DE3854256T2

DE3854256T2 - Expressionsvektor für hefe.

Info

Publication number: DE3854256T2
Application number: DE3854256T
Authority: DE
Inventors: Robert Daves; Robert Yocum
Original assignee: Omnigene Inc
Current assignee: Omnigene Inc
Priority date: 1987-06-06
Filing date: 1988-06-06
Publication date: 1996-02-01
Anticipated expiration: 2008-06-07
Also published as: EP0316444A4; WO1988009795A1; EP0316444A1; EP0316444B1; ATE125815T1; DE3854256D1

Description

Diese Erfindung betrifft die gentechnische Behandlung von Hefe und die Verwendung von bestimmten Promotoren, um die Ergebnisse solcher gentechnischen Behandlungen zu verbessern.
Eines der Ziele der gentechnischen Behandlung von Hefe ist die Gestaltung von Hefestämmen, die große Mengen von gewünschten Proteinen oder Enzymen herstellen. Ein bestimmtes Protein oder Enzym kann als eigenständiges Produkt von Interesse sein (z. B. menschliches Alpha-Interferon), oder ein Protein oder Enzym ist von Interesse, weil es die Herstellung von gewünschten Metaboliten durch die Wirtshefe ermöglicht (z. B. Ethanol oder eine Aminosäure) oder weil es die Herstellung von Lebensmittel- oder Getränkeprodukten ermöglicht (z. B. Bier, Wein, Brot oder Spirituosen). Weiterhin ist es inzwischen Routine, in Hefen ein bestimmtes Niveau der Expression von jedem gewünschten Gen in das dazu korrespondierende Protein zu erreichen, es ist aber häufig schwierig, ein Expressionsniveau zu erreichen, das hoch genug ist, um ein profitables Verfahren zu erlauben.
Der Ausdruck "Promotor", wie er in Verbindung mit der Expression von Hefegenen verwendet wird, hat eine Bedeutung, die über diejenige dieses Ausdrucks hinausgeht, wenn er in Verbindung mit E. coli verwendet wird, dem Organismus, bei dem Promotoren als erstes beschrieben wurden. Der Ausdruck "Promotor", wie er hier benutzt wird, betrifft jede DNA-Sequenz, die, wenn sie mit einem Strukturgen in der Wirtshefezelle assoziiert ist, eine Steigerung für dieses Strukturgen in einem oder mehreren von 1. Transkription, 2. Translation oder 3. mRNA-Stabilität bewirkt, verglichen zu Transkription, Translation oder mRNA-Stabilität in Abwesenheit der Promotorsequenz, unter vergleichbaren Wachstumsbedingungen (z. B. in Anwesenheit der Induktorsubstanz, wenn der Promotor induzierbar ist). "mRNA-Stabilität" bedeutet längere Halbwertzeiten der mRNA.
Verschiedene starke Promotoren sind im Stand der Technik bekannt und zeigten sich nutzvoll bei der Expression von heterologenen Genen in Hefen. (Ein "heterologes Gen" meint jedes Gen, das nicht in natürlicher Weise funktionell assoziiert ist mit einem vorhandenen Promotor, unabhängig davon, ob das Gen von einer Hefe stammt oder nicht.) Zum Beispiel sind Promotoren, die natürlicherweise mit den Saccharomyces cerevisiae-Genen TPI1 (Triosephosphat-Isomerase), PGK1 (Phosphoglycerase-Kinase), PYK1 (Pyruvat-Kinase) TDH1, TDH2 und TDH3 (Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase oder Triosephosphat-Dehydrogenase) und ENO1 (Enolase 1) assoziiert sind, als nutzvoll zur Expression von heterologenen Genen in Hefen beschrieben (Kawasaki, US-Patent 4,599,311; Kingsman und Kingsman, US-Patent 4,615,974; Burke et al., europäische Patentanmeldung 84 300 091.0; und Nunberg et al., WIPQ-Patentanmeldung 84/02921). Alle oben beschriebenen Gene codieren Enzyme, die am glycolytischen Stoffwechselpfad der Hefe beteiligt sind und die zu den am häufigsten abundanten Enzymen im Hefecytoplasma gehören (Brousse et al. (1985) "Applied and Environmental Microbiology" 50: 951).
Einige Hefestämme haben zwei unterschiedliche Enzyme, welche als Enolasen im glycolytischen Stoffwechselpfad fungieren. In S. cerevisiae haben diese zwei Enzyme die Namen Enolase 1 und Enolase 2, welche codiert sind durch die Gene ENO1 und ENO2, bzw. jedes von ihnen ist assoziiert mit ihren eigenen Promotorsequenzen (Holland et al. (1980) J. Biol. chem. 257: 7181 und Cohen et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6: 2287) . In S. cerevisiae, die Glucose als Kohlenstoffquelle nutzt, ist die Enolase 2 stärker abundant als die Enolase 1. So wie hier verwendet, bezieht sich "Enolase 2" auf die am meisten abundante Enolase von allen Hefestämmen, die Glucose als Kohlenstoffquelle verwenden, und "ENO2 Promotor" bezieht sich auf eine Promotorsequenz, die natürlich assoziiert ist mit dem Gen, das die am meisten abundante Enolase in einem Hefestamm, der Glucose als Kohlenstoffquelle nutzt, codiert.
Es wurden einige Versuche gemacht, Hybridpromotoren von Hefen herzustellen. Beispielsweise beschreibt Kingsman et al., EPO 0 258 067, Arbeiten, bei denen die Substitution von der PGK UAS mit der GAL1,10 UAS die Galactoseregulation auf den PGK-Promotor überträgt, ist aber der Einschub der GAL1,10 UAS an einer Position stromaufwärts oder stromabwärts der PGK UAS, so daß beide PGK und GAL1,10 UAS's in der Promotorsequenz vorhanden sind, führt dies zu keinen Auswirkungen in der Galactoseregulation der PGK-Genexpression.

Zusammenfassung der Erfindung

Im allgemeinen ist die Erfindung durch eine DNA-Sequenz, die einen Hefe-ENO2-Promotor enthält, der funktionell verbunden ist mit einem heterologen Gen, gekennzeichnet und durch eine Hefezelle, die mit dieser Sequenz transformiert wurde. ("Funktionell verbunden", bedeutet, daß Transkription, Translation oder mRNA-Stabilität des heterologen Gens durch den ENO2-Promotor beeinflußt wurde.) Im allgemeinen ist die DNA-Sequenz dieser Erfindung in einem Plasmidvektor enthalten, der verwendet wird, um eine Wirtshefezelle zu verändern, die gezüchtet wird, um ein Protein oder Enzym, das durch das heterologe Gen codiert wird, herzustellen. Ein bevorzugtes Enzym ist die Glucoamylase, welche der Wirtshefezellen (vorzugsweise der Gattung Saccharomyces) ermöglicht, Polysaccharide zu verwenden und somit die Wirtshefezellen nutzvoll für die Produktion von kohlehydratarmen "Light"-Bieren macht, wie von Yocum et al., US 864,785, beschrieben, übertragen auf denselben Anmelder wie der vorliegenden Anmeldung und hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Die ENO2-Promotoren können ein hohes Expressionsniveau der heterologen Gene in den Wirtshefezellen bewirken. Zusätzlich hat die ENO2-Promotorsequenz in S. cerevisiae den Vorteil, daß sie steuerbar ist: Die Expression kann um das 20fache gehemmt werden, dadurch, daß die Hefe auf einer nicht fermentierbaren Kohlenstoffquelle, wie Glycerol, Lactat oder Ethanol wächst (Cohen et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6: 2287). Folglich kann in dem Fall, daß das heterologe Gen ein Protein oder Enzym codiert, das das Wachstum der Hefen inhibiert, die Expression dieses Gens gehemmt werden, um eine Anreicherung der Zellmasse durch ein Zellwachstum auf einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle zu erreichen, und dann die Expression des gewünschten Gens durch Hinzugabe von Glucose zum Wachstumsmedium herbeigeführt werden.
Die Erfindung ist weiterhin durch eine DNA-Sequenz gekennzeichnet, die einen Hybridhefepromotor enthält, der funktionell mit einem heterologen Gen verbunden ist, als auch durch eine Wirtshefezelle, die mit dieser Sequenz umgewandelt ist. Der Hybridhefepromotor enthält die ENO2-Promotor-DNA, die funktionell mit einer DNA- Sequenz verbunden ist, die eine erste UAS enthält, welche aus dem Hefepromotor stammt. Vorzugsweise enthält die ENO2-Promotor-DNA eine ENO2-TATA-Region und eine ENO2 UAS, wobei die erste UAS von einem Hefepromotor gewonnen werden könnte, der ein anderer als der ENO2-Hefepromotor ist, oder, alternativ, von einem ENO2-Promotor.
Die erste UAS ist zwischen der ENO2 UAS und der ENO2-TATA-Region lokalisiert. Besonders vorzugsweise ist die erste UAS, die von einem nicht ENO2-Hefepromotor stammt, eine GAL1,10 UAS, die von der GAL1,10-DNA-Sequenz von S. cerevisiae herstammt. In allen vorgegebenen Hefestämmen, ist die GAL1,10 UAS eine DNA-Sequenz, die sich zwischen dem GAL1-Hefegen, das die Galactokinase codiert, und dem GAL10-Hefegen, das die UDP-Galactose-Epimerase codiert, befindet. Die GAL1,10 UAS reguliert beide Gene, die divergent transkribiert werden. GAL1,10 UAS's aus anderen Hefearten, besonders von Saccharomyces-Hefen, wie S. carlsbergensis, können ebenso verwendet werden. Die DNA-Sequenz der S. carlsbergensis Gall,10 UAS (Citron et al. (1984) J. Bact. 158: 269) ist ungefähr zu 95% homolog mit der DNA-Sequenz der GAL1,10 UAS von S. cerevisiae.
Die erfindungsgemäßen Hybridhefepromotoren sind nutzvoll, um eine hohe heterologe Genexpression in den Wirtshefezellen zu erreichen, und um eine Regulation der Hybridpromotoren durch unterschiedliche Kohlenstoffquellen zu gestatten; z. B. wird der ENO2-Promotor normalerweise durch Glucose angeregt, der Hybrid ENO2-GAL1,10- Promotor dagegen durch Glucose gehemmt und durch Galactose angeregt.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und durch die Ansprüche deutlich.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Zeichnungen werden als erstes beschrieben.

Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Plasmides, pRD158, der das Glucoamylasegen enthält, das sich unter der Transkriptionskontrolle durch den vorbekannten TPI1- Promotor befindet und die Abwandlung des den ENO2-Promotor enthaltenen Plasmids, pRD170, von der Erfindung aus pRD158.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids pRD219, einer Abwandlung von pRD170, das die S. diastaticus DEX4-Signalpeptid codierende Sequenz enthält; von pSV30, einer Abwandlung von pRD219, das die GAL1,10 stromaufwärts aktivierende Sequenz, eingefügt in den ENO2-Promotor, enthält; und pSV31, das identisch mit pSV30 ist, mit der Ausnahme, daß die GAL1,10 stromaufwärts aktivierende Sequenz in der entgegengesetzten Orientierung eingesetzt ist.
Fig. 3 ist die DNA-Sequenz des Bg1II-Fragments, das die GAL1,10 stromaufwärts aktivierende Sequenz enthält, welche in pRD219 eingefügt wurde, um pSV30 und pSV31 zu erhalten.

Aufbau von pRD170

Der erste Schritt zum Aufbau von pRD170 (Fig. 1), in dem sich das A. niger-Glucoamylasegen unter der Transkriptionskontrolle des ENO2-Promotors befindet, war die Isolierung des ENO2-Gens von Saccharomyces cerevisiae. Als nächstes wurde der ENO2-Promotor isoliert und ersetzte den TPI1-Promotor in pRD158. Als letztes wurde der daraus resultierende Vektor, pRD170, verwendet, um die S. cerevisiae-Wirtszellen zu transformieren. Im einzelnen wurden diese Schritte wie folgt durchgeführt. (Alle Manipulationen an DNA, Escherichia coli und S. cerevisiae wurden mit bekannten Routinetechniken durchgeführt (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press; und Sherman et al. (1981) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Alle angegebenen DNA-Koordinaten sind relativ zu den ATG- Startcodon der betreffenden Codesequenz, wobei das A des ATG- Startcodons als +1 bestimmt wurde.)

Klonierung des ENO2-Gens

Basierend auf der veröffentlichten Sequenz des S. cerevisiae ENO2- Gens, wurde ein Einzelstrang Oligonukleotid von 30 Basen (+1 bis +30 des ENO2-Gens), mit einem "Applied Biosystems model 380A", entsprechend den Empfehlungen des Herstellers, synthetisiert. Die Sequenz des synthetischen Oligonukleotids ist
Dieses 30-mer wurde mit ³²P an seinem 5'-Ende gelabelt und als Hybridisierungsprüfer verwendet, um Plasmide, die das ENO2-Gen aus einer genomen S. cerevisiae-Genbank enthalten, die im Vektor YEP24 hergestellt wurde, nachzuweisen (Carlson und Botstein (1982) Cell 28: 145). Die Kolonie-Hybridisierungsmethode wurde angewandt, um die E. coli Replicakolonien, die das gewünschte Plasmid enthalten, nachzuweisen. Die Anwesenheit des ENO2-Gens und -Promotors in den isolierten Plasmiden wurde dadurch belegt, daß die Anwesenheit von DNA Restriktionsfragmenten, wie sie aus der veröffentlichten DNA- Sequenz vorhergesagt wurden und dadurch, daß die Überproduktion eines Proteins von der Größe der Enolase 2 durch S. cerevisiae- Zellen, die vom Plasmid verändert wurden, bewiesen wurde. Ein besonderes Plasmid, das aus der Carlson-Genbank isoliert wurde und das ENO2-Gen enthält, wurde als pRD160 bezeichnet.

Isolierung des ENO2-Promotors

Aus der Literatur war bekannt, daß DNA-Sequenzen, für die ENO2- Promotoraktivität benötigt werden, sich zwischen einer SalI-Position bei ungefähr -600 Basenpaaren und dem Beginn der ENO2-Codesequenz befinden (Cohen et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6: 2287). Deshalb wurde das 750 Basenpaare umfassende SalI bis HindIII- Fragment, das die ENO2-Promotoraktivität und einige der ersten Basen der ENO2-Codesequenz von pRD160 enthält, durch Acrylamid- Gelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment wurde mit DdeI partiell verdaut und das 550 Basenpaare umfassende SalI bis DdeI (Teil-)fragment wurde abermals durch Acrylamid-Gelelektrophorese von anderen Fragmenten gereinigt. Dieses SalI bis DdeI (Teil)fragment wurde zusammen mit einem synthetischen DNA-Doppelstrangfragment verwendet, um den ENO2-Promotor mit einem heterologen Gen, dem Aspergillus niger Glucoamylasegen, wie unten beschrieben, zu rekonstituieren.
Expression des heterologen Gens vom ENO2-Promotor.
Entsprechend Abb. 1, substituierte, wie unten beschrieben, der S. cerevisiae ENO2-Promotor, den TPI1-Promotor im Plasmid pRD-158. (Folgende Abkürzungen werden in der Abbildung für die Restriktionsschnittstellen verwendet: A, XbaI; C, ClaI; E, EcoRI; G, BglII; H, HindIII; L, BclI; M, XmaI; X, XhoI; S, SalI. Klammern zeigen die früheren Schnittstellen an, die während des Aufbaus zerstört wurden. Im Uhrzeigersinn enthält pRD158 folgende DNA- Fragmente:
(1) HindIII bis XmaI, das S. cerevisiae URA3-Gen; (2) XmaI, XhoI, XmaI, ein synthetisches Zwischenstück mit der Sequenz
das eine XhoI-Schnittstelle zwischen zwei XmaI-Schnittstellen schafft; (3) XmaI bis BglII, dem S. cerevisiae TPI1-Promotor, der sich von der natürlich vorkommenden MstII-Schnittstelle (ausgefüllt) bei -638 bis zum T-Rest bei -44 erstreckt, gefolgt von einem synthetisches DNA-Fragment anschließt mit der folgenden Sequenz:
(4) BglII bis XbaI, einer DNA-Kopie des A. niger Glucoamylasegens (Boel et al. (1984) EMBO Jornal 3: 1097). Die BglII- Schnittstelle wurde, ohne die natürliche Aminosäurensequenz zu verändern, künstlich eingefügt, und die XbaI-Schnittstelle wurde bei der natürlichen BclI-Schnittstelle künstlich eingefügt (Boel et al., id.); (5) XbaI bis HindIII, ein 90 Basenpaar umfassendes Fragment, das den TPI1 Transcriptionsterminator enthält; (6) HindIII bis (EcoRI), in dem Hauptbestandteil von pBR322, mit einer 275 Basenpaare SalI bis BamHI Deletion, die eine SalI- Schnittstelle, aber keine BamHI-Schnittstelle stehen läßt, und die Tetracyclinresistenz aufhebt; (7) (EcoRI) bis (EcoRI), ein ungefähr 1000 Basenpaare umfassendes (XbaI) bis (PstI)-Fragment, das den Replikationsursprung des endogenen 2 Micron Ringplasmids von S. cerevisiae enthält; (8) (EcoRI) bis (ClaI), das kurze EcoRI bis ClaI-Fragment von pBR322; (9) (ClaI) bis (ClaI), ein ungefähr 1200 Basenpaare umfassendes (ClaI) bis (BamHI)-Fragment, das CEN3, den Centromeren des Chronosoms III von S. cerevisiae, enthält; (10) (ClaI) bis HindIII, das kurze ClaI bis HindIII- Fragment von pBR322.
Das XhoI bis BglII-Fragment von pPRD158, welches den TPI1-Promotor enthält, wurde mit dem oben beschriebenen 550 Basenpaar umfassenden (SalI) bis (DdeI) (Teil-)fragment substituiert, zusammen mit einem synthetischen 60/61-Mer, das kohärente Enden enthält, die kompatibel sind mit den DdeI und BglII kohärenten Enden; das 60/61-Mer hat die Sequenz:
Das daraus resultierende Plasmid, das den ENO2 Promotor von S. cerevisiae enthält, der über das synthetische Fragment korrekt mit dem Glucoamylasegen verknüpft ist, wurde als pRD170 bezeichnet. pRD 170 wurde verwendet, um den S. cerevisiae-Stamm BWG 1-7a (Mata. leu 2-3, leu 2-112, his 4-519, ade 1-100. ura 3-52) (Guarente und Hoar (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7860) zu URA3+ zu transformieren. Die Transformanten wuchsen bis zur Sättigung in einem minimal selektiven Medium, das 2% Glucose enthielt (bis die gesamte Glucose verbraucht war), die Kulturüberstände wurden überprüft, indem eine Mixtur aus 0,5 ml Überstand, 0,1 ml 1,0 M Natriumcitrat, pH 5,0, 0,2 ml 5%ige Difco-lösliche Stärke und 0,3 ml Wasser bei 50ºC zwischen 0,2 und 12 Stunden inkubiert wurden. In entsprechenden Zeitabständen wurde aus jeder Probe ein 25 Mikroliter Aliquot, mit einem Yellow-Springs-Instruments Glucose Analyzer, entsprechend den Merstellerangaben, auffreigesetzte Glucose überprüft. Wie in diesem Test gemessen, zeigen die pRD170- transformierten Zellen eine hohe Glucoamylaseproduktion.

Promotorelemente, die Auswirkungen auf die Expression der heterologen Gene haben

In S. cerevisiae, der am besten untersuchten Hefe, ist es im allgemeinen der Fall, daß ein DNA-Fragment, das eine Sequenz von ungefähr -800 bis +1 enthält, (relativ zum A des ATG des Startcodons des assoziierten Gens), die Transcription und Translationsinitiation unterstützt ebenso wie die mRNA-Stabilisation, wenn das Fragment durch Ligierung mit einer heterologen Codesequenz verbunden ist. Normalerweise enthalten solche Promotorfragmente Sequenzen, die den assoziierten Genen nicht nur die Fähigkeit übertragen, die Genexpression herbeizuführen, sondern auch Sequenzen (sogenannte Regulationssequenzen), die die Regulation des Expression beeinflussen.
Zusätzlich können die Regulationssequenzen manchmal stromabwärts von +1 gefunden werden, ungefähr bis +230. In einigen gut untersuchten Hefepromotoren ist die Regulationssequenz von dem eigentlichen Punkt (oder Punkten), an dem die mRNA-Transcription beginnt ("Initiationspunkte"), durch ungefähr 100 bis 400 Basenpaare getrennt. (Dies steht im Gegensatz zu der Situation in E. coli, wo sich die Regulationssequenz üblicherweise in unmittelbarer Nähe (innerhalb ungefähr 20 Basenpaaren) zu den Initiationspunkten befinden.) In Hefen, wenn sich eine Regulationssequenz stromaufwärts von den Initiationspunkten befindet, wird dies UAS (upstream activation sequence) genannt (siehe auch Guarente et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7410). Die UAS hat üblicherweise eine Länge zwischen ungefähr 15 Basenpaaren und 120 Basenpaaren und liegt wie oben erwähnt häufig zwischen -800 und den Transcriptionsinitiationspunkten. Anders ist die Situation bei E.coli, der exakte Abstand zwischen der UAS und den Initiationspunkten ist nicht kritisch, da es bekannt ist, daß die UAS's zehn oder auch hunderte von Basenpaaren relativ zu den Transcriptionsinitiationspunkten in jeder Richtung verschoben sein können, ohne die UAS- Aktivität aufzuheben. Andere Sequenzen, von denen man sich denken könnte, daß sie eine Rolle in der Expression von Genen in Hefe spielen, sind 1) die sogenannte "TATA"- oder "TATAA"-Sequenz (welche in der S. cerevisiae ENO2 bei -180 bis -176 lokalisiert ist), 2) die Sequenz CACACA oder CATACA oder eine engverwandte Sequenz, die zwischen den Initiationspunkten und +1 von vielen hochexpressierten Hefengen gefunden wird (-12 bis -7 in der S. cerevisiae ENO2), 3) die Sequenz an den Initiationspunkten (in vielen Hefegenen ist die Transcription an einem A-Rest initiiert), und 4) die Sequenz, die das ATG Startcodon umgibt. Viele hochexpressierte Saccharomyces-Gene haben ein A bei -3 und ein G bei +4, das G ist statistisch unterrepräsentiert in der Region stromaufwärts von ATG (-1 bis ungefähr -20). In Hefe ist, ausgenommen von "TATA", keine übereinstimmende Sequenz für Promotoren oder ribosomen Bindungsstellen wie in E. coli. Weiterhin scheint der genaue Freiraum zwischen den Sequenzbestandteilen nicht kritisch zu sein, da die Distanz zwischen "TATA" und den Initiationspunkten variieren kann von ungefähr 25 bis 100 Basenpaaren. Alle von den oben erwähnten Promotorbestandteilen können Einfluß auf die Transcription, Translation oder mRNA-Stabilität haben. Aufgrund dieser Tatsache kann man Vorteile der ENO2-Promotoren dieser Erfindung erhalten, durch die Verwendung von Teilen der oben beschriebenen ENO2-Sequenz des pRD170 in Kombination mit anderen Promotorbestandteilen, die aus anderen Quellen erhalten werden. Daß solche Hybridpromotoren vorteilhaft hergestellt und verwendet werden können, wurde im Fall von anderen Hefepromotoren, wie im folgenden, bewiesen.
Wie mit lacZ Verschmelzungen gemessen (Yocum et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 1985), ist ein vollständig induzierter GAL10-Promotor ist ungefähr doppelt so stark wie ein vollständig induzierter CYC1-Promotor (1800 gegenüber 900 Einheiten). Jedoch ein Hybridpromotor, der die GAL10 UAS für die CYC1 UAS substituiert, aber die drei anderen Bestandteile ("TATA", Initiationspunkte und ATG- Region) des CYC1-Promotors behält, war, wenn er vollständig induziert wird, fast zweimal so stark wie der GAL10-Promotor (3400 Einheiten). Aus diesen Daten kann man folgern, daß die vollständige induzierte GAL10 UAS effektiver ist als die vollständig induzierte CYC1 UAS, daß aber die anderen drei Bestandteile von CYC1 wirkungsvoller sind als die analogen Sequenzen von GAL10, wenigstens in dem besonderen Zusammenhang mit der Expression der heterologen lacZ-Verschmelzung.
Folglich enthält die vollständige ENO2-Promotorregion von -598 bis +1, wie oben kloniert und verwendet zur Expression eines heterologen Gens, verschiedene kleinere Bestandteile, die nützlich sein können in Verbindung mit anderen Promotorbestandteilen aus anderen Promotoren. Zum Peispiel, die ENO2 UAS ist bekanntlich zwischen einer SalI-Position bei -598 und ungefähr -456 gelegen. Dort ist Bcli-Position bei -315 und eine BstXI-Position bei -405. Folglich kann die ENO2 UAS (selbst ein "Promotor" gemäß der hierin verwendeten Definition) einfach erhalten werden auf einem SalI bis BclI oder BstXI-Fragment und verwendet werden, um Hybridpromotoren herzustellen. Zum Beispiel, der TPI1-Promotor hat SphI- und MstII- Positionen bei -225 bzw. -638, welche die TPI1 UAS umgeben. Der ENO2-Promotor kann ersetzt werden für die TPI1 UAS durch Bindung der ENO2-UAS (nach Abstumpfung der Enden) in die SphI und MstII- Lücke, wie oben vorgeschlagen (nach Abstumpfung der Enden). Ähnlich hat das S. diastaticus DEX1-Gen (Yamashita et al. (1985) J. Bact. 161: 567) eine Sau3A-Position bei -92, die mit der Bcl1- Position des ENO2-Promotors verbunden werden kann, um einen Hybrid-ENO2-DEX1-Promotor zu ergeben.
Umgekehrt kann, nach Entfernung der ENO2 UAS von einem geeigneten Plasmid, wie pRD170 durch Schneiden mit SmaI und BclII, eine neue UAS mit wünschenswerten Regulationseigenschaften (zum Beispiel die S. cerevisiae GAL1,10 UAS) eingeführt werden (Guarente et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 7410), um einen Hybridpromotor zu ergeben, der die "TATA", die Initiationspunkte und die ATG- Startcodonregion des ENO2-Promotors nutzt. Andere geeignete UAS's sind ebenso nützlich in Hybridpromotoren; zum Beispiel die S. carlsbergensis GAL1,10 UAS (Citron et al., s.s.o.). Es ist ebenso möglich, einen Hybridpromotor aufzubauen, der zwei oder mehr ENO2 UAS's enthält, oder eine ENO2 UAS plus eine TPI1 UAS, u.s.w..

Aufbau des ENO2-GAL1,10 Hybridoromotors

Ein ENO2-GAL1,10 Hybridpromotor wurde aufgebaut, beginnend mit dem Plasmit pRD219 (Abb. 2), welches den ENO2-Promotor verschmolzen mit einem Glucoamylasegen enthält. pRD219 ist identisch mit pRD170 (oben) mit der Ausnahme der Verknüpfungsregion, die den ENO2- Promotor und das Glucoamylasegen verbindet. Das Verknüpfungsfragment besteht aus ENO2-Promotorsequenzen herstammend aus den Positionen -50 bis -1 (relativ zur Translationssinitiation), gefolgt durch die DNA-Sequenz kodierend für das S. diastaticus DEX4-Gen Signalpeptid (beschrieben in Maine et al., U.S. Seriennummer 810 423, eingereicht am 18. Dezember 1985, übertragen auf den gleichen Rechtsnachfolger und hierdurch aufgenommen durch Bezugnahme). Die Anwesenheit von der DEX4-Signalpeptid kodierenden Sequenz ermöglicht eine gute Absonderung von dem Glucoamylasegenprodukt. Das Verknüpfungsfragment ist ein DdeI-BssHII 138/139-mer synthetisches DNA-Fragment von der folgenden Sequenz:
Die ENO2-abgeleitete Region von dem synthetischen DNA-Fragment enthält einen einzelnen Basenaustausch und einen einzelnen Baseneinschub gegenüber der natürlichen ENO2-Gensequenz genau 3'zu der DdeI-Position, das ergibt sich aus der Einführung von einer EcoRI- Position. Das Verbindungsfragment verbindet die DEX4-Signalpeptid kodierende DNA mit dem A. niger-Glucoamylasegen (Boel, et al.) durch eine BssHII-Position.
Die folgende Strategie wurde verwendet, um die S. cerevisiae GAL1,10 UAS zwischen die ENO2 UAS und ENO2-TATA-Region von pRD219 einzufügen. Das 365 Bp DdeI-Sau3A-Fragment, welches die GAL1,10 UAS enthält (siehe Abb.: 3) (Guarente et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7410; Yokum et al. (1984) Mol. Cell. Biol.4: 1985), wurde gereinigt, seine Enden wurden bündig gemacht durch Auffüllen und es wurde verbunden mit dem großen HindIII-AvaI- Fragment von pBR322, welches ebenso seine Enden aufgefüllt hat, um das Plasmid pRY20 zu bilden. In diesem Aufbau sind die HindIII und AvaI-Positionen regeneriert. pRY20 wurde mit AvaI geschnitten, die Enden wurden aufgefüllt und es wurde verbunden in der Anwesenheit von 8 Bp BglII-Bindegliedern (New England Biolabs); das rezirkularisierte Plasmid ist pRY21. Die gleiche Strategie wurde verwendet, um 8Bp BglII-Bindeglieder einzufügen bei derHindIII-Position von pRY21, erhaltend pRY24. Schließlich wurde das ungefähr 375 Bp BglII-Fragment von pRY24, enthaltend die GAL1,10 UAS, in beiden Ausrichtungen bei der einzigen BclI-Schnittstelle von pRD 219 eingefügt, liegend bei der ungefähren Position -316 relativ zu dem Translationsinitiationscodon von dem DEX4-Glucoamylase-Verschmelzungsgen, um die Plasmide pSV30 und pSV31 zu bilden; pSV3O enthält die GAL1,10 UAS so orientiert, daß das GAL10-nahe Ende näher an dem Glucoamylase-Gen ist, wohingegen pSV31 die GAL1,10 UAS in der entgegengesetzten Orientierung enthält.
pRD219, pSV30 und pSV31 werden verwendet, um den S. cerevisiae- Stamm BWG 1-7A (MATa, leu2-3, leu2-112, his4-519, ade 1-100, ura3- 52 GAL2) (Guarente und Hoar (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81: 7860) zu URA3+ zu transformieren. Die Transformanten wuchsen bis zur Sättigung in minimalselektivem Medium enthaltend entweder 2% Glucose oder 2% Galactose (bis entweder die gesamte Glucose oder die gesamte Galactose verbraucht war) und die überstehende Flüssigkeit wurde auf Glucoamylaseaktivität untersucht, wie vorstehend beschrieben. Die Glucoamylaseaktivität war hoch in pRD219-transformierten Zellen gewachsen in Glucose, aber kaum nachweisbar in pSV30- und pSV31-transformierten Zellen gewachsen in Glucose (siehe Tabelle I), naheliegend ist, daß die Regulationswirkungen von der GAL1,10 UAS bei der Glucoamylaseexpression dominant sind über jene von der ENO2 UAS. Die Glucoserepression von den GAL1 und GAL10 Genen wird bekanntlich herbeigeführt, wenigstens teilweise, durch Sequenzen, gelegen in der GAL1,10 UAS (Yocum (1987) in Biological Research on Industrial Yeasts, Vol III. eds. Stewart, Russell, Klein und Hiebsch (CRC Press, Boca Raton, Florida), Seiten 61-70.).
Das Wachstum auf Galactose anstatt auf Glucose führte zu einer Reduktion der Glucoamylaseproduktion in Zellen enthaltend pRD2lg, aber zu einer Induktion der Glucoamylaseproduktion in Zellen enthaltend pSV30 und pSV31, weiter unterstützt die obigen Schlußfolgerungen, daß die GAL1,10 UAS in diesem Zusammenhang dominant ist über die ENO2 UAS. Die Orientierung von der GAL1,10 UAS hat eine Auswirkung auf den Grad der Galaxtose-induzierten Expression von dem Glucoamylasegen; pSV30-transformierte Zellen weisen reproduzierbar einen höheren Grad der Glucoamylaseaktivität auf, wenn sie auf Galactose wuchsen, als pSV31-transformierte Zellen. Die Glucoamylaseaktivität war 3- bzw. 2-fach höher in pSV30- und pSV31-transformierten Zellen, gewachsen auf Galactose, als in pRD219-transformierten Zellen, gewachsen auf Glucose. Folglich führt die Verwendung von einem Hybridpromotor enthaltend zwei UAS- Sequenzen zu einer signifikaten Verbesserung der Glucoamylaseproduktion, und auch der genauen Regulation der Glucoamylaseproduktion in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle.
Die Auswirkung der Anzahl der Kopien der ENO2-GAL1,10-Glucoamylase-Verschmelzungsgene auf die Glucoamylaseproduktion und die Kohlenstoffquellen-Regulation wurden ebenso bestimmt. Die Plasmid pRD219, pSV30 und pSV31 enthalten ein Centromer und enthalten deshalb ungefähr 1 Kopie pro haploides Genom. pRD166 ist ein Vorläufer von pRD170, welchem es an der centromeren Sequenz mangelt, und pSV46 und pSV47 sind Derivate von pSV30 bzw. pSV31, welchen es ebenso an den centromeren Sequenzen mangelt; diese Plasmide enthalten einen 2-Micron-Kreis-Replicationsursprung und sind deshalb in einer hohen Anzahl von Kopien in der Zelle vorhanden. pRD226, pSV52 und pSV53 sind Integrationsvectoren, die verwendet werden, um einzelne Kopien von dem Glucoamylasegen in das Hefegenom einzuführen; diese Plasmide sind abgeleitet worden von pRD170, pSV30 bzw. pSV31. Eine cir&sup0;-Version des S. cerevisiae- Stamms BWG 1-7A wurde verwendet als ein Wirtshefestamm für Experimente, die centromere Plasmide einsetzen und eine cir&spplus;-Version von diesem Wirtsstamm wurde verwendet für alle anderen Experimente.
Transformierte Zellen wuchsen entweder auf Glucose oder Galactose und die Glucoamylaseproduktion wurde quantitativ bestimmt. Tabelle 1 zeigt, daß, wenn der Hybrid ENO2-GAL1,10-Promotor, enthaltend 2 UAS-Sequenzen, die Expression von dem Glucoamylasegen regelt, es dort ein signifikantes Anwachsen in der Glucoamylaseproduktion gibt, ungeachtet der Anzahl der Kopien von dem Glucoamylasegen. pRD219, pRD166 und pRD266 enthalten nicht die GAL1,10 UAS und produzieren ungefähr 2-3fach weniger Glucoamylase als die analogen GAL1,10 UAS-enthaltenden Plasmide, wenn sie vollständig induziert werden. YEP24 enthält kein Glucoamylasegen und, wie erwartet, produziert nicht irgendeine Glucoamylase. Außerdem war die Glucoamylaseproduktion in Plasmiden enthaltend die GAL1,10 UAS, unabhängig von der Anzahl der Kopien des Glucoamylasegens, durch Galactose induziert, wohingehen Plasmide, denen es an der GAL1,10 UAS mangelt, d.h. enthaltend nur die ENO2 UAS, am effizientesten durch Glucose, aber nicht nur durch sie, induziert werden. Tabelle 1 Plasmid Typ Orientierung der GAL1,10 UAS Glucoamylaseaktivität* Glucose Galactose Centromer 2-Micron integrierend *) willkürliche Einheiten

Aufbau von einer ENO2-GAL1,10-PDGF-Verschmelzung

Die galactoseinduzierbaren Hybridpromotoren enthaltend ENO2 und GAL1,10 UAS-Sequenzen, werden ebenfalls verwendet zum Expressieren und Absondern des humanen "platelet-derived growth factor" (PDGF) aus Hefe.
Der ENO2-Promotor für pRD219 oder die Hybridpromotoren von psv3o und pSV31 wurden an den Beginn gesetzt von einem Hybridgen kodierend die DEX4-Signalsequenz, verbunden in der Grundstruktur der PDGF kodierenden Sequenzen auf selbständig replizierenden, 2- Micron-basierenden Plasmiden enthalten das selektierbare URA3-Gen, um pAP275A, pSV43 bzw. pSV44 zu ergeben. Alle drei Plasmide werden transformiert in eine ura3&supmin; haploide Hefe durch Standardmethoden und die Transformanten werden geimpft in 10 ml minimal selektives Medium mit Uracilmangel und enthaltend entweder 2% Glucose oder 0,5% Glucose und 5% Galactose als Kohlenstoffquelle. Nach 72 Stunden Wachstum bei 30ºC werden die Zellen entfernt und der Kulturüberstand wird geprüft auf PDGF durch einen Western blot unter Verwendung kommerzieller Anti-PDGF-Antikörper (Collaborative Research, Waltham, MA). Der Grad des abgesonderten PDGF wurde abgeschätzt durch Vergleich mit einer Probe von PDGF, isoliert aus menschlichem Blut (Collaborative Research). Wie in Tabelle 2 gezeigt, wird ein höherer Grad von PDGF hergestellt, wenn der Hybridpromotor die Expression von dem PDGF-Gen regelt, als wenn der ENO2-Promotor die PDGF-Genexpression regelt. Der höchste Grad der PDGF-Genexpression kommt vor, wenn das GALL-nahe Ende von der GAL1,10 UAS in Richtung auf das PDGF-Gen ortientiert ist (pSV44).
Die Anwesenheit von dem Plasmid pAP27SA, welches das PDGF-Gen unter der Kontrolle von dem ENO2-Promotor enthält, bewies, daß es schädlich für das Wachstum der transformierten Zellen war, wenn Glucose die Kohlenstoffquelle war, dies ist anzunehmen als ein Ergebnis von dem hohen gebildeten Grad der ENO2-promotierten PDGF- Genexpression in der Anwesenheit von dem ENO2-Induktor (d.h. Glucose). Die Verwendung von den regulierten Hybridpromotoren (pSV43, pSV44) und das Wachstum der Transformanten in einem Gemisch aus Glucose und Galactose linderte dies Problem. In dem letzteren Fall ist der Hybridpromotor glucoserepressiert in dem frühen Statium der Fermentation und die Transformanten wachsen mit einer normalen Rate und produzieren wenig oder kein PDGF; wenn die Glucose später in der Fermentation erschöpft ist, wird der Hybridpromotor derepressiert durch den Mangel an Glucose und induziert durch Galactose, führend zu einem hohen Anteil von PDGF. Folglich ist die Verwendung von Hybridpromotoren, enthaltend streng regulierte Promotoren, deutlich vorteilhaft, wenn ein Gen auf einem hohen Niveau expressiert wird, das das Zellwachstum behindert. Tabelle 2 Plasmid Kohlenstoffquelle Wachstumsrate Abgesondertes PDGF cose gering 0,5 % Glucose 5% Galactose gut
Hybridpromotoren enthaltend viele UAS-Sequezen können nützlich sein für andere Anwendungen. Zum Beispiel kann das Glucoamylasegen auf pRD219 Maltose-induzierbar gemacht werden durch die Einfügung der Maltose-UAS (UASM) bei der BclI-Position. Die UASM vermittelt die Induktion von den Maltase-(MALS) und Maltosepermease (MALT)- Genen von S. cerevisiae durch Maltose (Hong und Marmur (1987) Mol. Cell. Biol. 1: 247). Ein Maltose-induzierbares Glucoamylasegen kann dann in Brauereistämme von Saccharomyces eingeführt werden, um kalorienarmes Bier herzustellen, oder in Brennereistämme von Saccharomvces, um die Kohlenhydratausnutzung und die Ethanolausbeute anwachsen zu lassen.
Es ist möglich, den ENO2-Promotor weiterhin zu unterteilen in eigenständige funktionelle Sequenzen, wie "TATA", die Initiationspunkte und ATG-Startcodon-Region. Vorbereitet entweder als durch Restriktionsenzyme hergestellte Fragmente oder als synthetische Oligonucleotide können diese Sequenzen die analogen Sequenzen in anderen Promotoren ersetzen, und solche Hybridpromotoren können wünschenswerte Eigenschaften haben, wie das Anwachsen ihrer Wirkungskraft.

Claims

1. Eine DNA-Sequenz umfassend einen Hefe-ENO2-Promotor funktionell verbunden mit einem heterologen Gen, wobei das Gen nicht eine Enolase kodiert.

2. Eine Hefezelle, transformiert mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1.

3. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin der ENO2-Promotor von S. cerevisiae stammt.

4. Die Hefezelle nach Anspruch 2, wobei die Hefe von der Gattung Saccharomyces ist.

5. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, enthalten in einem Plasmidvektor, der fähig ist, eine Wirthefezelle zu transformieren.

6. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das heterologe Gen eine Glucoamylase kodiert.

7. Plasmidvektor pRD170, ATCC Nr. 67385.

8. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das ein anderes als ein Enolase ist, umfassend die Zucht einer Hefezelle, die mit einem Vektor, der ein Gen umfaßt, das besagtes Protein kodiert, transformiert wurde, wobei das Gen funktionell mit einem ENO2-Promotor verbunden ist.

9. Eine DNA-Sequenz umfassend einen Hybridhefepromotor, der funktionell mit einem heterologen Gen verbunden ist, wobei das Gen keine Enolase kodiert, wobei der Hybridpromotor eine DNA-Sequenz umfaßt, die eine ENO2-Promotor-DNA umfaßt, die funktionell mit einer DNA-Sequenz verbunden ist, die eine erste stromaufwärts aktivierende Sequenz umfaßt, die von einem Hefepromotor abgeleitet ist.

10. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 9, worin die ENO2-Promotor-DNA eine ENO2 stromaufwärts aktivierende Sequenz enthält.

11. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 101 worin die erste stromaufwärts aktivierende Sequenz von einem Hefepromotor stammt, der ein anderer als der ENO2-Hefepromotor ist.

12. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, worin die erste, stromaufwärts aktivierende Sequenz von einem ENO2-Promotor abgeleitet ist.

13. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, worin die ENO2-Promotor-DNA eine TATA-Region enthält.

14. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 13, worin sich die erste stromaufwärts aktivierende Sequenz zwischen der ENO2 stromaufwärts aktivierenden Sequenz und der TATA-Region des ENO2-Promotors befindet.

15. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, wobei die erste stromaufwärts aktivierende Sequenz eine GAL1,10 stromaufwärts aktivierende Sequenz ist, die ein GAL1-nahes Ende und ein GAL10-nahes Ende hat.

16. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 15, wobei sich das GAL1-nahe Ende am nähesten zum heterologen Gen befindet.

17. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 15, wobei sich das GAL10-nahe Ende am nähesten zu dem heterologen Gen befindet.

18. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 15, wobei die GAL1,10 stromaufwärts aktivierende Sequenz von der GAL1,10-DNA-Sequenz einer Hefe der Gattung Saccharomyces abgeleitet ist.

19. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 18, wobei die Hefe S. cerevisiae ist.

20. Eine Hefezelle, die mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 10 transformiert wurde.

21. Die Hefezelle nach Anspruch 20, wobei die Hefe von der Gattung Saccharomvces ist.

22. Ein Plasmidvektor umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, wobei der Vektor in der Lage ist, eine Wirtshefezelle zu transformieren.

23. Die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, worin das heterologe Gen eine Glucoamylase kodiert.

24. Der Vektor pRD219, wobei der Vektor den Vektor pRD170, ATCC Nr. 67385 umfaßt, worin die S. diastaticus DEX4-Signalpeptid kodierende Sequenz in 3' bei der -1-Position des ENO2- Promotors eingefügt ist, wobei der Einschub ein Ddel-BssHII 138/139-mer synthetisches DNA-Fragment mit der Sequenz

umfaßt.

25. Der Vektor pSV30, wobei der Vektor den Vektor pRD219 nach Anspruch 24, umfaßt, worin die GAL1,10 UAS in die einzige BclI-Schnittstelle von pRD219 eingefügt ist, wobei GAL1,10 so orientiert ist, daß das GAL10-nahe Ende näher an dem Glucoamylase-Gen ist.

26. Der Vektor pSV31, wobei der Vektor den Vektor pPD219 nach Anspruch 24 umfaßt, worin die GAL1,10 UAS in die einzige BclI-Schnittstelle von pRD219 eingefügt ist, wobei GAL1,10 so orientiert ist, daß das GAL10-nahe Ende näher an dem ENO2- Promotor ist.

27. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das ein anderes als Enolase 2 ist, umfassend die Züchtung einer Hefezelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 10 transformiert ist.