DE3532794A1 - Antibiotika, verfahren zu deren herstellung und diese verbindungen enthaltende mittel - Google Patents

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PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER ΠΛ. WERNZR KittZEBACH

RtlTSTÖTTER. KINZIBACH ft PARTNER L PATENTANWÄLTE

POSTFACH 7SO. OSOOO MÜNCHEN 43 "V ZUGELASSENE VERTRETER BEIM

EUROPAISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

TELEFON: (OBB) 2 71 «9 83 CABLES: PATMONDIAL MÜNCHEN TELEX: OS21B2O« ISAR D TELEKOP: (080) 271 80 83 (OR. Il + III) BAUERSTRASSE 22. O-8OOO MÜNCHEN

München, 13. September I985

UNSERE AKTE: _M/₂6 109

BETREFF: RE

GLAXO GROUP LIMITED

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Antibiotika, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Mittel

POSTANSCHRIFT: D-SOOO MÜNCHEN 43. POSTFACH 78Ο

" 3532734

-Τι ο Die Erfindung betrifft antibiotisch wirkende Verbindungen und Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft insbesondere Antibiotika, die durch Fermentation von Streptomyces-Organismen erhalten werden können.

Erfindungsgemäß wird eine neue Substanzklasse bereitgestellt, die mit Antibiotika S541 bezeichnet ist. Diese Substanzen können durch Züchtung eines bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus-Stammes bei kontrollierten Bedingungen hergestellt werden. Die Antibiotika S541 besitzen antibiotische und insbesondere anti-endoparasitische, anti-ectoparasitiscbe, insektizide und nematizide Eigenschaften. Sie wirken ferner gegen Pilze und Milben. Diese Substanzen sind für die Landwirtschaft und für den Gartenbau sowie für die Tier- und Humanmedizin von Interesse. Die Verbindungen können auch als Zwischenverbindungen zur Herstellung weiterer wirksamer Verbindungen eingesetzt werden. Man kann die Verbindungen durch Fermentation erhalten und im wesentlichen in reiner Form gewinnen, wie dies nachstehend beschrieben ist..

Die Antibiotika S541 stellen eine Gruppe von verwandten Verbindungen mit der folgenden Teilformel (I) dar:

OH

(I)

Die Antibiotika S541 besitzen insbesondere die folgende Teilformel (II):

OH

CH₃

Sechs Verbindungen der Teilformel (II) sind nachstehend näher beschrieben.

Erfindungsgemäß sind sowohl die einzelnen Verbindungen der obigen Teilformeln als auch die Mischungen davon umfaßt. Für bestimmte Anwendungszwecke, beispielsweise in der Landwirtschaft oder im Gartenbau bzw. in der Veterinärmedizin, kann es von Vorteil sein, die Antibiotika S541 ohne Auftrennung in die einzelnen Bestand-

jQ teile einzusetzen. Für andere Anwendungszwecke hingegen, beispielsweise in der Humanmedizin, kann es von Vorteil sein, einzelne Verbindungen einzusetzen. Die Erfindung bezieht sich somit auch auf eine erfindungsgemäße Verbindung, die in Mischung mit mindestens einer weiteren

2g erfindungsgemäßen Verbindung vorliegt. Erfindungsgemäß sind auch die einzelnen Verbindungen, beispielsweise in im wesentlichen reiner Form oder im wesentlichen in Abwesenheit anderer Makrolide umfaßt.

2Q Die ursprünglich isolierten Antibiotika S541 können ohne Schwierigkeiten durch Chromatographie an Silika (ist nachstehend beschrieben) in zwei Komponenten mit antibiotischen Eigenschaften, z.B. Antihelminthika, aufgetrennt werden. Diese Komponenten quenchen UV-Fluoreszenz

2g bei 254 nm. Die Komponente I ist durch einen Rf-Wert von 0,70 bis 0,75 gekennzeichnet. Die Komponente II besitzt einen Rf-Wert von 0,39 bis 0,46. Diese Rf-Werte wurden dünnschichtchromatographisch an Merck 5735 Silika 60-Platten (Elution mit Chloroform:Ethylacetat;

2 nn 3:1) bestimmt. Die Komponenten I und II, worin R für -CH₃ bzw. -H steht, der Antibiotika S541 stellen ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal dar.

Die Komponenten I und II können wiederum weitergereinigt werden und führen zu sechs Verbindungen mit der Teil-

formel (I), die antibiotische Eigenschaften besitzen. Sie stellen beispielsweise Antihelminthika dar.

Gegenstand der Erfindung sind somit Verbindungen der allgemeinen Formel (III):

CH₃

(III)

worin R eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe bedeutet und

2 R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet.

Die sechs Verbindungen der allgemeinen Formel (III) sind mit Faktor A (R = Isopropyl, R = Wasserstoff , Faktor B (R¹ = Methyl, R² = Methyl), Faktor C (R¹ = .Methyl, R² = Wasserstoff , Faktor D (R¹ = Ethyl, R²= Wasserstoff), Faktor E (R¹ = Ethyl, R² = Methyl) und Faktor F (R¹ = Isopropyl, R = Methyl) bezeichnet. Die Faktoren A und C sind insbesondere bevorzugt.

Die Faktoren B, E und F erhält man aus der Komponente I,

während man die Faktoren A, C und D aus der Komponente II erhält.

Die erfindungsgemaßen Verbindungen besitzen eine antibiotische Aktivität. Sie wirken beispielsweise gegen Würmer, beispielsweise gegen Nematoden. Sie besitzen insbesondere anti-endoparasitische und anti-ektoparasitische Aktivität. Die Verbindungen sind im allgemeinen zur Bekämpfung von Parasiten, wie Ektoparasiten und Endoparasiten, geeignet. Ektoparasiten und Endoparasiten infizieren Menschen und viele Tiere und sind insbesondere auf Tierfarmen anzutreffen. Zu diesen Tieren zählen Schweine, Schafe, Rinder, Ziegen, Geflügel, Pferde und Haustiere, wie Hunde und Katzen. Eine parasitische Infektion des Viehbestandes, die zu Anämie, einer schlechten Ernährung und einen Gewichtsverlust führt,stellt einen der Hauptgründe für die weltweit erlittenen wirtschaftlichen Verluste dar.

Als Beispiele für Genera an Endoparasiten, welche Tiere und/oder Menschen infizieren, kann man nennen: Ancylostama, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Bunostomun, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Enterobius, Haeraonchus, Heterakis, Necator, Nematodirus, Nematospiroides, Nippostrongylus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris und üncinaria.

Als Beispiele für Ektoparasiten, welche Tier und/oder Menschen infizieren, kann man arthropode Ektoparasiten nennen, wie beißende Insekten, Schmeißfliegen,Fliegen, Läuse, Milben, saugende Insekten, Zecken und andere zweiflügelige Schädlinge.

Als Beispiele für Genera dieser Ektoparasiten, welche Tiere und/oder Menschen infizieren, kann man nennen: Ambylomma, Boophilus, Coroptes, Culliphore, Damodex, Damolinia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyalomma, Linognathus, Lucilia, Melophygus, Oestrus, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes und Stomoxys.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen sowohl in vitro als auch in vivo gegen eine Vielzahl von Endoparasiten und Ektoparasiten wirksam sind. Insbesondere wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen gegen parasitische Würmer, wie Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus colubiformis, Dictyocaulus viviparis, Cooperia oncophera, Ostertagia ostertagi und Nippostrongylus braziliensis und parasitische Milben, wie Sarcoptes sp. und Psoroptes sp. wirksam sind.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher zur Behandlung von Menschen und Tieren mit endoparasitischen und/oder ektoparasitischen Infektionen eingesetzt werden.

Die Spezies des Parasiten hängt von dem Wirt und von der hauptsächlichen Infektionsstelle ab. So infizieren beispielsweise Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta und Trichostrongylus colubiformis im allgemeinen Schafe und sind vorwiegend im Magen und im Dünndarm zu finden, während Dictyocaulus viviparus, Cooperia oncophora und Ostertagia ostertagi im allgemeinen Rinder infizieren und vorwiegend in der Lunge, im Darm oder im Magen zu finden sind.

Ferner wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen gegen Pilze wirken, beispielsweise gegen

- S&-
Stämme von Candida sp., wie Candida albicans und Candida glabrata, und gegen Hefen, wie Saccharomyces carlsbergensis.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch wirksam gegen den freilebenden Nematoden Caenorhabditis elegans.

Ferner wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Bekämpfung von Insekten-, Milben- und Nematodenbefall in der Landwirtschaft, im Gartenbau, in der Forstwirtschaft, im öffentlichen Gesundheitswesen und bei gelagerten Produkten eingesetzt werden können.

Schädlinge für Boden- und Pflanzenfrüchte, einschließlich Getreide (z.B. Weizen, Gerste, Mais und Reis), Gemüse (z.B. Soja), Früchte (z.B. Äpfel, Weintrauben und Zitrusfrüchte) sowie Wurzelgemüse (z.B. Zuckerrübe, Kartoffeln) können bekämpft werden.

Es wurde insbesondere gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen wirksam sind beispielsweise gegen Fruchtmilben und Blattläuse, wie Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae und Mitgliedern der Genera Trialeuroides; Nematoden, wie Mitgliedern der Genera Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne und Panagrellus; Lepidopteren, wie Heliothis, Plutella und Spodoptera; Getreidekäfer, wie Anthonomus grandis und Sitophilus granarius; Schwarzkäfer, wie Tribolium castaneum; Fliegen, wie Musca domestica; beißende Ameisen; Meniermotten; Pear psylla; Thrips tabaci; Kakerlaken, wie Blatella germanica und Periplaneta americana und Moskitos, wie Aedes aegypti.

Erfindungsgemäß werden Verbindungen mit der oben gezeigten Teilformel (I) bereitgestellt, die als Antibiotika eingesetzt werden können. Sie können insbesondere zur Behandlung von Tieren oder Menschen mit endoparasitisehen, ektoparasitischen und/oder Pilz-Infektionen und in der Landwirtschaft, im Gartenbau oder in der Forstwirtschaft als Pestizide zur Bekämpfung von Insekten, Milben der Ordnung Acarina und Nematoden eingesetzt werden. Sie können ferner als Pestizide zur Bekämpfung oder Regulierung von Schädlingen in anderen Umgebungen, z.B. in Läden, Gebäuden und anderen öffentlichen Orten eingesetzt werden. Im allgemeinen werden die Verbindungen entweder an den Wirt (Tier oder Mensch oder Pflanze oder andere Art der Vegetation) oder an die Schädlinge selbst oder an den Ort gegeben, wo sie sich befinden.

Insbesondere bevorzugt sind die oben definierten Faktoren A, B, C, D, E und F. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für eine Verabreichung auf jede für die Veterinär- oder Humanmedizin übliche Art formuliert werden. Gegenstand der Erfindung sind daher auch pharmazeutische Mittel, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, welche so bearbeitet wurde, daß sie in der Veterinär- oder Humanmedizin eingesetzt werden kann.

Diese Mittel werden in üblicher Weise eingesetzt und .

können einenoder mehrere geeignete Träger oder Exzipienten enthalten.

Die erfindungsgemäßen Mittel können so formuliert sein, daß sie für eine parenterale (einschließlich intramammäre), orale, rektale oder topische Verabreichung oder für Implantate geeignet sind. Ist es erforderlich, sterile Mittel zu formulieren, beispielsweise für Injektionen (einschließlich intramammäre Präparate), Augentropfen, Salben und Implantate dann kann man den

-Ab-

Wirkstoff selbst aseptisch herstellen oder nach der Herstellung durch Verfahren, wie γ-Bestrahlung oder Behandeln mit Ethylenoxid, sterilisieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Injektion zur Verwendung in der Veterinär- oder Humanmedizin formuliert werden. Sie können in Form einer Einzeldosis, in Ampullen oder in anderen Behältern für Einzeldosen oder in Mehrfachdosisbehältern vorliegen. Erforderlichenfalls gibt man ein Konservierungsmittel zu. Die Mittel für Injektionszwecke können als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen und können Formulierungshilfen enthalten, wie Suspendiermittel, Stabilisierungsmittel, Solubilisierungsmittel und/oder Dispergiermittel.

Der Wirkstoff kann in alternativer Weise auch in Form eines sterilen Pulvers vorliegen, das vor der Verwendung mit einem geeigneten Träger, beispielsweise sterilem, pyrogenfreiem Wasser, rekonstituiert wird. Zu den öligen Trägern zählen mehrwertige Alkohole und deren Ester, wie Glycerinester, Fettsäuren, pflanzliche öle, wie Ednußöl oder Baumwollsamenöl, Mineralöle, wie flüssiges Paraffin, und Ethyloleat und andere ähnliche Verbindungen. Man kann auch andere Träger, wie Propylenglykol, einsetzen.

Mittel für die Veterinärmedizin können auch als intramammäre Präparate formuliert sein, bei denen der Wirkstoff aus der Grundlage entweder langsam oder schnell freigesetzt wird. Es kann sich dabei um sterile Lösungen oder Suspensionen in wäßrigen oder öligen Trägern handeln. Die öligen Träger können beispielsweise diejenigen sein, die oben beschrieben sind. Sie können ferner ein Verdickungs- oder Suspendiermittel enthalten, wie weiche

oder harte Paraffine, Bienenwachs, 12-Hydroxystearin, hydriertes Castoröl, Aluminiumstearate oder Glycerylmonostearate. übliche, nicht-ionische, kationische oder anionische grenzflächenaktive Mittel können alleine oder in Kombination in den Mitteln eingesetzt werden.

Für die Veterinär- oder Humanmedizin können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in einer für die orale Verabreichung geeigneten Form formuliert sein. So können

IQ sie beispielsweise als Lösungen, Sirupe oder Suspensionen oder als Trockenpulver vorliegen, das vor der Verwendung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger konstituiert wird. Gewünschtenfalls können Geschmacksund Farbstoffe vorhanden sein. Man kann auch feste

!5 Mittel, wie Tabletten, Kapseln, Pastillen, Pillen, große Pillen (Bolus), Pulver, Pasten oder Granulate einsetzen.

Oral anzuwendende flüssige oder feste Mittel stellt man ^auf übliche Weise her. Diese Mittel können auch einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger oder Exzipienten enthalten, die fest oder flüssig sein können. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger zur Verwendung in festen Dosierungsformen sind beispielsweise Bindemittel (z.B. pregelatinierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffe (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumphosphat); Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talk oder Silika); disintegrierende Mittel «Ο (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycollat); oder Benetzungsmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat). Die Tabletten kann man auf übliche Weise mit einem überzug ausstatten.

Geeignete pharmazeutisch verträgliche Additive zur Ver-

Wendung in flüssigen Dosierungsformen sind beispielsweise Suspendiermittel (z.B. Sorbitsirup/ Methylcellulose oder hydrierte eßbare Fette); Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Acacia); nicht-wäßrige Träger (z.B. Mandelöl, ölige Ester oder Ethylalkohol); und Konservierungsmittel (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure). Man kann auch Stabilisierungs- und Solubilisierungsmittel dazugeben.

Oral zu verabreichende Pasten kann man auf bekannte Weise formulieren. Für die Formulierung von Pasten geeignete pharmazeutisch verträgliche Additive sind beispielsweise Suspendier- oder Gelierungsmittel, z.B. Aluminiumdistearat oder hydriertes Castoröl; Dispergiermittel, z.B. Polysorbate; nicht-wäßrige Träger, z.B. Erdnußöl oder ölige Ester; und Stabilisierungs- und Solubilisierungsmittel. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in der Veterinärmedizin auch dadurch verabreicht werden, daß man sie der festen oder flüssigen Nahrung für die Tiere einverleibt. So kann man sie beispielsweise der täglichen Nahrung für die Tiere oder dem Trinkwasser zugeben.

Für eine bukale Verabreichung können die Mittel auf übliehe Weise in Form von Tabletten, Pasten oder Pastillen formuliert werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in der Veterinärmedizin auch oral in Form eines Arzneitranks verabreicht werden, der beispielsweise als Lösung, Suspension oder Dispersion des Wirkstoffs zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten vorliegt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für die Ve-

- /4"
terinär- oder Humanmedizin auch beispielsweise als Suppositorien, z.B. solche mit üblichen Suppositorienbasen, formuliert sein.

Für die topische Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen in der Veterinär- und Humanmedizin als Salben, Cremes, Lotionen, Pulver, Pessare, Sprays, Dips, Aerosole oder Tropfen (z.B. Augen- oder Nasentropfen) formuliert sein. Salben und Cremes können beispielsweise mit einer wäßrigen oder öligen Basis unter Hinzufügung geeigneter Verdickungs- und/oder Gelierungsmittel formuliert sein. In die Augen zu verabreichende Salben kann man auf sterile Weise unter Verwendung steriler Bestandteile herstellen.

Die Lotionen können mit einer wäßrigen oder öligen Basis formuliert sein und enthalten im allgemeinen ferner ein oder mehrere Emulgiermittel, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder Färbemittel.

Die Pulver kann man mit Hilfe jeder geeigneten Pulverbasis herstellen. Die Tropfen kann man mit einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Basis formulieren, die ferner ein oder mehrere Dispergiermittel, Stabilisierungsmittel, Solubilisierungsmittel oder Suspendiermittel aufweisen. Sie können auch ein Konservierungsmittel enthalten.

Werden die erfindungsgemäßen Mittel in der Veterinär- oder Humanmedizin topisch durch Inhalieren verabreicht, dann können sie in Form eines Aerosolsprays vorliegen. Sie können auch mittels eines Pulverzerstäubers verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zusammen mit anderen pharmazeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Die tägliche Gesamtdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen beträgt sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin etwa 1 - 2000 ug/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10 - 1000 ug/kg und insbesondere bevorzugt 100 - 500 μg/kg. Diese Gesamtdosis kann man auch in mehreren Dosen verabreichen, z.B. 1- bis 4mal/Tag.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf jede Weise formuliert sein, die für einen Einsatz in der Landwirtschaft oder im Gartenbau geeignet ist. Gegenstand der Erfindung sind daher auch Mittel, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, welche für den Einsatz im Gartenbau oder in der Landwirtschaft angepaßt wurde. Derartige Formulierungen sind beispielsweise flüssiger oder trockener Art. Dazu zählen beispielsweise Stäube, einschließlich Staubbasen oder Konzentrate, Pulver, einschließlich lösliche oder benetzbare Pulver, Granulate, einschließlich Mikrogranulate und dispergierbare Granulate, Pellets, fließbare Formulierungen, Emulsionen, wie verdünnte Emulsionen oder emulgierbare Konzentrate, Dips, wie Wurzeldips und Samendips, Samendressings, Samenpellets, ölkonzentrate, öllösungen, Injektionen, z.B. Injektionen in den Stamm, Sprays, Rauch und Nebel.

Diese Formulierungen enthalten die erfindungsgemäße Verbindung im allgemeinen zusammen mit einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel. Diese Träger können flüssig oder fest sein und dienen dazu, die Anwendung der Verbindung zu erleichtern, indem sie diese dort dispergieren, wo sie aufgetragen wird, oder indem sie eine Formulierung bereitstellen, die vom Verwender zu einem dispergierbaren Präparat gemacht werden kann.

Derartige Formulierungen sind gutbekannt und können

auf übliche Weise hergestellt werden. Dazu zählt beispielsweise das Vermischen und/oder Zermahlen des (der) Werkstoffe(s) zusammen mit dem Träger oder Verdünnungsmittel, z.B. festen Träger, Lösungsmittel oder oberflächenaktivem Mittel.

Geeignete feste Träger zur Verwendung in Formulierungen, wie Stäuben, Granulaten und Pulver, sind beispielsweise natürliche Mineralfüllstoffe, wie Diatomit, Talk,

IQ Kaolinit, Montmorillonit, Pyrophyllit oder Attapulgit. Hochdispergierte Kieselsäure oder hochdispergierte absorbierende Polymere können gewünschtenfalls den Mitteln einverleibt werden. Als granulierte Adsprptionsträger kann man poröse (z.B. Bimsstein, Erdstein, Meerschaum oder Bentonit) oder nicht-poröse (wie Calcit oder Sand) einsetzen. Geeignete, pregranulierte, einsetzbare Materialien können organischen oder anorganischen Ursprungs sein. Dazu zählen Dolomit und Reste von Erdpflanzen.

Geeignete Lösungsmittel zur Verwendung als Träger oder Verdünnungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, aliphatische Kohlenwasserstoffe, Alkohole und Glykole oder Ether davon, Ester, Ketone, Säureamide, stark polare Lösungsmittel, gewünschtenfalls epoxidierte pflanzliche öle und Wasser.

übliche, nicht-ionische, kationische oder anionische grenzflächenaktive Mittel, z.B. ethoxylierte Alkyl-

Q₀ phenole und Alkohole, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze von Alkylbenzolsulfonsäuren, Lignosulfonsäuren oder Sulfobernsteinsäuren oder Sulfonate von polymeren Phenolen mit guten emulgierenden, dispergierenden und/oder benetzenden Eigenschaften können

O₅ entweder alleine oder in Kombination in den erfindungs-

gemäßen Mitteln eingesetzt werden.

Stabilisierungsmittel, Mittel, welche ein Zusammenbacken verhindern, Antischaummittel, Viskositätsregulatoren, Bindemittel und Klebemittel, Photostabilisatoren sowie Düngemittel, die Futteraufnahme stimulierende Agentien sowie andere Wirkstoffe können den erfindungsgemäßen Mitteln gewünschtenfalls einverleibt sein. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Mischung mit anderen Insektiziden, milbentötenden Mitteln und wurmtötenden Mitteln formuliert sein.

In diesen Formulierungen beträgt die Konzentration an aktivem Material im allgemeinen von 0,01 - 99% und vorzugsweise von 0,01 - 40 Gew.-%.

Handelsprodukte werden im allgemeinen als konzentrierte Mittel bereitgestellt, die vor der Verwendung auf eine geeignete Konzentration des Wirkstoffs, beispielsweise von 0,001 - 0,0001 Gew.-%, verdünnt werden.

Zum Einsatz im Gartenbau und in der Landwirtschaft sowie in der Veterinärmedizin kann es wünschenswert sein, die gesamte Fermentationsbrühe einzusetzen, ohne eine Auftrennung in die Komponente oder Faktoren vorzunehmen. Die Brühe dient dann als Quelle für die Wirkstoffe. Man kann auch die getrocknete Brühe (enthält Myzele) einsetzen. Es ist ferner möglich, lysierte Myzele oder lebende oder tote Myzele einzusetzen, die aus der Brühe durch Fest/Flüssig-Trennung oder Verdampfungstechniken abgetrennt wurden. Man kann auch die nach der Abtrennung der Myzele verbleibende Fermentationsbrühe verwenden. Die Myzele kann man gewünschtenfalls pasteurisieren oder vorzugsweise trocknen, z.B. durch Sprühtrocknung oder Walzentrocknung. Gewünschtenfalls kann man die Brühe

-κ-

Brühe oder die Myzele zu Mitteln formulieren, welche übliche inerte Träer, Exzipienten oder Verdünnungsmittel, wie oben beschrieben, enthalten.

Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen im allgemeinen zur Bekämpfung von Infektionen oder von Parasitenbefall eingesetzt werden können. Dazu trägt man eine wirksame Menge einer oder mehrerer der genannten Verbindungen auf den für die jQ Infektion oder den Befall verantwortlichen Organismus oder oder auf die befallene Stelle auf.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der zuvor definierten Antibiotika S541 oder

jg einer Komponente oder eines Faktors davon. Dazu kultiviert man einen Organismus des Genus Streptomyces, der in der Lage ist, mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen zu produzieren. Dadurch erhält man mindestens eine der Verbindungen. Diese kann man gewünschten-

2Q falls davon abtrennen und isolieren. Bei dem Organismus handelt es sich vorzugsweise um einen solchen, der im wesentlichen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen produziert.

Taxonomische Untersuchungen haben gezeigt, daß es sich bei dem bestimmten Mirkoorganismus, der obige Substanzen produzieren kann, um eine neue Spezies des Genus Streptomyces handelt, Dieser Mikroorganismus wurde mit Streptomyces thermoarchaensis bezeichnet. Eine Probe _ dieses Mikroorganismus, der aus dem Boden isoliert wurde,

ist bei der Hinterlegungsstelle "National Collections of Industrial and Marine Bacteria", Torry Research Station, Aberdeen, United Kingdom, hinterlegt worden. Diesem Mikroorganismus wurde die Nr. NCIB 12015 zugeteilt .*Έ)ΐθ

morphologischen Charakteristika und die Kulturcharakteri-35

*) hinterlegt am 10. September 1984

stika von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 sind nachstehend beschrieben. Dieser Organismus sowie weitere Antibiotika S541 produzierende Streptomyces-Stämme sind erfindungsgemäß umfaßt. Die Erfindung ist insbesondere auf die neue Spezies von Streptomyces gerichtet, deren Mitglieder die gleichen wesentlichen morphologischen und kulturellen Charakteristika wie Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 besitzen.

Zur Erfindung gehören auch alle Verbindungen, die durch Fermentation von S. thermoarchaensis NCIB 12015 gewonnen werden können und welche optische Isomere der Verbindungen der Formel (I) darstellen.

Bei dem Organismus vom Genus Streptomyces handelt es sich vorzugsweise um Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 oder einen Mutanten davon.

Mutanten von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 können spontan entstehen oder können durch eine Vielzahl von Verfahren produziert werden. Dazu gehören diejenigen, die beschrieben sind in "Techniques for the Development of Micro-organisms by H.I.Adler in Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of the Symposium, Wien 1973,

S. 241, International Atomic Energy Authority. Zu diesera Verfahren gehören die Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen, chemische Verfahren, z.B. Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG); Hitze;

go genetische Techniken, wie Rekombination, Transduktion, Transformation, Lysogenisation und lysogene Umwandlung, und selektive Techniken für spontane Mutanten. So wurden beispielsweise vier Mutantenstämme von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 erhalten. Jeder dieser Stämme

O₅ wurde bei der Hinterlegungsstelle "National Collections

of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, United Kingdom" hinterlegt.*' Diesen Stämmen wurden die folgenden Hinterlegungsnummern zugeteilt: NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 und NCIB 12114. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, 12112, 12113 und 12114 und die Mutanten davon stellen somit einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar.

Die Mutantenstämme NCIB 12111, 12112 und 12113 wurden IQ durch Behandlung der Sporen von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 mit NTG behandelt. Sie wurden dann nach dem Einstufenverfahren (one-step method) von Holliday (R. Holliday (1956) Nature V78_ 987) charakterisiert.

Der Mutantenstamm NCIB 12114 entstand durch spontane Mutation von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015. Von diesem Stamm wurde festgestellt, daß er gegenüber Streptomycin resistent ist, da er, nachdem er 100 μg/ml Streptomycinsulfat 5 Tage bei 28⁰C ausgesetzt gewesen war, lebensfähig blieb.

Taxonomische Untersuchungen deuten darauf hin, daß Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ein zuvor nicht offenbarter Mikroorganismus einer neuen Spezies darstellt. Die Eigenschaften davon sind nachstehend beschrieben und stellen im wesentlichen diejenigen der Spezies als Ganzes dar. Erfindungsgemäß sind alle Mitglieder dieser Spezies umfaßt. Dazu zählen auch alle

go Organismen, welche in der Hauptsache ähnliche wesentliche Charakteristika besitzen.

Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 wächst auf den bevorzugten Sporulationsmedien, Weizenmehl, Malz/Hefe_a5 Agar und anorganische Salze/Stärke-Agar (Shirling, E.B. und Gottlieb, D. (1966) Int. J. Syst. Bacteriol, 16,

*) hinterlegt am 26. Juni 1985 ' „.,-*,-,..-·, ρ\~~;ΙΟ"ΠΓΟ

-Χ Ι 313-340) üppig und produziert ein stabiles Substratmyzel und ein Luftmyzel, das Sporen in offenen Spiralenketten trägt, die Seitenzweige der Hauthyphen darstellen. Auf diesen Medien ist die rückwärtige Pigmentation gelb/braun. Die Sporophoren sind grau. Bei einer 100-fachen Vergrößerung zeigen die Sporophoren 2-5 Windungen pro Kette mit 5 - TO Sporen innerhalb jeder Windung der Spirale. Die Sporophoren enthalten durchschnittlich 20 - 50 Sporen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen bei einer Vergrößerung von 12 000 zeigen, daß die Sporen glattwandig sind und Ellipsenform besitzen, mit Maßen von 0,7 μια χ 1,4 um zwischen den am weitesten entfernten Punkten. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ist gram-positiv und kann bei Temperaturen zwischen 20°C und 50⁰C wachsen und Sporen bilden.

Ein Vergleich der zuvor genannten Daten mit den in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition) veröffentlichten Beschreibungen zeigt, daß der Organismus Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 zum Genus Streptomyces gehört.

Die Zuordnung von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 zu einer Spezies-Untergruppe wurde mit Hilfe einer computerisierten Identifikationsmatrix durchgeführt, die von Williams et al stammt (J. Gen. Microbiol (1983) 129, 1815-1830). Für Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 wurden in den von den oben genannten Autoren gO beschriebenen 41 taxonomischen Tests folgende Ergebnisse erhalten:

Merkmal ~~ Ergebnis

Sporenkette verticillati

Sporenkette retinaculiaperti

Sporenkette rectiflexibiles
Sporenkette spirales +

Myzelfragmentation

Sporenoberfläche glatt +

Sporenoberfläche faltig

Sporenfarbe grau +

Sporenfarbe rot

Sporenfarbe grün

Rückseite gelb/braun +

Rückseite rot/orange

Melaninproduktion
Verwertung von Adonit

Verwertung von Cellobiose +

Verwertung von D-Fructose +

Verwertung von meso-Inosit

Verwertung von Inulin +

Verwertung von Mannit

Verwertung von Raffinose +

Verwertung von Rhamnoee +

Verwertung von D-Xylose +

Verwertung von DL-c-Aminobuttersäure
Verwertung von L-Histidin . +

Verwertung von L-Hydroxyprolin

Abbau von Allantoin +

Abbau von Arbutin +

Abbau von Xanthin +

go Abbau von Pectin +

Abbau von Lecithin

Nitratreduktion +

Schwefelwasserstoffproduktion +

Verträglichkeit von Natriumazid (0,01% G/V)
«κ Verträglichkeit von Natriumchlorid (7%

-24-

Merkmal Ergebnis

Verträglichkeit von Phenol (0,1% G/V) +

Wachstum bei 45⁰C + Resistenz gegenüber Neomycin (50 ug-ml )

Resistenz gegenüber Refampicin (50 μg·ml ) +

Antibiose auf Aspergillus niger LIV 131 + Antibiose auf Bacillus subtilis NCIB 3610

Antibiose auf Streptomyces murinus ISP 5091 +

Der Organismus konnte keiner der 23 Hauptspeziesgruppen (Williams, S.I. et al. (1983) J. Gen. Microbiol 129, 1815-1830) zugeordnet werden. Der Organismus konnte auch keiner der Nebenspeziesgruppen und einzelnen Mitgliedergruppen (wie von Williams et al definiert;

J. Gen. Microbiol (1983) 129, 1743-1813) zugeordnet werden. Die Charakteristika von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 wurden auch verglichen mit Beschreibungen bekannter Streptomyces Spezies in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Eigth Edition), in ISP Berichten von Shirling und Gottlieb (Int. J.Syst. Bacteriol. (1968) J_8, 69-189; Int. J. Syst. Bacteriol. (1968) 1_8, 279-392; Int. J. Syst. Bacteriol. (1969) 19, 391-512; Int. J. Syst.

Bacteriol. (1972) 2_2, 265-394). Ein weiterer Vergleich wurde mit neuen Spezies durchgeführt, die im International Journal of Systematic Bacteriology seit 1980 in ausreichendem Maße beschrieben sind.

Es konnte keine Übereinstimmung zwischen Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 und einer beschriebenen Spezies festgestellt werden. Es wird daher angenommen, daß Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 das erste bekannte Mitglied einer neuen Spezies darstellt, die zum Genus Streptomyces gehört.

Alle Mutantenstämme NCIB 12111, 12112, 12113 und 12114 haben im wesentlichen ähnliche essentielle Charakteristika wie Streptomyces thermoarchaensis. Jedoch benötigt NCIB 12111 zum Wachstum Adenin, NCIB 12112 benötigt zum Wachstum Serin, NCIB 12113 benötigt zum Wachstum Histidin und NCIB 12114 ist gegenüber Streptomycin resistent.

Die Herstellung von S541durch Fermentation eines geeigneten Streptomyces-Organismus kann man auf übliche Weise durchführen, beispielsweise durch Kultivieren des Streptomyces-Organismus in Gegenwart assimilierbarer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und in Anwesenheit von anorganischen Salzen.

Die assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die Mineralien können als einfache oder komplexe Nährstoffe vorliegen. Als Kohlenstoffquellen kann man im allgemeinen Glucose, Maltose, Stärke, Glycerin, Melassen, Dextrin, Lactose, Sucrose, Fructose, Carbonsäuren, Aminosäuren, Glyceride, Alkohole, Alkane und pflanzliche öle einsetzen. Die Kohlenstoffquellen machen im allgemeinen 0,5 - 10 Gew.-% des Fermentationsmediums aus.

Stickstoffquellen sind im allgemeinen Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Maisschlämpe, Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Peptone, gemahlenes Nußmehl, Malzextrakt, Melassen, Casein, Aminosäuremischungen, Ammoniak (Gas oder Lösung), Ammoniumsalze oder Nitrate. Man kann auch Harnstoff oder andere Amide einsetzen. Die Stickstoffquellen machen im allgemeinen 0,1 - 10 Gew.-% des Fermentationsmediums aus.

Man kann auch mineralische Nährsalze zum Kulturmedium

geben. Im allgemeinen setzt man Salze ein, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Eisen-, Magnesium, Zink-, Nickel-, Kobalt-/ Mangan-, Vanadium-, Chrom-, Calcium-, Kupfer-, Molybdän-, Bor-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen liefern können.

Auch ein Antischaummittel kann zugegen sein, um ein exzessives Schäumen zu vermeiden. Dies wird in den erforderlichen Abständen zugegeben.

Die Kultivierung des Streptomyces-Organismus führt man im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 - 50⁰C, vorzugsweise bei 25 - 40°C, und insbesondere bei etwa 34⁰C durch. Es ist von Vorteil dabei zu belüften und 5 das Medium in Bewegung zu halten, beispielsweise durch Schütteln oder Rühren. Das Medium kann man am Anfang mit einer kleinen Menge einer Suspension des Mikroorganismus animpfen, der Sporen gebildet hat. Um jedoch eine Wachstumsverzögerung zu vermeiden, kann man ein

2Q vegetatives Inokulum des Organismus herstellen, indem man eine geringe Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus animpft und das erhaltene vegetative Inokulum in das Fermentationsmedium transferiert. Man kann das vegetative Inokulum jedoch auch, was bevorzugt ist, auf ein oder mehrere Samengebiete, wo weiteres Wachstum stattfindet, transferieren, bevor man es in das hauptsächliche Fermentationsmedium überführt. Die Fermentation führt man im allgemeinen bei einem pH von 5,5 - 8,5, vorzugsweise 5,5 - 7,5, durch.

Die Fermentation kann man während eines Zeitraums von 2-10 Tagen, z.B. während etwa 5 Tagen, durchführen.

Wünscht man, ein Material von der gesamten Fermentation g₅ abzutrennen, das die Antibiotika S541 oder irgendeine

Komponente oder irgendeinen Faktor davon enthält, oder möchte man irgendeinen der Komponenten oder Faktoren isolieren, dann kann man dies nach üblichen Isolierungsund Auftrennverfahren durchführen. Die erfindungsgemäßen Antibiotika S541 sind vorwiegend in den Myzelen der Zellen enthalten. Sie werden jedoch auch in der Fermentationsbrühe gefunden. Die Fermentationsbrühe kann entweder vor oder nach dem Klarwerden diesen Isolierungsverfahren unterzogen werden. Eine Vielzahl derartiger Isolierungsverfahren stehen zur Verfügung.

Die Antibiotika S541 können nach einer Vielzahl von Fraktionierungsverfahren isoliert und abgetrennt werden; beispielsweise durch Adsorption-Eluierung, Präzipitation, fraktionierte Kristallisation und Lösungsmittelextraktion. Man kann diese Verfahren auch auf verschiedene Weise miteinander kombinieren.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen am besten durch Lösungsmittelextraktion, Chromatographie und fraktionierte Kristallisation isoliert und abgetrennt werden können.

Nach der Fermentation gewinnt man die Myzele auf übliche Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Danach kann man das Material beispielsweise aus den Myzelen mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel extrahieren. Zu diesen Lösungsmitteln zählen Ketone, z.B. Aceton, Methylethylketon oder Methylisobutylketon; Kohlenwasserstoffe, z.B. Hexan; halogenierte Kohlenwasserstoffe, z.B. Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff oder Methylenchlorid; Alkohole, z.B. Methanol oder Ethanol; Diole, z.B. Propan-1,2-diol; oder Ester, z.B. Methylacetat oder Ethylacetat. Enthalten die Myzele signifikante Wassermengen, dann setzt man vorzugsweise

-23--ein wasserlösliches Lösungsmittel ein.

Im allgemeinen ist mehr als eine Extraktion wünschenswert, um eine optimale Ausbeute zu erzielen. Vorzugsweise führt man die erste Extraktion unter Verwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Methanol oder Aceton, durch. Die Antibiotika kann man als Rohextrakt durch Entfernen des Lösungsmittels gewinnen. Die Lösungsmittelextrakte kann man dann selbst, gewünschtenfalls nach Reduktion des Lösungsmittelvolumens, beispielsweise durch Einengen, extrahieren. In dieser Stufe ist es bevorzugt, ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie Hexan, Chloroform, Methylenchlorid oder Ethylacetat oder Mischungen davon einzusetzen, wobei man ausreichend Wasser zugibt, um eine ausreichende Trennung der antibiotischen Verbindungen zu erzielen. Nach Entfernen der mit Wasser nicht mischbaren Phase erhält man ein Material, das die Antibiotika S541 enthält. Gewünschtenfalls kann man den Faktor B durch Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel/ z.B. Isopropanol, abtrennen.

Die Reinigung und/oder Trennung der wirksamen Bestandteile und/oder der Faktoren (vollständig oder von anderen vorhandenen Makroliden) kann man auf übliche Weise durchführen, beispielsweise chromatographisch (einschließlich high performance liquid chromatography) an einem geeigneten Träger, wie Silika, einem nicht-funktionellen makronetzförmigen Adsorptionsharz, wie beispielsweise vernetzte Polystyrolharze/ wie Amberlite XAD-2-/XAD-4- oder XAD-1180-Harze (Rohm & Haas Ltd.) oder S112-Harz (Kastell Ltd.) oder an einem organischen lösungsmittelkompatiblen vernetzten Dextran, wie Sephadex LH20 (Pharmacia UK Ltd.), oder im Falle von hplc an Umkehrphasenträgern, wie durch Kohlenwasserstoffe verbundenes Silika, z.B. C₁„-verbundenes Silika, durchführen. Der

ι ο

Träger kann in Form eines Bettes vorliegen. Vorzugsweise ist er in einer Säule gepackt. Setzt man nicht-funktionel· Ie makrovernetzte Harze, wie XAD-1180 oder S112 ein, dann kann man Mischungen organischer Lösungsmittel, wie Acetonitril/Wasser, für die Elution einsetzen.

Im allgemeinen gibt man eine Lösung der Verbindungen in einem geeigneten Lösungsmittel auf die Silika- oder Sephadex-Säule, nachdem man gewünschtenfalls das Lösungsmittelvolumen reduziert hat. Die Säule kann man gewünschtenfalls waschen. Dann eluiert man mit einem Lösungsmittel geeigneter Polarität. Setzt man Sephadex und Silika ein, dann kann man Alkohole, wie Methanol; Kohlenwasserstoffe, wie Hexan; Acetonitril; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder Methylenchlorid; oder Ester, wie Ethylacetat, als Lösungsmittel verwenden. Man kann auch Kombinationen dieser Lösungsmittel untereinander oder mit Wasser einsetzen.

Die Elution und Trennung/Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann man auf übliche Weise überwachen, beispielsweise chromatographisch, z.B. dünnschichtchromatographisch, und durch high performance liquid chromatography, oder indem man sich die zuvor beschriebenen Eigenschaften der Verbindungen zunutze macht.

Bei der Chromatographie an Silika, vorzugsweise unter Verwendung eines Eluierungsmittels, wie Chloroform .'Ethylacetat, trennen sich die Antibiotika S541 ohne Schwierigkeiten in die Komponenten I und II auf, wobei die Komponente I zuerst eluiert wird. Die Faktoren B, E und F können dann ohne weiteres chromatographisch aus der Komponente I erhalten werden, beispielsweise durch hplc. In ähnlicher Weise können die Faktoren A, C und D ohne weiteres aus der Komponente II isoliert werden. In alter-

-2ή-

nativer Weise kann man den Faktor B von den Faktoren E und F durch Kristallisierung aus einem Alkohol, wie Methanol oder Isopropanol, abtrennen. Die Mutterflüssigkeiten, welche die Faktoren E und F enthalten, kann man gewünschtenfalls weiter reinigen, beispielsweise chromatographisch an Silika. Die Faktoren E und F isoliert man mittels hplc. Hat man die Faktoren einmal erhalten, dann kann man sie weiter durch Kristallisierung aus beispielsweise Methanol, Isopropanol oder einer Methanol/Wasser-Mischung reinigen. Die Erfindung umfaßt somit auch die Verbindungen in kristalliner Form.

Durch eine geeignete Kombination der zuvor beschriebenen Arbeitsweisen kann man die erfindungsgemäßen Verbindungen als Feststoffe isolieren. Dabei kann man die Reihenfolge, in welcher man die oben beschriebenen Reinigungsstufen durchführt, und auch die Art der Reinigung in einem großen Bereich variieren.

So wurde der Faktor B als kristalliner Feststoff mit einer Reinheit größer als 90% erhalten. In ähnlicher Weise wurden die Faktoren A, C, D, E und F in einer Reinheit größer als 90% erhalten. Die Faktoren können jedoch, wie dies oben ausgeführt ist, je nach dem beabsichtigten Einsatzgebiet in unterschiedlichen Reinheitsgraden eingesetzt werden. Zum Einsatz in der Humanmedizin ist eine Reinheit von mindestens 90% und vorzugsweise von größer als 95% wünschenswert. Für die Verwendung in der Veterinärmedizin oder in der Landwirtschaft oder im Gartenbau sind niedrigere Reinheitsgrade ausreichend, beispielsweise 50% oder niedriger.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Dabei werden folgende Abkürzungen benutzt: tlc = Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von

Merck 5735 Sllika 60 Platten; entwickelt mit

CHCl₃:Ethylacetat (3:1), soweit nichts anderes angegeben ist);

CCM = Säulenchromatographie, gepackt mit Merck 7734 Silika 60 (200 χ 4 cm Säule, sofern nichts anderes angegeben ist) und eluiert mit CHCl-:Ethylacetat (3:1), sofern nichts anderes angegeben ist;

hplc = high performance liquid chromatography; PE = Petrolether (Siedepunkt 60 - 80°C, sofern nichts

anderes angegeben ist);
1 = Liter;
EA = Ethylacetat.

Bei den in den Beispielen genannten Medien A, B und C handelt es sich um folgende:

Medium A gl~*

D-Glucose 15,0

Glycerin 15,0

So j apepton 15,0 NaCl 3,0

CaCO₃ 1,0

Man füllt mit destilliertem Wasser auf 1 1 auf und stellt den pH mit einer wäßrigen NaOH-Lösung auf pH 7,0 ein, bevor man sterilisiert.

Medium B gl"¹

D-Glucose 2,5

Malzdextrin MD 3OE (Roquette (UK)Ltd) 25,0

Arkasoy 50 (British Arkady Co. Ltd.) 12,5 Melassen 1,5

K₂HPO₄ 0,125

Calciumcarbonat 1,25

MOPS (3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure) 21,0

Man füllt mit destilliertem Wasser auf 1 1 auf und stellt den pH mit 5N NaOH auf 6,5 ein, bevor man sterilisiert.

Medium C	gi"1
D-Glucose	2,5
Malzdextrin MD 3OE (Roquette (UK) Ltd.)	25,0
Arkasoy 50	12,5
Zuckerrübenmelassen	1,5
K2HPO4	0,125
CaCO3	1,25
Silikon 1520 (Dow Corning)	0,625

Man füllt mit destilliertem Wasser bis 1 1 auf und stellt den pH auf 6,5 ein, bevor man sterilisiert.

Beispiel 1

Sporen von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 wurden durch Impfung auf Schrägagar übertragen, der aus folgenden Bestandteilen aufgebaut war:

Hefeextrakt (Oxoid L21) 0,5

Maisextrakt (Oxoid L39) 30,0

mykologisches Pepton (Oxoid 40) 5,0

Agar Nr. 3 (Oxoid L13) 15,0

Mit destilliertem Wasser wurde auf 1 1 aufgefüllt, der pH auf etwa 5,4 eingestellt und 10 Tage bei 28⁰C inkubiert. Der entwickelte Schrägagar wurde dann mit einer 10%igen Glycerinlösung (6 ml) bedeckt und mit einem sterilen Werkzeug gekratzt, um die Sporen und das Myzel zu lockern. 0,4 ml Aliquots der erhaltenen Sporensuspension wurden in dünne sterile Polypropylenröhrchen überführt,die dann mit Hitze verschlossen wurden und im

Dampf vom flüssigen Stickstoff bis zur Verwendung gelagert wurden.

Der Inhalt eines einzelnen dünnen Röhrchens wurde verwendet, um 10 ml des Mediums A zu beimpfen, das dann 3 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM (Durchmesser der Umlaufbahn: 50 mm) bei 28⁰C inkubiert wurde. Dieses inkubierte Medium wurde eingesetzt, um 15 Röhrchen und zwei 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die 10 ml bzw. 50 ml Medium B enthielten, anzuimpfen (Gehalt 2%).

Die Röhrchen und Kolben wurden 5 Tage bei 28⁰C gehalten. Die Kulturen wurden dann getrennt im Vakuum filtriert. Die Zellen wurden 30 min mit Methanol geschüttelt, wobei das Methanolvolumen demjenigen des Kulturfiltrats entsprach.

Von den Extrakten der Zellen, die sowohl in den Röhrchen als auch in den Kolben gewachsen waren, wurde festgestellt, daß sie gegen Caenorhabditis elegans wirksam sind. Diese Myzelextrakte wurden zusammengegeben, zur Trockene eingeengt und mit Methanol zu einem Konzentrat (6 ml) reextrahiert, das auf eine Säule gegeben wurde, die mit Sephadex LH20 (110 χ 2,5 cm) gepackt war. Es wurde mit Methanol eluiert. Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt.

Die Fraktionen 21-28 wurden vereinigt und eingeengt, wobei ein öliger Rückstand (156 mg) erhalten wurde, der

QQ mit CHCl-:EA (3:1) extrahiert wurde. Es wurde ein Extrakt (3 ml) erhalten, der einer CCM (55 χ 2,5cm Säule] unterworfen wurde. Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt und mittels tlc unter Verwendung von Platten, die einen Fluoreszenzindikator enthielten, analysiert.

Die Fraktionen 20 bis 23 und 36 bis 44 führten zu zwei

-3h

Hauptflächen, welche die Fluoreszenz unterdrückten. Diese wurden als Komponente I (Rf 0,70) und als Komponente II (Rf 0,43) identifiziert. Durch Abziehen der Fraktionen 20-23 wurde die Komponente I als Feststoff (9 mg) erhalten;

^^238 nm, Ε_χ34Ο; A_max245 nm, E*35O; und A_max254 nm,

E¹ 200.

Durch Einengen der Fraktionen 36 bis 44 wurde die Komponente II als Feststoff (11 mg) erhalten;

1 1

λ 238 nm, E₁440; λ 245 nm, E₁ 460; und λ 254 nm, max ι max i max

E¹ 280.

Beispiel 2

Zwei 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Medium A enthielten, wurden jeweils mit 0,2 ml einer Sporensuspension von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 angeimpft, die aus dem dünnen Röhrchen stammte, das gemäß Beispiel 1 hergestellt worden war. Die Kolben wurden 3 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM (Durchmesser der Umlaufbahn: 50 mm) bei 28⁰C inkubiert. Der Inhalt der beiden Kolben wurde zum Animpfen eines 20 1 Fermentergefäßes verwendet, das 12 1 Medium B enthielt.

Die Kultur wurde nach 5-tägigem Wachstum geerntet und wie in Beispiel 3 beschrieben bearbeitet.

Beispiel 3

Nach einem 5-tägigen Wachstum bei 28⁰C wurde die gemäß Beispiel 2 erhaltene Fermentationsbrühe (12 1) geerntet und zentrifugiert (4 200 UpM bei 10°C und 15 min). Das Zellpellet wurde mit 5 1 Methanol vermischt und 20 h bei 4⁰C stehengelassen. Der Myzelextrakt wurde filtriert, bei 40°C eingeengt und nach Zugabe von 100 ml Butan-1-ol

353279A

-W
einer azeotropen Destillation unterworfen. Der Extrakt wurde dann mit 5 χ 200 ml Methanol behandelt. Die vereinigten Extrakte wurden auf 100 ml eingeengt und auf eine Sephadex LH20-Säule (112 χ 5 cm) gegeben. Die Säule wurde mit Methanol eluiert. Nach einem Vorlauf von 200 ml wurden 50 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 40-90 wurden vereinigt und zu einem öligen Rückstand (3,85 g) eingeengt. Dieser Rückstand wurde mit 77 ml. CHCl,:EA (3:1) extrahiert, filtriert und dann einer CCM unterworfen. Nach einem Vorlauf von 200 ml wurden etwa 15 ml Fraktionen gesammelt.

Die Fraktionen 124 bis 142, welche die Komponente I enthielten, wurden vereinigt und zu einem Feststoff (253 mg) eingeengt. Davon wurden 216 mg mittels hplc (Zorbax ODS, 25 χ 2,1 cm, 80% CH₃CN/H₂O) gereinigt. Die Fraktionen 250 bis 320, welche die Komponente II enthielten, wurden vereinigt und zu einem Feststoff (602 mg) eingeengt, von dem 540 mg mittels hplc (wie bei den Franktionen 124-142) gereinigt wurden. Es wurden Fraktionen von verschiedenen Läufen gesammelt.

Das von der hplc-Süule eluierte Material wurde UV-spektroskopisch bei 243 nm überwacht. Bei dieser Wellenlänge absorbierende Peaks (Fraktionen) wurden getrocknet und

i) auf Aktivität gegen Caenorhabditis elegans getestet und

ii) dünnschichtchromatographisch analysiert.

Vier Peaks, die gegen Caenorhabditis elegans aktiv waren, besaßen auch einen Rf-Wert in einem Bereich von 0,39 bis 0,46 oder 0,70 bis 0,75.

Die Komponente I führte zu einem Peak mit einem Rf-Wert von 0,70 bis 0,75. Dieser Peak wurde mit Faktor B be-

zeichnet. Die Komponente II ergab drei Peaks mit Rf-Wertenvon 0,39 bis 0,46. Diese Peaks wurden als Faktoren A, C und D bezeichnet.

Der Faktor A wurde von der hplc-Säule von 260 bis 340 ml nach Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,44 (dünnschichtchromatographisch). Der Faktor B wurde von der hplc-Säule zwischen 270 bis 310 ml nach der Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,72 (dünnschichtchromatographisch). Der Faktor C wurde von der hplc-Säule zwischen 160 bis 180 ml nach der Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,4 (dünnschichtchromatographisch). Der Faktor D wurde von der hplc-Säule zwischen 220 bis 250 ml nach Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,42 (dünnschichtchromatographisch). Die weiteren Charakteristika der Faktoren A, B, C und D sind nachfolgend beschrieben.

Beispiel 4

0,4 ml einer Sporensuspension des Organismus Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, die von einem gemäß Beispiel 1 hergestellten dünnen Röhrchen genommen wurde, wurde zum Animpfen eines 250 ml Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml Medium A enthielt. Der Kolben wurde 4 Tage bei 28°C auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM inkubiert (Durchmesser der Kreisbewegung: 50 mm). 8 ml Portionen wurden dann verwendet, um jeweils zwei 2 1 Kolben mit flachem Boden anzuimpfen, die jeweils 400 ml desselben Mediums enthielten. Danach wurde 3 Tage bei denselben Bedingungen inkubiert.

Der Inhalt der beiden Kolben wurde dann zum Impfen

eines 70 1 Fermentergefäßes verwendet, das 40 1 Medium B enthielt, dem Silicone 525 (Dow-Corning; 0,0625% (v/v)) zugesetzt war. Die Fermentation wurde unter Rühren durchgeführt. Dabei wurde so stark belüftet, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer als 20% der Sättigung war. Silikon-Ant!schaummittel wurde zugegeben, wenn es erforderlich war. Nach 10 Tagen wurde die Fermentation geerntet. Die Brühe (40 1) wurde mittels Zentrifugieren (15 000 UpM) geklärt. Der überstehende Rest wurde mit Wasser (5 1) verdrängt. Die gewonnenen Zellen (1,4 kg) wurden bei -20°C gefroren.

Nach 1 Woche wurden die gefrorenen Zellen aufgetaut, in 15 1 Methanol suspendiert und vorsichtig 15h gerührt. Die Suspension wurde dann filtriert und der feste Rückstand wurde mit 10 1 Methanol reextrahiert. Das vereinigte Filtrat (25 1) wurde mit 12 1 Wasser verdünnt und mit 25 1 PE extrahiert. Nach 30 min wurden die Phasen durch Zentrifugieren getrennt.

Die untere, Methanolphase wurde dreimal mit PE (25 1, 15 1 und 15 1) reextrahiert. Die vereinigten PE-Phasen (80 1) wurden konzentriert, indem sie dreimal durch einen Pfaudier 8.8-12V-27 wiped-film-Verdampfer (Dampfdruck 0,1 bar, Dampftemperatur 20°C, Wasserdampftemperatur 127⁰C) gegeben wurde. Das Konzentrat (8 1) wurde über Natriumsulfat (1 kg) getrocknet und bei vermindertem Druck bei 40⁰C in einem Rotationsfilmverdampfer weiter konzentriert. Der ölige Rückstand (15 ml) wurde in einer Mischung von CHCl₃ und EA (70 ml, 3:1 Volumen/Volumen) gelöst und einer CCM unterworfen. Es wurden Fraktionen von etwa 40 ml nach einem Vorlauf von 1 400 ml gesammelt.

Die Fraktionen 45-65 wurden vereinigt und eingeengt,

wobei der Faktor B (940 mg; wie in Beispiel 3 definiert) erhalten wurde, der zweimal aus Methanol und schließlich aus Nitromethan kristallisiert wurde. Die Kristalle wurden einer Einzelkristall-Röntgenstrukturanalyse unterworfen. Es zeigte sich, daß sie orthorhombische, klare Prismen waren mit a = 10.171(3), b = 13.317(5), c = 25.032 (7)Ä, V = 3391ij, Z = 4, Raumgruppe Ρ2_<.2₁2'_1# D =1,18 gem""³, R = 0,053 für 2169 beobachtete unabhängige Reflexe (Θ ^i 58°), gemessen mit einem Diffrakto-

meter mit Kupfer-Ka-Strahlung (A= 1.54178A). Die röntgenographisch bestimmte Kristallstruktur ist in Fig.5 gezeigt.

Beispiel 5

Ein Inokulum von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wobei die Wachstumsperiode 2 Tage betrug. Dieses Inokulum wurde zum Animpfen eines Fermentergefäßes (70 1) verwendet, das 40 1 Medium B enthielt, das anstelle von Silicone 525 mit Polypropylen 2000 (0,06% Volumen/Volumen) versetzt war. Polypropylen 2000 wurde erforderlichenfalls während der Fermentation zugegeben, um die Schaumbildung unter Kontrolle zu halten. Die Fermentation wurde bei 28⁰C unter Rühren durchgeführt. Dabei wurde derart belüftet, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als 30% der Sättigung. Nach 24-stündiger Fermentation wurde ein Teil der Brühe (9 1) in einen Fermenter (700 1) überführt, der 450 1 eines Mediums enthielt, das sich wie folgt zusammensetzte:

D-Glucose	(MD 30E) ·	2,8
Malzdextrin		27,8
Arkasoy 50		13,9
Melassen		1,7
K2HPO4		0,14
CaCO3	(Dow Corning)	1,39
Silikon 525	Vor der Sterilisierung auf pH 6,	0,06% (v/v)
	5 eingestellt.

Die Fermentation wurde bei 28⁰C unter Schütteln durchgeführt. Dabei wurde so stark belüftet, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als bei 20% Sättigung. Polypropylen 2000-Antischaum wurde erforderlichenfalls hinzugegeben. Nach 2 Tagen wurde der pH durch Zugabe von H-SO₄ auf 7,2 eingestellt. Die Fermentation wurde nach 5 Tagen geerntet.

Die Brühe (450 1) wurde durch Zentrifugieren geklärt. Der überstehende Rest wurde mit 20 1 Wasser verdrängt. Die gewonnen Zellen (25,5 kg) wurden 1 h in einem so großen Volumen Methanol gerührt, daß ein Gesamtvolumen von 75 1 erhalten wurde. Die Suspension wurde filtriert und der feste Rückstand wurde mit 35 1 Methanol reextrahiert und filtriert. Das vereinigte Filtrat (87 1) wurde mit 40 1 Wasser verdünnt und mit PE extrahiert. Nach 30 min wurden durch Zentrifugieren die Phasen getrennt. Die untere Methanolphase wurde mit 30 1 PE nach der Zugabe von 40 1 Wasser reextrahiert. Nach Abtrennen wurde die untere Phase wiederum mit 30 1 PE extrahiert. Die vereinigten PE-Phasen (85 1) wurden konzentriert, indem sie dreimal durch einen Pfandler 8.8-12V-27 wiped-film-Verdampfer (Dampfdruck 0,1 bar, Dampftemperatur 20°C, Wasserdampftemperatur 127⁰C) gegeben wurden. Das Konzentrat (9 1) wurde mit Natriumsulfat (2 Ig) getrocknet und bei ver-

minderten» Druck bei 40°C in einem Rota-Filmverdampfer eingeengt. Der ölige Rückstand {130 g) wurde in CHClgelöst, so daß 190 ml erhalten wurden. Dies wurde einer CCM unterworfen (gepackte Säule und gewaschen (500 ml) in CHCl₃). Fraktionen von etwa 40 ml wurden nach einem Vorlauf von 1 400 ml gesammelt.

Die Fraktionen 32-46 wurden vereinigt und zu einem öl (21,2 g) eingeengt. Die Fraktionen 47-93 wurden vereinigt und zu einem öl (20,1 g) eingeengt, das in CHCl₃:EA (3:1) gelöst wurde (50 ml). Dann wurde eine CCM durchgeführt, wobei Fraktionen von etwa 40 ml nach einem Vorlauf von 1 400 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen 22-36 wurden vereinigt und zu einem öl (3,1 g) eingeengt, das zu dem aus den Fraktionen 32-46 von der ersten Säule erhaltenen öl gegeben wurde. Die vereinigten öle wurden in siedendem Methanol (4 ml) gelöst, das dann zu heißem Propan-2-ol (20 ml) gegeben wurde, wobei nach Stehen kristalliner Faktor B (2,57 g) erhalten wurde.

Nach der Kristallisation des Faktors B wurde die Mutterflüssigkeit zu einem öl eingeengt, das in einem gleichen Volumen CH₂Cl₂ gelöst und auf eine Säule (30 χ 2,2 cm) von Merck Kieselgel 60 (70 - 230 mesh ASTM, Art.Nr. 7734; gepackt in CH-Cl-) gegeben wurde. Das Bett wurde mit CH₂Cl₂ (2-Bettvolumen) gewaschen und mit CHCl₃:EA (3:1) (2-Bettvolumen) eluiert. Nach Abziehen des Eluats wurde ein öl erhalten, das in Methanol gelöst wurde und mit dem eine präparative hplc an Spherisorb S5 ODS-2 (250 mm χ 20 mm, Phase Sep.Ltd.) durchgeführt wurde. Die Probe (5 ml) wurde während eines Zeitraums von 1 min auf die Säule gepumpt. Die Säule wurde mit Acetonitril: Wasser (7:3) bei den folgenden Bedingungen eluiert:

-3-8-

Zeit (min)	Fluß (ml/min)	) }	I ηjektions zeit
0,00 1 ,00	0,00 0,00
1 , 10	30,00
39,5C	30,00
40,00	35,00
75,00	35,00

Das von der hplc-Saule eluierte Material wurde UV-spextro~ skopisch bei 238 run überwacht. Einengen der vereinigten Fraktionen mit Peaks, die bei 26,3 min eiuj«rten, ergab den Faktor E als Feststoff. Einenger der vereinigten Fraktionen :sit Peaks, die bei 36,4 κ-".η eluierten, ergab den Faktor F als Feststoff. Die weiteren Charakter istika der Faktoren E und F s.i:»d nachfolgend beschrieben.

Beispiel 6

Eine nach 117 h geerntete Fermentationsbrühe {ähnlich der in Beispiel 2 hergestellten wurde in einem Autoklaven (121⁰C, 1 h) behandelt, auf Raumtemperatur gekühlt ü.-.d mit einem Magnetrührer gerührt, so daß eine homogene Zeilsuspension erhalten wurde. Zwei Portionen (2 ml) wurden zentrifugiert (12 0OC g; 2 min; Raumtemperatur . Die überstehenden Flüssigkeiten wurden dexantieit un\ die zurückbleibenden Zellen wurden in 2 al Wasser suspendiert, gründlich gemischt und wiederur zentrifugiert ("12 000 g; 2 min; Raumtemperatur) . Nach ' bdekantierer der überstehenden Flüssigkeiten wurden d e Zellen zweimal mit destilliertem Wasser (2 ; .1 Portionen' gewesenen. .-:.ie gewaschenen Zellen wurden dar.n gründlich entweder mit 2 ml Wasser oder mit 2 ml Mehanol vermischt und bei Raumtemperatur 1,5 h stehenc--lassen, wöbe", gelegentlich geschüttelt wurde. Die Suspensionen wurde::, wiederum

BAD ORIGINAL

zentrifugiert (12 OOO g; 2 min; Raumtemperatur) und die überstehenden Flüssigkeiten wurden sequentiell in Wasser verdünnt. Die Zellen von der wäßrigen Suspension wurden in Wasser resuspendiert und unmittelbar sequentiell in Wasser verdünnt. Portionen (10 μΐ) jeder dieser Verdünnungen wurden zu einer Suspension (200 μΐ) des Nematoden Caenorhabditis elegans in einer Pufferlösung gegeben, die Na₃HPO₄ (6 g/l), K₃HPO₄ (3 g/l), NaCl (5 g/l) und MgSO₄-7H₃O (0,25 g/l) enthielt und auf pH 7,0 eingestellt war. Nach 4 h wurden die Nematodensuspensionen begutachtet, um festzustellen, welche Verdünnungen der Testmischung eine völlige Inhibierung der Motalität (größer als 98%) der Nematoden in der Assay-Suspension bewirkt hatten. Es wurde gefunden, daß 1 zu 5, 1 zu 25, 1 zu 250 und 1 zu 500 Verdünnungen des Methanolextrakts, 1 zu 5, 1 zu 25, 1 zu 250, 1 zu 500 und 1 zu 1000 Verdünnungen der Zellsuspension und 1 zu 2, 1 zu 4 und 1 zu Verdünnungen des wäßrigen Extrakts eine derartige Inhibierung der Nematoden bewirkten, wenn 10 ul zu 200 μΐ der Nematodensuspensionen gegeben wurden.

Beispiel 7

250 ml Erlenmeyer-Kolben, die entweder 50 ml Medium A oder 50 ml Medium B enthielten, wurden mit 0,4 ml einer Sporensuspension von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 geimpft, die aus einem gemäß Beispiel 1 hergestellten dünnen Röhrchen stammte. Die das Medium A oder Medium B enthaltenden Kolben wurden 2 Tage bei 28⁰C QQ auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM (Durchmesser der Kreisbewegung: 50 mm) inkubiert. 8 ml Portionen aus jedem Medium wurden dann zum Animpfen von 2 1 Kolben mit flachem Boden eingesetzt, die 400 ml desselben Mediums (A bzw. B) enthielten. Diese Kolben wurden 2 Tage bei denselben Bedingungen inkubiert.

-4Θ-

Zwei 70 ml Fermenter wurden jeweils mit zwei Kolben des Mediums A angeimpft und ein weiterer 70 1 Fermenter wurde mit zwei Kolben des Mediums B angeimpft. Jeder Fermenter enthielt 40 1 des Mediums C.

Die Fermentationen wurden bei 34⁰C unter Schütteln durchgeführt, wobei so stark belüftet wurde, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als 30% des Sättigungsgehalts. Nach einer etwa 24-stündigen Fermentation wurde der pH durch Zugabe wäßriger H_SO. auf 7,2 eingestellt. Erforderlichenfalls wurde Polypropylenglykol 2000-Antischaummittel zugegeben. Nach 5 Tagen wurden diese Fermentationen geerntet und vereinigt.

Ein weiterer 70 1 Fermenter, der Medium B enthielt, dem Silicone 1520 (0,06%) zugegeben worden war, wurde ebenfalls mit zwei Medium B enthaltenden Kolben angeimpft. Die Fermentation wurde bei 28⁰C unter Schütteln durchgeführt. Dabei wurde so stark belüftet, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als 30% des Sättigungsgehalts. Erforderlichenfalls wurde Polypropylenglykol 2000 zugegeben, um die Schaumbildung unter Kontrolle zu halten. Nach 24 h wurde ein 9 1-Teil in einen 700 1-Fermenter überführt, der 450 1 Medium C enthielt.

Die Fermentation wurde bei 34⁰C unter Schütteln durchgeführt, wobei so stark gelüftet wurde, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als 30% des Sättigungsgehalts. Die Schaumbildung wurde durch Zugabe von Polypropylenglykol 2000 unter Kontrolle gehalten. Nach etwa 24 h wurde der pH durch Zugabe wäßriger H₃SO₄ auf 7,2 eingestellt. Die Fermentation wurde nach 4 Tagen geerntet und mit den drei oben beschriebenen 40 1 Fermentationen vereinigt.

Die vereinigten geernteten Brühen wurden zentrifugiert, Sharpies AS16PY bei etwa 120 l/h. Die im Zentrifugengefäß zurückbleibende überstehende Flüssigkeit wurde mit Wasser verdrängt.
5

Die gewonnenen Zellen {11,65 kg) wurden in Methanol (33 1) mit einem Silverson-Mischer emulgiert. Nach 60 min wurde die Suspension durch ein Twilltuch filtriert. Der Rückstand wurde erneut in Methanol (34 1) emulgiert. Nach 40 min wurde die Suspension erneut filtriert. Die Filtrate der beiden Methanolextraktionen wurden vereinigt.

Die vereinigten Extrakte (53,5 1) wurden mit Wasser (27 1) und PE (27 1) vermischt. Nach 20-minütigem Rühren wurden die beiden Phasen in einer Westfalia MEM 1256-Zentrifuge getrennt. Die untere wäßrige Methanolphase (70 1) wurde mit Wasser (37 1) und PE (27 1) vermischt und gerührt und wie zuvor getrennt. Die Grenzflächenemulsion in der PE-Phase wurde mit Aceton (4 1) gebrochen. Die untere wäßrige Methanolphase (108 1) wurde dann mit Wasser (40 1) und PE (27 1) ein drittes Mal vermischt und gerührt und wie zuvor getrennt, wobei Aceton (4 1) zum Klären der Grenzflächenemulsion eingesetzt wurde. Die drei Hexanextrakte wurden dann vereinigt.

Der vereinigte PE-Extrakt (85 1) wurde mit einem wipedfilm-Verdampfer (Dampfdruck 0,15 bar, Dampftemperatur 26°C) konzentriert. Das Konzentrat (3 1) wurde mit Natriumsulfat (2 kg) getrocknet und dann weiter bei vermindertem Druck bei 40°C eingeengt. Das erhaltene öl (639 g) wurde in 300 ml einer Mischung aus Chloroform und EA (3:1 Volumen/Volumen) gelöst und filtriert und durch ein Glasfaserpapier gewaschen. Das FiItrat und die zum Waschen eingesetzten Lösungsmittel (1060 ml)

wurden einer CCM unterworfen (Durchmesser 1500 mm χ 100 mm), wobei bei einer Flußrate von 6 l/h eluiert wurde.

Die zwischen 8,8 und 13,1 1 eluierte Fraktion wurde vereinigt und bei niedrigem Druck zu einem öl (56,3 g) eingeengt, während die zwischen 13,1 1 und 24,6 1 eluierte Fraktion in ähnlicher Weise bei niedrigem Druck zu einem hellgelben Feststoff (153,4 g) eingeengt wurde. Die erstere Fraktion enthielt im wesentlichen Faktor B, während letztere Fraktion eine Mischung der Faktoren A, B, C und D enthielt. Der Faktor B in dieser letzteren Fraktion wurde nach und nach entfernt, indem die zuvor beschriebene CCM-Chromatographie zweimal - das letzte Mal an frischem Silika - bei ähnlichen Bedingungen wiederholt wurde, wobei jedoch die Durchflußrate auf 3 l/h reduziert wurde.

Die die Faktoren A, C und D enthaltenden Peaks von der zweiten dieser Säulen wurden zwischen 8,8 und 17,6 1 eluiert, während der übrige Faktor B, der darin enthalten war, in der dritten Säule abgetrennt wurde, von der die Faktoren A, C und D zwischen 14 und 28 1 eluiert wurden. Dieses letzte Bulk-Eluat wurde bei vermindertem Druck zu einem Feststoff (114 g) eingeengt. Die den Faktor B von den beiden Säulen (7,5 - 8,8 1 bzw. 10,3 - 13,4 1) wurden zu ölen eingeengt (10,7 g bzw. 10 g) und mit dem von der ersten der drei Säulen erhaltenen öl vereinigt.

Die den Faktor B enthaltenden öle wurden in siedendem Methanol (25 ml) gelöst und mit siedendem Propan-2-ol (100 ml) vermischt. Nach Kühlen auf 4⁰C kristallisierte der Faktor B. Er wurde abfiltriert, mit 200 ml Methanol gewaschen, auf -20°C gekühlt und im Vakuum getrocknet.

Es wurden 25,3 g des Faktors B erhalten.

353279V
-#·

-43-

Der Feststoff von der dritten Silikasäule, der die Faktoren A, C und D enthielt, wurde im Vakuum bis zur Gewichtskonstante (87 g) getrocknet. Proben (20 g) dieses Feststoffs wurden in 190 ml Methanol gelöst und mit 7:3 (v/v) AcetonitrilrWasser auf 230 ml aufgefüllt. 5 ml Portionen dieser Lösung wurden dann chromatographiert an einer Säule (Durchmesser 250 mm χ 21,2 mm) von Spherisorb ODS-2 (Partikeldurchmesser 5 μΐη) , wobei 7:3 Acetonitril:Wasser als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die Durchflußrate wurde für etwa 10 s bei 20 ml/ min gehalten. Dann wurde sie gleichmäßig während eines Zeitraums von 22 min auf 34 ml/min erhöht und 3 min bei letzterem Wert gehalten. Die eluierten Faktoren wurden bei 238 nm detektiert. Der Faktor C wurde zwischen 11,0 und 13,4 min, der Faktor D zwischen 13,4 und 17,4 min und der Faktor A zwischen 17,4 und 23,0 min eluiert.

Die den Faktor C enthaltenden Fraktionen von jeder chromatographischen Trennung wurden vereinigt und bei vermindertem Druck zu einem Feststoff eingeengt. Die den Faktor A enthaltenden Fraktionen wurden in ähnlicher Weise zu einem Feststoff eingeengt. Die den Faktor D enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zu einem unreinen Feststoff (7 g) vereinigt. Dieser wurde in 65 ml Methanol wiederum gelöst, mit 7:3 Acetonitril:Wasser vermischt und wiederum an der zuvor beschriebenen Spherisorb ODS2-Säule chromatographiert, wobei jedoch die Durchflußrate bei 20 ml/min konstant gehalten wurde. Der Faktor D wurde nun zwischen 16 und 20 min eluiert.

Diese Fraktion von jedem Chromatographischen Lauf wurde vereinigt. Das vereinigte Eluat wurde zu einem Feststoff eingeengt. Die drei die Faktoren A, C und D enthaltenden Feststoffe wurden über P₂°5 ^^{m Va}^^uum bis ^zur Gewichtskonstante getrocknet (55 g, 7,0 g bzw. 1,21 g).

-44-

Von den vier nach diesem Verfahren isolierten Feststoffen konnte gezeigt werden, daß sie mit den authentischen Proben der Faktoren A, B, C und D übereinstimmen.

Beispiel 8

250 ml Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Medium B enthielten, wurden mit 0,5 ml einer Sporensuspension von jeweils Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, 12112, 12113 und IQ 12114 beimpft, welche von den gemäß Beispiel 1 hergestellten dünnen Röhrchen genommen wurden.

Die Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112 und NCIB 12113 enthaltenden Kolben wurden auf einem Drehschüttler bei 31⁰C inkubiert. Der Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12114 enthaltende Kolben wurde 2 Tage bei 28⁰C inkubiert. Dann wurde 1 ml der Brühe zu einem weiteren 250 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert, der 50 ml Medium B enthielt. Dieser Kolben wurde auf einem Drehschüttler bei 31⁰C inkubiert. Alle Kolben wurden bei 250 UpM geschüttelt (Kreisdurchmesser 50 mm) .

Nach 4-tägiger Inkubation wurde ein 10 ml-Probe jeder Brühe bei 1 250 g 45 min zentrifugiert und wie folgt weiterverarbeitet. Das Pellet wurde in 10 ml Methanol resuspendiert. Die Suspension wurde heftig geschüttelt und 1 h stehengelassen, wobei gelegentlich gemischt wurde. Die Suspension wurde dann bei 10 000 g 5 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels hplc (S5 ODS-2, 10 cm χ 4,6 mm, 70% CH-jCN/0,1M NH₄H₂PO₄) analysiert. Die Peaks wurden bei 246 nm überwacht .

Die hplc-Analyse zeigte, daß die Faktoren A, B, C und D in jedem Fall vorhanden waren.

Beispiel 9

-4-5-•Βλ-

Es wurde festgestellt, daß die Faktoren A, B, C, D, E und F die folgenden Charakteristika besitzen: 5

i) Sie enthalten lediglich Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff.

ii) Die Elektronenstoß (E.I.)-Massenspektroskopie der Faktoren A, B, C₁ D, E und F führte zu folgenden Ergebnissen:

Faktor	Molekülion	entspricht der Brutto-
		formel
A	612.37	C36H52°8
B	598.35	C35H5O°8
C	584.3 4	C34H48°8
D	598.35	C35H5O°8
E	612.3638	C36H52°8
F	626.3807	C37H54°8

Die Fast Atom Bombardment (FAB)-Massenspektroskopie führte zu folgenden Ergebnissen:

25	Faktor	+ve FAß	-ve	FAB	Molekular gewicht
	A	M/Z 635[M+Na]+	Μ/Ζ	611[M-HJ-	612
		M/Z 613[M+H]+
	8	M/Z 69i[M+H+qlycerol]+			598
30		Μ/Ζ 599[M+H]+
		Μ/Ζ 581[MH-H2O]+
		Μ/Ζ 563[ΜΗ-2Η2θ]+
35	C	Μ/Ζ 607[M+Na]+	Μ/Ζ	583[M-H]-	58Α
	0	Μ/Ζ 621[M+Na]+	Μ/Ζ	597[M-Hj-	598

Die Felddesorptionsmassenspektroskopie des Faktors E führte zu: Μ/Ζ 612 M und die des Faktors F zu: M/Z 626 M⁺. Ein E.I.-Spektrum des Faktors A, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei:

612.37 C₃₆H₅₂O₈; 466.31 C₃₀H₁₄₂O,; 448.30 C₃₀H₁₄₀O₃; 425.23 C₂₆H₃₃O₅; 354.22 C₂₃H₃₀O₃; 297.22 C₂₁H₂₉O; 278.11 C₁₅H₁₈O₅; 247.17 C₁₆H₂₃O₂; 219.18 C₁₅H₂₃O;

95.05 C₆H₇O.
10

Ein E.I.-Spektrum des Faktors B, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei:

598.35 C₃₅H₅₀O₈; 438.28 C₂₈H₃₈O₁₄; 420.26 C₂₈H₃₆O₃;

314.19 C₂₀H₂₆O₃; 248.14 C₁₅H₂₀O₃; 151.08 C₉H₁₁O₂. 15

Ein E.I.-Spektrum des Faktors C, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei:

584.34 C₃₄H₄₈O₈; 566.33 C₃₄H₄₆O₇; 438.28 C₂₈H₃₈O₄.

Ein E.I.-Spektrum des Faktors D, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei:

598.35 C₃₅H₅₀O₈; 452.29 C₃₉H₄₀O₄; 434.28 C₂₉H₃₃O₃.

Ein genaue Messung der Masse des Faktors E bei der E.I.·

Ionisation ergab ein Ion bei: 452.2908 C_nH.-Ό,; für ³ 29 40 4

den Faktor F ergab sich ein Ion bei: 466.3067 C,_H„„O,.

30 24 4

iii) Die Faktoren A, B, C, D, E und F besitzen in Bromoform charakteristische IR-Spektren, wozu folgende

^UW Peaks gehören:

Für Faktor A bei etwa 3510 (OH), 1712 (Ester) und 998 cm"¹ (C-O);

für Faktor B bei etwa 3510 (OH), 1710 (Ester) und

996 cm"¹ (C-O);
35

Faktor C zeigt Peaks bei etwa 3510 (OH), 1712 (Ester) und

996 cm"¹ (C-O); Faktor D zeigt Peaks bei etwa 3508 (OH), 1711 (Ester)

und 996 cm"¹ (C-O); Faktor E zeigt Peaks bei etwa 3500 (OH), 1708 (Ester)

und 994 cm"¹ (C-O); und Faktor F zeigt Peaks bei etwa 3500 (OH), 1708 (Ester)

und 997 cm"¹ (C-O).

Die vollständigen Spektren für die Faktoren A, B, C, D und F sind in den Figuren 1, 2, 3, 4, 6 und 7 der nachfolgenden Zeichnungen gezeigt.

Iv) Die Faktoren A, B, C, D, E und F besitzen in Methanol (c= 0,002%) folgende UV-Spektren (I = Beugung und M = Maximum):

Faktor	Mnm)	(I)	£}	Faktor	λ(ηιη)	(I)	ü
A	252	(M)	318	0	252	(M)	263
	244.5	(I)	468		244.5	(I)	393
	239	(I)	430		239	(I)	362
B	252	(M)	302	* E	252	(M)	266
	244.5	(I)	426		244	(M)	402
	239	(I)	394		238	(I)	373
C	252	(M)	316	* F	252	(M)	285
	244.5	(D	470		244,5	(U)	421
	239	432		239	389

*Methanol c = 0,001%

Es ist festzuhalten, daß die E^-Werte die Reinheit des erhaltenen Materials wiederspiegelt, während die oben aufgeführten X_max-Werte für jeden Faktor charakteristisch sind. Jedoch sind die Verhältnisse der E: charakteristisch für die Verbindung per se.

v) Ein 200 MHz-Protonen-NMR-Spektrum einer Lösung jedes Faktor in Deuterochloroform ergibt unter anderen folgende Signale [die Tl -Werte sind zusammen mit den Multiplizitäten, den Koppelungskonstanten (Hz) und den Werten für die Integrale in Klammern angegeben]:

Faktor A : 4.1 to 4.4(m,2H);4.61 ( breit,s,1H);4.6 to 4.75(m,2H); 4.81(d,9,1H); 5.05(m,1H);5.34(s,2H);5.69(d,5,1H); 6.06(d,5,1H);

' 6.17(m,1H); 6.26(d,11,1H);6.37(m,1H);6.46(d,10,1H); 6.74(q,2,1H);

7.42(m,1H);7.7 - 7.9(m,5H); 8.14(s,3H); 8.40(s,3H); 8.47(s,3H); 8.61(t,11,1H); 8.96(d,7,3H); 9.06(d,7,3H); 9.02(d,7,3H); 9.13(q,11,1H); 9.21(d,7,3H).

faktor B : 4.2 - 4.4(m,2H); 4.55(q,7,1H); 4.65(breit ,s,1H); 4.6 -

2E

4.8(m,2H); 5.06(m,1H); 5.3 - 5.5(m,2H); 6.01(d5,1H); 6.07(d_f5,1H>; 6.12(s,1H); 6.24(d,11,1H); 6.24(m,1H); 6.3 to 6.5(m,2H); 6.53(s,3H); 6.73(q,2,1H); 7.62(m,1H); 7.6-8.0(m,4H); 8.22(s,3H); 8.35(d,7,3H); 8.41(s,3H); 8.49(s,3H); 8.62(t,11,1H); 9.03(d,6,3H); 9.12(q,11,1H); 9.22(d,7,3H).

Faktor C : 4.29(d,11,t,2,1H);4.4 - 4.6(m,3H);4.56(breit s,1H); 5.14(dd,i5,10,1H); 5.23(m,1H); 5.65 (breit,3,2H); 5.72(d,6,1H); 5.95(d,10,1H); 5.99(d,6,1H); 6.08foreit, s,1H); 6.1 - 6.4(m,3H); 6.62(q,3,1H); 7.7 - 8.1(m,ca7H);8.18(s,3H); 8.33(s,3H);

-SS- 8.48(d,7,3H);8.64(s,3H);8.68(t,11,1H); 9.00(d,7,3H); 9.08(d,7,3H);

9.12(q,12,lH).

Faktor 0 : A.18 - 4.4 (m,2H); 4.47 - 4.81 (m,4H); 5.04 (m,lH);

5.35 (s,2H); 5.72 (d,7,lH); 6.07 (d,7,lH); 6.15 - 6.45 (m,4H); 6.74 (q,4,lH)7.45 - 8.1 (m,8H); 8.16 (s,3H);8.41 (s,3H);8.49 (s,3H);8.62 (t, 11,IH); 8.92 - 9.05 (m,6H);9.21 (d,7,3H).

Faktor E: 4.1 - 4.3 (m,2H); 4.5 - 4.8 (m,4Hgesamt); 5.04 (m,1H); 5.2 - 5.5 (m,2H); 6.01 (d,5,1H);6.05 (d,5,1H); 6.11 (s,1H); 6.1 6.4 (m,3H);6.45 (d,10,1H); 6.51 (s,3H);6.70 (q,2,1H); 7.60 (m,1H);8.20 (s,3H); 8.41 (s,3H); 8.47 (s,3H); 8.60 (t,11,1H);9.00 (t,7,3H); 9.02 (d,6,3H);9.11 (q,11,1H);9.20 (d,7,3H).

Faktor F: 4.2 - 4.4 (m,2H); 4.62 (s,1H); ca 4.70 (m,2H); 4.80 (d,9,1H); 5.04 (m,1H); 5.2 - 5.5 (m,2H); 5.99 (d,5,1H); 6.05 (d,5,1H);6.11 (s,1H); 6.1 - 6.3 (m,2H); ca 6.36 (m,1H);6.45 (d,10,1H); 6.51 (s,3H); 6.70 (q,2,1H);7.42 (m,1H);7.58 (m,1H); 8.19 (s_t3H);8.40 (s,3H);8.47 (s,3H);8.60 (t,11,1H); 8.95 (d,7,3H);9.05 (d,7,3H);9.01 (d,7,3H); 9.10 (q,11,1H); 9.21 (d,6,3H).

vi) Ein rausch-entkuppeltes 25,05 MHz C-NMR-Spektrum einer Lösung jedes Faktors in Deuterochloroform ergibt unter anderem folgende Peaks ί die δ-Werte sind mit den Multiplizitäten der Signale im Off-Resonanzspektrum in Klammern angegeben]:

Faktor A: 173.2(s); 142.6(d); 139.2(s); 137.6(s); 137.Ks); 137.0(d); 130.4(s); 123.Kd); 120.Kd) ;117.8(d); 99.5(s); 80.0(s); 79.0(d); 76.5(d); 69.0(d); 68.3»; 67.4(d); 48.2(t>; 45.5(d); 40.9(t); 40.5(t); 35.8*; 34.5(t); 22.Kq); 34.5(t); 26.6(d); 22.6(q); 22.0(q);

19.7(q); 15.3(q); 13.7(q);10.8(q).

* fiiltiplizität unsicher

Faktor 8: 173.4(s); 142.Kd); 139.5(s); 137.Ks); 135.7(s);

133.7(s); 123.6(d); 123.3(d);12O.O(d);1i9.3(d); 118.2(d); 99.5(s);

80.Ks); 77.3(d);76.6(d);76.4(d); 69.0(d) ;68.3(d);67.9 »;67.6 *;57.5(q);48.2(t); 45.4(d); 40.7(t); 40.5(t); 35.8*; 34.5(t); 22.Kq);

19.6(q); 15.3(q);13.6(q); 12.9(q); 10.5(q).

Faktor C : 173.3(s); 142.2(d); 140.3(s); 138.5(s); 137.0(s);

134.9(s); 123.9(d); 121.Kd); 120.6(d); 118.Kd); 100.2(s); 80.6(s); 10

80.1(d); 77.4(d);69.2(d);69.0(d); 68.3 *;68.0(d); 67.9(d);48.6(t);

46.3(d);41.4(t); 36.5 *;36.3 *;36.1(d);35.0(t); 22.6(q);20.0(q); 15.4(q);14.3(q);13.1(q);10.8(q).

Faktor D; 173.2 (s); 142.5 (d); 139.1 (s); 137.5 (s); 137.1 (s); 132.1 (s); 131.4 (d); 123.1 (d);120.1 (d);1i7.8 (d); 99.5 (s); 79.9 (s); 79.2 (d); 76.5 (d);69.0 (d); 68.3*;68.1*;67.6·; 67.4 ♦; 48.2 (t);45.5 (d);40.8 (t); 40.5 (t);35.7 ·;34.5 (t);22.O (q);20.6 (t);19.6 (_q). I5.3q);13.7 (q);13.6 (q);10.7 (q).

Multiplizität unsicher

vii) Zirkulardichroismoskurven für die Faktoren A, B, C und D (ca. 0,1%-ige Lösungen in Methanol) sind in Fig. 8 gezeigt. Die Kurven sind im Bereich von 230 bis 260 nm, sehr ähnlich. In diesem Bereich absorbiert der Dienchromophor. Dies zeigt an, daß die absoluten Konfigurationen an C~, C₇, C₇ und C.Q für alle Faktoren die gleichen sind.

Nachstehend sind Beispiele für erfindungsgemäße Formulierungen aufgeführt. Der verwendete Ausdruck "Wirkstoff" bezeichnet eine erfindungsgemäße Verbindung und kann beispielsweise für einen der

5 Faktoren A, B, C, D, E oder F stehen.

Parenterale Multidosisinjektion

Wirkstoff Benzylalkohol Glyceryltriacetat Propylenglykol auf

% G/V

4,0 2,0 30,0 100

Bereich 1 - 5 % G /V

Man löst den Wirkstoff in Benzylalkohol und Glyceryltriacetat. Man gibt Propylenglykol bis zum gewünschten Volumen zu. Man filtriert die Lösung, um partikelförmige Verunreinigungen zu entfernen. Das Produkt füllt man aseptisch in Injektionsampullen und verschließt mit Gummiverschlüssen oder Gummistopfen, die mit Aluminiumdeckelverschlüssen in Lage gehalten werden. Zum Schluß wird das Produkt durch Erhitzen in einem Autoclave sterilisiert.

Aerosolspray

% G/G

Wirkstoff	0,1
Trichlorethan	29,9
Trichlor fluorine than	35,0
Dichlordifluormethan	35,0

Bereich 0,1 - 0,50 % G/G

Man mischt den Wirkstoff mit Trichlorethan und füllt in einen Aerosolbehälter. Den Luftraum im Flüssigkeitsbehälter spült man mit dem gasartigen Treibmittel. Dann befestigt man das Ventil. Man füllt das erforderliche Gewicht des flüssigen Treibmittels unter Druck durch das Ventil ein. Man stattet mit einer Betätigungsvorrichtung und mit Staubkappen aus.

Tablette

Herstellungsverfahren - Naßgranulierung

	250,0
1 !	4,5
5 '■	22,5
2 '■	9,0
1 ί	4,5
i G/G
h G/G
t G/G
i G/G

mg

Wirkstoff Magnesiumstearat

Maistärke Natriumstärkeglykolat Natriumlaurylsulfat

Mikrokristalline Cellulose bis zu einem Kerngewicht der

Tablette von 450 mg 25

Zu dem Wirkstoff gibt man eine so große Menge einer 10%-igen Stärkepaste, das man eine für die Granulierung geeignete nasse Masse erhält. Man stellt die Kügelchen her und trocknet unter Verwendung eines Boden- oder Flüssig-

bettrockners. Man siebt durch ein Sieb, gibt die übrigen Bestandteile zu und komprimiert zu Tabletten.

Erforderlichenfalls kann man die Tablettenkerne mit einem Film überziehen, wobei Hydroxypropylmethylcellulose oder ein anderes ähnlich filmbildendes Material einsetzt, wobei

wobei man entweder ein wäßriges oder nicht-wäßriges Lösungsmittelsystem zur Anwendung bringt.

Der Lösung für den Filmüberzug kann ein Weichmacher oder ein geeigneter Farbstoff einverleibt sein.

Veterinärtablette für kleine Tiere oder Haustiere Herstellungsverfahren - Trockengranulierung

mg ^y

Wirkstoff 50,0.

Magnesiumstearat 7,5

Mikrokristalline Cellulose bis zu einen Gewicht des Tablettenkerns von 75,0

Man vermischt den Wirkstoff mit Magnesiumstearat und mikrokristalliner Cellulose. Die Mischung kompaktiert man zu Rohlingen. Man zerbricht die Rohlinge, indem man sie durch einen Rotationsgranulator gibt, um freifließende Tabletten zu produzieren. Man komprimiert zu Tabletten. Die Tablettenkerne kann man gewünschtenfalls wie zuvor beschrieben mit einem Filmüberzug ausstatten.

Veterinäre intrammäre Injektion

mg/Dosis Bereich

Wirkstoff 150 mg 150 - 500 mg

Polysorbat 60 3,0% g/G bis 3 oder 5 g

3g weißes Bienenwachs 6,0% G/G bis 3 g bis 3 oder 5 g

Erdnußöl 91,0% G/G bis 3 oder 5 g

Man erhitzt das Erdnußöl, das Bienenwachs und PoIy-

sorbat 60 auf 160⁰C, wobei man rührt. Man hält 2 Stunden bei 160 C und kühlt dann unter Rühren auf Raumtemperatur ab. Den Wirkstoff gibt man aseptisch zu dem Träger und dispergiert unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsmischers. Man macht das Produkt feiner, indem man es durch eine Kolloidmühle gibt. Man füllt das Produkt aseptisch in sterile Plastikspritzen.

Veterinärer oraler Arzneitrank

% G/V Bereich

Wirkstoff 0,35 0,05 - 0,50 % G/V

Polysorbat 85 5,0

Benzylalkohol 3,0

Propylenglykol 30,0

Phosphatpuffer bis pH 6,0 - 6,5

Wasser auf 100,0

Man löst den Wirkstoff in Polysorbat 85, Benzylalkohol und Propylenglykol. Man gibt einen Teil des Wassers zu und stellt erforderlichenfalls mit dem Phosphatpuffer auf pH 6,0 bis 6,5 ein. Man gibt das restliche Wasser bis zum gewünschten Volumen zu. Man füllt das Produkt in Arzneitrankbehälter.

Veterinäre orale Paste

	% G/G	Bereich
Wirkstoff	7,5	1 - 10 % G/G
Saccharin	25,0
Polysorbat 85	3,0
Alumaniumdistearat	5,0
fraktioniertes Kokusnußöl	bis 100,0

Man dispergiert das Aluminiumstearat in dem fraktionierten Kokusnußöl und Polysorbat 85, wobei man erhitzt. Man kühlt auf Raumtemperatur ab und dispergiert das Saccharin in dem öglichen Träger. Man dispensiert den Wirkstoff in der Basis. Man füllt in Plastikspritzen.

Kügelchen zur Verabreichung an Tiere im Futter

% G/G Bereich

Wirkstoff 2,5 0,05 - 5 % G/G

!5 Kalksteinmehl bis 100,0

Man vermischt den Wirkstoff mit dem Kalksteinmehl. Man stellt Kügelchen nach einem Naßgranulierungs-Verfahren her. Man trocknet unter Verwendung eines Boden- oder Flüssigbettrockners. Man füllt in die geeigneten Behälter.

Emulgierbares Konzentrat

Wirkstoff 50 g

Anionischen Emulgator 40 g

(z.B. Phenylsulfonat CALX)

nicht-ionische Emulgator 60 g (z.B. Syperonic NP13)

aromatisches Lösungsmittel
(z.B. Solvesso 100) bis 1 1

Man mischt alle Bestandteile und rührt, bis sich alles gelöst hat.

50	g	1	kg
40	g	g
bis	g
50	1	kg
40
bis

Granulat (Kügelchen)

a) Wirkstoff Baumharz Gipskügelchen (20 - 60 Mesh)

(z.B. Agsorb 100A) 10

b) Wirkstoff Syperonic NP Gipskügelchen (20 - 60 Mesh)

Man löst alle Bestandteile in einem flüchtigen Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, und gibt zu den Kügelchen im Trommelmischer. Man trocknet, um das Lösungsmittel zu entfernen.

Die Aktivität der Faktoren A, B, C, D und F wurde mit Hilfe einer Vielzahl von Schädlingen und deren Wirten bestimmt. Dazu zählen die folgenden:

Tetranychus urticae (Feuerbohne und Myrobalan B Pflaume),

Myzus persicae (Chinakohl und Rettich), Heliothis 25

virescens (Baumwolle), Chilo portellus (Rapsbohne), Meloidogyne incognita (Mungobohne) , Panonchus ulmi (Myrobalan B Pflaume), Phorodon humuli (Hopfen), Aulacorthum circiumflexum (Alpenveilchen).

Das Produkt wurde als Flüssigpräparat eingesetzt. Die Präparate wurden durch Lösen der Produkte in Aceton hergestellt. Die Lösungen wurden dann mit Wasser verdünnt, das 0,1 % oder 0,01 Gew.-% eines Netzmittels enthielt,

bis die Flüssigpräparate die erforderliche Produkt-35

konzentration enthielt.

Die Testverfahren wurden dem jeweiligen Schädling angepaßt. Dazu wurden eine Anzahl von Schädlingen auf ein Medium gegeben, das gewöhnlich eine Wirtspflanze darstellt. Dann wurde das Medium mit dem Präparat behandelt (Residualtest) . Irn Fall von Tetranychus urticae wurden sowohl die Schädlinge als auch das Medium mit dem Präparat behandelt (Kontakttest).

Bei diesen Tests wurde gefunden, daß die Faktoren A, B, C, D und F in Konzentrationen (bezogen auf das Gewicht des Produktes) von 500 Teilen pro Million oder weniger wirksam waren.

- Leerseite -

Claims (24)

3532734 PATENTANSPRÜCHE

1. Verbindungen mit folgender Teilformel (I):

OH

( I

CH₃

2. Verbindungen nach Anspruch 1 mit der folgenden Teilformel (II) :

OH

3. Verbindungen nach Anspruch 2 der folgenden allgemeinen Formel (III):

CH₃

[M)

worin R eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe

2
und R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe

bedeuten.

4. Verbindung nach Anspruch 3, bei der R eine Iso-

2
propylgruppe und R ein Wasserstoffatom bedeuten.

5. Verbindung nach Anspruch 3, bei der R eine Methylgruppe und R ein Wasserstoffatom bedeuten.

6. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche im wesentlichen frei von anderen Makroliden.

7. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in im wesentlichen reiner Form.

8. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Mischung mit mindestens einer weiteren Verbindung nach einem dieser Ansprüche; oder eine Mischung der Ver-

bindungen nach Anspruch 3, worin R ein Wasserstoffatom bedeutet; oder eine Mischung der Verbindungen

2
nach Anspruch 3, worin R eine Methylgruppe bedeutet.

9. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Form der gesamten Fermentationsbrühe, die mindestens eine solche Verbindung enthält; die Feststoffe der gesamten Fermentationsbrühe, die mindestens eine solche Verbindung, die aus einer derartigen Brühe abgetrennten unze-rstörten oder lysierten Myzele oder die Feststoffe einer solchen Brühe nach Abtrennung der unzerstörten oder lysierten Myzele enthält; oder diese Brühe nach Abtrennung der Myzele.

10. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 3 als Antibiotika zur Behandlung von Mensch und Tier.

11. Schädlingsbekämpfungsmittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 9 zusammen mit einem oder mehreren Trägern und/oder Exzipienten.

12. Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung nach Anspruch 3 gewünschtenfalls zusammen mit einem oder mehreren grenzflächenaktiven Mitteln, Mitteln, welche ein Zusammenbacken verhindern, Antischaummitteln, Viskositätsregulatoren, Bindemitteln, Klebemitteln, Düngemitteln, Stabilisierungsmitteln oder anderen Additiven oder wirksamen Bestandteilen enthält.

13. Pharmazeutisches Mittel für die Human- oder Veterinärmedizin, enthaltend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zusammen mit einem oder mehreren Trägern und/oder Exzipienten.

14. Mittel nach Anspruch 13 für die Veterinärmedizin, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere der Verbindungen nach Anspruch 3 mit mindestens 50%iger Reinheit enthält und in einer für die parenterale (einschließlich intramammäre), orale, rektale oder topische Verabreichung oder zur Verwendung als Implantat geeigneten Form vorliegt.

15. Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mischung der wirksamen Verbindungen enthält, welche im wesentlichen aus einer oder mehreren Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bestehen.

16. Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verbindung nach Anspruch 4 oder Anspruch 5 enthält.

17. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus des Genus Streptomyces unter Bildung dieser Verbindungen kultiviert und gewünschtenfalls anschließend eine oder mehrere dieser Verbindungen aus der Fermentationsbrühe abtrennt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,

daß man als Mikroorganismus Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 oder einen Mutanten davon oder ein anderes Mitglied der Spezies Streptomyces thermoarchaensis einsetzt.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Myzele des Mikroorganismus mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in Kontakt bringt, um eine oder mehrere Verbindungen nach Anspruch 1 daraus zu extrahieren.

1 20. Makrolide, die durch Fermentation von Streptomyces thermoarchaensis herstellbar sind.

21. Mikroorganismen der Spezies Streptomyces 5 thermoarchaensis.

22. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 und Mutanten davon.

10 23. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 und NCIB 12114 und Mutanten davon.

24. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen

bis 9 zur Bekämpfung von Infektionen oder von Schädel 5 lingsbefall, beispielsweise in der Landwirtschaft, im Gartenbau oder in der Forstwirtschaft.