DE3519834C2

DE3519834C2 - Neue antibiotische Wirkstoffe, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Anwendung zur Bekämpfung von Infektionen bei Tieren und Pflanzen

Info

Publication number: DE3519834C2
Application number: DE3519834A
Authority: DE
Inventors: Irwin Bovden Wood; John Anthony Pankavich; Guy Thomas Carter; Margaret Jennings Torrey; Michael Greenstein
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1984-06-05
Filing date: 1985-06-03
Publication date: 1993-12-16
Anticipated expiration: 2005-06-04
Also published as: EP0170006A2; EP0170006A3; JPS6110589A; DK165210C; DK248885A; DE3519834A1; DK165436C; DK53691D0; JP2524688B2; DK165461B; HUT43637A; IE851391L; PT80577B; DK165436B; JPH0776223B2; DK165119C; ES543948A0; IE58100B1; DK53591D0; AU588811B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue antibiotische Verbindungen, die zusammenfassend als LL-F28 249 identifiziert werden. Die neuen Antibiotika werden hergestellt durch Fermentation des Mikroorganismenstamms Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus LL-F28 249, NRRL Nr. 15 773, in einem Nährmedium. Die Erfindung betrifft ferner die pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze der Verbindungen. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren und Mittel zur Verhinderung, Behandlung oder Bekämpfung von Infektionen, die verursacht werden durch Helminthen, arthropoide Ectoparasiten und Milben (Acariasis) bei Warmblütern. Dazu wird den Warmblütern eine wirksame Menge der Wirkstoffe (Verbindungen) verabreicht, die bezeichnet sind mit LL-F28 249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν und ω, oder Mischungen derselben, und zwar beispielsweise in Form der Fermentationsbrühe oder der Gesamtmaische oder des pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salzes der Verbindungen. Pflanzennematoden werden ebenfalls wirksam bekämpft unter Anwendung dieser Wirkstoffe, Mischungen und/oder Salze. Die genannten Wirkstoffe sind darüber hinaus auch als insektizide Mittel wirksam.

Die oben erwähnten Krankheiten verursachen katastrophale Schäden und führen bei Landwirten, die sich mit der Aufzucht von fleischerzeugenden Tieren, wie Schweinen, Schafen, Rindern, Ziegen, Kaninchen und Geflügel, befassen, zu ernsthaften wirtschaftlichen Problemen und Verlusten. Darüber hinaus sind diese Krankheiten Anlaß zu großer Sorge bei Haustieren, wie Pferden, Hunden und Katzen. Die Krankheiten sind zwar bereits seit vielen Jahren bekannt und es existieren auch Mittel zur Behandlung und/oder zur Verhinderung dieser Krankheiten. Von der vorliegenden Erfindung wird jedoch eine gänzlich neue Gruppe von Wirkstoffen, die aus einem zuvor unbekannten Mikroorganismus isoliert wurden, zur Verhinderung, Behandlung oder Bekämpfung derartiger Krankheiten genutzt.

In der US-PS 39 50 360, Aoki et al., 13. April 1966, sind bestimmte antibiotische Substanzen beschrieben, die durch Kultivierung eines Streptomyces-Mikroorganismus erhalten wurden. Die Verbindungen sind als Insektizide und Akarizide brauchbar. Aus den charakteristischen Eigenschaften, aufgrund derer der Mikroorganismus identifiziert wird, ist jedoch klar, daß der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung sich von den bekannten unterscheidet, so daß die Wirkstoffe von vollständig verschiedenen Mikroorganismen stammen. Eine ganze Serie von US-PSen betrifft bestimmte Verbindungen, die durch Fermentierung von Streptomyces avermitilis erzeugt wurden. Dieser Organismus unterscheidet sich von dem Organismus der vorliegenden Erfindung (US-PS 41 71 314, Chabala et al., 16. Oktober 1979; US-PS 41 99 569, Chabala et al., 22. April 1980; US-PS 42 06 205, Mrozik et al., 3. Juni 1980; US-PS 43 10 519, Albers-Schonberg, 12. Januar 1982; US-PS 43 33 925, Buhs et al., 8. Juni 1982). Die US-PS 44 23 209, Mrozik, 27. Dezember 1983, betrifft das Verfahren zur Umwandlung einiger dieser weniger erwünschten Komponenten in bevorzugtere Komponenten. Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, die als LL-F28 249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν und ω bezeichnet werden, stammen jedoch aus der Fermentation eines neu entdeckten und zuvor nicht kultivierten Mikroorganismus. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder die Fermentationsbrühe oder Gesamtmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus NRRL 15 773 sowie die pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze der Verbindungen (zusammenfassend als Wirkstoff oder wirksamer Bestandteil bezeichnet) eignen sich ausgezeichnet und wirkungsvoll zur Behandlung und/oder Verhinderung dieser ernsten Erkrankungen von warmblütigen Tieren.

Der vollständige Name des Mikroorganismus LL-F28 249 NRRL Nr. 15 773, ausgedrückt als Gattung, Species und Subspecies ist Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus; im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird jedoch aus Zweckmäßigkeitsgründen die verkürzte Schreibweise ebenfalls verwendet.

Der Stamm wird der Gattung Streptomyces zugeordnet aufgrund der Morphologie und Zellchemie (Gehalt des L-Isomeren von Diaminopimelinsäure). Aufgrund der morphologischen und physiologischen Daten des Stammes gehört er in die Nähe von S. cyaneogriseus, repräsentiert durch ISP 5534 (ATCC 27 426). Anschließend wurden Vergleiche durchgeführt hinsichtlich der Bildung von grauen, luftmyzellöslichen Pigmenten auf Medien (Tabelle A) und hinsichtlich gewendeter Ketten von glatten Conidia (3 bis 25 Sporen/Kette). Der Stamm der vorliegenden Erfindung verhält sich negativ hinsichtlich blauem, löslichem Pigment, wohingegen der Vergleichsstamm (ISP 5534) positiv reagiert. Die Stämme zeigen ähnliche Reaktionen bei den ISP-Kohlenhydrat- Nutzungstests, und zwar verhalten sie sich positiv gegenüber Arabinose, Fructose, Glucose, Rhamnose und Xylose, während sie sich negativ verhalten gegenüber Inosit, Mannit, Raffinose und Saccharose (ISP 5534 geringfügig positiv). Die Stämme unterscheiden sich jedoch in einigen Punkten (Tabelle B) unter den 53 untersuchten Eigenschaften bei den Gordon-Tests. Diese Unterschiede belegen, daß es sich bei dem vorliegenden Mikroorganismus um eine Subspecies von S. cyaneogriseus handelt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Bekämpfung von Infektionen bei warmblütigen Tieren, verursacht durch Helminthen, arthropoide Ectoparasiten und Akarizide (Milben), insbesondere bei fleischerzeugenden Tieren, wie Geflügel, Rindvieh, Schafen, Schweinen, Kaninchen, sowie bei Haustieren, wie Pferden, Hunden und Katzen.

Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Mittel zur Verfügung zu stellen, die in effektiver Weise zur Bekämpfung der genannten Krankheiten bei warmblütigen Tieren eingesetzt werden können.

Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren sowie Mittel zur Bekämpfung von Insektenschädlingen zu schaffen. Weitere Aufgaben und Ziele ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Die Kultur von Streptomyces cyaneogriseus nonycanogenus (LL-F28 249, hinterlegt unter NRRL Nr. 15 773), welche die mit α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν und ω bezeichneten Wirkstoffkomponenten erzeugt, wurde aus Malleesand isoliert, der in Südaustralien gefunden wurde.

Es wurde festgestellt, daß man durch Fermentierung eines Nährmediums, das den Mikroorganismusstamm Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NNRRL 15 773, enthält, Wirkstoffe erzeugen kann, die für die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel brauchbar sind. Diese Wirkstoffe umfassen nicht nur die Fermentationsbrühe und die Gesamtmaische des Mikroorganismus, sondern auch die Wirkstoffkomponenten LL-F28 249α, LL-F28 249β, LL-F28 249γ, LL- F28 249δ, LL-F28 249ε, LL-F28 249ζ, LL-F28 249η, LL-F28 249R, LL-F28 249, LL-F28 249, LL-F28 249λ, LL-F28 249μ, LL- F28 249ν und LL-F28 249ω.

Tabelle A

Vergleich von F28 249und ISP 5534 auf ISP-Morphologie-Testmedien (die Zahlenangaben sind aus NBS-ISCC entnommen)

Tabelle B

Vergleich von Lederle F28 249 mit ISP 5534 (Gordon-Tests)

Beide Stämme zeigen folgende Reaktionen:

Positiv - Hydrolyse von Casein, Hypoxanthin, Xanthin, Tyrosin, Adrenin, Kartoffelstärke, Gelatine und Äsculin; Produktion von Phosphatase; Empfindlichkeit gegen Lysozym; Decarboxylierung von Acetat, Citrat, Lactat, Malat, Oxalat und Propionat; Säureproduktion aus Arabinose, Cellobiose, Dextrin, Fructose, Galactose, Glucose, Glycerin, Lactose, Maltose, Mannose, α-Methyl-D-glucosid, Rhamnose, Salicin, Trehalose.
Negativ - Produktion von Nitratreductase; Decarboxylierung von Benzoat und Tartrat; Säure aus Adonit, Dulcit, Erythrit, Inosit, Mannit, Sorbit, β-Methyl-D-xylosid; Wachstum auf 5% NaCl.

Die Struktur und die Stereochemie von LL-F28 249 ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Die vorgeschlagenen Strukturen werden nachstehend angegeben. Die Komponente LL- F28 249 ist verwandt mit Hondamycin (Albimycin), das beschrieben ist in The Journal of Antibiotics, 22, Nr. 11, 521-526 (1969).

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 charakteristische UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249α, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 2 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249α, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 3 charakteristisches Protonenkernmagnetisches Resonanzspektrum (PMR-Spektrum) der mit LL-F28 249α, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCL₃-Lösung;

Fig. 4 charakteristisches ¹³C-kernmagnetisches Resonanz(¹³C-NMR)-Spektrum der mit LL-F28 249α, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃-Lösung;

Fig. 5 charakteristisches Elektronenstoß-Massen- (EM)-Spektrum der mit LL-F28 249α, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 6 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249β, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 7 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249β, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 8 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249β, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 9 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL- F28 249β, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 10 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249γ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 11 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249γ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 12 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249γ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 13 charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum der mit LL-F28 249γ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 14 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249γ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 15 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249ω, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 16 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249ω, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 17 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249ω, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 18 charakteristisches NMR-Spektrum der mit LL-F28 249ω, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 19 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249ω, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 20 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249δ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 21 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249δ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 22 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249δ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 23 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249ε, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 24 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249ε, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 25 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249ε, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 26 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249ζ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 27 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249ζ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 28 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249ζ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 29 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249η, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 30 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249η, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 31 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249η, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 32 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249R, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 33 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249R, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 34 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249R, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 35 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 36 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃;

Fig. 37 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 38 charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum der LL-F28 249β, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung in CDCl₃- Lösung;

Fig. 39 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 40 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 41 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 42 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 43 charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum der mit LL-F28 249, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 44 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249λ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 45 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249ω, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 46 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249λ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 47 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249λ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 48 charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum der mit LL-F28 249λ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 49 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249μ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 50 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249μ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 51 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249μ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 52 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249μ, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 53 charakteristisches UV-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249ν, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 54 charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-F28 249ν, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 55 charakteristisches EM-Spektrum der mit LL-F28 249ν, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung;

Fig. 56 charakteristisches PMR-Spektrum der mit LL-F28 249ν, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung; und

Fig. 57 charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum der mit LL-F28 249ν, NRRL 15 773, bezeichneten Verbindung.

Es wurde gefunden, daß die oben erwähnten Wirkstoffe sowie die Fermentationsbrühe und die Gesamtmaische des genannten Mikroorganismus speziell wirksam sind zur Bekämpfung von Infektionen, die durch Helminthen, arthropoide Ectoparasiten und Akarazide (Milben) bei fleischerzeugenden Tieren, wie Rindern, Schafen, Schweinen, Kaninchen, Geflügel, z. B. Hühnchen, Truthähnen, Enten, Gänsen, Wachteln und Fasanen, sowie bei Haustieren verursacht werden.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung erfolgt die Verhinderung, Bekämpfung oder Behandlung der genannten Infektionen bei warmblütigen Tieren, indem man den Tieren auf oralem, parenteralem oder topischem Weg eine prophylaktisch, pharmazeutisch oder therapeutisch wirksame Menge der Fermentationsbrühe oder Gesamtmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15 773, verabreicht, wobei die Fermentationsbrühe oder die Gesamtmaische des genannten Mikroorganismus Verbindungen enthält, die mit LL-F29 249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν und ω bezeichnet werden, und zwar die als LL-F28 249α, LL-F28 249β, LL-F28 249γ, LL-F28 249δ, LL- F28 249ε, LL-F28 249ζ, LL-F28 249η, LL-F28 249R, LL-F28 249, LL-F28 249, LL-F28 249λ, LL-F28 249μ, LL-F28 249ν und LL- F28 249ω bezeichneten Verbindungen, wie sie in der vorliegenden Beschreibung identifiziert und charakterisiert sind, oder die pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze derselben (zusammenfassend bezeichnet als aktiver Bestandteil oder Wirkstoff).

Die Verabreichung der Verbindung oder der Fermentationsbrühe/ Gesamtmaische (im folgenden als Brühe oder Maische bezeichnet) erfolgt im allgemeinen am praktischsten in oder zusammen mit dem Futter oder dem Trinkwasser. Die oben erwähnten Verbindungen, die Brühe oder Maische oder pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptable Salze der Verbindungen können jedoch auch in Form von Tabletten, Mitteln zum Einflößen, Gelen, Kapseln oder dergl. oder durch Injektion in Form einer Paste, eines Gels, Pellets oder Lösung den einzelnen Tieren verabreicht werden. Die letztgenannten Verabreichungsmethoden sind natürlich für die Behandlung großer Tiergruppen weniger praktikabel. Im Falle kleinerer Gruppen oder einzelner Tiere sind diese Methoden jedoch durchaus anwendbar.

Falls die Wirkstoffe (Antibiotika) LL-F28 249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν oder ω oder die Fermentationsbrühe oder die Gesamtmaische von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15 773, als Prophylaktikum oder therapeutisches Mittel zur Behandlung on Infektionen, ausgelöst durch Helminthen, arthropoide Ectoparasiten und Milben, bei Tieren und Geflügel verwendet werden, so sind im allgemeinen Mengen von etwa 0,05 bis 500,0 TpM, vorzugsweise 0,1 bis 300 TpM, des Mittels oder der Brühe oder der Maische, wie sie oben erläutert wurden, verabreicht in der Nahrung oder im Trinkwasser des Tiers, wirksam im Sinne einer Verhinderung, Bekämpfung oder Behandlung der genannten Infektionen bei den Tieren.

Medikamentierte Futtermittel, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar sind, werden im allgemeinen hergestellt, indem man etwa 0,00001 Gew.-% bis etwa 0,01 Gew.-% des Wirkstoffs (Antibiotikums) oder der oben beschriebenen Brühe oder Maische mit einem nährstoffmäßig ausgewogenen Futter, z. B. dem in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Futter, gründlich vermischt.

Falls man die Verbindungen und/oder Brühe oder Maische der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung oder Bekämpfung von Helminthen, arthropoiden Ectoparasiten und Akariden (Milben) verwendet, so wird der Wirkstoff im allgemeinen zunächst in Form eines Tierfutter-Prämix bereitet. Das Prämix enthält im allgemeinen einen relativ hohen Prozentgehalt des Wirkstoffs und wird dem Tierfutter im allgemeinen unmittelbar vor der Verabreichung zugemischt. Gegebenenfalls kann das Futter-Prämix auch appliziert werden, indem man es als Lockfutter auf die Tagesration des Tiers aufstreut.

Die Futter-Prämixe oder -Konzentrate, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können hergestellt werden, indem man etwa 0,1 bis 5,0 Gew.-% der oben identifizierten Wirkstoffe, Brühe oder Maische oder der pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze der Wirkstoffe mit etwa 99,9 bis 95 Gew.-% eines zweckentsprechenden Trägerstoffs oder Verdünnungsmittels vermischt. Geeignete Trägerstoffe für die Verwendung bei der Herstellung der Futterzusatzmittel umfassen die folgenden: Alfalfamehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatölmehl, Leinsamenölmehl, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Maismehl, Zuckerrohrmelasse, Harnstoff, Knochenmehl, Maiskolbenmehl, Reisspelzenmehl und dergl. Die Träger fördern eine im wesentlichen einförmige Verteilung des Wirkstoffs in dem fertigen Futter, dem der Futterzusatz zugemischt wird. Der Träger übt somit eine wichtige Funktion dahingehend aus, daß er die zweckentsprechende Verteilung des Wirkstoffs, d. h. etwa 0,1 bis 100 TpM desselben über das Futter gewährleistet. Dieses entspricht einer Menge von 0,00001 bis 0,01 Gew.-% des Wirkstoffs in dem fertigen Futter. In der Praxis werden im allgemeinen ein oder mehrere Pfund des Prämix pro Tonne Futter zugesetzt, um in dem fertigen Futter das gewünschte Niveau des Wirkstoffs (Antibiotikum) oder der Brühe oder Maische zu erhalten.

Falls der Futterzusatz oder das Prämix als Lockfutter auf das Futter aufgestreut wird, gewährleistet es ebenfalls eine einförmige Verteilung des Wirkstoffs über das bestreute Futter.

Da die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre pharamazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze relativ wasserlöslich sind, ist es im allgemeinen erwünscht, bei der Verabreichung einer derartigen Verbindung im Trinkwasser des Tiers den Wirkstoff in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton, DMSO, Ölsäure, Linolsäure, Propylenglykol oder dergl., aufzulösen und mit der Lösung eine geringe Menge eines oberflächenaktiven Mittels und/oder eines Dispersionsmittels zu vermischen, um eine Auflösung und/oder Dispersion des Wirkstoffs im Trinkwasser des Tiers zu gewährleisten.

Falls die Behandlung einer kleineren Anzahl von großen, fleischerzeugenden Tieren zur Bekämpfung von parasitären Infektionen erforderlich ist, kann man die Mittel LL- F28 249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν und ω, die Brühe oder Maische oder pharmazeutisch und pharmakologisch Salze der Verbindungen mit Vorteil oral verabreichen, und zwar täglich in Form eines medikamentierten Gels.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe zeigen ferner nematozide Wirksamkeit gegen Pflanzennematoden. Diese Tatsache wird demonstriert durch die Wirksamkeit der Wirkstoffe bei der Bekämpfung der freilebenden Bodennematode C. elegans. Mittel mit einem Gehalt dieser Wirkstoffe zur Bekämpfung von Pflanzennematoden können formuliert werden als Flüssigkeiten oder als benetzbare Pulver. Flüssige Mittel umfassen etwa 5 bis 20 Gew.-% des aktiven Bestandteils (Wirkstoff, Fermentationsbrühe, Gesamtmaische oder Salze) zusammen mit zweckentsprechenden Mengen eines Lösungsmittels, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Acetonitril u. a., sowie als Rest Wasser. Benetzbare Pulver umfassen etwa 5 bis 20 Gew.-% des aktiven Bestandteils, etwa 1 bis 10% oberflächenaktives Mittel sowie inerte Trägerstoffe, wie Tone, Vermiculit, Ruß oder dergl. Eine Menge von etwa 0,1 bis 1,4 kg Wirkstoff/ha wird den Blättern der Pflanzen, dem Boden, in dem die Pflanzen wachsen, oder den Strünken der Pflanzen appliziert.

Die Wirkstoffe sind auch als topische Insektizide, als Fraßgifte sowie als systemische Insektizide wirksam und erweisen sich als besonders wirksam zur Bekämpfung von Insekten der Ordnungen Lepedoptera, Coleoptera Homoptera, Depera und Thysanoptera. Pflanzenmilben, Akariden, werden ebenfalls durch die erfindungsgemäßen Wirkstoffe bekämpft.

Die Wirkstoffe werden im allgemeinen in Form verdünnter, fester oder flüssiger Mittel auf die Brutplätze, die Nahrungsvorräte oder den Lebensraum derartiger Insekten und/ oder Akariden appliziert. Die Anwendungsmenge auf derartige Orte umfaßt etwa 0,01 bis etwa 8,0 kg/ha, vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 0,5 kg/ha.

Oberflächenaktive Mittel, die bei der Herstellung von benetzbaren Pulvern der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, umfassen die gebräuchlicherweise für die Formulierung derartiger benetzbarer Pulver verwendeten Substanzen, vorzugsweise Alkylbenzolsulfonat-natriumsalze. Bentonit, Ton oder Mischungen derselben sind bevorzugte Trägermaterialien.

Es hat sich ferner gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Wirkstoffe eine systemische Insektizidwirkung gegen M. ovinus bei Schafen aufweisen.

In der Praxis sind im allgemeinen etwa 0,02 bis etwa 3,0 mg/kg/Tag wirksam zur Bekämpfung von parasitären Injektionen bei Rindern, Schafen und Schweinen sowie bei Haustieren. Bei länger dauernder Anwendung kann man so geringe Mengen wie 0,002 mg/kg Körpergewicht/Tag einsetzen.

Es hat sich ferner in der Praxis gezeigt, daß etwa 0,1 bis 100 mg/kg an Tiere verabreicht werden sollten, die mit Helminthen infiziert sind.

Die physiochemischen Eigenschaften der α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν und ω-Komponenten von LL-F28 249 werden nachstehend beschrieben.

LL-F8249α

1) Molekulargewicht: 612 (FAB-MS)
2) Molekülformel: C₃₆H₅₂O₈
3) spezifische optische Drehung: [α] =+133±3° (C 0,3, Aceton)
4) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. I gezeigt UV = 244 nm (ε 28 000)
5) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. II gezeigt (KBr- Scheibe): 3439, 2960, 2925, 1714, 1454, 1374, 1338, 1171, 1120, 996, 967 cm^-1
6) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. III gezeigt
7) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. IV gezeigt und in Tabelle I beschrieben und
8) EM-Spektrum: wie in Fig. V gezeigt mit der genauen Massenbestimmung und der vorgeschlagenen Elementarzusammensetzung gemäß Tabelle II.

LL-F28249β

1) Molekulargewicht: 584 (FAB-MS)
2) Molekülformel: C₃₄H₄₈O₈3) spezifische optische Drehung: [α] =+125° (C 0,30, Aceton)
4) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. VI gezeigt UV = 244 nm (ε 25 600)
5) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. VII gezeigt (KBr- Scheibe): 3250, 2910, 1735, 1717, 1450, 1375, 1335, 1180, 1170, 1119, 993, 727 cm^-1
6) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. VIII gezeigt
7) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XXXVIII gezeigt und in Tabelle IIA beschrieben und
8) EM-Spektrum: wie in Fig. IX gezeigt mit der genauen Massenbestimmung und der vorgeschlagenen Elementarzusammensetzung gemäß Tabelle III.

LL-F28249γ

1) Molekulargewicht: 598 (FAB-MS)
2) Molekülformel: C₃₅H₅₀O₈
3) spezifische optische Drehung: [α] =+150°±4° (C 0,3, Aceton)
4) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. X gezeigt UV = 244 nm (ε 27 100)
5) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XI gezeigt (KBr- Scheibe): 3510, 2910, 1735, 1715, 1452, 1375, 1338, 1182, 1172, 1119, 995 cm^-1
6) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XII gezeigt
7) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XIII gezeigt und in Tabelle IV beschrieben und
8) EM-Spektrum: wie in Fig. XIV gezeigt mit der genauen Massenbestimmung und der vorgeschlagenen Elementarzusammensetzung gemäß Tabelle V.

LL-F28249ω

1) Molekulargewicht: 806 (FAB-MS)
2) Molekülformel: C₄₅H₇₄O₁₂3) spezifische optische Drehung: [α] =-49±3° (C 0,35, Methanol)
4) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XV gezeigt UV = 225 nm (ε 27 400) und 232 nm (ε 25 700)
5) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XVI gezeigt (KBr- Scheibe): 3480, 2965, 2935, 2880, 1703, 1647, 1458, 1380, 1292, 1223, 1135, 1098, 984 cm^-1
6) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XVII gezeigt
7) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XVIII gezeigt und in Tabelle VI beschrieben und
8) EM-Spektrum: wie in Fig. XIX gezeigt mit der genauen Massenbestimmung und der vorgeschlagenen Elementarzusammensetzung gemäß Tabelle VII.

LL-F28249δ

1) Molekulargewicht: 616 (EJ-MS)
2) Molekularformel: C₃₅H₅₂O₉
3) HPLC-Retentionsvolumen von 14,0 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System
4) UV-Absorptionsspektrum (Methanol): wie in Fig. XX gezeigt
5) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XXI gezeigt und
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XXII gezeigt.

LL-F28249ε

1) Molekulargewicht: 598 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₅H₅₀O₈
3) HPLC-Retentionsvolumen von 14,8 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System
4) UV-Absorptionsspektrum (Methanol): wie in Fig. XXIII gezeigt
5) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XXIV gezeigt und
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XXV gezeigt.

LL-F28249ζ

1) Molekulargewicht: 598 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₅H₅₀O₈
3) HPLC-Retentionsvolumen von 16,0 ml in dem in Tabelle VIII gezeigten System
4) UV-Absorptionsspektrum (Methanol): wie in Fig. XXVI gezeigt
5) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XXVII gezeigt und
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XXVIII gezeigt.

LL-F28249η

1) Molekulargewicht: 612 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₆H₅₂O₈
3) HPLC-Retentionsvolumen von 23,5 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System
4) UV-Absorptionsspektrum (Methanol): wie in Fig. XXIX gezeigt
5) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XXX gezeigt und
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XXXI gezeigt.

LL-F28249R

1) Molekulargewicht: 626 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₇H₅₄O₈
3) HPLC-Retentionsvolumen von 24,5 ml in dem in Tabelle VIII gezeigten System
4) UV-Absorptionsspektrum (Methanol): wie in Fig. XXXII gezeigt
5) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XXXIII gezeigt und
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XXXIV gezeigt.

LL-F28249

1) Molekulargewicht: 626 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₇H₅₄O₈
3) HPLC-Retentionsvolumen von 26,0 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System
4) UV-Absorptionsspektrum (Methanol): wie in Tabelle XXXV gezeigt
5) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XXXVI gezeigt und
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XXXVII gezeigt.

LL-F28249

1) Molekulargewicht: 584 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₅H₅₂O₇3) spezifische optische Drehung: [α] =+189° (C 0,165, Aceton)
4) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XXXIX gezeigtUV =241 nm (ε 20 400)
5) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XL gezeigt (KBr- Scheibe)
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XLI gezeigt
7) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XLII gezeigt und
8) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XLIII gezeigt und in Tabelle IX beschrieben.

LL-F28249λ

1) Molekulargewicht: 626 (FAB-MS)
2) Molekülformel: C₃₇H₅₄O₈3) spezifische optische Drehung: [α] =+145° (C 0,23, Aceton)
4) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XLIV gezeigtUV =244 nm (ε 30 000)
5) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XLV gezeigt (KBr- Scheibe)
6) EM-Spektrum: wie in Fig. XLVI gezeigt
7) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XLVII gezeigt und
8) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. XLVIII gezeigt und in Tabelle X beschrieben.

LL-F28249μ

1) Molekulargewicht: 612 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₇H₅₆O₇
3) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. XLIX gezeigt UV =241 nm (ε 16 800)
4) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. L gezeigt (KBr- Scheibe)
5) EM-Spektrum: wie in Fig. LI gezeigt und
6) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. LII gezeigt.

LL-F28249ν

1) Molekulargewicht: 592 (EJ-MS)
2) Molekülformel: C₃₆H₄₈O₇3) spezifische optische Drehung: [α] =+131° (C 0,325, Aceton)
4) UV-Absorptionsspektrum: wie in Fig. LIII gezeigt UV =256 nm (ε 20 500), 358 nm (ε 8830)
5) IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. LIV gezeigt (KBr- Scheibe)
6) EM-Spektrum: wie in Fig. LV gezeigt
7) PMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. LVI gezeigt und
8) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. LVII gezeigt und in Tabelle XI beschrieben.

Tabelle II

Hochaufgelöste Massenbestimmungen für LL-F28249α

Tabelle IIa

¹³C-NMR-Daten für LL-F28249β

Tabelle III

Hochaufgelöste Massenbestimmungen für LL-F28249β

Tabelle IV

¹³C-NMR-Werte für LL-F28249γ

Tabelle V

Hochaufgelöste Massenbestimmung für LL-F28249γ

Tabelle VI

¹³C-NMR-Daten für LL-F28249ω

Tabelle VII

Hochaufgelöste Massen-Bestimmungen für LL-F28249ω

Tabelle VIII

HPLC-Retentionsvolumen für LL-F28249α, δ, ε, ζ, η, R und

Tabelle IX

¹³C-NMR-Daten für LL-F28249

Tabelle X

¹³C-NMR-Daten für LL-F28249λ

Tabelle XI

¹³C-NMR-Daten für LL-F28249ν

Tabelle XII

Chromatographische Daten

Die neuen Wirkstoffe, bezeichnet LL-F28249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν und ω, werden gebildet im Verlauf der Kultivierung von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, unter kontrollierten Bedingungen.

Dieser Organismus ist in der Kultursammlung der Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur Nr. LL-F28249 enthalten. Eine lebensfähige Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt und deren permanenter Sammlung einverleibt. Der Mikroorganismus ist der Öffentlichkeit in dieser Hinterlegungsstelle unter seiner Hinterlegungsnummer NRRL 15773 frei zugänglich.

Die vorliegende Erfindung ist hinsichtlich der Herstellung dieser neuen Wirkstoffe nicht auf diesen speziellen Organismus beschränkt. Umfaßt ist auch die Verwendung von natürlich vorkommenden Mutanten dieses Organismus sowie von induzierten Mutanten, die aus diesem Organismus durch Anwendung verschiedener mutagener Mittel, die den Fachleuten bekannt sind, wie beispielsweise die Behandlung mit Stickstoffmustard, Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, N′-Methyl- N′-nitro-N-nitrosoguanidin, Actinophagen und dgl., erzeugt wurden. Ferner sind von der vorliegenden Erfindung umfaßt die inter- und intraspezifischen, genetischen Rekombinanten, die erzeugt wurden durch genetische Techniken, wie sie den Fachleuten bekannt sind, z. B. Konjugation, Transduktion und Techniken des genetic engineering.

Allgemeine Fermentationsbedingungen

Die Kultivierung von Streptomyces cyanogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, kann in einer breiten Vielfalt flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Brauchbare Medien für die Bildung der Wirkstoffe LL-F28249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, μ, ν uns ω umfassen eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, wie Dextrin, Saccharose, Melasse, Glycerin etc.; eine assimilierbare Quelle von Stickstoff, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser etc.; sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid etc., Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer etc., werden in Form von Verunreinigungen der anderen Bestandteile der Medien zugeführt. Die Belüftung in Tanks und Flaschen wird durchgeführt, indem man sterile Luft durch das fermentierende Medium hindurchdrückt oder auf die Oberfläche des fermentierenden Mediums aufpreßt. Eine weitere Bewegung in den Tanks wird durch einen mechanischen Rührer gewährleistet. Sofern erforderlich, kann ein Antischäummittel, wie Siliconöl, zugesetzt werden.

Beispiel 1 Inokulum-Herstellung

Ein typisches Medium, wie es zur Aufzucht der verschiedenen Stufen des Inokulums verwendet wird, wird gemäß folgender Rezeptur hergestellt:


%
Dextrose
1,0
Dextrin	2,0
Hefeextrakt	0,5
NZ-amin	0,5
Calciumcarbonat	0,1
Wasser q.s.	100

Dieses Medium wird sterilisiert. Eine 100-ml-Portion des sterilen Mediums wird in einer Flasche mit abgekratztem Myzel von einem Agarslant (einer geneigten Agarplatte) von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, inokuliert. Das Medium wird anschließend 48 bis 72 h bei 28°C heftig auf einem Rotationsschüttler geschüttelt, um ein Primärinokulum zu erhalten. Dieses Primärinokulum wird anschließend verwendet, um 1 l des obigen sterilen Mediums zu beimpfen. Durch aerobische Kultivierung bei 28°C während 48 h erhält man ein Sekundärinokulum.

Beispiel 2 Fermentation

Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:


%
Dextrin
1,0
Sojapepton	1,0
Melasse	2,0
Calciumcarbonat	0,1
Wasser q.s.	100

Dieses Medium wird sterilisiert. Anschließend wird eine 30-l-Portion mit 1 l des gemäß Beispiel 1 hergestellten Sekundärinokulums beimpft. Die Fermentation wird bei 30°C durchgeführt, wobei ein steriler Luftstrom von 30 l/ min aufrechterhalten wird, bei einem Druck von 8 psig Überdruck und unter Rühren mit einem Propeller, der mit 500 U/min betrieben wird. Die Fermentation wird 91 h durchgeführt und anschließend die Maische geerntet.

Beispiel 3 Isolierung von LL-F28249α, β und γ

Eine Gesamtmenge von 26 l der Gesamterntemaische, hergestellt gemäß Beispiel 2, wird mit 1500 g Diatomeenerde vermischt und filtriert. Der Myzelkuchen wird mit 5 l Wasser gewaschen und das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der Myzelkuchen wird mit 10 l Methanol 1 h vermischt, dann filtriert und mit 5 l Methanol gewaschen. Der Methanolextrakt und die Methanol-Waschflüssigkeit werden vereinigt und eingedampft zu einem wäßrigen Rückstand von etwa 1 bis 2 l. Dieser wäßrige Rückstand wird mit der doppelten Menge seines Volumens an Methylenchlorid versetzt und das Ganze eine halbe Stunde vermischt. Die Methylenchlorid-Phase wird abgetrennt und dann zu einem Sirup konzentriert, wobei man 27 g Rohmaterial erhält.

Diese 27 g Rohmaterial werden in einem Gemisch aus Methylenchlorid und Methanol aufgelöst, durch Baumwolle und wasserfreies Natriumsulfat filtriert und dann eingedampft. Dabei erhält man 7,0 g eines Öls.

Eine 170-g-Portionen Silikagel wird in 12,5% Ethylacetat in Methylenchlorid aufgeschlämmt und zur Bildung einer Säule von 2,5×58 cm verwendet. Das Öl wird in 12,5%igem Ethylacetat in Methlyenchlorid aufgelöst und auf die Säule appliziert. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Die mobile Phase wird zu Beginn mit 1,3 ml/min laufenlassen, und es werden 15-Minuten- Fraktionen aufgefangen. Nach zehn Fraktionen wird die Strömungsrate auf etwa 0,5 ml/min verlangsamt, so daß die Fraktionen 1 bis 10 jeweils 20 ml umfassen, abnehmend auf etwa 10 ml, und die Fraktionen 11 bis 98 jeweils etwa 7 ml umfassen. Bei Fraktionen 99 wird die Strömungsrate wieder gesteigert, so daß 25-ml-Fraktionen während jeweils 10 min erhalten werden. Es wird eine Geamtzahl von 105 Fraktionen aufgefangen. Diese Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie in Ethylacetat-Methylenchlorid (1/1) untersucht.

Die Fraktionen 30 bis 54 werden vereinigt und eingedampft, wobei man 1,08 g eines Öls erhält, das LL-F28249γ enthält.

Die Fraktionen 55 bis 62 werden vereinigt und eingedampft, wobei man 150 mg eines Feststoffs erhält, der LL- F28249α und β enthält.

Die 150 mg des Feststoffs mit einem Gehalt an LL-F28249α und β werden chromatographiert mittels einer präparativen HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Whatman C8, 2,2·50 cm), entwickelt mit 80% (V/V) Methanol in Wasser. Die Strömungsrate beträgt etwa 10 ml/min, und es werden 2-Minuten-Fraktionen aufgefangen.

Die Fraktionen 58 bis 69 werden vereinigt, das Methanol wird abgedampft, t-Butanol wird zugesetzt und das Gemisch lyophilisiert, wobei man 60 mg reines LL-F28249α erhält.

Die Fraktionen 40 bis 43 werden vereinigt, das Methanol wird abgedampft und die zurückbleibende, wäßrige Suspension mit Methylenchlorid extrahiert. Nach Eindampfen des Extrakts erhält man 10 mg reines LL-F28249β.

Die 1,08 g des LL-F28249γ enthaltenden Öls werden in 10% Ethylacetat in Methylenchlorid aufgelöst und auf eine Säule (2,5·50 cm) gegeben, die mit Silikagel gepackt ist. Die Säule wird mit 10% Ethylacetat in Methylenchlorid entwickelt, mit einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert, und es werden 12-Minuten-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 19 bis 29 werden vereinigt und zu einem Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird durch präparative Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt, wie oben für die α- und β-Komponenten beschrieben. Die Fraktionen 55 bis 62 werden vereinigt, das Methanol wird im Vakuum abgedampft, t-Butanol zugesetzt und das Gemisch lyophilisiert. Man erhält 60 mg reines LL-F28249γ.

Beispiel 4 Fermentation in großem Maßstab

Ein Inokulum von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, wird gemäß Beispiel 1 hergestellt. Unter Verwendung von 100 ml des Primärinokulums werden 10 l Sekundärinokulum produziert.

Zwei 300-l-Fermentationen werden gemäß Beispiel 2 durchgeführt, und zwar unter Verwendung von 10 l des obigen Sekundärinokulum für jeweils 300 l des Fermentationsmediums. Nach 118 h werden die Maischen geerntet.

Beispiel 5 Isolierung von LL-F28249ω

Eine Gesamtmenge von 450 l der geernteten Maische aus den beiden 300-l-Fermentationen, die in Beispiel 4 beschrieben wurden, wird wie im ersten Abschnitt von Beispiel 3 beschrieben behandelt, wobei man ein Rohmaterial in Form eines Sirups erhält.

Dieser Siruprückstand wird mit Hexan gewaschen, um nichtpolare Materialien zu entfernen. Die zurückbleibenden 9 g unlösliches Material werden einer Sephadex-LH20- Trennchromatographie unterworfen.

Die Chromatographiesäule wird hergestellt unter Verwendung von 9 l Sephadex LH-20, das zuvor in Methanol gequollen wurde. Es wird eine Säule von 10×110 cm gebildet. Die Säule wird äquilibriert, indem man etwa 4800 ml mobile Phase [Methylenchlorid-Hexan-Methanol (10/10/1)] durchleitet mit einer Strömungsrate von 5 ml/min. Die 9 g unlösliches Material werden in 50 ml der mobilen Phase auf die Säule gegeben. Ein erster Vorlauf von 2150 ml wird mit einer Strömungsrate von 5 ml/min erhalten. Die Strömungsrate wird anschließend auf 8 ml/min gesteigert, und jeweils nach 45 min wird eine neue Fraktion abgenommen. Die Fraktionen 9 bis 12 werden vereinigt und die Lösungmittel im Vakuum abgedampft. Man erhält 4,9 g eines Rückstands.

Dieser Rückstand wird in einem 1 : 1-Gemisch von Cyclohexan und Ethylacetat aufgelöst und langsam bei Zimmertemperatur eindampfen gelassen. Bei Zusatz von n-Hexan erhält man einen Niederschlag, der gesammelt wird. Man erhält 3,1 g eines Feststoffs.

Eine 3,0-g-Portion dieses Feststoffs wird weiter gereinigt durch Präzipitation aus 25 ml Methylenchlorid unter Verwendung von 50 ml n-Hexan.

Das auf diese Weise erhaltene Präzipitat wird in 15 ml Methylenchlorid wieder aufgelöst und mit 25 ml n-Hexan gefällt, wobei man 510 mg reines LL-F28249ω erhält.

Beispiel 6 Isolierung von LL-F28249δ, ε, ζ, η, R und

Die Fraktionen 4 bis 7 aus der Sephadex-LH-20-Säulenchromatographie, die in Beispiel 5 beschrieben ist, werden kombiniert und die Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Man erhält 1,9 g eines Rückstandes. Dieser Rückstand wird auf einer 200 g Silikagelsäule (2,5 cm×83 cm) unter Verwendung von 10% Ethylacetat in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Die Strömungsrate wird auf etwa 2 ml/min eingestellt und jeweils nach 12 min wird eine neue Fraktion abgenommen.

Die Fraktionen 65 bis 67 und 73 bis 79 werden miteinander vereinigt und die Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Man erhält 250 mg eines Rückstands.

Dieser 250-mg-Rückstand werden einer präparativen Umkehrphasen- Chromatographie unterworfen, wie sie in Beispiel 3 beschrieben wurde. Dabei verwendet man jedoch 75% Methanol in Wasser als mobile Phase. Die Strömungsrate beträgt etwa 10 ml/min. Die erste 2000-ml-Portion des Eluats wird verworfen. Anschließend werden 72 Fraktionen in 2,0-min-Intervallen aufgefangen. Nachdem eine weitere Portion des Eluats verworfen wurde (zwischen 300 und 400 ml), werden wiederum Fraktionen aufgefangen, jedoch nunmehr in 2,5minütigen Intervallen.

Die Fraktionen werden, wie unten angegeben, vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden in einem Abzug über Nacht eingedampft. Anschließend werden die Komponenten in Methylenchlorid extrahiert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels erhält man jeweils etwa 1 mg der reinen Komponenten.

Vereinigte Fraktionen
Verbindung
7-10
LL-F28249δ
19-22	LL-F28249ε
28-31	LL-F28249ζ
81-83	LL-F28249η
86-88	LL-F28249R
93-95	LL-F28249

Beispiel 7 Isolierung von LL-F28249, λ, μ und ν

Eine Gesamtmenge von 390 l der Fermentationsmaische, die aus den gemäß Beispiel 2 durchgeführten Fermentationen geerntet wurde, wird im wesentlichen wie im ersten Absatz von Beispiel 3 beschrieben aufgearbeitet. Dabei erhält man 120 ml eines Methylenchlorid-Konzentrats. Dieses Konzentrat wird mit 200 ml Hexan verdünnt und über Nacht bei 4°C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wird durch Filtration entfernt und verworfen. Das Filtrat wird mit 300 ml Hexan verdünnt. Das resultierende Präzipitat (A) wird durch Filtration gesammelt und aufbewahrt. Dieses Filtrat wird zur Trockene eingedampft und der ölige Rückstand anschließend in 200 ml Methylenchlorid aufgelöst und mit 1700 ml Hexan verdünnt. Das resultierende Präzipitat (B) wird durch Filtration gesammelt und aufbewahrt. Dieses Filtrat wird zu einem öligen Rückstand konzentriert, der anschließend in 50 ml Methlyenchlorid wieder aufgelöst wird. Man gibt 950 ml Methanol zu und lagert diese Lösung 3 Tage bei 4°C. Das resultierende Präzipitat wird durch Filtration entfernt und verworfen. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand (C) mit (A) und (B) vereinigt und folgendermaßen chromatographiert: Die 5,0×109-cm-Säule wird gepackt mit einer Aufschlämmung von Woelm TSC Silikagel in Ethylacetat-Methylenchlorid (1/9). Die Säule wird mit der gleichen Lösungsmittelmischung entwickelt, und zwar mit einer Rate von 25 ml/min. Die ersten 2 l des gereinigten Abwassers werden verworfen. Dann werden sechzehn 400-ml-Fraktionen aufgefangen.

Die Fraktionen 2 und 3 werden vereinigt und eingedampft, wobei man 3,9 g öliges Material (D) erhält.

Die Fraktionen 4 bis 7 werden vereinigt und eingedampft, wobei man 9,5 g öliges Material erhält, das in Hexan aufgelöst und auf einer 2,5×110-cm-Säule chromatographiert wird, die bepackt ist mit einer Aufschlämmung von 300 g Woelm Silikagel in Ethylacetat-Hexan (1/4). Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelsystem mit einer Rate von 4 ml/min entwickelt, und es werden Fraktionen in 7minütigen Intervallen aufgefangen.

Die Fraktionen 45 bis 54 werden vereinigt und eingedampft, wobei man 0,3 g des Materials (E) erhält.

Die Fraktionen 63 bis 135 werden vereinigt, zur Trockene eingedampft und anschließend in t-Butanol wiederaufge löst. Nach Gefriertrocknung erhält man 4,6 g eines schmut zigweißen Feststoffs (F).

LL-F28249 und µ

Die Materialien (D) und (E) werden vereinigt und auf ei ner 2,5 · 110 cm Säule chromatographiert, die bepackt ist mit 300 g Woelm Silikagel. Es wird mit Ethylacetat-Hexan (1/9) entwickelt. Die Strömungsrate wird bei 4 ml/min ge halten und die Fraktionen werden in 7minütigen Inter vallen abgenommen.

Die Fraktionen 67 bis 115 werden kombiniert und zur Trockene eingedampft, wobei man 920 mg Rückstand (G) er hält.

Dieser Rückstand (G) wird mittels präparativer HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Whatman C8, 2,2 · 50 cm) und Entwicklung mit 85% (V/V) Methanol in Wasser chromatographiert. Die Strömungsrate beträgt etwa 10 ml/ min und die Fraktionen werden in 2,5 Minuten-Intervallen aufgefangen.

Die Fraktionen 33 bis 40 werden vereinigt, zur Entfernung des Methanols konzentriert, anschließend mit Methylen chlorid extrahiert. Der beim Eindampfen erhaltene Rück stand wird in t-Butanol aufgelöst und gefriergetrocknet. Man erhält 60 mg LL-F28249.

Die Fraktionen 52 bis 58 werden auf ähnliche Weise aufge arbeitet, wobei man eine geringe Menge LL-F28249µ erhält.

LL-F28249λ

Eine 1 g-Portion des Materials (F) wird chromatographiert mittels einer Umkehrphasen-HPLC auf die oben beschriebene Weise. Es wird jedoch 80% (V/V) Methanol in Wasser als Elutionsmittel verwendet. Die Fraktionen 61 bis 75 werden vereinigt und auf die oben beschriebene Weise aufgearbei tet, wobei man 100 mg LL-F28249λ erhält.

LL-F28249ν

Eine 396 g-Portion eines Materials, das im wesentlichen dem oben beschriebenen Material (D) gleicht, wird in 500 ml Methanol aufgelöst und anschließend einige Stunden bei 4°C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wird durch Filtration entfernt, mit kaltem Methanol gewaschen und verworfen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat wird eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in Hexan aufgelöst und auf eine 5 · 50 cm trockengepackte Silika gelsäule (Mallinkrodt SilicAR cc-7) gegeben. Die Säule wird mit Ethylacetat-Hexan (1,5/8,5) eluiert, und zwar mit einer Rate von etwa 50 ml/min. Es werden vier Frak tionen aufgefangen:

Fraktion
Volumen (l)
1
1
2	4
3	1
4	2

Die Fraktion 3 wird eingedampft, wobei man 5,0 g eines Rückstands erhält, der gereinigt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC (Waters C₁₈, 5 · 60 cm). Die Säule wird zu Beginn mit 16 l 80% Methanol in Wasser (V/V) eluiert, und zwar mit 100 ml/min. Daraufhin werden 6,4 l 84%iges Methanol in Wasser (V/V) verwendet. Der erste Liter des Abwassers wird verworfen. Anschließend werden Fraktionen von jeweils 400 ml aufgefangen.

Die Fraktionen 44 bis 47 werden vereinigt und auf die oben beschriebene Weise aufgearbeitet. Man erhält 390 mg LL-F28249ν als blaßgelben Feststoff.

Beispiel 8 Anti-Nematoden-Wirkung von LL-F28249, NRRL 15773

Bei diesem in vitro-Test wird die freilebende Nematode Caenohabditis elegans (C. elegans) zur Bestimmung der Anti- Nematoden-Wirkung der Fermentationsbrühe gegenüber Bodenorganismen genutzt. Bei dem Testverfahren werden je weils 50 µl der jeweiligen Brühe in eine der 96 Vertie fungen einer Mikrokulturplatte mikropipettiert und 10 µl einer 3 bis 4 Tage alten Kultur von C. elegans (in allen Entwicklungsstadien), suspendiert in C.briggsae Nährme dium zugesetzt. Die Wirkungen der Fermentationsbrühen wer den 48 h nach dem Vermischen von Brühe und Nematoden be obachtet und aufgezeichnet.

Die Brühe von LL-F28249, NRRL 15773, führt zu einer Ab tötung sämtlicher adulten Nematoden und zu einer bemer kenswerten Reduzierung der Überlebensrate und Mobilität der verschiedenen Larvenstadien. Dieses Ergebnis wird so wohl bei dem anfänglichen Test als auch bei einem Wie derholungstest beobachtet.

Beispiel 9 In vivo-anthelminthische Aktivität von LL-F28249, NRRL 15773

Bei diesem in vivo-System soll eine potentielle anthel minithische Aktivität der Fermentationsprodukte ermittelt werden, bei denen sich gezeigt hat, daß sie eine Anti- Nematoden-Wirkung gegen C. elegans aufweisen. Proben von LL-F28249, NRRL 15773, werden mit dem Futter vermischt, und zwar in Konzentrationen von 0,0031 bis 2,0% (31 bis 20 000 TpM). Die medikamentierte Nahrung mit einem Gehalt an verschiedenen Konzentrationen von LL-F28249, NRRL 15773, wird an Rennmäuse (Gerbillus) verfüttert, die mit 400 Larven von Trichostrongylus colubriformis im dritten Entwicklungsstadium infiziert sind. Das medikamentierte Futter wird ad libitum während 3 ½ bis 4 Tagen gefüt tert, und zwar beginnend nachdem die Infektion 7 Tage alt ist. Anschließend werden die Rennmäuse getötet. Der Ver dauungstrakt wird entfernt und in Wasser in einem Inkuba tor 2 h bei 45°C aufbewahrt, damit die Parasiten aus dem Gewebe herauskommen können. Die Wirksamkeit der jeweili gen Behandlung wird bestimmt, indem man die Anzahl von T. colubriformis bestimmt, die im Vergleich zu einem unbe handelten Kontrollversuch zurückerhalten wird. Die Ergeb nisse dieser Experimente sind in der folgenden Tabelle XIII aufgeführt. Die Ergebnisse belegen die anthelminthi sche Wirksamkeit von LL-F28249 bei Verabreichung zusam men mit dem Futter sowie bei Verabreichung in Form einer einzigen oralen Einflößung und bei Verabreichung durch subkutane Injektion.

Beispiel 10 Anthelminthische Aktivität von LL-F28249α gegen parasitäre Nematoden bei Schafen

Dieses Experiment dient zur Bewertung der Wirksamkeit von LL-F28249α gegen die unter wirtschaftlichen Gesichtspunk ten wichtigen Parasiten von Schafen. Die Schafe werden für den Versuch mit infizierten Larven von Haemonchus contor tus, Ostertagia circumcincta und Trichostrongylus colubri formis geimpft, um Infektionen auszulösen, die mit LL- F28249α behandelt werden sollen. 21 Tage nach der Ein impfung wird das Infektionsniveau bestimmt. Dazu wird die Anzahl der Eier jeder Species/g Fäkal nach Standard-Nemato denzählverfahren bestimmt. Die Schafe werden wahllos in Behandlungs- und Kontrollgruppen zugeordnet, und zwar ba sierend auf den Ergebnissen der Nematodeneizählungen für drei Wiederholungen des Tests. 22 Tage nach der Infektion der Schafe werden diese mit LL-F28249α behandelt, wobei die in der folgenden Tabelle XIV angegebenen Dosismengen und Verabreichungswege angewendet werden. 7 bzw. 8 Tage nach der Behandlung werden die Schafe getötet und die Wür mer nach Standard-anthelminthischen Bewertungsverfahren isoliert. Die Wirksamkeit der jeweiligen Behandlung gegen jede Species wird bestimmt durch Vergleich der Anzahl der Würmer bei der jeweiligen Dosismenge mit der Anzahl der aus den drei unbehandelten Kontrolltieren zurückgewonnenen Würmer. Die Ergebnisse dieser Bewertungen, die in der fol genden Tabelle XIV zusammengestellt sind, belegen den hohen Wirkungsgrad von LL-F28249α als anthelminthisches Mittel.

Beispiel 11 Wirksamkeit des Antibiotikums LL-F28249α gegen das parasi täre Insekt Melophagus ovinus (Schaflausfliege) bei Schafen

Dieses Experiment wird gleichzeitig bei den gleichen Scha fen durchgeführt, die für die Bestimmung der anthelminthi schen Aktivität gemäß Beispiel 10 verwendet wurden. Die Schafe werden vor der Behandlung daraufhin untersucht, ob sie Anzeichen für einen natürlichen Befall mit M. ovinus aufweisen. Eine Hälfte jedes Schafes wird beim Schlachten hinsichtlich der Anzeichen von anti-ectoparasitärer Wir kung 7 Tage nach Behandlung untersucht. Die linke Seite je des Schafes wird mit einem elektrischen Schergerät langsam geschoren und auf lebende und tote Schaflausfliegen unter sucht. Der Grad des Befalls wird aufgrund der Anzahl von Puppen abgeschätzt, die während der Untersuchung in der Wolle gefunden werden. Die Bewertung erfolgt mit 0 bis +++ entsprechend "keine Puppen" bis "viele Puppen". Die Anzahl der Schaflausfliegen wird für jedes Schaf festge stellt, und zwar ohne das jeweilige Behandlungsniveau zu kennen, um Vorurteile zu eliminieren. Anfangs wurden die Schaflausfliegen als tot oder lebendig gezählt. Mit zuneh mender Erfahrung im Verlauf des Experiments wurden jedoch einige Schaflausfliegen aufgrund ihres abnorm langsamen Verhaltens als moribund gezählt. Die Zahl der bei den Schafen festgestellten Schaflausfliegen variiert in star kem Maße. Die in Tabelle XV angegebenen Daten zeigen je doch, daß LL-F28249α wirksam ist gegen M. ovinus und daß der genannte Wirkstoff eine systemische ectoparasitäre Wirksamkeit aufweist. Bei den behandelten Tieren wird die Anzahl der lebenden Schaflausfliegen in effektiver Weise reduziert und die Anzahl der toten Schaflausfliegen steigt bei den intramuskulär behandelten Schafen an.

Beispiel 12 Insektizidwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die Insektizidwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen gegen eine Vielzahl von Insekten bei unterschiedlichen Konzentrationen des Wirkstoffs in Aceton-Wasser-Lösungen wird mittels der folgenden Insektizidtest-Beispiele be stimmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle XVI zusammengefaßt.

(A) Heliothis virescens, Eier, tobacco budworm

Ein junges Baumwollblatt, etwa 7 bis 8 cm lang, wird in eine Testsuspension 3 sec eingetaucht und bewegt. Eier werden auf einem Seihtuch gesammelt, das in 10 bis 20 mm Quadrate zerschnitten ist, enthaltend etwa 50 bis 100 Eier (6 bis 30 h alt). Ein Quadrat des Seihtuchs mit Eiern wird ebenfalls in die Testsuspension eingetaucht und auf das behandelte Blatt placiert. Diese Kombination wird zum Trocknen in den Abzug gestellt. Anschließend wird die Kombination in einen 8 Unzen-Becher (Dixie cup Nr. 2168-ST; 240 ml, 6 cm hoch, oberer Durchmesser 9,5 cm, unterer Durchmesser 8 cm) placiert, der einen 5 cm langen feuchten Dentaldocht enthält. Ein klarer Plastikdeckel wird oben auf den Becher aufgelegt. Nach dreitägiger Be handlung werden Mortalitätszählungen durchgeführt.

(B) Aphis fabae, verschiedene Entwicklungsstadien, bean aphids

Töpfe, enthaltend eine einzige Masturtiumpflanze (Tro paeolum sp.), etwa 5 cm hoch, werden mit etwa 100 Schäd lingen einen Tag vor dem Test infiziert. In einem Abzug wird jede Pflanze mit der Testsuspension besprüht, und zwar während 2 Umdrehungen auf einem mit 4 U/min rotie renden Tisch, wobei ein Nr. 154 DeVilluss-Zerstäuber verwendet wird. Die Töpfe werden auf weiße Porzellanträ ger gestellt und zwei Tage gepflegt. Anschließend wird die Mortalität der Schädlinge abgeschätzt.

(C) Empoasca abrupta, adulte Tiere, western potato leafhopper

Ein Blatt einer Sieva Limabohnenpflanze, etwa 5 cm lang, wird in die Testsuspension 3 sec eingetaucht und bewegt. Anschließend wird das Blatt zum Trocknen in einen Abzug placiert. Das Blatt wird in eine 100 · 10 mm Petrischale gelegt, die auf ihrem Boden ein feuchtes Filterpapier enthält. 10 adulte Schädlinge werden in jede Schale ge setzt und die Behandlung wird 3 Tage durchgeführt. Dann werden die Mortalitätszählungen gemacht.

(D) Trichoplusia ni, Larven im 3. Entwicklungsstadium, cabbage looper

Blätter einer Sieva Limabohnenpflanze, die auf 7 bis 8 cm Länge aufgespannt sind, werden 3 sec in eine Test suspension eingetaucht und bewegt und anschließend zum Trocknen in einen Abzug gestellt. Daraufhin wird ein Blatt abgeschnitten und in eine 100 · 10 mm Petrischale gelegt, die an ihrem Boden ein feuchtes Filterpapier ent hält. 10 Larven im 3. Entwicklungsstadium werden zuge setzt. Die Schale wird 3 Tage aufbewahrt, bevor die Beob achtungen hinsichtlich Mortalität und verringerter Fut teraufnahme durchgeführt werden.

(E) Spodoptera eridanis, Larven im 3. Entwicklungsstadium, southern armyworm

Blätter einer Sieva Limabohnenpflanze, die auf 7 bis 8 cm Länge ausgebreitet sind, werden in die Testsuspen sion 3 sec eingetaucht und bewegt und anschließend zum Trocknen in einen Abzug gestellt. Ein Blatt wird dann abgeschnitten und in eine 100 · 10 mm Petrischale gelegt, die an ihrem Boden ein feuchtes Filterpapier enthält. 10 Larven im 3. Entwicklungsstadium werden zugesetzt. Die Schale wird 5 Tage aufbewahrt, bevor die Untersuchungen hinsichtlich Mortalität, verringerter Futteraufnahme oder irgendeiner Beeinflussung der normalen Häutung durchge führt werden.

(F) Heliothis virescens, Larven im 3. Entwicklungsstadium, tobacco budworm

Baumwollkeimblätter (Cotyledone) werden in die Testsuspen sion eingetaucht und zum Trocknen in einen Abzug gestellt. Das Cotyledon wird in vier Abschnitte zerschnitten und jeder Abschnitt in einen 30 ml-Kunststoff-Medikamenten becher placiert, der ein 5 bis 7 mm langes Stück feuch ten Dentaldocht enthält. Eine Larve im 3. Entwicklungs stadium wird in jeden Becher gesetzt und der Becher mit einem Pappdeckel verschlossen. Die Behandlung wird 3 Tage durchgeführt, bevor die Mortalitätszählungen durchgeführt werden und die Verringerung bei der Futteraufnahme abge schätzt wird.

Musca domestica, Hausfliege

Die gewünschte Konzentration der Testverbindung wird dem Standard-CSMA-Alfalfa-Kleielarvenmedium zugesetzt. Haus fliegeneier mit einem Halter von 0 bis 4 h werden dem be handelten Medium zugesetzt. Das behandelte Medium wird aufbewahrt und beobachtet hinsichtlich Eischlupf, Wachs tum von Larven und Ausschlüpfen adulter Tiere.

(H) Tribolium confusum, confused flour beetle

Die Käfer (Tribolium confusum) werden aus Laboratoriums kolonien erhalten, die auf einem Gemisch von ganzem Wei zen und weißem Mehl aufgezogen werden. Für diesen Test wurde weißes Mehl mit einer Acetonlösung des Testmateri als behandelt, wobei 1 ml der Lösung/5 g Mehl in einem 30 ml Weithalsgefäß verwendet wird. Das Aceton wird in einem Abzug über Nacht abgedampft. Der Inhalt des Gefäßes wird mit einem Spatel gerührt, um die durch die Testlö sung gebildeten Klumpen zu zerbrechen. Das Gefäß wird an schließend auf einen Vortes-Genie®-Vibrationsmischer placiert, um die Testmaterialien gründlich mit der Nah rung zu vermischen. 10 adulte Käfer werden in jedes Ge fäß gesetzt und daß Gefäß wird lose verschlossen. Nach 5 Tagen zur Eiablagerung werden die Käfer entfernt, wo bei eine etwaige Mortalität festgestellt wird. 2 und 4 Wochen nach der anfänglichen Infektion wird die Zahl und Größe der durch die sich entwickelnden Larven im be handelten Mehl erzeugten Spuren festgestellt. Bei dieser Beobachtung erhält man Hinweise hinsichtlich eines verzö gerten Wachstums, einer Abtötung von Eiern oder Larven oder irgendwelcher anderer Beeinflussungen des normalen Wachstumsmusters. Nach etwa 9 Wochen bei 27°C schlüpfen die adulten Käfer aus. Die Schlußbeobachtung wird durch geführt, indem man den Inhalt jedes Gefäßes durch ein 50 Maschen/2,5 cm Sieb hindurchsiebt. Es wird die Anzahl von adulten Tieren, Puppen und Larven festgestellt. Fer ner werden die Brocken untersucht, die nicht durch das Sieb hindurchgehen, um festzustellen, ob sie abgestorbe ne Eier oder neugeschlüpfte Tiere enthalten.

(I) Tetranychus urticae (p-resistenter Stamm) 2-gepunktete Spinnmilbe

Sieva Limabohnenpflanzen, deren Primärblätter 7 bis 8 cm ausgebreitet sind, werden ausgewählt und bis auf eine Pflanze pro Topf zurückgeschnitten. Ein kleines Stück wird von einem Blatt abgeschnitten, das der Haupt kolonie entnommen wurde. Das Blattstück wird jeweils auf das Blatt der Testpflanzen placiert. Dies erfolgt etwa 2 h vor der Behandlung, so daß die Milben auf die Test pflanzen überwechseln können und dort Eier legen können. Die Größe des abgeschnittenen Stücks wird variiert, so daß etwa 100 Milben/Blatt erhalten werden. Zum Zeitpunkt der Behandlung wird das zur Übertragung der Milben ver wendete Blattstück entfernt und weggeworfen. Die mit Mil ben infizierten Pflanzen werden 3 sec in die Testlösung eingetaucht und bewegt und anschließend zum Trocknen in den Abzug gestellt. Die Pflanzen werden 2 Tage aufbewahrt, bevor eine Bestimmung der getöteten, adulten Tiere unter Verwendung des ersten Blatts durchgeführt wird. Das zwei te Blatt wird weitere 5 Tage an der Pflanze belassen, be vor die Untersuchungen hinsichtlich der Abtötung von Eiern und/oder neugeschlüpften Nymphen durchgeführt wer den.

(J) Spodoptera eridania, 3. Entwicklungsstadium, southern armyworm, systemischer Test am abgeschnittenen Stengel

Die Verbindung wird in Form einer Emulsion formuliert, enthaltend 0,1 g des Testmaterials, 0,1 g polyethoxylier tes Pflanzenöl in 0,4 g Wasser, 10 ml Aceton und 90 ml Wasser. Diese Emulsion wird mit Wasser auf das 10fache verdünnt, um eine 100 TpM-Emulsion für die Testzwecke zu erhalten. Sieva Limabohnenpflanzen, bei denen die Primär blätter sich gerade ausbreiten, werden bei diesem Test verwendet. Diese Blätter werden abgeschnitten, und zwar mindestens 2,5 cm oberhalb des Bodenniveaus, um eine Kontaminierung mit Bodenbakterien zu vermeiden, wodurch ein Zerfall des Stengels während des Tests verursacht werden könnte. Die abgeschnittenen Stengel werden in die Testemulsion gelegt. Nach 3 Tagen der Aufnahme wird ein Blatt abgeschnitten und in eine 100 · 10 mm Petrischale gelegt, die am Boden ein feuchtes Filterpapier enthält und in der sich 10 Larven im 3. Entwicklungsstadium be finden. Nach 3 Tagen werden Mortalitätszählungen durchge führt und eine reduzierte Futteraufnahme wird abgeschätzt.

(K) Thrips palmi, Thrips

Stark befallene Blätter von jungen Baumwollpflanzen wer den unter Feldbedingungen mit den gewünschten Konzentra tionen besprüht. Es wird die Zahl der Schädlinge vor und nach dem Besprühen festgestellt. Bezogen auf die Ergeb nisse dieser Zählungen wird die prozentuale Bekämpfung ermittelt.

(L) Tetranychus urticae (P-resistenter Stamm), zweigepunktete Spinnmilbe

Die Verbindung wird in Form einer Emulsion formuliert, enthaltend 0,1 g Testmaterial, 0,1 g eines polyethoxylier ten Pflanzenöls in 0,4 g Wasser, 10 ml Aceton und 90 ml Wasser. Diese Emulsion wird mit Wasser auf das 10fache verdünnt, um eine 100 TpM-Emulsion für Testzwecke zu er halten. Sieva Limabohnenpflanzen, deren Primärblätter sich gerade entfalten, werden bei diesem Test verwendet. Die Blätter werden mindestens 2,5 cm oberhalb des Boden niveaus abgeschnitten, um eine Kontaminierung mit Boden bakterien zu vermeiden, wodurch anderenfalls ein Zerfall des Stengels während des Tests verursacht werden können. Die abgeschnittenen Stengel werden in die Testemulsionen placiert. Jedes Blatt wird mit etwa 100 adulten Milben infiziert und 3 Tage aufbewahrt. Anschließend werden die Mortalitätszählungen durchgeführt.

Claims

1. Verbindung LL-F28249α, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 612 (FAB-MS);
(b) Molekülformel C₃₆H₅₂O₈;
(c) spezifische optische Drehung [α] =+133±3° (C 0,3, Aceton);
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. I;
(e) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. II;
(f) Protonen-kernmagnetisches Resonanz(PMR)-Spektrum gemäß Fig. III;
(g) Kohlenstoff-13-kernmagneti sches Resonanz(¹³C-NMR)-Spektrum gemäß Fig. IV mit signifikanten Signalen bei 173,4, 142,8, 139,4, 137,7, 137,3, 137,2, 130,6, 123,3, 120,3, 118,0, 99,7, 80,2, 79,3, 76,7, 69,3, 68,5, 68,4, 67,8, 67,7, 48,4, 45,7, 41,1, 40,7, 36,1, 36,0, 35,9, 34,7, 26,8, 22,8, 22,2, 19,9, 15,1, 13,9, 11,0; und
(h) Elektronenstoß-Massen-(EM)- Spektrum gemäß Fig. V und mit den nachstehend angegeben, durch hochauflösende Massen bestimmung erhaltenen, gemessenen m/z-Werten und zugeordneten Elementarzusammensetzungen

wobei die Fig. I bis V Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verbindung LL-F28249β, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 584 (FAB-MS);
(b) Molekülformel C₃₄H₄₈O₈;
(c) spezifische optische Drehung [α] =+125° (C 0,30, Aceton);
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. VI;
(e) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. VII;
(f) PMR-Spektrum gemäß Fig. VIII;
(g) ¹³C-NMR-Spektrum gemäß Fig. XXXVIII mit signifikanten Signalen bei 173,3, 142,6, 139,5, 137,7, 137,3, 133,9, 123,8, 123,4, 120,3, 120,2, 118,0, 99,7, 80,2, 79,4, 76,7, 69,2, 68,6, 68,3, 67,8, 67,7, 48,4, 45,7, 41,0, 40,8, 36,1, 35,9, 34,7, 22,3, 19,8, 15,5, 13,8, 13,1, 10,8; und
(h) EM-Spektrum gemäß Fig. IX und mit den nachstehend angegebenen, durch hochauflösende Massenbestimmung erhaltenen, gemessenen m/z-Werten und zugeordneten Elementarzusammensetzungen

wobei die Fig. VI bis IX und XXXVIII Bestandteil dieses Anspruchs sind.

3. Verbindung LL-F28249γ, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 598 (FAB-MS);
(b) Molekülformel C₃₅H₅₀O₈;
(c) spezifische optische Drehung [α] =+150±4° (C 0,3, Aceton);
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. X;
(e) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XI;
(f) PMR-Spektrum gemäß Fig. XII;
(g) ¹³C-NMR-Spektrum gemäß Fig. XIII mit signifikanten Signalen bei 173,6, 142,4, 139,9, 137,3, 136,0, 134,0, 123,8, 123,6, 120,4, 119,6, 118,5, 99,8, 80,5, 77,8, 77,0, 76,8, 69,3, 68,6, 68,3, 67,9, 57,7, 48,5, 45,8, 41,2, 40,8, 36,2, 36,1, 36,0, 34,8, 22,3, 19,9, 15,5, 13,8, 13,1, 10,8; und
(h) EM-Spektrum gemäß Fig. XIV und mit den nachstehend angegebenen, durch hochauflösende Massenbestimmung erhaltenen, ge messenen m/z-Werten und zugeordneten Elementarzusam mensetzungen

wobei die Fig. X bis XIV Bestandteil dieses Anspruchs sind.

4. Die Verbindung LL-F28249ω, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 806 (FAB-MS);
(b) Molekülformel C₄₅H₇₄O₁₂;
(c) spezifische optische Drehung [α] =-49±4° (C 0,35, Methanol);
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XV;
(e) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XVI;
(f) PMR-Spektrum gemäß Fig. XVII;
(g) ¹³C-NMR-Spektrum gemäß Fig. XVIII mit signifikanten Signalen bei 220,7, 219,6, 165,2, 148,7, 133,1, 132,3, 130,2, 122,3, 100,0, 82,9, 75,9, 73,0, 72,7, 72,6, 72,1, 69,0, 67,3, 63,6, 51,4, 46,2, 45,7, 42,2, 40,4, 38,3, 37,6, 36,1, 34,8, 33,5, 30,1, 26,6, 25,4, 24,5, 23,0, 21,1, 17,9, 14,3, 14,2, 12,1, 11,5, 10,9, 8,7, 8,3, 5,7; und
(h) EM-Spektrum gemäß Fig. XIX und mit den nachstehend angegebenen, durch hochauflösende Massenbestimmung erhaltenen, gemesse nen m/z-Werten und zugeordneten Elementarzusammenset zungen

wobei die Fig. XV bis XIX Bestandteil dieses Anspruchs sind.

5. Verbindung LL-F28249δ, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 616 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₅H₅₂O₉;
(c) HPLC-Retentionsvolumen von 14,0 ml;
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XX;
(e) PMR-Spektrum gemäß Fig. XXI; und
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XXII,

wobei die Fig. XX bis XXII Bestandteil dieses Anspruchs sind.

6. Verbindung LL-F28249ε, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 598 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₅H₅₀O₈;
(c) HPLC-Retentionsvolumen von 14,8 ml;
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XXIII;
(e) PMR-Spektrum gemäß Fig. XXIV; und
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XXV,

wobei die Fig. XXIII bis XXV Bestandteil dieses Anspruchs sind.

7. Verbindung LL-F28249ζ, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 598 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₅H₅₀O₈;
(c) HPLC-Retentionsvolumen von 16,0 ml;
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XXVI;
(e) PMR-Spektrum gemäß Fig. XXVII; und
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XXVIII,

wobei die Fig. XXVI bis XXVIII Bestandteil dieses Anspruchs sind.

8. Verbindung LL-F28249η, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 612 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₆H₅₂O₈;
(c) HPLC-Retentionsvolumen von 23,5 ml;
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XXIX;
(e) PMR-Spektrum gemäß Fig. XXX; und
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XXXI,

wobei die Fig. XXIX bis XXXI Bestandteil dieses Anspruchs sind.

9. Verbindung LL-F28249R, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 626 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₇H₅₄O₈;
(c) HPLC-Retentionsvolumen von 24,5 ml;
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XXXII;
(e) PMR-Spektrum gemäß Fig. XXXIII; und
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XXXIV,

wobei die Fig. XXXII bis XXXIV Bestandteil dieses Anspruchs sind.

10. Verbindung LL-F28249, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 626 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₇H₅₄O₈;
(c) HPLC-Retentionsvolumen von 26,0 ml;
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XXXV;
(e) PMR-Spektrum gemäß Fig. XXXVI; und
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XXXVII,

wobei die Fig. XXXV bis XXXVII Bestandteil dieses Anspruchs sind.

11. Verbindung LL-F28249, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 584 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₅H₅₂O₇;
(c) spezifische optische Rotation [α] =+189° (C 0,165, Aceton);
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XXXIX UV =241 nm (E 20 400);
(e) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XL (KBR-Scheibe);
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XLI,
(g) PMR-Spektrum (CDCl₃) gemäß Fig. XLII; und
(h) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃) wie in Fig. XLIII ge zeigt und in Tabelle IX beschrieben,

wobei die Fig. XXIX bis XLIII und die Tabelle IX Bestandteil dieses Anspruchs sind.

12. Verbindung LL-F28249λ, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 626 (FAB-MS);
(b) Molekülformel C₃₇H₅₄O₈;
(c) spezifische optische Drehung [α] =+145° (C 0,23, Aceton);
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XLIV UV =244 nm (E 30 000);
(e) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XLV (KBr-Scheibe);
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. XLVI;
(g) PMR-Spektrum (CDCl₃) gemäß Fig. XLVII; und
(h) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃) wie in Fig. XLVIII gezeigt und in Tabelle X beschrieben,

wobei die Fig. XLIV bis XLVIII und die Tabelle X Bestandteil dieses Anspruchs sind.

13. Verbindung LL-F28249µ, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 612 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₇H₅₆O₇;
(c) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. XLIX UV =241 nm (E 16 800);
(d) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. L (KBr-Scheibe);
(e) EM-Spektrum gemäß Fig. LI; und
(f) PMR-Spektrum (CDCl₃) gemäß Fig. LII,

wobei die Fig. XLIX bis LII Bestandteil dieses Anspruchs sind.

14. Verbindung LL-F28249ν, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von 592 (EJ-MS);
(b) Molekülformel C₃₆H₄₈O₇;
(c) spezifische optische Drehung [α] =+131° (C 0,325, Aceton);
(d) UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. LIII UV =256 (E 20 500); 358 (E 8830);
(e) IR-Absorptionsspektrum gemäß Fig. LIV (KBr-Scheibe);
(f) EM-Spektrum gemäß Fig. LV;
(g) PMR-Spektrum (CDCl₃) gemäß Fig. LVI; und
(h) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl₃) wie in Fig. LVII gezeigt und in Tabelle XI beschrieben,

wobei die Fig. LIII bis LVII und die Tabelle XI Bestandteil dieses Anspruchs sind.

15. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn zeichnet, daß die Verbindung in Form ihres pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salzes vorliegt.

16. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen LL-F28249α, LL-F28249β, LL-F28249γ, LL-F28249δ, LL-F28249ε, LL-F28249ζ, LL-F28249η, LL-F28249R, LL-F28249, LL-F28249, LL-F28249λ, LL-F28249µ, LL-F28249ν und LL-F28249ω, dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen den Organismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15 773, oder eine LL-F28249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, µ, ν und ω produzierende, in bekannter Weise induzierte Mutante desselben in in einem flüssigen Medium, enthal tend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Anionen und Kationen, fermentiert, bis sich eine wesentliche Menge an LL-F28249α, β, γ, δ, ε, ζ, η, R, , , λ, µ, ν undd ω in dem Medium gebildet hat, und nachfolgend die Wirkstoffe daraus gewinnt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, die Fermenta tionskultur bei steriler Belüftung und unter Rühren wäh rend eines Zeitraums von 80 bis 200 Stunden bei einer Temperatur von 24 bis 32°C durchführt.

18. Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15 773 und durch Be handlung mit mutagenen Mitteln genetisch veränderte Kultur davon die jedoch immer noch die Fähigkeit behalten hat, Mittel LL-F28249α, LL-F28249β, LL-F28249γ, LL-F28249δ, LL-F28249ε, LL-F28249ζ, LL-F28249η, LL-F28249R, LL-F28249, LL-F28249, LL-F28249λ, LL-F28249µ, LL-F28249ν und LL-F28249ω zu synthetisieren.

19. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 in einer prophylaktisch, therapeutisch oder pharmazeutisch wirksamen Menge bei der Behandlung von Infektionen bei warmblütigen Tieren, die durch Helminthen, arthropoide Ectoparasiten oder Milben ausgelöst werden, oder zur Bekämpfung von Pflanzennematoden.