PL152148B1 - Antibiotic compounds and their preparation - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 152 148 POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 85 09 13 (P. 255360)

Int. Cl.⁵ C12P 17/08

Pierwszeństwo: 84 09 14 dla zastrz. 1-4

Wielka Brytania f 6 Ó_L H

12 21 dla zastrz. 5-7

Wielka Brytania

Zgłoszenie ogłoszono: 88 02 18

Opis patentowy opublikowano: 1991 06 28

Twórca wynalazku —

Uprawniony z patentu: Glaxo Group Limited,

Londyn (Wielka Brytania)

Sposób wytwarzania nowych antybiotyków S541

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych antybiotyków S541, zwłaszcza sposobu ich wytwarzania na drodze fermentacji mikroorganizmu Streptomyces.

Nowe antybiotyki S541 wytwarza się w kontrolowanych warunkach hodowli wymienionego szczepu mikroorganizmu. Antybiotyki S541 wykazują działanie antybiotyczne, a w szczególności przeciw-pasożytom wewnętrznym (bytującym wewnątrz swego gospodarza), przeciw-pasożytom zewnętrznym, grzybobójcze, owadobójcze, roztoczobójcze i nicieniobójcze i są szczególnie interesujące do zastosowania w rolnictwie, ogrodnictwie oraz do leczenia ludzi i zwierząt. Związki te mogą być również stosowane jako związki wyjściowe do wytwarzania innych związków aktywnych. Nowe związki wytwarza się na drodze fermentacyjnej i wydziela w zasadniczo czystej postaci, co opisano poniżej bardziej szczegółowo.

Antybiotyki S541 stanowią grupę związków o cząstkowym wzorze 1, a zwłaszcza o cząstkowym wzorze 2.

Sześć związków o cząstkowym wzorze 2 opisano bardziej szczegółowo poniżej.

Niniejszy wynalazek dotyczy związków o powyższych cząstkowych wzorach zarówno indywidualnych jak i w połączeniu.

Dla niektórych zastosowań, np. w rolnictwie i ogrodnictwie albo w lecznictwie weterynaryjnym może być bardziej odpowiednie zastosowanie Antybiotyku S541 bez rozdzielania na poszczególne składniki, natomiast dla innych zastosowań, np. do leczenia ludzi stosuje się rozdzielanie w celu użycia poszczególnych składników. Tak więc, związki sposobem według wynalazku wytwarza się zarówno w postaci mieszaniny jednego związku z co najmniej jednym innym związkiem, jak również jako poszczególne związki w zasadniczo czystej postaci lub zasadniczo pod nieobecność innych związków makrolidowych.

Antybiotyki S541 można łatwo rozdzielić na drodze chromatografii jak opisano poniżej na dwa składniki o właściwościach antybiotycznych, np. działaniu przeciw robakom, a których fluorescencja U.V. występuje przy 254 nm. Składnik I charakteryzuje się wartością Rf w zakresie 0,70-0,75, a składnik II wartością Rf w zakresie 0,39-0,46, przy czym wartość Rf określano

152 148 chromatografią cienkowarstwową na 60 płytkach z żelem krzemionkowym Merck 5735 eluując mieszaniną chloroformu i octanu etylu (3:1). Składniki I i II, w których R2 oznacza odpowiednio -CH3 lub -H antybiotyków S541 tworzą dalsze cechy charakterystyczne wynalazku. Same składniki I i II mogą być oczyszczane i uzyskuje się sześć związków o cząstkowym wzorze 1 wykazujących działanie antybiotyczne, np. działanie robakobójcze. Tak więc, sposobem według wynalazku wytwarza się związki o ogólnym wzorze 3, w którym R¹ oznacza grupę metylową, etylową lub izopropylową, a R² oznacza atom wodoru lub grupę metylową.

Oznaczono sześć związków o wzorze 3, jako faktor A, (R1 = izopropyl, R2 — wodór), faktor B (R1 — metyl, R2 = metyl), faktor C (R1 = metyl, R2 = wodór), faktor D (R1 — etyl, R2 = wodór), faktor E (R1 =etyl, R2 = metyl) i faktor F (R1 = izopropyl, R2 = metyl). Szczególnie korzystne są faktory A i C.

Faktory B, E i F otrzymano ze składnika I, natomiast faktory A, C i D otrzymano ze składnika II.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mają działanie antybiotyczne, np. działanie robakobójcze, takie jak działanie przeciw obleńcom, a w szczególności przeciw pasożytom wewnętrznym i zewnętrznym. Ogólnie, nowe związki służą do zwalczania pasożytów zarówno wewnętrznych jak i zewnętrznych. Pasożyty zewnętrzne i wewnętrzne zakażają ludzi oraz różne zwierzęta i szczególnie często występują na fermach zwierząt, takich jak świnie, owce, bydło, kozy i drób, konie i u zwierząt domowych, takich jak psy i koty. Zakażenie inwentarza powoduje anemie, zmniejszoną przyswajalność pokarmu i spadek ciężaru ciała, co z kolei jest przyczyną strat ekonomicznych na świecie. Przykładami tego rodzaju pasożytów wewnętrznych atakujących zwierzęta i/lub ludzi są Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Necator, Nematodirus, Nematospiroides, Nippostrongylus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris i Uncinaria.

Przykładami pasożytów zewnętrznych infekujących zwierzęta i/lub ludzi są stawonogi, takie jak wszoły (owady kąsające), mucha stajenna, pchły, wszy, roztocze, pluskwy, kleszcze oraz inne szkodniki dwuskrzydłowe. Przykładami tego rodzaju pasożytów zewnętrznych atakujących ludzi i/lub zwierzęta są Ambylomma, Boophilus, Coroptes, Culliphore, Damodex, Damolinia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis. Hyalomma, Linognathus, Lucilia, Melophygus, Oestrus, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes i Stomoxys.

Stwierdzono, że związki wytwarzane sposobem według wynalazku są skuteczne zarówno in vitro jak in vivo przeciw pasożytom zewnętrznym i wewnętrznym. W szczególności stwierdzono, że związki wytwarzane sposobem według wynalazku są aktywne przeciw pasożytom nicieniowatym, takim jak Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus colubiformis, Dictyocaulus viviparis, Cooperia oncophera, Ostertagia ostertagi i Nippostrongylus braziliensis oraz pasożytniczym roztoczom, takim jak Sarcoptes i Psoroptes sp.

Tak więc, związki wytwarzane sposobem według wynalazku są użyteczne do leczenia zwierząt i ludzi zarażonych zarówno pasożytami zewnętrznymi i/lub wewnętrznymi.

Gatunki pasożytów dla różnego rodzaju żywicieli, na których pasożytują są bardzo różne i infekcje atakują różne miejsca. Na przykład Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta i Trichostrongylus colubiformis zasadniczo atakują owce i umiejscawiają się w żołądku i jelicie cienkim, natomiast Dictyocaulus viviparus, Cooperia oncophora i Ostertagia ostertagi zasadniczo infekują bydło i głównie umiejscawiają się odpowiednio w języku, jelicie lub żołądku.

Ponadto stwierdzono, że związki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują działanie przeciw-grzybicze, np. przeciw szczepom Candidia sp., takim jak Candidia albicans i Candidia glabrata oraz przeciw-drożdżom, takim jak Saccharomyces carlsbergensis.

Stwierdzono również, że związki wytwarzane sposobem według wynalazku są skuteczne do zwalczania szkodliwych owadów, przędziorkowatych, roztoczy i obleńców w rolnictwie, ogrodnictwie, leśnictwie, służbie zdrowia i podczas składowania produktów. Można nimi skutecznie zwalczać szkodniki gleby i roślin uprawnych, takich jak rośliny zbożowe, np. pszenicy, jęczmienia, kukurydzy i ryżu, warzyw, np. soi, owoców, np. jabłek, winogron i cytrusów, jak również roślin korzeniowych, np. buraka cukrowego i ziemniaków.

152 148

W szczególności stwierdzono, że związki według wynalazku są aktywne przeciw mszycom i roztoczom roślin owocowych, takim jak Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon Humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae i innym osobnikom rodzaju Trialeuroides; nicieniowatym, takim jak osobniki rodzaju Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne i Panagrellus; łuskowatym, takim jak Heliothis, Plutella i Spodoptera; wołkom zbożowym, takim jak Anthonomus grandis i Sitophilus granarius; mącznikom młynarkom, takim jak Tribolium castaneum; muchom, takim jak Musca domestica; mrówkom; owadom minującym liście; Pear psylla; Thrips tabaci; karaluchom, takim jak Blatella germanica i Periplaneta americana, i moskitom, takim jak Aedes aegypti.

Związki o cząstkowym wzorze 1 określonym powyżej za wyjątkiem związków o wzorze 1, w którym podstawnik w położeniu 25 oznacza grupę metylową, etylową, propylową lub butylową mogą być stosowane jako antybiotyki. W szczególności stosuje się je do leczenia zwierząt i ludzi zakażonych pasożytami wewnętrznymi, zewnętrznymi i/lub grzybami oraz w rolnictwie i ogrodnictwie albo leśnictwie jako środki szkodnikobójcze do zwalczania szkodliwych owadów, roztoczy i nicieni. Zasadniczo stosuje się je jako środki szkodnikobójcze do zwalczania szkodników egzystujących, np. w przechowalniach, budynkach lub innych miejscach publicznych albo innych miejscach wegetowania szkodników. Ogólnie, związki stosuje się zarówno do żywicieli, tj. zwierząt albo ludzi, albo roślin, albo wobec samych szkodników, albo w miejscach ich pobytu. Szczególnie korzystnie stosuje się określone wyżej faktory A, B, C, D, E i F.Związki wytwarzane sposobem według wynalazku formuje się w znany sposób w preparaty, odpowiednie do zastosowania w medycynie i weterynarii, zawierające nowe związki odpowiednie do użycia w medycynie lub weterynarii. Preparaty te stosuje się w znany sposób razem ze składnikiem pomocniczym stanowiącym jeden lub więcej nośnik lub zaróbkę.

Środki zawierające związki wytwarzane sposobem według wynalazku obejmują postacie formowane szczególnie do użycia pozajelitowego z wewnątrzsutkowymi włącznie, doustnego, doodbytniczego, miejscowego lub wszczepowo.

Jeżeli stosuje się środek w postaci sterylnych preparatów, np. do wstrzykiwania z preparatami dosutkowymi włącznie, kropelki do oczu, maście i wszczepy, sam składnik aktywny musi być wytworzony aseptycznie albo wysterylizowany po wytworzeniu metodami, takimi jak naświetlanie promieniami gamma lub poddanie działaniu tlenku etylenu.

Związki wytworzone sposobem według wynalazku można formować w dawki jednostkowe odpowiednie do użycia w medycynie lub weterynarii na drodze injekcji w ampułki lub inne pojemniki zawierające dawki jednostkowe albo w pojemniki zawierające multi-dawki ewentualnie z dodatkiem substancji konserwujących. Środki do injekcji można wytwarzać w postaci zawiesin, roztworów lub emulsji w oleju lub nośnikach wodnych i mogą zawierać substancje pomocnicze, takie jak suspendujące, stabilizujące, rozpuszczające i/lub dyspergujące. Alternatywnie, składnik pomocniczy może być w postaci sterylnego proszku dla odtworzenia przed użyciem z odpowiednim nośnikiem np. sterylną wodą wolną od pirogenu. Oleiste nośniki obejmują alkohole poliwodorowe oraz ich estry, takie jak estry glicerolu, kwasy tłuszczowe, oleje roślinne, takie jak olej arachidowy lub olej z nasion bawełny, oleje mineralne, takie jak ciekłe parafiny i oleinian etylu oraz inne podobne związki. Można również stosować inne nośniki, takie jak glikol propylenowy.

Środki do stosowania w weterynarii mogą być również formowane w preparaty dosutkowe lub zasadniczo szybkodziałające preparaty i mogą stanowić sterylne roztwory lub zawiesiny w nośnikach wodnych lub oleistych.

Stosuje się opisane wyżej nośniki oleiste ale również i takie, które mogą zawierać substancje zgęszczające lub suspendujące, takie jak miękkie lub twarde parafiny, wosk pszczeli, 12hydroksystearynę, uwodorniony olej rycynowy, stearyniany glinu lub monostearynian glicerylu. Zwykłe nie-jonowe, kationowe lub anionowe substancje powierzchniowo-czynne można dodawać do środka same lub w mieszaninie.

Nowe związki do zastosowania w medycynie lub weterynarii można również użyć w postaci odpowiedniej do podawania doustnego, np. w formie roztworów, syropów lub zawiesin albo suchego proszku do odtworzenia z wodą lub innym odpowiednim nośnikiem przed bezpośrednim użyciem, ewentualnie z dodatkiem substancji smakowych lub barwiących. Można również stoso4 152148 wać środki w postaci stałej, takie jak tabletki, kapsułki, drażetki, pigułki, proszki, pasty lub granulki.

Stałe lub ciekłe postacie środka do stosowania doustnego wytwarza się metodami znanymi w tej dziedzinie. Postacie te mogą również zawierać jeden lub więcej dopuszczalnych w farmacji nośników albo zarobek, które mogą być w postaci stałej lub ciekłej. Przykładami odpowiednich, farmaceutycznie dopuszczalnych nośników do stosowania w stałych postaciach środka są substancje wiążące, takie jak preżelatynizowana skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon lub hydroksypropylometyloceluloza, wypełniacze, takie jak laktoza, mikrokrystaliczna celuloza lub fosforan wapnia, substancje smarne, takie jak stearynian magnezu, talk lub krzemionka, substancje dezintegrujące, takie jak skrobia ziemniaczana lub glikolan skrobiowo-sodowy albo substancje zwilżające, takie jak laurylosiarczan sodu. Tabletki można pokrywać znanymi metodami. Przykładem odpowiednich farmakologicznie dopuszczalnych dodatków do zastosowania w postaci ciekłej środka są substancje suspendujące, np. syrop sorbitowy, metyloceluloza albo uwodornione, jadalne tłuszcze, substancje emulgujące, np. lecytyny lub akacja, nośniki nie-wodne, np. olej migdałkowy, estry olejowe lub alkohol etylowy oraz substancje konserwujące, np. p-hydroksybenzoesan metylu lub propylu albo kwas sorbowy, a także substancje stabilizujące lub rozpuszczające.

Pasty do użycia doustnego wytwarza się metodami znanymi w tej dziedzinie. Do wytwarzania środka w postaci pasty stosuje się dopuszczalne w farmacji dodatki, takie jak substancje suspendujące lub żelujące, np. distearynian glinu lub uwodorniony olej rycynowy, substancje dyspergujące np. polisorbaty, nośniki nie-wodne, np. olej arachidowy lub estry olejowe, a także substancje rozpuszczające lub stabilizujące. Nowe związki można również stosować w medycynie lub weterynarii przez wprowadzenie ich do pożywienia dziennego stałego lub ciekłego np. w postaci dodatku do codziennej paszy dla zwierząt lub wody pitnej.

Do stosowania dopoliczkowego stosuje się środek w postaci tabletek, pasty lub drażetek wytworzonych w znany sposób.

Związki wytworzone sposobem według wynalazku można stosować doustnie w weterynarii w postaci wlewów do gardła, np. w formie roztworów, zawiesin lub dyspersji składnika czynnego razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką.

Związki wytworzone sposobem według wynalazku można również formować w postaci czopków, np. z zastosowaniem znanych substancji tworzących osnowę czopków do stosowania w medycynie lub weterynarii.

Nowe związki formuje się w postacie odpowiednie do użycia miejscowego, np. w medycynie lub weterynarii, w formie maści, kremów, lotionów, proszków, krążków domacicznych, spray'ów, preparatów do moczenia lub przemywania, aerozoli lub kropli, takich jak krople do oczu lub do nosa.

Maści lub kremy można formować np. z osnowami wodnymi lub olejowymi z dodatkiem odpowiednich substancji zagęszczających i/lub żelujących. Maści do oczu powinny być wytwarzane w sposób sterylny z zastosowaniem wyjałowionych składników.

Lotiony (płyny do przemywania lub obmywania) można formować z osnowy wodnej lub oleistej i zasadniczo zawierają one jedną lub więcej substancję emulgującą, stabilizującą, dyspergującą, suspendującą, zagęszczającą lub barwiącą.

Proszki wytwarza się na bazie odpowiednio sproszkowanej osnowy.

Krople wytwarza się na bazie osnowy wodnej lub nie-wodnej i mogą one zawierać również jedną lub więcej substancję dyspergującą, stabilizującą, rozpuszczającą lub suspendującą. Ponadto, mogą one również zawierać substancje konserwujące.

Do stosowania domiejscowego na drodze inhalacji w medycynie lub weterynarii stosuje się środki zawierające nowe związki w postaci aerozoli, spray'u lub preparatów stosowanych w przyrządach do wdmuchiwania proszków lub gazów.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można stosować łącznie z innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi składnikami aktywnymi. Ogólnie, dzienne dawki związku stosowanego zarówno w medycynie jak i w weterynarii mieszczą się w zakresie 1-2000/zg/kg ciężaru wagowego pacjenta,a korzystnie wynoszą 10-1000pg/kg, zwłaszcza 100-500/ig/kg i mogą być podawane w dawkach jednostkowych, np. 1-4-krotnie w ciągu dnia.

152 148

Związki wytworzone sposobem według wynalazku formuje się w znany sposób w środki do stosowania w rolnictwie lub ogrodnictwie i środki te wchodzą w zakres wynalazku. Środki te stosuje się w postaci preparatów suchych lub ciekłych, np. preparatów odpowiednich do opylania, koncentratów, proszków rozpuszczalnych lub zwilżalnych, granulatów z mikrogranulkami i granulkami tworzącymi dyspersję włącznie, tabletek preparatów płynnych, emulsji, takich jak emulsje rozcieńczalne lub koncentraty tworzące emulsje, preparatów do moczenia, np. do moczenia korzeni, nasion, zaprawiania nasion, tabletek do zaprawiania nasion, oleistych koncentratów, roztworów oleistych, injekcji, np. injekcji parowych, spray'ów, dymów oraz zawiesin koloidalnych.

Ogólnie preparaty te zawierają związek czynny w mieszaninie z odpowiednim nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Stosuje się zarówno stałe jak i ciekłe nośniki w zależności od postaci środka, którą chcemy otrzymać. Preparaty stosowane do wytwarzania środka według wynalazku są dobrze znane w tej dziedzinie techniki. Środki według wynalazku można otrzymać, np. przez zmieszanie i/lub rozdrabnianie składnika lub składników czynnych razem z nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, np. nośnikiem stałym, rozpuszczalnikiem lub substancją powierzchniowo-czynną.

Do wytwarzania środka w postaci odpowiedniej do opylania stosuje się granulaty i proszki wybrane np. z naturalnych wypełniaczy mineralnych, takich jak ziemia okrzemkowa, talk, kaolin, montmorylonit, pyrofylit lub atapulgit. W miarę potrzeby środek według wynalazku może zawierać wysoce dyspersyjny kwas krzemowy lub wysoce dyspersyjne absorbenty polimerowe.

Jako granulowane adsorpcyjne nośniki stosuje się materiały porowate, takie jak pumeks, rozdrobniona cegła, sepiolit i bentonit, albo nie-porowate, takie jak kalcyt lub piasek. Można stosować odpowiednie wcześniej granulowane materiały pochodzenia organicznego lub nieorganicznego, takie jak dolomit i rozdrobnione części roślin.

Odpowiednimi rozpuszczalnikami stosowanymi jako nośniki lub rozcieńczalniki są węglowodory aromatyczne, węglowodory alifatyczne, alkohole i glikole lub ich estry, etery, ketony, amidy kwasowe, silnie polarne rozpuszczalniki, ewentualnie epoksydowane oleje roślinne oraz woda.

Konwencjonalnymi niejonowymi, kationowymi lub anionowymi substancjami powierzchniowoczynnymi stosowanymi jako dodatki do środka według wynalazku, są np. etoksylowane fenole alkilowe i alkohole, sole metali alkalicznych oraz metali ziem alkalicznych z kwasami alkilobenzenosulfonowymi, kwasami lignosulfono.wymi lub kwasami sulfobursztynowymi albo sulfoniany polimerycznych fenoli, które są dobrze emulgowane, mają dobrą dyspersyjność i/lub zwilżalność same lub w mieszaninie.

Stabilizatory, substancje przeciw-zbrylaniu, przeciwpienieniu, regulatory lepkości, substancje wiążące i adhezyjne, fotostabilizatory, jak również nawozy, substancje odżywcze oraz inne substancje czynne można również włączać do środka według wynalazku. Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można również łączyć z innymi środkami owadobójczymi, roztoczobójczymi i nicieniobójczymi.

Środki według wynalazku zawierają składnik czynny zasadniczo w ilości 0,01-99%, a zwłaszcza 0,01-40% wagowych.

Produkty handlowe zazwyczaj wytwarza się w postaci skoncentrowanej i przed bezpośrednim użyciem rozcieńcza do odpowiedniego stężenia składnika czynnego np. 0,001 do 0,0001% wagowego.

Do zastosowania w rolnictwie i ogrodnictwie lub weterynarii może być pożądane użycie jako składnika aktywnego całej brzeczki fermentacyjnej bez rozdzielania na składniki lub faktory. Może być również odpowiednie użycie suszonej brzeczki (zawierającej mycelia) albo użycie rozpadniętych myceli, przy czym żywe lub martwe mycelia wydziela się z brzeczki z zastosowaniem techniki wydzielania lub odparowywania stałego lub ciekłego brzeczki fermentacyjnej pozostającej po wydzieleniu myceli. W miarę potrzeby mycelia można pasteryzować albo bardziej korzystnie suszyć, np. przez suszenie rozpyłowe lub suszenie walcowe. Ponadto, w miarę potrzeby mycelia lub brzeczka mogą być formowane w postacie środka z zastosowaniem znanych obojętnych nośników, zarobek lub rozcieńczalników jakie przedstawiono powyżej.

Ogólnie, z powyższego wynika, że związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być stosowane do zwalczania infekcji, zawszenia, zarobaczenia, inwazji pasożytów z użyciem skutecznej dawki jednego lub więcej z wymienionych związków.

152 148

Sposób wytwarzania antybiotyku S541 lub jego składnika' albo jego faktorów, jakie określono powyżej, z włączeniem związków o wzorze 1, w którym podstawnik w położeniu 25 oznacza grupę metylową, etylową, propylową lub butylową, według wynalazku polega na tym, że obejmuje etap hodowania mikroorganizmu rodzaju Streptomyces zdolnego do wytwarzania co najmniej jednego z nowych związków w celu wytwarzania tego związku i w miarę potrzeby wydzielanie tego związku. Korzystnie stosuje się mikroorganizm, który głównie wytwarza jeden lub więcej nowych związków.

Opierając się na badaniach taksonomicznych, stwierdzono, że mikroorganizmem szczególnie zdolnym do wytwarzania powyższych substancji jest nowy szczep rodzaju Streptomyces. Został on nazwany Streptomyces thermoarchaensis. Próbka tego mikroorganizmu, którą wydzielono z ziemi, została złożona do depozytu w National Collections of Industrial and Marinę Bacteria, Terry Research Station, Aberdeen, Wielka Brytania i jest oznaczona numerem NCIB 12015. Właściwości morfologiczne i kulturowe Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 przedstawiono poniżej. W szczególności w sposobie według wynalazku stosuje się nowe szczepy Streptomyces, które wykazują zasadniczo te same właściwości morfologiczne i kulturowe co Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015. Szczep NCIB 12015 został złożony w depozycie 10 września 1984, a szczep NCIB 12 114 został złożony w depozycie 26 czerwca 1985.

W ten sposób w zakres wynalazku wchodzą związki, które można wytworzyć na drodze fermentacji S. thermoarchaensis NCIB 12 015, a które są izomerami optycznie czynnymi związku o ogólnym wzorze 1.

Jako mikroorganizm rodzaju Streptomyces w sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 albo jego mutant.

Mutanty Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 mogą pojawiać się spontanicznie albo mogą być wytwarzane różnymi metodami z włączeniem metod przedstawionych w Techniąues for the Development of Microorganisms przez H.I Adler'a w „Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms referaty wygłoszone na sympozjum w Viennie 1973, str. 241, International Atomie Energy Authority. Metody te obejmują napromieniowanie jonizujące, metody chemiczne, np. działanie N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyną (NTG); użycie ciepła; techniki genetyczne, takie jak rekombinacja, transdukcja, transformacja, lizogenizacja i konwersja lizogenna oraz technologie selekcyjne odpowiednie dla mutantów spontanicznych. Tak więc, np. otrzymano cztery szczepy mutanta Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, a każdy z nich został złożony do depozytu w kolekcji kulturowej National Collections of Industrial i Marinę Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Wielka Brytania jako oznaczony numerem depozytowym NCIB 12 111, NCIB 12 112, NCIB 12 113 i NCIB 12 114. Szczep NCIB 12015 złożono 10 września 1984, a szczep NCIB 12 114-5 złożono 26.06.1985.

Mutanty szczepów NCIB 12111, 12 112 i 12113 otrzymano przez poddanie sporów Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 działaniu NTG, a następnie scharakteryzowano metodą jednoetapową Holliday (R. Holliday /1956// Naturę 178 987).

Mutant szczepu NCIB 12 114 wystąpił przy spontanicznej mutacji Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 i został zidentyfikowany jako odporny na streptomycynę po poddaniu działaniu siarczanu streptomycyny w ilości lO0pg/ml w temperaturze 28°C w czasie 5 dni.

Badania taksonomiczne wskazują, że Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 jest dotychczas nieujawnionym nowym szczepem, którego właściwości przedstawiono poniżej, a które są zasadnicze dla tego gatunku jako całości.

W korzystnym środowisku sporulacyjnym, agarze owsianym, agarze słodowo-drożdżowym i agarze sole nieorganiczne - skrobia (Shirling, E.B. i Gottlieb, D. (1966) Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340), Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 rośnie obficie wytwarzając stabilne mycelium wyjściowe i mycelium powierzchniowe niosące spory w otwartych spiralnych łańcuchach jako boczne rozgałęzienia głównego strzępka grzyba. W tym środowisku odwrócona pigmentacja jest żółto/brązowa, a sporofory są szare. Przy powiększeniu 100-krotnym sporofory zawierają 2-5 skrętów w łańcuchu z 5-10 sforami wewnątrz każdego skrętu spirali. Przeciętnie, sporofory zawierają od 20 do 50 sforów. Mikroskopia elektroniczna przy powiększeniu 12000-krotnym odsłania spory o gładkich ściankach, w kształcie elipsoidy o średnicy 0,7μιηΧ1,4μπι w ich najszerszych miejscach. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 jest gram-dodatni i jest zdolny do wzrostu i sporulowania w temperaturze 20-50°C.

152 148

Porównanie z poprzednimi danymi opublikowanych opisów Bergey's Manuał of Determinative Bacteriology (wydanie piąte) wskazuje, że mikroorganizm Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12 015 należy do szczepu Streptomyces.

Identyfikację Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 do odpowiedniego rodzaju-grupy przeprowadzono za pomocą skomputeryzowanej matrycy identyfikacyjnej przedstawionej przez Williams'a i wsp. (J. Gen. Microbiol. /1983./ 129, 18^^^1830). Wyniki badań taksonomicznych przedstawionych przez wyżej wymienionych autorów dla Streptomyces thermoarchaensis

NCIB 12015 były następujące:

Test Wynik

Pionowy łańcuch sporowy —

Posiatkowany łańcuch sporowy —

Rektyfleksyjne łańcuchy sporo we —

Spiralne łańcuchy sporowe +

Fragmenty mycelinu —

Gładka powierzchnia spory +

Pomarszczona powierzchnia spory —

Szare zabarwienie spory +

Czerwone zabarwienie spory —

Zielone zabarwienie spory —

Rewers żółto/brązowy +

Rewers czerwono/pomarańczowy —

Wytwarzanie melaniny —

Wykorzystanie adonitolu —

Wykorzystanie cellobiozy +

Wykorzystanie D-fruktozy +

Wykorzystanie mezo-inozitolu —

Wykorzystanie insuliny +

Wykorzystanie mannitolu —

Wykorzystanie raffinozy +

Wykorzystanie ramnozy +

Wykorzystanie D-ksylozy +

Wykorzystanie kwasu DL-a-aminomasłowego —

Wykorzystanie L-histydyny +

Wykorzystanie L-hydroksyproliny —

Rozkład allantoiny +

Rozkład arbutyny +

Rozkład ksantyny +

Rozkład pektyn +

Rozkład lecytyny —

Rozkład azotanów +

Wytwarzanie siarkowodoru +

Tolerancja azydku sodu (0,01%, w/obj) —

Tolerancja chlorku sodu (7%, w/obj) —

Tolerancja fenolu (0,1% w/obj) +

Wzrost 45°C +

Odporność na neomycynę (50 //g’ml^_1) —

Odporność na rifampicynę (50 pg^ml^) +

Antybioza Aspergillus niger LIV 131 +

Antybioza Bacillus subtilis NCIB 3610 —

Antybioza Streptomyces murinus ISP 5091 +

Organizm zidentyfikowano jako nie należący do 23 większych grup gatunków (Williams, S.T. i współprac. /1983/ J. Gen. Microbiol. 129,1815-1830) ani żadnej z mniejszych grup gatunków oraz pojedyńczego członka grona określonego przez Williams'a i współprac., (J. Gen. Microbiol. /1983/ 129, 1743-1813). Właściwości Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 porównano

152 148 również z opisem znanych gatunków Streptomyces przedstawionych w Bergey's Manuał of Determinative Bacteriology (wydanie piąte), ISP raportem Shirling'a i Gottlieb'a (Int. Syst, Bacteriol. /1968/, 18, 69-189; Int. J. Syst. Bacteriol. /1968/ 18, 279-392; Int. J. Syst. Bacteriol /1969/, 19, 391-512; Int. J. Syst. Bacteriol. /1972/22,265-394) oraz wiadomościami opisanymi w International Journal of Systematic Bacteriology od roku 1980.

Na bazie porównań stwierdzono, że nie znano dotychczas Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 i należy wierzyć, że Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 jest pierwszym znanym członkiem nowego szczepu należącego do rodzaju Streptomyces.

Szczepy mutantów NCIB 12111, 12112, 12 113 i 12114 mają wszystkie zasadniczo te same właściwości jak Streptomyces thermoarchaensis. Chociaż szczep NCIB 12111 wymaga dla wzrostu adeniny, NCIB 12 112 wymaga dla wzrostu seryny, NCIB 12 113 wymaga dla wzrostu histydyny, a NCIB 12 114 jest odporny na streptomycynę.

Mikroorganizmy zdolne do wytwarzania antybiotyku S541 można łatwo oznaczyć z zastosowaniem znanego testu małej skali z wykorzystaniem Caenorhabditis elegaus, np. przez dodanie próbki testowej do zawiesiny nitkowca i badanie skutku działania oraz żywotności nitkowca.

Wytwarzanie antybiotyku S541 na drodze fermentacyjnej sposobem według wynalazku przeprowadza sią przez hodowanie mikroorganizmu Streptomyces w obecności odpowiednich zdolnych do asymilacji źródeł węgla, azotu i soli mineralnych.

Źródła zdolnych do asymilacji węgla, azotu i substancji mineralnych otrzymuje się z prostych lub kompleksowych odżywek. Jako źródło węgla zazwyczaj stosuje się glukozę, maltozę, skrobię, glicerol, melasy, dekstrynę, laktozę, sacharozę, fruktozę, kwasy karboksylowe, aminokwasy, glicerydy, alkohole, alkany i oleje roślinne. Źródło węgla zazwyczaj stosuje się w ilości 0,5-10% wagowych w odniesieniu do brzeczki fermentacyjnej.

Jako źródło azotu zazwyczaj stosuje się mączkę sojową, ciecz z macerowanej kukurydzy, rozpuszczalne destylaty, ekstrakty drożdżowe, mieszaniny aminokwasów, amoniak ciekły lub gazowy, sole amonowe lub azotany. Można również stosować mocznik oraz inne aminy. Źródło azotu stosuje się zazwyczaj w ilości 0,1-10% wagowych w stosunku do brzeczki fermentacyjnej.

Jako odżywcze sole mineralne, które wprowadza się do środowiska hodowlanego, stosuje się sole zdolne do wytworzenia jonów sodu, potasu, amonu, żelaza, manganu, magnezu, cynku, niklu, kobaltu, wanadu, chromu, wapnia, miedzi, molibdenu, boru, fosforowych, siarczanowych, chlorkowych i węglanowych.

Hodowanie mikroorganizmu Streptomyces prowadzi się zasadniczo w temperaturze 20-50°C, korzystnie 25-40°C, zwłaszcza około 34°C i ma miejsce korzystnie w warunkach napowietrzania i mieszania, np. przez wstrząsanie lub wymieszanie.

Środowisko można początkowo zaszczepić małą ilością zawiesiny sporulowanego mikroorganizmu lecz w celu zapewnienia opóźnienia wzrostu wegetatywne inokulum mikroorganizmu można wytworzyć przez zaszczepienie małą ilością środowiska hodowlanego postacią spory mikroorganizmu, a wegetatywne inokulum można otrzymać przez przeniesienia do środowiska hodowlanego albo bardziej korzystnie do jednego lub więcej etapów (stadiów) początkowych, gdzie następuje dalszy wzrost, przed wprowadzeniem do zasadniczego środowiska fermentacyjnego. Fermentację prowadzi się zazwyczaj przy wartości pH w zakresie 5,5-8,5, korzystnie 5,5-7,5.

Czas fermentacji wynosi około 2-10 dni, np. około 5 dni. Produkt wytwarza się w postaci stałej substancji znajdującej się w brzeczce fermentacyjnej zawierającej co najmniej jeden związek o wzorze 3, nienaruszone lub uległe lizie mycelia wydzielane z tej brzeczki, albo substancje stałe z brzczki po wydzieleniu nienaruszonych lub uległych lizie myceli.

Jeżeli występuje potrzeba rozdzielenia materiału zawierającego antybiotyk S541 oraz jego składników lub faktorów z całej brzeczki fermentacyjnej lub wydzielenie składników lub faktorów, wówczas przeprowadza się znaną w tej dziedzinie techniki metodą wydzielania i rozdziału.

Antybiotyk S541 wytworzony sposobem według wynalazku jest zawarty w myceliach komórek lecz może on również znajdować się w brzeczce fermentacyjnej zarówno przed jak i po oczyszczaniu. Należy zaznaczyć, że wybór metody wydzielania może być bardzo różny.

Antybiotyki S541 można wydzielić i rozdzielić różnymi metodami frakcjonowania, np. eluowaniem z adsorpcją, wytrącaniem, krystalizacją frakcyjną oraz na drodze ekstrakcji rozpuszczalnikiem, przy czym metody te można dowolnie łączyć.

152 148 9

Ekstrakcja rozpuszczalnikiem i chromatografia oraz krystalizacja frakcyjna są najodpowiedniejszymi metodami dla wydzielania i rozdzielania nowych związków.

Po fermentacji mycelia można zebrać z zastosowaniem znanych technologii, np. przesączania i odwirowania. Następnie, np. materiał można poddać ekstrakcji z myceli za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego jak keton, np. aceton, metyloetyloketon lub metyloizobutyloketon; węglowodór, np. heksan, chlorowcowany węglowodór, np. chloroform, tetrachlorek węgla lub chlorek metylenu; alkohol, np. metanol lub etanol; albo diol, np. propanodiol-1,2; albo ester, np. octan metylu lub octan etylu. Jeżeli mycelia zawierają znaczną ilość wody, wówczas korzystnie stosuje się rozpuszczalnik rozpuszczalny w wodzie.

Ogólnie, w miarę potrzeby stosuje się więcej niż jedną ekstrakcję w celu otrzymania optymalnego wydzielenia, korzystnie pierwszą ekstrakcję prowadzi się z zastosowaniem rozpuszczalnika mieszającego się z wodą, takiego jak metanol lub aceton. Antybiotyki można wyodrębnić jako surowy ekstrakt przez wydzielenie rozpuszczalnika. Same ekstrakty rozpuszczalnikowe można poddać ekstrakcji w miarę potrzeby po zmniejszeniu objętości rozpuszczalnika, np. przez odparowanie. W tym etapie korzystnie stosuje się rozpuszczalnik nie mieszający się z wodą, taki jak heksan, chloroform, chlorek metylenu lub octan etylu albo ich mieszaniny, ewentualnie dla uzyskania zadowalającego częściowego rozdzielenia antybiotyków można dodać wody. Wydzielenie fazy nie mieszającej się z wodą pozwala otrzymać substancję zawierającą antybiotyki S541. Ewentualnie, faktor B można rozdzielić na drodze krystalizacji z odpowiedniego rozpuszczalnika, np. izopropanolu.

Oczyszczanie i/lub rozdzielanie składników czynnych i/lub faktorów (całkowicie lub od innych obecnych związków makrolidowych) można przeprowadzić znanymi metodami, np. chromatograficznie (z włączeniem wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej), na odpowiednim nośniku, takim jak krzemionka, makroretykularna żywica adsorpcyjna, np. usieciowana żywica polistyrenowa, taka jak Amberlite XAD-2, XAD-4 lub XAD-1180 (Rohm and Haas Ltd) albo żywica S 112 (Kastell Ltd) albo usieciowana, zgodna z rozpuszczalnikiem organicznym dekstryna, taka jak Sephadex LH20 (Pharmacia UK Ltd), albo w przypadku wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej nośników rewersowych fazowych, takich jak węglowodorowa liniowa krzemionka, np. Cie-liniowa krzemionka. Nośnik może także tworzyć złoże albo bardziej korzystnie tworzyć wypełnienie kolumny. W przypadku żywic makroretikularnych, takich jak XAD-1180 lub SI 12 do eluowania stosuje się mieszaniny rozpuszczalników organicznych, takich jak acetonitryl z wodą.

Rozpuszczanie związków w odpowiednim rozpuszczalniku zasadniczo prowadzi się na krzemionce lub kolumnach Sephadex ewentualnie po uprzednim zredukowaniu objętości rozpuszczalnika. Kolumnę można ewentualnie przemywać, a następnie eluować rozpuszczalnikiem o odpowiedniej polarności. W przypadku Sephadex'u i krzemionki, jako rozpuszczalniki stosuje się alkohole, takie jak metanol; węglowodory, takie jak heksan; acetonitryl; chlorowcowane węglowodory, takie jak chloroform lub chlorek metylenu; albo estry, takie jak octan etylu. Można stosować wymienione rozpuszczalniki same lub w mieszaninie albo w mieszaninie z wodą.

Eluowanie i rozdział/oczyszczanie związków wytworzonych sposobem według wynalazku można przeprowadzić znanymi metodami, takimi jak chromatografia, np. cienkowarstwowa, wysokociśnieniowa cieczowa albo przez wykorzystanie właściwości związków opisanych powyżej.

Chromatografię na żelu krzemionkowym przeprowadza się korzystnie z zastosowaniem eluantów, takich jak chloroform i octan etylu, łatwo rozdzielających antybiotyki S541 na składniki I i II. Składnik I eluuje się najpierw. Faktory B, E i F można łatwo otrzymać ze składnika I z zastosowaniem chromatografii, np. wysokociśnieniowej cieczowej. Podobnie faktory A, C i D można łatwo wydzielić ze składnika II. Alternatywnie, faktor B można rozdzielić od faktorów E i F na drodze krystalizacji z alkoholu, takiego jak metanol lub izopropanol. Ługi macierzyste zawierające faktory E i F można, w razie potrzeby, poddać dalszemu oczyszczaniu, np. chromatografią na żelu krzemionkowym, a faktory E i F wydziela się z użyciem wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Otrzymane faktory można dalej oczyszczać przez krystalizację, np. z metanolu, izopropanolu lub mieszaniny metanol/woda, a w zakres wynalazku wchodzą również związki wytwarzane w postaci krystalicznej.

152 148

Przez odpowiednie połączenie wyżej wymienionych metod związki wytwarza się sposobem według wynalazku w postaci stałej. Należy zauważyć, że wymienione etapy prowadzi się z zastosowaniem odpowiedniego doboru metod w bardzo szerokim zakresie.

Tak więc, faktor B można otrzymać w stałej postaci krystalicznej z czystością przekraczającą 90%. Podobnie, faktory A, C, D, E i F można również otrzymać z czystością ponad 90%. Jednakże, faktory można stosować, co przedstawiono powyżej, przy mniejszym poziomie czystości w zależności od ich wykorzystania. Do zastosowania w medycynie wymagana czystość wynosi co najmniej 90%, a korzystnie powyżej 95%. Do zastosowania w weterynarii, rolnictwie lub ogrodnictwie można stosować mniej czyste związki, np. o czystości 50% lub mniejszej.

Następujące przykłady ilustrują przedmiot wynalazku. Stosowano następujące skróty: tle — chromatografia cienkowarstwowa (z zastosowaniem żelu krzemionkowego Merck 5735 na 60 płytkach rozwijanych CHCI3 i octan etylu 3:1, jeżeli nie zaznaczono inaczej),

CCM — chromatografia kolumnowa z zastosowaniem żelu krzemionkowego Merck 773 460 (200 X 4 cm kolumny, jeżeli nie zaznaczono inaczej) i eluowania CHCI3 i octan etylu 3: 1 hplc — wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa,

PE — eter naftowy (temperatura wrzenia 60-80°C, jeżeli nie zaznaczono inaczej),

L — litr,

EA — octan etylu.

Pożywka A, B i C oznaczała:

Pożywka A gL ¹

D-glukoza 15,0

Glicerol 15,0

Pepton sojowy 15,0 NaCl 3,0

CaCOs 1,0

Woda destylowana do 1 litra, wartość pH 7,0 regulowana wodnym roztworem NaOH przed włożeniem do autoklawu.

Pożywka B gL-¹

D-glukoza 2,5

Dekstryna słodowa MD 30E (Roąuette /UK/ Ltd) 25,0

Arkasoy 50 (British Arkady Co., Ltd) 12,5

Melasy 1,5

K2HPO4 0,125

Węglan wapnia 1,25

MOPS kwas /3-^i-morfolino/proanosulfonowy 21,0

Woda destylowana do 1 litra, wartość pH 6,5 regulowana 5N NaOH przed wprowadzeniem do autoklawu.

Pożywka C gL ¹

D-glukoza 2,5

Dekstryna słodowa MD 30E (Roąuette /UK/ Ltd) 25,0

Arkasoy 50 12,5

Melasy pszczele 15

K2HPO4 0,125

CaCOa 1,25

Silikon 1520 (Dow Corning) 0,625

Woda destylowana 1 litr, wartość pH 6,5 przed sterylizacją.

Przykład I. Spory Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 inokulowano do skosów agarowych wytworzonych z następujących składników:

Ekstrakt drożdży (Oxoid L21)	gL'1 0,5
Ekstrakt słodu (Oxoid L39)	30,0
Pepton mykologiczny (Oxoid L40)	5,0
Agar nr 3 (Oxoid LI 3)	15,0

152 148

Wodą destylowaną uzupełniono do 1 litra, wartość pH wynosiła około 5,4 i inkubowano w temperaturze 28°C w czasie 10 dni. Dojrzałe skosy pokrywano 6 ml 10% roztworu glicerolu i skrobano sterylną łopatką do wyciągnięcia spor i mycelium.

Do wyjałowionych propylenowych słomek przenoszono 0,4 ml części uzyskanej zawiesiny sporów, a następnie zatapiano podczas ogrzewania i przechowywano w ciekłych parach azotu.

Zawartość pojedynczej słomki stosowano do zaszczepiania 10 ml pożywki A, którą następnie inkubowano w temperaturze 28°C w czasie 3 dni na wstrząsarce obrotowej przy 250 obrotach na minutę ze średnicą orbity poruszania wynoszącą 50 mm. Inkubowaną pożywkę stosowano do zaszczepiania na poziomie 2%, 15 probówek i dwóch 250 ml kolb Erlenmeyer'a zawierających odpowiednio 10 ml i 50 ml pożywki B.

Probówki i kolby utrzymywano w temperaturze 28°C w czasie 5 dni, po czym kultury przesączano oddzielnie pod zmniejszonym ciśnieniem, a komórki wstrząsano 30 minut z metanolem w objętości odpowiedniej do przesączu kulturowego.

Działanie przeciw Caenorhabditis elegans oznaczano w ekstraktach komórek rosnących zarówno w probówkach jak i kolbach, a ekstrakty mycelii łączono, odparowywano do sucha i powtórnie ekstrahowano metanolem do stężenia (6 ml), które było stosowane na kolumnę Sephadex LH 20 (110 X 2,5 cm) i eluowanej metanolem. Zbierano 10 ml frakcje.

Frakcje 21-28 zebrano razem i odparowywano z uzyskaniem 156 mg oleistej pozostałości, którą ekstrahowano za pomocą CHCI3 i EA (3:1) z otrzymaniem 3 ml ekstraktu, który poddawano CCM kolumna (55 X 2,5 cm). Zebrano 10 ml frakcji, które poddawano analizie tle z zastosowaniem płytek zawierających indykator fluorescencyjny. Frakcje 20-23 i frakcje 36-44 dały dwa główne wystąpienia, które stłumiono fluorescencją, a które zidentyfikowano jako składnik I (Rf 0,70) oraz składnik II (Rf 0,43). Po odparowaniu frakcji 20-23 otrzymano 9 mg składnika I w postaci stałej. ma_XaX8nm,E¹1 340; Λ max 245nm,E¹1 350; i Λ max254 nm, E¹i 200. Odparowanie frakcji 36-44 dało 11 mg składnika II w postaci stałej Ż_max238 nm, E1 440; ^_max 245 nm, E1 460; i ^_max 254 nm, E1 280.

Przykład II. Dwie kolby Elrenmeyer'a zawierające 50 ml pożywki A zaszczepiono 0,2 ml zawiesiny spory Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 pobranej ze słomki przygotowanej jak opisano w przykładzie I. Kolby inkubowano w temperaturze 28°C w czasie 3 dni na wstrząsarce obrotowej przy 250 obrotach na minutę i średnicy orbity obrotów 50 mm. Następnie zawartość obydwu kolb stosowano do zaszczepienia 20 L kotła fermentacyjnego zawierającego 12 L pożywki

B. Kulturę zbierano po 5 dniach wzrostu i postępowano dalej w sposób opisany w przykładzie III.

Przykład III. Brzeczkę fermentacyjną otrzymaną jak opisano w przykładzie w ilości 12 L zebraną po 5 dniach hodowania w temperaturze 28°C odwirowywano w czasie 15 minut w temperaturze 10°C przy 4200 obrotach na minutę. Zebrane komórki mieszano z 5 L metanolu i pozostawiono na 20 h w temperaturze 4°C. Ekstrakt mycelii odsączano, odparowywano w temperaturze 40°C i poddawano destylacji azeotropowej po dodaniu 100 ml butanolu-1. Następnie ekstrakty zadawano 5X200 ml metanolu i połączone ekstrakty odparowywano do objętości 100 ml, po czym wprowadzano na kolumnę Sephadex (112X5 cm). Kolumnę eluowano metanolem, po czym zbierano 200 ml i 50 ml przedgonu. Frakcje 40-90 zbierano razem i odparowywano z uzyskaniem 3,85 g oleistej pozostałości. Pozostałość ekstrahowano 77 ml CHCI3 i EA (3:1), przesączano, a następnie poddawano CCM, po czym z 200 ml przedgonu zbierano 15 ml frakcje.

Frakcje 124-142 zawierające składnik I zbierano razem i odparowywano z uzyskaniem 253 mg substancji stałej, z której po oczyszczeniu hplc (Zorbax ODS 25X2,1 cm, 80% CH3CN//H2O) otrzymano 216 mg substancji. Frakcje 250-320 zawierające składnik II zbierano razem i odparowywano z uzyskaniem 602 mg substancji stałej, z której po oczyszczeniu hplc (jako frakcje 124-142) otrzymano 540 mg substancji i zbierano frakcje z następnych prób.

Materiał eluujący z kolumny hplc był monitorowany spektroskopią UV przy 243 nm. Piki absorbujące przy długości fali były suszone i a/ badane na aktywność wobec Caenorhabditis elegans oraz b/ analizowane za pomocą tle. Cztery piki, które były aktywne wobec Caenorhabditis elegans miały również wartość Rf w zakresie 0,39-0,46 lub 0,70-0,75.

Składnik I dał jeden pik o wartości Rf 0,70-0,75 i pik ten był wykazany jako faktor B. Składnik II dał trzy piki o wartości Rf 0,39-0,46 i piki te były wykazane jako faktory A, C i D.

152 148

Faktor A eluowany z kolumny hplc pomiędzy 260-340 ml po injekcji próbki miały wartość Rf 0,44 oznaczoną przez tle. Faktor B eluowany z kolumny hplc pomiędzy 270-310 ml, po injekcji próbki miały wartość Rf 0,72 oznaczoną przez tle. Faktor C eluowany z kolumny hplc pomiędzy ^^(^0-180 ml, po injekcji próbki miały wartość Rf 0,4 oznaczoną przez tle. Faktor D eluowany z kolumny hplc pomiędzy 220-250 ml, po injekcji próbki miały wartość Rf 0,42 oznaczoną przez tle. Dalsze właściwości faktorów A, B, C i D przedstawiono poniżej.

Przykład IV. Do inokulowania 250ml kolby Erlenmeyer'a zawierającej 50ml pożywki A stosowano 0,4 ml zawiesiny spory mikroorganizmu Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 pobranej ze słomki przygotowanej jak opisano w przykładzie I. Kolbę inkubowano w temperaturze 28°C w czasie 4 dni na wstrząsarce obrotowej przy 250 obrotach na minutę i średnicy orbity obrotów 50 mm.

Następnie porcje 8 ml stosowano do zaszczepienia każdej z dwóch 2L kolb płaskodennych zawierających indywidualnie 400 ml tej samej pożywki, po czym inkubowano w tych samych warunkach w czasie 3 dni.

Zawartości obydwu kolb stosowano do zaszczepienia 70 L kotła fermentacyjnego zawierającego 40 L pożywki B uzupełnionej preparatem Silicone 525 [Dow-Corning; 0,0625%, /wag/wag/]. Fermentację prowadzono podczas mieszania i odpowiedniego napowietrzania dla utrzymania tlenu powyżej 20% nasycenia z dodaniem Siliconu jako czynnika przeciwpienieniu. Fermentację kończono po 10 dniach i 40 L brzeczki oczyszczano przez odwirowanie (1500 obrotów na minutę). Pozostały supernatant zastępowano 5 L wody, a wydzielone komórki w ilości 1,4 kg wymrażano w temperaturze -20°C. Po tygodniu zamrożone komórki roztapiano, zawieszano w 15 L metanolu i łagodnie mieszano w czasie 15 h. Następnie zawiesinę przesączano, a stałą pozostałość powtórnie ekstrahowano 10 L metanolu. Połączony przesącz (20 L) rozcieńczano 12 L wody i ekstrahowano 25 L PE. Po 30 minutach rozdzielano fazy przez odwirowanie.

Niższą fazę metanolową ekstrahowano następnie 3-krotnie 25 L, 15 L i 15LPE. Połączone 80 L fazy PE zatężano przez 3-krotne przepuszczanie przez wyparkę filmową Pfandler'a 8,8-12V-27 (ciśnienie parowania lOkPa, temperatura parowania 20°, temperatura pary 127°), a 8 L koncentratu suszono 1 kg siarczanu sodu i dalej zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C na obrotowej wyparce filmowej. W 70 ml mieszaniny CHCI3 i EA (3:1 wag/wag) rozpuszczono 15 ml oleistej pozostałości i poddano CCM. Po pierwszym rzucie zbierano około 40 ml frakcji z 1400 ml przedgonu.

Frakcje 45-65 połączono i odparowywano z otrzymaniem 940 mg faktora B jak określono w przykładzie III, który to faktor krystalizowano następnie dwukrotnie z metanolu i na zakończenie z nitrometanu. Kryształy poddawano pojedynczej analizie defrakcyjnej promieniami X. Wykazała ona kryształy ortoromboidalne o jasnych pryzmatach a = 10,171/3/, b = 13,317/5/, c = 25,032/7/·10-¹ nm, V = 3,391 nm³, Z = 4, grupa przestrzenna P2i2-|2i, Dc= l,18gcm-³, R = 0,053 dla 2169 niezależnie zaobserwowaną refleksję /0^58°/ mierzoną na dyfraktometrze z naświetlaniem Cu-Κα /λ = 0,154178 nm/. Budowę określono krystalograficznie promieniami X i przedstawiono na fig. 5.

Przykład V. W sposób opisany w przykładzie IV przygotowano inolulum Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 rosnące w czasie 2 dni i stosowano do zaszczepienia 70 L kotła fermentacyjnego zawierającego 40 L pożywki B uzupełnionej propylenem 2000 (0,06% wag/wag) zamiast Silicone 525. Propylen 2000 dodano w czasie fermentacji dla zapobiegania pienieniu. Fermentację prowadzono w temperaturze 28°C, podczas mieszania i odpowiedniego napowietrzania dla utrzymania właściwego poziomu rozpuszczonego tlenu powyżej 30% nasycenia. Po 24 h fermentacji część brzeczki (1 L) przeniesionio do 700 L kotła fermentacyjnego zawierającego 400 L pożywki składającej się z:

D-glukoza

Dekstryna słodowa Arkasoy 50 Melasy K2HPO4 CaCOs

Silicone 525 (Dow Corning)

2,8

27.8

13.9 1,7 0,14 1,39

0,06% (wag/wag)

Przed wyjałowieniem doprowadzono pH do wartości 6,5.

152 148

Fermentację prowadzono w temperaturze 28°C podczas mieszania i odpowiedniego napowietrzania dla utrzymania właściwego poziomu rozpuszczonego tlenu powyżej 20% nasycenia. Jako środek przeciw pienieniu dodawano polipropylen 2000. Po 2 dniach regulowano wartość pH do 7,2 za pomocą H2SO4. Fermentację kończono po 5 dniach.

Brzeczkę (450 L) oczyszczano przez odwirowanie, a supernatant zastępowano 20 L wody. Wydzielone komórki w ilości 25,5 kg mieszano w czasie 1h w metanolu z otrzymaniem całkowitej objętości wynoszącej 75 L. Zawiesinę przesączono, a stałą pozostałość ekstrahowano 35 L metanolu i przesączano. Połączone ekstrakty (87 L) rozcieńczano 40 L wody i ekstrahowano PE. Po 30 min. fazy rozdzielano przez odwirowanie i niższą fazę metanolową powtórnie ekstrahowano 30 L PE po dodaniu 40 L wody. Po rozdzieleniu niższą fazę znów ekstrahowano 30 L PE. Połączone fazy (80 L) zatężano przez przepuszczanie przez wyparkę filmową Pfandler'a 8,8-12V-27 (ciśnienie parowania 10 kPa, temperatura parowania 20°, temperatura pary 127°). Koncentrat (9 L) suszono 2 kg siarczanu sodu i dalej zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40° na rotacyjnej wyparce filmowej. Oleistą pozostałość (130 g) rozpuszczano w CHCI3 z uzyskaniem 190 ml objętości, po czym poddawano CCM (kolumny ze złożem, przemywane 500 ml w CHCI3), przy czym zebrano około 40 ml frakcji ze 1400 ml przedgonu.

Frakcje 32-46 połączono i odparowywano z uzyskaniem 21,2 g oleistej substancji. Frakcje 47-93 połączono i odparowywano z uzyskaniem 20,1 g oleistej substancji, którą rozpuszczono w CHCI3 i EA (3:1) do objętości 50 ml i poddano CCM. Z 1400 ml przedgonu zebrano 40 ml frakcji. Frakcje 22-36 połączono i odparowywano z otrzymaniem 3,1 g substancji oleistej, którą dodano do substancji otrzymanej z frakcji 32-46 pierwszej kolumny. Połączone substancje oleiste rozpuszczono w 4 ml wrzącego metanolu, który następnie dodano do 20 ml gorącego propanolu-2 z uzyskaniem po odstaniu 2,57 g krystalicznego faktora B.

Ług macierzysty po krystalizacji faktora B odparowywano z otrzymaniem substancji oleistej, którą rozpuszczono w równej objętości CH2CI i wprowadzono na kolumnę (30 X 2,2 cm) wypełnioną Merck Kiesdgel60 (70-230 mesh ASTM, Ast. nr 7734) w CH2CI2. Złoże przemywano CH2CI2 (2 objętości złoża) i eluowano CHCI3 i EA (3:1) (2 objętości złoża). Po odparowaniu eluatu otrzymano substancję oleistą, którą rozpuszczano w metanolu i poddawano preparatywnej hplc na Spherisorb S5 ODS-2 (250 mm X 20 mm, Phase Sep. Ltd). Próbkę (5 ml) wprowadzono na kolumnę w czasie ponad 1 min. i kolumnę eluowano mieszaniną acetonitryl: woda (7:3) w następujących warunkach:

Czas (min)	Przepływ (ml/min)
0,00	0,00 (injekcja)
1,00	0,00 (czas)
1,10	30,0
39,90	30,0
40,00	35,00
75,00	35,00

Materiał eluujący z kolumny hplc monitorowano spektroskopem UV przy 238 nm. Po odparowaniu połączone fazy z pikiem eluującym przy 26,3 minutach dały faktor E w postaci stałej. Odparowanie połączonych frakcji z pikiem eluującym przy 36,4 minutach dały faktor F w postaci stałej. Dokładniejsze właściwości faktorów E i F przedstawiono poniżej.

Przykład VI. Brzeczkę fermentacyjną wytworzoną analogicznie do przykładu II zbierano po 17 h przebywania w autoklawie (121°C, 1 h), chłodzono do temperatury pokojowej i mieszano magnetycznym mieszadłem z otrzymaniem jednorodnej zawiesiny komórek. Dwie porcje (2 ml) odwirowywano (12,000 g, 2 min., temperatura pokojowa), supernatant dekantowano, a pozostałe komórki zawieszano w 2 ml wody, po czym mieszano i odwirowywano powtórnie (12,000 g, 2 min., temperatura pokojowa). Po zdekantowaniu supernatanta, komórki przemywano dwukrotnie 2 ml porcjami wody destylowanej. Przemyte komórki mieszano jeszcze z 2 ml wody lub 2 ml metanolu i pozostawiano w temperaturze pokojowej mieszając okresowo w czasie 1,5 h. Zawiesinę powtórnie odwirowywano (12,000g, 2 min., temperatura pokojowa), a supernatant rozcieńczano wodą. Komórki z roztworu wodnego powtórnie zawieszano w wodzie i bezpośrednio rozcieńczano wodą.

152 148

Porcje 10μ1 każdego rozcieńczenia dodawano do 200μ1 zawiesiny nicienia Caenorhabolitis elegans w roztworze buforowym zawierającym 6g/L Na2HPO4, 3 g/L K2HPO4, 3g/L NaCl i 0,25 g/L MgSO4-7HzO i doprowadzano pPI do wartości 7,0. Po 4 h zawiesinę nicienia badano w każdym rozcieńczeniu na hamowanie poruszania się nicieni w stopniu większym niż 98% w zawiesinie próbko wej. Stwierdzono, Żelw5,lw25,lw 250 i 1 w 500 rozcieńczeniu ekstraktu metanolowego, 1 w 5,1 w 25,1 w 250,1 w 500 i 1 w 1000 rozcieńczeniu zawiesiny komórek oraz lw 2, Iw4ilw8 rozcieńczeniu ekstraktu wodnego powodował takie inhibitowanie nicieni jak 10//1 dodanych do 200μ1 zawiesiny nicieni.

Przykład VII. W sposób opisany w przykładzie I 250ml kolby Erlenmeyer'a zawierające 50 ml pożywki A lub 50 ml pożywki B szczepiono zawiesiną spory Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 pobraną ze słomki. Kolby zawierające pożywkę A lub B inkubowano w temperaturze 28° w czasie 2 dni na wstrząsarce obrotowej przy 250 obrotach na min. o średnicy orbity obrotów 50 mm. Do zaszczepienia 2 L płaskodennych kolb zawierających 400 ml tej samej pożywki (A lub B) stosowano 8 ml porcje każdego otrzymanego inokuluru. Kolby inkubowano w tych samych warunkach w czasie 2 dni.

Dwa 70 L fermentatory zaszczepiono 2 kolbami pożywki A, a inny 70 L fermentator szczepiono dwoma kolbami pożywki B. Każdy fermentator zawierał 40 L pożywki C.

Fermentację prowadzono w temperaturze 34° podczas mieszania i odpowiedniego napowietrzania dla utrzymania wystarczającego poziomu rozpuszczonego tlenu powyżej 30% nasycenia. Po około 24 h fermentacji pH regulowano wodnym roztworem H2SO4 do wartości 7,2. Jako czynnik przeciwpienieniu dodawano glikol polipropylenowy 2000 w wystarczającej ilości. Po 5 dniach fermentację zatrzymywano i zbierano.

Jeden inny 70 L fermentator, który również zaszczepiono dwoma kolbami pożywki B, przy czym zawartość pożywki B uzupełniono silikonem 1520 (0,06%). Fermentację prowadzono w temperaturze 20°C podczas mieszania i napowietrzania dla utrzymania odpowiedniego poziomu rozpuszczonego tlenu powyżej 30% nasycenia. Do likwidowania piany dodawano glikol polipropylenowy 2000. Po 24 h 9 L porcje przenoszono do 700 L fermentatora zawierającego 450 L pożywki

C.

Fermentację prowadzono w temperaturze 34°C podczas mieszania i napowietrzania dla utrzymania właściwego poziomu rozpuszczonego na poziomie powyżej 30% nasycenia. Pianę likwidowano dodatkiem glikolu propylenowego 2000, a po około 24 h, pH regulowano za pomocą wodnego roztworu H2SO4 do wartości 7,2. Fermentację kończono po 4 dniach i zbierano trzy 401 fermentacje, jak opisano wyżej. Zebrane razem brzeczki pofermentacyjne odwirowywano na urządzeniu Sharples AS 16 PY o wydajności około 120 L/h. Pozostały supernatant w odwirowanym rzucie zastępowano wodą. .

Wydzielone komórki (11,65 kg) emulgowano w 33 L metanolu za pomocą miksera Silverson. Po 60 min. zawiesinę przesączono przez złożoną ukośnie tkaninę, a pozostałość emulgowano powtórnie w 34 L metanolu. Po 40 min. zawiesinę przesączano powtórnie. Przesącze z ekstraktór metanolowych łączono.

Połączone ekstrakty (53,5 L) mieszano z 27 L wody i 27 L PE. Po mieszaniu w czasie 20 min. dwie fazy rozdzielano na wirówce Westfalia MEM 1256. Niższą fazę wodną w ilości 70 L z 37 L wody i 27 L PE i rozdzielano jak uprzednio. Emulsję międzyfazową w fazie PE wymieszano z 4 L acetonu. Niższą fazę wodno-metanolową (108 L) mieszano następnie z 40 L wody i 27L PE trzykrotnie i wymieszano i rozdzielano jak uprzednio z wymieszaniem 4 L acetonu do sklarowania emulsji międzyfazowej. Następnie trzy ekstrakty heksanowe łączono. Połączone ekstrakty PE (85 L) zatężano na wyparce filmowej (ciśnienie parowania 15kPa, temperatura parowania 26°). Koncentrat 3 L suszono za pomocą 2 kg siarczanu sodu, a następnie dalej odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°. Uzyskaną substancję oleistą (639 g) rozpuszczano w 300 ml mieszaniny chloroformu i EA (3:1 wag/wag), przesączano i przemywano na papierze z włókna szklanego. Przesącz i przemywarki (1060 ml) poddawano CCM (1500 mm X 100 mm średnicy) z eluowaniem przy prędkości przepływu 6 L/h. Frakcję eluowaną między 8,8 a 13,1 L mieszano i odparowywano pod niskim ciśnieniem z otrzymaniem 56,3 g substancji oleistej natomiast eluowaną między 13,1 L a 24,6 L analogicznie odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem z otrzymaniem 153,4g substancji stałej barwy jasnożółtej. Wcześniejsza frakcja wykazała zawartość w większej ilości faktora B, natomiast późniejsza frakcja zawierała mieszaninę faktorów A, B,

152 148

C i D. Faktor B w późniejszej frakcji był progresywnie wydzielany przez poddawanie chromatografii CCM, jak opisano powyżej, dwukrotnie. Ostatni raz z zastosowaniem świeżego żelu krzemionkowego w warunkach analogicznych za wyjątkiem zredukowania prędkości przepływu do 3 L/h.

Piki zawierające faktory A, C i Dzdrugiej kolumny eluowano między 8,8 a 17,6 L, a pozostały faktor B, który był zanieczyszczony wydzielano z trzeciej kolumny od faktorów A, C i D eluowanych między 14 a 28 L. Finalne eluaty odparowywano pod niskim ciśnieniem z otrzymaniem 114 g substancji stałej. Piki zawierające faktor B z dwóch kolumn (odpowiednio 7,5-8,8 L i 10,3-13,4 L) odparowywano do uzyskania substancji oleistej (odpowiednio 10,7 g i 10 g) i łączono z substancją oleistą otrzymaną z pierwszych trzech kolumn.

Substancje oleiste zawierające faktor B rozpuszczano w 25 ml wrzącego metanolu i mieszano ze 100 ml wrzącego propanolu-2. Po ochłodzeniu do temperatury 4° faktor B krystalizował. Po jego odsączeniu, przemyciu 200 ml metanolu i ochłodzeniu do -20°C oraz osuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 25,3 g faktora B.

Substancję stałą z trzeciej kolumny, która zawierała faktory A, C i D suszono pod zmniejszonym ciśnieniem do stałego ciężaru 87 g. Próbki 20 g tego stałego związku rozpuszczano w 190 ml metanolu i doprowadzano do objętości 230 ml mieszaniną acetonitrylu i wody (7: 3 obj/obj). Porcje 5 ml otrzymanego roztworu poddawano następnie chromatografowaniu na kolumnie (250 mm X 21,2 mm średnicy) wypełnionej Spherisorb'em ODS-2 (cząstki o średnicy 5//m) z zastosowaniem acetonitrylu i wody (7: 3) jako rozpuszczalnika eluującego. Szybkość przepływu utrzymywano na poziomie 20ml/min przez około lOsek; a następnie zwiększano w ponad 22 min do 34 ml/min i utrzymywano tę wartość przez dalsze 3 min. Faktory eluujące wykrywano przy 238 nm. Faktor C eluowano między 11,0 a 13,4 min, faktor D między 13,4 a 17,4 min, a faktor A między 17,4 a 23,0 min.

Frakcje zawierające faktor C z każdego rozdziału chromatograficznego łączono i odparowywano pod niskim ciśnieniem z otrzymaniem substancji stałej. Frakcje zawierające faktor A odparowywano podobnie z otrzymaniem stałej substancji. Frakcje zawierające faktor D również łączono i odparowywano z otrzymaniem 7 g zanieczyszczonej substancji stałej. Rozpuszczano ją w 65 ml metanolu, mieszano z acetonitrylem i wodą (7:3) i powtórnie chromatografowano na kolumnie ze Spherisorb'em “DS2 jak opisano uprzednio z tym, że przez cały czas utrzymywano stały przepływ 20 ml/min. Następnie faktor D eluowano między 16 a 20 min. i frakcję tę odłączono od innych. Połączone eluaty odparowywano z otrzymaniem substancji stałej. Trzy substancje stałe zawierające faktory A, C i D suszono nad P2O5 pod zmniejszonym ciśnieniem do stałego ciężaru wagowego odpowiednio 55 g, 7,0 g i 1,21 g.

Cztery substancje stałe wydzielone w tym procesie wykazały z autentycznymi próbkami, że są nimi faktory A, B, C i D.

Przykład VIII. Kolby Erlenmeyer'a o pojemności 250ml zawierające 50 ml pożywki B szczepiono 0,5 ml zawiesiny spory każdego ze Streptomyces thermoarchaensis NCIB12111, 12112, 12 113 i 12114 pobranymi ze słomek przygotowanych jak opisano w przykładzie I.

Kolby zawierające Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112 i NCIB 12 113 inkubowano w temperaturze 31°C na wstrząsarce obrotowej. Kolbę zawierającą Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12 114 inkubowano w temperaturze 28°C w czasie 2 dni, a następnie brzeczki przenoszono do innej 250 ml kolby Erlenmeyer'a zawierającej 50 ml pożywki B. Kolbę inkubowano w temperaturze 31 °C na wstrząsarce obrotowej. Wszystkie kolby wstrząsano przy 250 obrotach na minutę przy średnicy orbity obrotów 50 mm. Po 4 dniach inkubowania odwirowywano 10 ml próbki każdej brzeczki (1,250 g) w czasie 45 min. i postępowano w sposób opisany poniżej. Supernatant oddzielono, a śrutę rozpuszczano w 10 ml metanolu. Zawiesinę wstrząsano intensywnie i pozostawiano 1 h okresowo mieszając. Następnie zawiesinę odwirowywano (10,000 g) w czasie 5 min, a supernatant analizowano za pomocą hplc(S5 ODS-2,10 cm X 4,6 mm, 70% CHaCN/0,1 NH4H2PO4). Piki były monitorowane przy 246 nm.

Analiza hplc wykazała obecność faktorów A, B, C i D w każdym przypadku.

Przykład IX. Stwierdzono, że faktory A, B, C, D, E i F mają niżej podane właściwości: a) zawierają tylko węgiel, wodór i tlen,

152 148

b) spektroskopia elektronowa masowa (E.I.) faktorów A, B, C, D, E i F dała niżej podane wyniki:

OaorwijaeżO

Fkktrr Jrn molekularny wzrru cząsteczkowego

A	612,37	C36H52O8
B	598,35	C35H50O8
C	584,34	C34H48O8
D	598,35	C35H50O8
E	612,3638	C36H52O8
F	626,3807	C37H54O8

Soiktrpokpoik msorws FAB (Fsot Atom Bombsrament) daaa niżej oodane wyniki:

Ciężar wsgrwy

Faktor	+ve FAB	—ve FAB	molowy
A	M/Z 635 (M + Na)+ M/Z 613 (M + H)+	M/Z 611 (M-H)'	612
B	M/Z 691 (Μ + H + glicerol)* M/Z 599 (M + H)+ M/Z 581 (MH-H2O)+ M/Z 563 (MH-2H2O)+		598
C	M/Z 607 (M + Na)+	M/Z 583 (M-H)	584
D	M/Z 621 (M + Na)+	M/Z 597 (M-H)	598

Soektrpokroik masowa orla desorpcji faktora E daaa wynik M/Z 612 M+, a faktora F wynik M/Z 626 M+.

Widmo E.I. faktora A z dokaadnym oomiarem masy wykazaao jony orzy 612,37 C36H52O8; 466,31 C30H42O4; 488,30 C30H40O3; 425,23 C26H33O5; 354,22 C23H30O3; 297,22 C₂iH₂9O; 278,11 C15H18O5; 247,17 CWH23O2; 219,18 C15H23O; 95,05 C6H7O.

Widmo E.I. faktora B z dokaadnym oomiarem masy wykazaao jony orzy 598,35 C35H50O8;

438.28 C28H38O4; 420,26 C28H36O3; 314,19 C20H26O3; 248,14 C15H20O3; 151,08 C9HnO₂.

Widmo E.I. faktora C z aokakanym oomikrem masy wykazaap jony orzy 584,34 C34H48O8;

566,33 C34H46O7; 438,28 C2eH38O4.

Widmo E.I. faktora D z dokaadnym oomiarem masy wykazaao jony orzy 598,35 C35H50O8;

452.29 C29H40O4; 434,28 C29H38O3.

Dokaadny oomiar masy faktora E w modelu jonizacji E.I. wykazaa jon orzy: 452,2908 C29H4oO4; a dla faktora F jon orzy: 466,3067 C3o^24^4.

c) faktory A, B, C, D, E i F mają charakterystyczne widmo IR w bromoformie z nastęoującymi oikami: dla faktora A orzy okpao 3510 /OH/, 1712 /ester/ i 998 cm’ /C-O/, dla faktora B orzy okoao 3510 /OH/, 1710 /ester/ i 996 cm-1 /C-O/, dla faktora C z włączeniem oików orzy 3510 /OH/, 1712 /ester/ i 996 cm’1 /C-O/, dla faktora D z włączeniem oików orzy 3508 /OH/, 1711 /ester?/ i 996 cm’1 /C-O/, dla faktora E z włączeniem oików orzy 3500 /OH/, 1708 /ester/ i 994 cm’1 /co/, dla faktora F z włączeniem oasma orzy 3500 /OH/, 1708 /ester/ i 997 cm’1 /C-O/.

Cka0owite widma dla faktorów A, B, C, D, E i F orzeastawiρno na rysunkach oaopwiednio na fig. 12, 3, 4, 6 i 7.

d) Faktory A, B, C, D, E i F mają widmo UV w metanolu (c = 0,002%) ukazujące się (I — infleksja a M = maksimum):

Faktor	λ (nm)	E1i	Faktor	λ (nm)	e1
1	2	3	4	5	6
A	ą52 (I)	318	D	252 (I)	263
	244,5 (M)	468		244,5 (M)	393
	239 (I)	430		239 (I)	362
B	252 (I)	302	Xe	252 (I)	266
	244,5 (M)	426		244 (M)	402
	239 (I)	394		238 (M)	373

152 148

I

1	2	3	4	5	6
c	252 (I)	316	Xf	252 (I)	285
	244,5 (M)	470		244,5 (M)	421
	239 (I)	432		239 (M)	389

Należy zauważyć, że jeżeli powyższe wartości max są charakterystyczne dla każdego faktora, to wartości E1| zależą od czystości otrzymanej substancji. Chociaż, stosunek wartości E¹i jest charakterystyczny dla związku per se.

e) Widmo NMR protonu 200 MHz roztworu każdego faktora w denterowanym chloroformie obejmuje sygnały (wartość τ z multipletami, stałymi /Hz/ i wartościami całkowania w nawiasach/ ośrodkujące się przy niżej podanych wartościach:

Faktor A: 4,1 do 4,4 /m, 2H/; 4,61 /szerokie, s, 1H/; 4,6 do 4,75 /m, 2H/; 4,81 /d, 9,1H/; 5,05 /m, 1H/; 5,34 /s, 2H/; 5,69 /d, 5, 1H/; 6,06 /d, 5,1H/; 6,17 /m, 1H/; 6,26 /d, 11,1H/; 6,37 /m, 1H/; 6,46 /d, 10,1H/; 6,74/q, 2,1H/; 7,42/m, 1H/; 7,7 do 7,9/m, 5H/; 8,14/s, 3H/; 8,40/s, 3H/; 8,47 /s, 3H/; 8,61 /t, 11, 1H/; 8,96 /d, 7,3H/; 9,06 /d, 7,3H/; 9,02 /d, 7,3H/; 9,13 /q, 11, 1H/; 9,21 /d, 7, 3H/.

Faktor B: 4,2 do 4,4 /m, 2H/; 4,55 /q, 7,1H/; 4,65 /szerokie, s, 1H/; 4,6 do 4,8 /m, 2H/; 5,06 /m, lH/;5,3do5,5/m,2H/;6,01 /d5, lH/;6,07/d,5, lH/;6,12/s, lH/;6,24/d, 11, lH/;6,24/m, 1H/; 6,3 do 6,5 /m, 2H/; 6,53 /s, 3H/; 6,73 /q, 2,1H/, 7,62 /m, 1H/; 7,6-8,0 /m, 4H/; 8,22 /s, 3H/; 8,35 /d, 7,3H/; 8,41 /s, 3H/; 8,49 /s, 3H/; 8,62 /t, 11,1H/, 9,03 /d, 6,3H//, 9,12 /q, 11,1H/; 9,22 /d, 7, 3H/.

Faktor C: 4,29 /d, 11, t, 2,1H/; 4,4 do 4,6 /m, 3H/; 4,56 /szerokie, s, 1H/; 5,14/dd, 15,10, 1H/; 5,23 /m, 1H/; 5,65 /szerokie, s, 2H/; 5,72 /d, 6,1H/; 5,95 /d, 10,1H/; 5,99 /d, 6 1H/; 6,08 /szerokie, s, 1H/; 6,1 do 6,4/m, 3H/; 6,62 /q, 3 1H/; Ί,Ί do 8,1 /m, ca, 7H/; 8,18 /s, 3H/; 8,33 /s, 3H/; 8,48 /d, 7, 3H/; 8,64 /s, 3H/; 8,68 /t, 11, 1H/; 9,00 /d, 7, 3H/; 9,08 /d, 7, 3H/; 9,12 /q, 12, 1H/.

Faktor D: 4,18 do 4,4 /m, 2H/; 4,47 do 4,81 /m, 4H/; 5,04 /m, 1H/; 5,35 /s, 2H/; 5,72 /d, 7, 1H/; 6,07 /d, 7, 1H/; 6,15 do 6,45 /m, 4H/; 6,74/q, 4,1H/; 7,45-8,1 /m, 8H/; 8,16/s, 3H/; 8,41 /s, 3H/; 8,49 /s, 3H/; 8,62 /t, 11, 1H/; 8,92-9,05 /m, 6H/; 9,21 /d, 7, 3H/.

Faktor E: 4,1 do 4,3 /m, 2H/; 4,5 do 4,8 /m, 4H, całkowicie/; 5,04 /m, 1H/; 5,2 do 5,5 /m, 2H/; 6,01 /d, 5,1H/; 6,05 /d, 5, 1H/; 6,11 /s, 1H/; 6,1 do 6,4 /m, 3H/; 6,45 /d, 10,1H/; 6,51 /s, 3H/; 6,70 /q, 2, 1H/; 7,60 /m, 1H/; 8,20 /s, 3H/; 8,41 /s, 3H/; 8,47 /s, 3H/; 8,60 /t, 11,1H/; 9,00 /t, 7, 3H/; 9,02 /d, 6, 3H/; 9,11 /q, 11, 1H/; 9,20 /d, 7, 3H/.

Faktor F:4,2do4,4/m,2H/;4,62/s, 1H/;około4,70/m,2H/;4,80/d,9, lH/;5,04/m, 1H/;

5,2 do 5,5 /m, 2H/; 5,99 /d, 5,1H/; 6,05 /d, 5 1H/; 6,11 /s, 1H/; 6,1 do 6,3 /m, 2H/; około 6,36 /m, 1H/; 6,45 /d, 10,1H/; 6,51 /s, 3H/; 6,70 /q, 2,1H/; 7,42/m, 1H/; 7,58 /m, 1H/; 8,19 /s, 3H/; 8,40 /s, 3H/; 8,47 /s, 3H/; 8,60 /t, 11,1H/; 8,95 /d, 7,3H/; 9,05 /d, 7,3H/; 9,01 /d, 7,3H/; 9,10 /q, 11, 1H/; 9,21 /d, 6, 3H/.

f) Widmo NMR 25,05 MHz węgla-13 roztworu każdego faktora w dentero-chloroformie obejmuje piki / (wartość < z multipletami sygnałów w widmie rezonansu w nawiasach) przy niżej podanych wartościach:

Faktor A: 173,2 /s/; 142,6/d/; 139,2/S/; 137,6/s/; 137,1 /S/; 137,0/d/; 130,4/s/; 123,1 /d/; 120,1 /d/; 117,8 ZdZ; 99,5 /s/; 80,0 /s/; 79,0 /d/; 76,5 /d/; 69,0 /d/; 68,3^κ; 67,4 /d/; 48,2 /t/; 45,5 /d/; 40,9 ZtZ; 40,5 /t/; 35Χ; 34,5 ZtZ; 22,1 ZąZ; 34,5 /t/; 26,6 ZdZ; 22,6 /q/; 22,0 /q/; 19,7 /q/; 15,3 /q/; 13,7 ZąZ; 10,8 ZąZ.

Faktor B: 173,4/s/; 142,1 ZdZ; 139,5/s/; 137,1 ZsZ; 1-35,1 ZsZ; 133,7/s/; 123,6/d/; 123,3/d/; 120,0 /d/; 119,3 /d/; 118,2 /d/; 99,5 /s/; 80,1 /s/; 77,3 ZdZ; 76,4 /d/; 69,0 /d/; 68,3 /d/; 67^; 67,6X; 57,5 /q/; 48,2 /tZ; 45,4 ZdZ; 40,7 ZtZ; 40,5 /t/; 35Χ; 34,5 /t/; 22,1 ZąZ; 19,6 ZąZ; 15,3 /q/;

13.6 /q/; 12,9 /q/; 10,5 ZąZ.

Faktor C: 173,3/s/; 142,2 ZdZ; 140,3/s/; 138,5/s/; 137,0/s/; 134,9/s/; 123,9/d/; 121,1 /d/;

120.6 /d/; 118,1 /d/; 100,2 /s/; 80,6 /s/; 80,1 /d/; 77,4 ZdZ; 69,2 /d/; 69,0 ZdZ·, 68,3X; 68,0 /d/; 67,9 /d/; 48,6 /t/; 46,3 /d/; 41,4 /t/; 36^; 36,3X 36,1 /d/; 35,0 ZtZ; 22,6 ZąZ; 20,0 /q/; 15,4 /q/; 14,3 /q/; 10,8 /q/.

152 148

Faktor D: 173,2/s/; 142,5/d/; 139,1 /s/; 137,5/s/; 137,1 /s/; 132,1 /s/; 131,4/d/; 123,1 /d/; 120,1 /d/; 117,8 /d/; 99,5 /s/; 79,9 /s/; 79,2 /d/; 76,5 /d/; 69,0 /d/; 68,3^X; 68,Γ; 67,6^X; 67,4^X; 48,2 /t/;45,5/d/; 40,8/t/; 40,5 /t/; 35,7^X; 34,5 /t/; 22,0 /q/; 20,6 /t/; 19,6 /q/; 15,3/q/; 13,7 /q/; 13,6 /ą/; 10,7 /q/.

*multiplet niepewny.

g) Kołowe krzywe dichroizmu dla faktorów A, B, C i D (około 0,1% roztwór w metanolu) przedstawiono na fig. 8. Krzywe te są ściśle porównywalne z regionem 230-260 nm towarzyszącym absorpcji chromoforu dienu. Wskazuje to, że absolutne konfiguracje trzech C2, C7, C17 oraz C19 są takie same dla wszystkich czterech faktorów.

Poniżej podano przykłady środków wchodzących w zakres wynalazku. Określenie „składnik czynny oznacza związek wytworzony sposobem według wynalazku, np. faktory A, B, C, D, E lub F.

Wielokrotna dawka do injekcji pozajelitowej:

	% wag/obj	zakres
składnik czynny	4,0	1-5% wag/obj
alkohol benzylowy	2,0
trioctan glicerylu	30,0
glikol propylenowy do	100,0

Składnik czynny rozpuszcza się w alkoholu benzylowym i trioctanie glicerylu. Do uzupełnienia objętości dodaje się glikol propylenowy. Roztwór przesącza się do oddzielenia stałych zanieczyszczeń. Do fiolek wprowadza się aseptyczny produkt i zamyka się je i zatapia dokładnie utrzymując w tym położeniu. Końcową sterylizację produktu przeprowadza się na drodze ogrzewania w autoklawie.

Środek w postaci spray'u w aerozolu zawiera następujące składniki:

% wag/wag zakres składnik czynny 0,1 0,01-0,50% wag/wag trichloroetan 29,9 trichlorofluorometan 35,0 dichlorodifluorometan 35,0

Składnik czynny miesza się z trichloroetanem i wprowadza do pojemnika aerozolowego. Górną część pojemnika wypełnia się gazowym propelentem i w tej pozycji ustawia się zawór. Pod ciśnieniem przez zawór wprowadza się określoną ilość ciekłego propelentu. Dopasowuje się przyrząd uruchamiający i kołpak do rozpylania.

Tabletki. Zwilżalne granulki wytwarza się z następujących składników:

mg

składnik czynny	250,0
stearynian magnezu	1% wag/wag	4,5
skrobia kukurydziana	5% wag/wag	22,5
glikolan skrobiowo-sodowy	2% wag/wag	9,0
laurylosiarczan sodu	1% wag/wag	4,5
mikrokrystaliczna celuloza	jako rdzeń tabletki do wagi	450

Do składnika czynnego dodaje się odpowiednią ilość 10% pasty skrobiowej z wytworzeniem masy o odpowiedniej wilgotności do granulowania. Wytwarza się granulki i suszy je na suszarce taśmowej lub ze złożem fluidyzowanym. Następnie przesiewa przez sito, dodaje pozostałe składniki i sprasowuje w tabletki.

W razie potrzeby rdzeń tabletki pokrywa się cienką warstewką hydroksypropylometylocelulozy lub podobnej substancji tworzącej warstwę filmu, stosując zarówno wodne jak i niewodne układy rozpuszczalników. Do roztworów powlekających tworzących warstwę filmu można dodawać plastyfikatory lub substancje barwiące.

Tabletki do zastosowania w weterynarii dla małych zwierząt domowych

152 148

Suche granulki wytwarza się z następujących składników: mg

składnik czynny	50,0
stearynian magnezu	7,5
mikrokrystaliczna celuloza
jako rdzeń tabletki do	75,0

Wytwarza się mieszaninę składnika czynnego i stearynianu magnezu oraz mikrokrystalicznej celulozy. Sprasowuje mieszaninę w bryłki. Przepuszcza bryłki przez granulator rotacyjny, który wytwarza wolno płynące tabletki. Rdzenie tabletek można następnie pokrywać warstwą filmu jak opisano powyżej.

Środek do iniekcji weterynaryjnej dosutkowej wytwarza się z następujących składników:

	mg/dawkę	zakres
składnik czynny		150 mg	150-500 mg
Polysorbat 60	3,0% wag/wag		do 3 lub 5 g
biały wosk pszczeli	6,0% wag/wag	do 3 g	do 3 lub 5 g
olej arachidowy	91,0% wag/wag		do 3 lub 5 g

Na gorąco w temperaturze do 160°C miesza się olej arachidowy, biały wosk pszczeli i polisorbat 60. Mieszaninę utrzymuje się w temperaturze 160°C w czasie 2h, po czym podczas mieszania chłodzi do temperatury pokojowej. Do nośnika dodaje się aseptycznie składnik czynny, dysperguje mieszadłem szybkoobrotowym, oczyszcza przeprowadzając przez młyn koloidalny i aseptyczny produkt wprowadza się do sterylnych plastykowych strzykawek.

Środek w postaci doustnych wlewów do zastosowania w weterynarii wytwarza się z następujących składników:

% wag/obj Zakres składnik czynny polysorbat 85 alkohol benzylowy glikol propylenowy bufor fosforanowy woda

0,35 0,05-0,50% wag/obj

5,0 3,0 30,0 pH 6,0-6,5 do 100,0

Składnik czynny rozpuszcza się w Polisorbate 85, alkoholu benzylowym i glikolu propylenowym. Dodaje się część wody i doprowadza w miarę potrzeby pH do wartości 6,0-6,5 za pomocą buforu fosforanowego. Uzupełnia wodą. Gotowy produkt wprowadza się do pojemników wlewowych.

Środek w postaci pasty do stosowania doustnego w weterynarii % wag/wag Zakres składnik czynny 7,5 1-10% wag/wag sacharyna 25,0

Polysorbate 85 3,0 distearynian glinu 5,0 frakcjonowany olej kokosowy do 100,0

Przez ogrzewanie wytwarza się dyspersję distearynianu glinu we frakcjonowanym oleju kokosowym i Polisorbate 85. Dyspersję oziębia się do temperatury pokojowej i w oleistym nośniku dysperguje się sacharynę. Do osnowy wprowadza się składnik czynny i gotowym produktem wypełnia plastykowe strzykawki.

Środek w postaci granulek stanowiących dodatek do paszy w weterynarii wytwarza się z następujących składników:

% wag/wag Zakres składnik czynny mączka wapienna do

2,5 0,05-5% wag/wag

100

152 148

Wytwarza się mieszaninę składnika czynnego z mączką wapienną, z której wytwarza się granulki z zastosowaniem wilgotnej metody granulowania. Po osuszeniu na suszarce taśmowej lub ze złożem fluidalnym, gotowy produkt wprowadza się do odpowiednich pojemników.

Środek w postaci emulgowanego koncentratu wytwarza się z następujących składników:

składnik czynny 50 g emulgator anionowy (np. Fenylosulfonian/CALX) 40 g niejonowy emulgator (np. Syperonic NP 13) 60 g rozpuszczalnik aromatyczny (np. Solvesso 100) do 1 litra

Wszystkie składniki miesza się do rozpuszczenia.

Środek w postaci granulek wytwarza się z następujących składników:

(a) składnik czynny 50 g żywica drzewna 40 g granulki gipsu (0,804-0,252 mm) do 1 kg (np. Agsorb 100A) (b) składnik czynny 50 g

Syperonic NP13 40 g granulki gipsu (0,80-0,252 mm) do 1 kg

Wszystkie składniki rozpuszcza się w lotnym rozpuszczalniku, np. w chlorku metylenu dodaje do granulek obracanych w mieszadle. Rozpuszczalnik usuwa się przez suszenie.

Aktywność faktorów A, B, C, D, E i F określono z zastosowaniem różnych szkodników i ich żywicieli, takich jak Tetranychus urticae (fasola francuska i śliwa Myrobalan B), Myzus persicae (kapusta chińska i rzodkiewka), Heliothis virescens (bawełna), Chilo protellus (rzepak), Meloidogyne incognita (fasola azjatycka), Panonchus ulmi (śliwa Myrobalan B), Phorodon humuli (chmiel), Autacorthun circumflexum (cyklamen).

Produkt stosowano w postaci ciekłego preparatu. Preparaty przygotowywano przez rozpuszczenie produktu w acetonie. Następnie, roztwory rozcieńczano wodą zawierającą 0,1% lub 0,01% wagowego substancji zwilżającej tak, że ciekły preparat zawierał żądaną ilość produktu.

Testy dostosowywano do poszczególnego szkodnika, wprowadzając określoną liczbę szkodników do środowiska stanowiącego zazwyczaj roślinę żywiciela i zadając określonym preparatem.

W przypadku Tetranychus urticae zarówno szkodnik jak i środowisko poddano działaniu preparatu (test kontaktowy).

W testach tych stwierdzono, że faktory A do F były skuteczne w stężeniach (wagowo) 500 części na milion lub mniejszych.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patento w e

   1. Sposób wytwarzania nowych antybiotyków S541 o ogólnym wzorze 3, w którym R¹ oznacza grupę metylową, etylową lub izopropylową, a R^{2 3 4} oznacza atom wodoru lub grupę metylową, na drodze fermentacji mikroorganizmu Streptomyces, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania w temperaturze 20-50°C mikroorganizmu rodzaju Streptomyces, takiego jak Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 lub jego mutantu, z wytworzeniem wymienionego związku i następnie ewentualnie wydziela się co najmniej jeden wymieniony związek z brzeczki fermentacyjnej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mycelia mikroorganizmu kontaktuje się z rozpuszczalnikiem mieszającym się z wodą w celu wyekstrahowania co najmniej jednego lub więcej związków określonych w zastrz. 1.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wydziela się związek o wzorze 3, w którym R¹ oznacza grupę izopropylową, a R2 oznacza atom wodoru albo R¹ oznacza grupę metylową, a R2 oznacza atom wodoru.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się produkt w postaci stałej substancji znajdującej się w brzeczce fermentacyjnej zawierającej co najmniej jeden związek o wzorze 3 według zastrz. 1, nienaruszone lub uległe lizie mycelia wydzielone z tej brzeczki, albo substancje stałe z brzeczki po wydzieleniu nienaruszonych lub uległych lizie myceli.

   152 148 21
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12 112, NCIB 12113 i NCIB 12 114 albo jego mutant.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fermentację z mikroorganizmem przeprowadza się przy wartości pH 5,5-8,5.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fermentację prowadzi się w czasie 2-10 dni.

   WZÓR 3

   A A/u i i / /L K o ^,vu w - / /

   1000 3500 »00 2900 2000 1800 1600 1100 1200 1000 800 600 400 200

   FIG.1

   100- 00- 60- J 40 looo 35 00 30 M 00 25 00 20 00 10 7^ 00 161 U DO 141 XJ DO 121 p DO 10 Jzla 00 0( X) 61 n u 10 201

   FIG 2

   A Λ 4 A k X / J K u r Wl / X J ‘

   1000 3500 3000 2500 2000 1800 16)0 1400 1200 1000 800 600 ŁOO 200

   FIG. 3.

   FIG.7

   FIG. 8