien werden gepickt und durch Schneiden ihrer Plasmid DNA mit SaII analysiert, um den SaII Linker in der vorherigen EcoRI Schnittstelle zu zeigen. Das erhaltene Plasmid wird pMK2 genannt.
2 ug pMK2 werden mit BamHI geschnitten. Die 5'-Phoshatgruppen werden mit 500 Einheiten BAP (alkalische Phosphatase vom Rind) in BAP Puffer bei 65ºC für 30 Minuten entfernt. Das Fragment läßt man auf einem präparativen 0,8% Agarosegel laufen, schneidet es aus und reinigt es durch EllutipD® Chromatographie (Schleicher und Schüll. Dassel. Germany). Das Fragment wird anschließend mit 1 Einheit T4 Polymerase in Gegenwart von jeweils 0,05 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP für 30 Minuten bei 37ºC stumpfendig gemacht. Die Polymerase wird bei 65ºC für 10 Minuten hitzeinaktiviert.
2 ug pPFY53 (siehe Beispiel 1) wird mit SaII geschnitten. Das 1,3 kb Fragment, das die CUP1p- Hirudinexpressionskassette enthält, wird auf einem 0,5% Agarosegel abgetrennt, gereinigt und mit T4 Polymerase stumpfendig gemacht, wie dies oben beschrieben ist. Etwa 20 ng jedes der hergestellten Fragmente werden in Gegenwart von 1 mM ATP mit 0,5 Einheiten T4 Ligase für 3 Stunden bei Raumtemperatur zusammenligiert. Das Ligationsgemisch wird zur Transformation von kompetenten E. coli DH5αF' Zellen (D. Hanahan. J. Mol. Biol. 166 (1983), 557) verwendet und die Zellen werden auf LB Medium mit Ampicillin plattiert. Die Ampicillin-resistenten Kolonien werden gepickt und mitttels XbaI analysiert, um das Vorkommen des korrekten Inserts zu bestätigen und die Orientierung zu bestimmen. Die erzeugten Plasmide werden pMK3/1 und pMK3/2 bezeichnet. pMK3/1 enthält die CUP1p-Hirudinespressionskassette in derselben Orientierung, wie das URA3 Gen, während pMK3/2 die jeweiligen Gene in der entgegengesetzten Orientierung enthält.
2 ug von pFBY74 werden mit SnaBI geschnitten. Die 5'-Phosphatgruppen werden mit BAP entfernt und das erhaltene DNA Fragment wird über ein 0,8% Agarosegel und eine ElutipD® Chromatographie gereinigt, wie dies oben beschrieben wurde, 2 ug pMK3/2 werden mit SaII geschnitten. Das 2,6 kb Fragment, das die CUPIp- Hirudinexpressionskassette und das URA3 Gen enthält, wird über ein Gel gereinigt und stumpfendig gemacht, wie dies vorher beschrieben wurde. Jeweils etwa 20 ng des geschnittenen pFBY74 und des pMK3/2 Fragments werden zusammenligiert und wie oben beschrieben in kompetente E. coli DHSaF' Zellen transformiert. Es werden Ampicillin-resistente Kolonien analysieren, indem man ihre Plasmid DNA mit SaII und NcoI verdaut, um das richtige Insert zu bestätigen und die Orientierung zu bestimmen. Die zwei erhaltenen Plasmide werden pMK5x1 und pMK5x2 genannt. Der Unterschied zwischen diesen zwei Plasmiden ist, daß im ersteren die CUP1p- Hirudinexpressionskassette die umgekehrte und im letzten die gleiche Orientierung wie das LEU2 Gen aufweist.

Beispiel 23: Veränderung des Matingtyps von Stamm TR1456

Die Erzeugung eines diploiden Hefestamms erfolgt normalerweise durch Mating von zwei haploiden Stämmen jeweils vom α und a Matingtyp. Um die isogene diploide Version des haploiden Stamms TR1456 mit dem Matingtyp a (siehe Beispiel 5) zu erhalten, muß der andere Matingtyp von Tr1456 über eine Matingtypveränderung hergestellt werden. Der Hintergrund und das Prinzip dieser Methode sind in Herskowitz und Jensen (1991), Methods in Enzymology. Band 194. Seite 132-146 beschrieben.
Der Stamm TR1456 wird mit dem Plasmid pGAL-HO transformiert, der das HO Endonukleasegen unter der Kontrolle des GAL10 Promotors, den URA3 Marker und die CEN4 Funktionen enthält (Herskowitz und Jensen (1991). Methods in Enzymology. Band 194, Seite 132-146). Die Transformation und Selektion auf Hefeminimalmedium, das mit Leucin supplementiert ist und bezüglich Uracil defizient ist, wird wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Einzelne transformierte Hefeklone werden isoliert und ein Klon wird in 20 ml synthetischem Medium angezogen, das sich zusammensetzt aus (g/l):
Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 8,4
L-Asparagin 10
L-Histidin 1
L-Leucin 0,1
Glucose 20
Die Vorkultur wird über Nacht bei 30ºC und 180 Upm angezogen. Anschließend wird die Kultur zwanzigmal im oben beschriebenen Medium verdünnt, das aber nur 0,25% Glucose enthält. Die Kultur wird erneut bei 30ºC und 180 Upm inkubiert und der Glucoseverbrauch mittels Glucoseteststreifen (Diabur-Test 500, Boehringer Mannheim) verfolgt. Wenn die Glucose verbraucht ist, wird Galaktose in einer Endkonzentration von 2% zum Kolben gegeben, um den GAL10 Promotor zu induzieren. Nach 7 h Inkubation bei 30ºC und 180 Upm wird 1 ml der Kultur entnommen und die Zellen werden gewaschen und in 10 ml komplexem Medium resuspendiert, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist, und weiter für 4 Stunden bei 30ºC und 180 Upm inkubiert. Anschließend wird eine Probe der Zellen entnommen, in destilliertem Wasser verdünnt und in einer Konzentration von etwa 200 Zellen pro Platte auf dem folgenden komplexen Medium ausplattiert (g/l):
Bacto Hefeextrakt 20
Bacto Pepton 10
Bacto Agar 20
Glucose 20
Die Platten werden bei 30ºC für 2 Tage inkubiert, bis die Kolonien eine Größe von etwa 2 mm erreichen.
Die Kolonien werden dann auf den Zelltyp (a. α oder a/α) durch den Standardtest für die Matingfaktorbildung ("Halotest") getestet. Das Verfahren ist ausgiebig von Sprague (1991). Methods in Enzymology, Band 194. Seite 77-93 beschrieben.
Acht Kolonien, die den α-Matingyp zeigen, werden gepickt und jeweils in 5 ml des folgenden komplexen Mediums (g/l) gepickt:
Bacto Pepton 20
Bacto Hefeextrakt 10
Glucose 20
Die Zellen werden für 16 Stunden bei 30ºC und 180 Upm angezogen. Eine Probe wird entnommen, in destilliertem Wasser verdünnt und in einer Konzentration von etwa 200 Zellen pro Platte auf dem oben beschriebenen komplexen Medium ausplattiert. Die Platten werden bei 30ºC für 2 Tage inkubiert, bis die Kolonien eine Größe von etwa 2 mm erreichen. Diese Kolonien werden erneut auf den α-Matingtyp mittels des "Halotests" überprüft. Gleichzeitig werden die Kolonien auf Minimalmedium gestempelt, das mit Leucin supplementiert und bezüglich Uracil defizient ist, wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist. Die Kolonien, die das pGAL-HO Plasmid verloren haben, können auf diesem Medium nicht wachsen, da ihnen der URA3 Marker fehlt.
Eine Kolonie, die wiederholt den α-Matingtyp zeigt und das pGAL-HO Plasmid verloren hat, wird gepickt und erneut auf komplexem Medium ausgestrichen. Der Stamm stellt den isogenen Gegenpart mit α-Matingtyp von TR1456 dar und wird GPY11 genannt.

Beispiel 24: Diploidenbildung mittels der Stämme TR1456a und GPY11α

Flächige Ausstriche vom Stamm TR1456 und Stamm GPY11 werden sorgfältig mit einem Zahnstocher auf einer YPD Platte gemischt, die besteht aus (g/l):
Bacto Pepton 20
Bacto Hefeextrakt 10
Glucose 20
Bacto Agar 10
Die Platte wird bei Raumtemperatur inkubiert, um das Mating der Zellen zu erlauben. Nach etwa 12 Stunden wird ein Inokulum des Matinggemisches mit destilliertem Wasser verdünnt und ein Aliquot wird auf eine YPD Platte als einzelner Ausstrich aufgetragen. Die Platte wird einer Mikromanipulation mittels eines CIT Alcatel Micromanipulators zusammen mit einem Leitz Mikroskop (Vergrößerung 250 fach) unterzogen. Zygoten sind mikroskopisch leicht durch ihre charakteristische Form erkennbar. 10-20 potentielle Zygoten werden vom Matinggemisch auf der YPD Platte abgetrennt. Die Platte wird dann bei Raumtemperatur für 2-3 Tage inkubiert, bis die Zygoten Kolonien gebildet haben. Der Diploidenstatus der Zygoten wird durch Ausführen des "Halotests" für die Matingpheromonbildung bestätigt, wie dies oben beschrieben ist. Die diploiden Zellen sekretieren weder einen α-Faktor noch einen α-Faktor.
Es wird eine diploide Kolonie ausgewählt und mit GPY 18 bezeichnet. Sie repräsentiert die isogene diploide Version des Stamms TR 1456.

Beispiel 25 Desulfatohirudinbildung durch die Stämme TR1456 und GPY18, die mit den Plasmiden pPFY56 oder pMK5x2 transformiert sind und in Schüttelkulturen mit komplexem Medium angezogen werden

Die Zellen von Stamm TR1456 und GPY18 werden jeweils mit den Plasmiden pPFY56 (Beispiel 1) und pMK5 · 2 (Beispiel 22) transformiert, wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist.
Die Stämme TR1456 / pPFY56, TR1456 / pMK5x2, GPY18 / pPFY56 und GPY18 / pMK5x2 werden jeweils in einer Vorkultur (10 ml. Zusammensetzung in Beispiel 23 beschrieben) für 72 Stunden bei 28ºC und 250 Upm angezogen. Das Medium der Hauptkultur (50 ml) ist das in Beispiel 7 beschriebene, außer daß Kupfersulfat in einer Konzentration von 1 mM zugegeben wird. Die Hauptkultur wird mit den Zellen aus der Vorkultur mit einer OD600 von 0,1 beimpft. Die Kulturen werden bis 72 Stunden bei 28ºC und 250 Upm angezogen. Nach der Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die Menge an Desulfatohirudin in den Überständen wird durch HPLC gemessen, wie dies in EP 0 340 170 A beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.

Tabelle 8

Desulfatohirudinbildung (mg/l)

Unter den Bedingungen des Experiments zeigt der diploide Stamm GPY18 höhere Hirudinmengen im Vergleich zum haploiden Elternstamm TR1456. Die Transformation mit dem Plasmid pMK5x2 führt zu höheren Hirudintitern entweder im haploiden oder im diploiden Stamm im Vergleich zu Plasmid pPFY56.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Die folgenden Mirkoorganismenstämme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b. D-3300 Braunschweig hinterlegt (Hinterlegungsnummern und Hinterlegungsdaten sind angegeben):

Sequenzliste

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder:
(A) Name: Ciba-Geigy AG
(B) Straße: Klybeckstr. 141
(C) Stadt: Basel
(E) Land: Schweiz
(F) Postleitzahl (ZIP): 4002
(G) Telefon: +41 61 69 11 11
(H) Telefax: +41 61 696 79 76
(I) Telex: 962 991
(A) Name: UCP Gen-Pharma
(B) Straße: Solothurnstraße 24
(C) Stadt: Kirchberg
(E) Land: Schweiz
(F) Postleitzahl (ZIP): 8044
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren
(iii) Anzahl an Sequenzen: 7
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Diskette
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25 (EPO)
(v) Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: EP 928106681.4
(B) Anmeldedatum: 4. September 1992
(2) Information für SEQ ID Nr. 1
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1082 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Sonstiges Merkmal
(8) Lage: 1...6
(D) Andere Information: Funktion = "BamHI Linker"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Promotor
(B) Lage: 7.432
(D) Andere Information: Standardname = "CUP1 Promotor"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Sonstiges Merkmal
(B) Lage: 433...441
(D) Andere Information: Funktion = "EcoRI Linker"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Signalpeptid
(B) Lage: 442...492
(D) Andere Information: Standardname = "PHO5 Signalsequenz"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Reifes Peptid
(B) Lage: 493.690
(D) Andere Information: Produkt = "Desulfatohirudin HV1"
Standardname = "HV1"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Terminator
(B) Lage: 691...1068
(D) Andere Information: Standardname = "PHO5 Transkriptionsterminator"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Sonstiges Merkmal
(B) Lage: 1069...1082
(D) Andere Information: Funktion = "SaII Linker"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 442...690
(D) Andere Information: Produkt = "Primärtranskript"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1
(2) Information für SEQ ID Nr. 2
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 82 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 2
(2) Information für SEQ ID Nr. 3
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 28 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1...28
(D) Andere Information: Produkt = "PCR Primer"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 3
GGATCCATTA CCGACATTTG GGCGCTAT
(2) Information für SEQ ID Nr. 4
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Lange: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(m) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1...0
(D) Andere Information: Produkt = "PCR Primer"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 4
GAATTCACAG TTTGTTTTTC TTAATATCTA
(2) Information für SEQ ID Nr: 5
(t) Sequenzeigenschaften
(A) Lange: 27 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(u) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1...27
(D) Andere Information Produkt = "PCR Primer"
(xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr: 6
GATATCGATC GTGAAAGAAT ATTTGCT
(2) Information für SEQ ID Nr: 5
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Lange: 29 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(u) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1...29
(D) Andere Information Produkt = "PCR Primer"
(xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr: 6
GATATCATGA GGATGATGAC AAAGAAGAC
(2) Information für SEQ ID Nr: 7
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 26 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Anderes Merkmal
(B) Lage: 1...26
(D) Andere Information: Produkt = "PCR Primer"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 7
CTGATAATCA GTGAATTCAC AGAATG

Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren

Zusammenfassung der Erfindung

Es wird ein neues Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Desulfatohirudin durch eine transformierte Hefe bereitgestellt. Das Verfahren verwendet eine Expressionskassette, die den CUP1 Promotor der Hefe enthält. Die Erfindung betrifft auch die transformierten Hefestämme, neue Expressionsvektoren und Verfahren zu deren Herstellung.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Desulfatohirudin, gekennzeichnet durch Kultivierung eines Hefestamms in einem komplexen Kulturmedium, der einen Hefeexpressionsvektor enthält, welcher eine Desulfatohirudinexpressionskassette umfaßt, die besteht aus dem Hefe CUP1 Promotor, der mit einer ersten DNA Sequenz funktionsfähig verbunden ist, die für ein Hefesignalpeptid kodiert, das im richtigen Leserahmen an eine zweite DNA Sequenz gebunden ist, die für Desulfatohirudin kodiert, und eine DNA Sequenz, die Hefetranskriptionsterminationssignale enthält, und Isolierung des gebildeten Desulfatohirudins aus der Kulturbrühe, worin das Kulturmedium zum Beimpfungszeitpunkt mit einer den CUP1 Promotor induzierenden Menge eines Kupfersalzes versetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Desulfatohirudin aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Desulfatohirudinvariante HV1, HV2, HV3 und einem Derivat einer dieser Desulfatohirudinvarianten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung der Desulfatohirudinvariante HV1.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefestamm ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefestamm ein cir&sup0; Stamm von Saccharomyces cerevisiae ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefestamm einfach oder mehrfach Protease-defizient ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Hefestamm in der Carboxypeptidaseaktivität yscα und yscY defizient ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefestamm 0-16, insbesondere 2-6 Kopien des chromosomalen CUP1 Gens enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefestamm 1-3 zusätzliche Kopien des chromosomalen ACE1 Gens enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefestamm eine Ploidie von größer oder gleich zwei aufweist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Hefestamm diploid ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin der CUP1 Promotor des Hefeexpressionsvektors das in SEQ ID Nr. 1 gezeigte 0,4 kb BamHI-EcoRI Fragment ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA Sequenz des Hefeexpressionsvektors, die für ein Signalpeptid kodiert, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Signal- und Präprosequenzen der Hefegene Invertase, α-Faktor, Pheromonpeptidase (KEX 1), "Killertoxin" und reprimierbare säure Phosphatase (PHO5) und der Glucoamylasesignalsequenz von Aspergillus awamori ausgewählt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA Sequenz des Hefeexpressionsvektors, die für ein Signalpeptid kodiert, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Signalsequenz des Invertase- und PHO5-Gens der Hefe besteht.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA Sequenz des Hefeexpressionsvektors, die die Hefetranskriptionsterminationssignale enthält, die 3' flankierende Sequenz eines Hefegens ist, das die geeigneten Signale für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefeexpressionsvektor die vollständige Zweimikron-DNA enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefeexpressionsvektor 1 bis 3 zusätzliche Desulfatohirudinexpressionskassetten enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefeexpresionsvektor eine zusätzliche ACE1 Transkriptionsaktivatorexpressionskassette enthält.

19. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hefeexpressionsvektor eine Symmetrie zeigt und bakterielle Sequenzen fehlen.