NL8902010A

NL8902010A - Dna-fragment met ten minste een protease-gen, een dergelijk dna-fragment bevattende cloneringsvektor, een gastheercel getransformeerd met een dusdanig opgebouwde cloneringsvektor, alsmede de met dergelijke gastheercellen geproduceerde proteasen resp. bereide produkten zoals voedingsmiddelen.

Info

Publication number: NL8902010A
Application number: NL8902010A
Authority: NL
Original assignee: Nl Zuivelonderzoek Inst
Priority date: 1989-08-04
Filing date: 1989-08-04
Publication date: 1991-03-01
Also published as: EP0411715A3; JPH08503840A; AU6051590A; AU638042B2; ZA906137B; WO1991002064A3; WO1991002064A2; EP0411715A2; EP0494149A1; CA2064577A1; IE902832A1

Description

DNA-fragment met ten minste een protease-gen, een diergelijk DNA-fragment bevattende cloneringsvektor, een gastheercel getransformeerd met een dusdanig opgebouwde cloneringsvektor, alsmede de met dergelijke gastheercellen geproduceerde proteasen resp. bereide produkten zoals voedingsmiddelen.

De uitvinding heeft betrekking op een DNA-fragment, dat ten minste een mutant protease-gen omvat.

Zoals bekend worden gram-positieve bacteriën toegepast bij de bereiding van een groot aantal voedingsmiddelen. Melkzuurbacteriën zijn gram-positieve bacteriën, die gebruikt worden bij de produktie van een reeks gefermenteerde voedingsmiddelen, waaronder zuivelprodukten. Deze bacteriën, in het bijzonder die behoren tot de soort Lactococcus lactis (L.lactis), bezitten een complex proteolytisch systeem voor het afbreken van melkeiwitten tot kleine peptiden en vrije aminozuren, welke vervolgens voor de celgroei worden gebruikt; zie Thomas T.D. et al., FEMS Microbiol. Rev. 46, (1987), blz. 245-268. Een sleutelenzym in dit pro-teolytische systeem is een groot, op het celmembraan gelocaliseerd serine-protease, dat betrokken is bij de initiële splitsingen van caseines, welke de voornaamste melkeiwitten zijn. Dit protease is essentieel voor de celgroei en het produceert peptiden, welke tot de aroma-ontwikkeling van een aantal zuivelprodukten bijdragen; zie Visser, S., c.s., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2^, (1988), blz. 61-66. Door verandering van het DNA coderend voor het C-terminale gedeelte van het protease kan volledige secretie van het, normaal aan de buitenkant van de celmembraan gebonden, protease worden bewerkstelligd; zie de Vos, W.M., Biomolecular Engineering in the European Community (1986), blz. 465-472, Martinus Nijhoff Publishers, The Netherlands. Hierdoor is een eenvoudige isolatie van het betreffende protease op grote schaal mogelijk.

De op het celmembraan gelocaliseerde proteasen kunnen op basis van hun caseinolytische eigenschappen in twee hoofdgroepen worden verdeeld, nl. de type I en type III-proteasen; zie Visser S., c.s., Appl. Environ. Microbiol. ^2, (1986), blz. 1162-1166. Van type III-proteasen is bekend, dat deze asl-, β- en k-caseine afbreken terwijl type I-proteasen in hoofdzaak β-caseine afbreken. Bij inwerking op totaal caseïne produceren type I-proteasen veel meer bitter smakende peptiden dan type III-proteasen (zie Visser S. c.s., Neth. Milk Dairy J. 37 (1983), blz. I69-I8O). Van de bovengenoemde twee typen proteasen is gebleken, dat deze immunologisch verwante proteinen met soortgelijke molecuulgewichten zijn. De protease-genen van een vertegenwoordiger van elke groep, t.w. het type I-protease van L.lactis Wg2 en het type III-protease van L.lactis SK11 zijn gedoneerd en in L.lactis tot expressie gebracht; zie Kok, J. c.s., Appl. Environ. Microbiol. ^0, (1985), blz. 94-101 en De Vos, W.M., Biomolecular Engineering in the European Community, (1986) blz. 465-472, Martinus Nijhoff Publishers, The Nether-lands. Bovendien is de complete nucleotide-sequentie van het L.lactis Wg2-protease-gen door Kok, J., c.s., Appl. Environ. Microbiol. §4, (1988), blz. 231-238 bepaald en heeft Aanvraagster de volledige nucleotide-sequentie van het L.lactis SKll-protease-gen (EP-A- 0 307 011) bepaald; deze sequenties worden in Fig. 1 weergegeven. De protease-genen coderen voor zeer grote pre-pro-proteinen (>200 kDa), welke aan de N- en C-terminus worden omgezet voor het verkrijgen van de rijpe aktieve enzymen (Haandrikman A. c.s., J. Bacteriol 171 (1989) blz. 2789-2794 en Vos, P. c.s., J. Bacteriol. 171 (1989) blz. 2795“2802). De aminozuur-volgorden van de L.lactis SK11 en Wg2 proteasen, zoals afgeleid uit de nucleotidesequenties, bleken op een 44-tal punten, weergegeven in Tabel A, te verschillen [zie ook Kok, J. en Venema, G., Biochimie 70 (1988) blz. 475-488]. Voorts vertoont het lactococcen-protease een aanzienlijke sequentie-homologie met een aantal serine-proteasen van de sub-tilisine-familie; zie Kok, J., c.s., Appl. Environ. Microbiol. ^4, (1988), blz. 231-238. Deze gebieden van homologie zijn onder meer gelocaliseerd rondom de aminozuurresiduen van de actieve plaats-triade en in het substraat-bindingsgebied van de subtilisines, zoals aangegeven in Fig. 3.

Aanvraagster heeft nu onderzoek verricht naar de verschillen in aminozuursequentie tussen de Llactis Wg2- en L.lactis SKll-proteasen, welke verantwoordelijk dienen te zijn voor de verschillende splitsings-specificiteit van beide enzymen. Hierbij zijn uitgaande van de genen, die coderen voor de proteasen uit L.lactis SK11 en Wg2, nieuwe protease-genen geconstrueerd, welke coderen voor mutant proteasen. Bij dit onderzoek zijn mutant proteasen ontwikkeld, waarbij met mutant protease-gen wordt bedoeld - een gen, opgebouwd uit delen van protease-genen van meerdere lacto-coccen-stammen, o.a. L.lactis SK11 en L♦lactis Wg2, alsook - een protease-gen van een lactococcen-stam, waarvan de DNA-sequentie zodanig is gewijzigd dat in het protease, waarvoor het gen codeert (a) op ten minste één plaats een ander aminozuur aanwezig is dan het "wild type" protease en/of (b) op ten minste één plaats binnen de eerste 1350 residuen van de aminozuur-sequentie, gerekend vanaf de N-terminus ten minste één aminozuur van het "wild type" protease ontbreekt en/of één of meer aminozuren zijn ingevoegd, of (c) op ten minste twee van elkaar gescheiden plaatsen één of meer aminozuren ontbreken en/of één of meer aminozuren zijn ingevoegd. De uitvinding heeft derhalve betrekking op DNA-fragmenten met ten minste een mutant protease-gen, welk gecodeerd protease tot nu toe onbekende eigenschappen bezit. Tot deze eigenschappen worden de thermische stabiliteit, alkalische/zure pH-stabiliteit, oxidatieve stabiliteit, autoproteolyse, calcium ion binding, splitsings- en substraat-specificiteit, katalytische aktiviteit en pH-aktiviteitsprofiel van de proteasen volgens de uitvinding gerekend. Een bijzondere uitvoeringsvorm van een mutant protease-gen is een hybride protease-gen, dat uitsluitend opgebouwd is uit delen van het Wg2-protease-gen en het SKI1-protease-gen.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op cloneringsvektoren, bij voorkeur zoals beschreven in EP-A- 0.157*441 of EP-A- 0.228.726, welk een dergelijk DNA-fragment volgens de uitvinding bevatten, op gastheercellen, met voordeel lactococcen-stammen, in het bijzonder de L.lactis-stam MGI363, gedeponeerd bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures onder nummer CBS 364.89, welke met een bovenaangeduide cloneringsvektor zijn getransformeerd, op de met dergelijke gastheercellen bereide proteasen alsook op de produkten, zoals levensmiddelen en aromastoffen, welke met behulp van de bovenaangeduide gastheercellen resp. proteasen zijn verkregen.

De uitvinding wordt aan de hand van het onderstaand beschreven onderzoek nader toegelicht.

A) De bij het onderzoek toegepaste bacterie-stammen en plasmiden.

Als gastheer voor transformatie met M13-fagen werd gebruikt E.coli TG1: K12, (Alac-pro), supE, thi, hsdD5/ F'traD36, proA+B+, laclq, laczAM15.

De stam L.lactis subsp. lactis MGI363 is een plasmide-vrij derivaat van L.lactis subsp. lactis 712 en wordt door Gasson, M.J., J. Bac-teriol. 154, (1983), blz. 1_9 beschreven. Deze stam werd als gastheer voor alle plasmide-transformaties toegepast.

Het plasmide pGKV552 bevatte het volledige protease-gen (prtP-gen) en een functioneel maturatie-eiwit gen (prtM-gen) van L.lactis subsp. cremoris Wg2, geïntroduceerd in de lactococcen-cloneringsvektor pGKl4, als beschreven door Haandrikman A., c.s. J. Bacteriol. 171 (1989) blz.

2789-279^· Het prtM-gen codeert voor een trans-werkzaam maturatie-eiwit, dat volgens Aanvraagster essentieel wordt geacht voor proteolytische activiteit. In deze aanvrage wordt het gedeelte van het plasmide, dat zowel het prtM-gen als het prtP-gen alsmede promotergebieden daarvoor bevat, het protease-gebied genoemd.

Het plasmide pNZ521 bevatte het complete protease-gen (prtP-gen) en een functioneel maturatie-eiwit gen (prtM-gen) van L.lactis subsp. cremoris SK11, geïntroduceerd in de lactococcen-cloneringsvector pNZ122, zoals beschreven door Vos, P., c.s. J. Bacteriol. 171 (1989) blz. 2795" 2802. Plasmide pNZ521 blijkt in stam L,lactis subsp. lactis MGI363 een redelijk hoog kopie-aantal te hebben en bovendien stabiel gehandhaafd te worden zonder antibioticum-selectiedruk. De promotergebieden voor de prtM en prtP genen van stam SK11 en Wg2 zijn niet volledig identiek.

B) De bij het onderzoek toegepaste moleculaire cloneringsmethode.

De cloneringsmethode werd uitgevoerd overeenkomstig algemeen bekende cloneringstechnieken zoals beschreven door Maniatis, T., c.s., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982, met slechts geringe modificaties. Alle benodigde enzymen werden betrokken van Bethesda Research Laboratories en New England Biolabs Corp. en werden overeenkomstig de aanwijzingen van de leverancier gebruikt. De plasmiden werden door middel van electroporatie (zie Chassy, B.M. c.s., FEMS Microbiol. Lett. 44, (1987), blz. 173"177) in de stam L.lactis MGI363 ingébracht. De recombinant L.lactis-stammen werden geanalyseerd met behulp van restrictie-enzym-analyse en in een aantal gevallen door het direkt sequencen met dubbelstrengs-plasmide DNA (zie Tabor, S. c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, (1987), blz. 1074-1078 en Zhang, H., c.s., Nucleic Acids Res. 16, (1988), blz. 1220) met behulp van specifieke oligonucleotide-primers. Deze oligonucleotiden werden met behulp van een Biosearch Cycloon DNA-synthesizer (New Brunswick Scien-tificCorp.) gesynthetiseerd.

C) Constructie van de plasmiden.

De plasmiden met de hybride protease-genen werden geconstrueerd door het vervangen van specifieke fragmenten van het L. lactis SK11 protease-gen door het overeenkomstige fragment van het L.lactis Wg2 protease-gen en omgekeerd. De verscheidene fragmenten, welke uitgewisseld zijn, worden in Fig. 2 aangegeven. Hierbij is fragment (a) een 1055 bp Clal-BamHl-fragment met de coderingsequentie van een gedeelte van de pre-pro-sequentie en de eerste 175 aminozuren van het rijpe protease.

Fragment (b) is een 970 bp BamHl-SacII-fragment, dat codeert voor de aminozuren 176-497 en fragment (c) is een 1778 bp SacII-BstEII-fragment, dat codeert voor de aminozuren 498-1090 van het protease (zie Fig. 2). In elk der fragmenten (a), (b) en (c) is een restrictieplaats aanwezig, welke uniek is voor een van de twee proteasen, te weten PstI, Kpnl en BglII (zie Fig. 2). De hybride protease-plasmiden werden derhalve aanvankelijk geanalyseerd met behulp van restrictie-enzyme-analyse en vervolgens geverifieerd door nucleotide-sequentie-analyse aan het relevante deel van het plasmide DNA. Zoals in Fig. 3 is aangegeven werden de protease-plasmiden met de benamingen pNZ521a, pNZ521b en pNZ521c alsook pGKV552a, pGKV552b en pGKV552c geconstrueerd. Voorts werd in het plasmide pGKV552a het fragment (c) van het SKll-protease geïntroduceerd, wat resulteerde in het plasmide pGKV552ac en kan in plasmide pNZ521a het fragment (c) van het Wg2-protease worden geïntroduceerd, wat resulteert in het plasmide pNZ521ac. Daarenboven werd in plasmide pNZ521 DNA-frag-menten met slechts delen van het fragment (c) uitgewisseld; zie Fig. 2. Fragment (cl) is een 1,45 kb EcoRI-BstEII-fragment, dat correspondeert met de aminozuren 606-1090, fragment (c2) is een 1,11 kb MStl-BstEII-fragment, dat correspondeert met de aminozuren 721-1090 en fragment (c3) is een 0,75 kb Styl-BstEII-fragment, dat correspondeert met de aminozuren 840-1090. De verkregen plasmiden werden als pNZ521cl, pNZ521c2 en pNZ521c3 aangeduid. De productie van het functionele protease, dat door al deze plasmiden werd gespecificeerd, werd door analyse van de groepkarakteristieken in melk van deze plasmiden bevattende L.lactis MGI363-stammen geverifieerd.

D) Plaatsgerichte mutagenese in de nucleotidenvolgorde coderend voor het L.lactis celwandprotease.

Voor het maken van plaatsspecifieke mutaties in het protease-gen, werden eerst subfragmenten van het protease-gen gekloneerd in kloneringsvektor M13mpl0 of M13mpll. Vervolgens werden de verkregen recombinante M13~fagen geïsoleerd, en hieruit werd enkelstrengs DNA geïsoleerd zoals beschreven door Sanger, F., c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2ii* (1976), blz. 5463-5^67. Dit enkelstrengs DNA werd gehybri-diseerd met een complementaire oligonucleotide, waarin de gewenste mutatie aanwezig was en deze oligonucleotide werd vervolgens gebruikt als primer voor synthese van een complementaire DNA-streng zoals beschreven door Zoller, M.J. en Smith, M., Nucleic Acids Res. 10, (1982), blz. 6487-65ΟΟ. Vervolgens werd de gewenste mutatie ook in de "template"-DNA-streng aangebracht volgens de methode van Nakamaye, K. en

Eckstein, F., beschreven in Nucleic Acids Res. 14, (1986), blz. 9679” 9698. Het op deze wijze gesynthetiseerde dubbelstrengs DNA werd getransformeerd in E.coli stam TG1, en recombinante fagen met de goede mutaties werden geselekteerd door het bepalen van de nucleotidenvolgorde van het relevante deel van het DNA van de betreffende M13-faag zoals beschreven door Sanger, F., c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, (1976), blz. 5463-5^67. Als laatste werd het subfragment van het protease-gen met de gemaakte mutatie teruggezet in het volledige protease-gen van L.lactis, gebruikmakend van kloneringstechnieken zoals beschreven in sectie B. Een overzicht van de gebruikte oligonucleotiden en de daaruit resulterende mutaties in het protease-gen is weergegeven in Fig. 5A.

Het resultaat van een van de gemaakte mutaties in het protease-gen, was een deletie van 9 nucleotiden coderend voor aminozuren A137, KI38 en T139 van het L.lactis SK11 protease. Hierdoor ontstond bovendien in de coderende sequentie op deze positie een restrictieplaats voor het enzym AccIII. Deze restrictieplaats werd vervolgens gebruikt om op deze positie extra nucleotiden te inserteren, gebruikmakend van synthetisch gemaakte 9 baseparen dubbelstrengs adapterfragmenten. Het resultaat van enkele van deze constructies is weergegeven in Fig. 5B.

E) Het isoleren van de verkregen mutant proteasen.

Het protease werd geïsoleerd door vrijmaking uit de cellen en wel in principe op de wijze zoals beschreven door Exterkate, F.A. c.s., Appl. Environ. Microbiol. 49. (1985). blz. 328-332. De L.lactis-cellen werden gedurende 12-20 uur in een op wei gebaseerd medium gecultiveerd. Vervolgens werden de cellen door centrifugeren verzameld en snel éénmaal met "release"-buffer (50 mM natriumacetaat/fosfaat, pH: 6,5) gewassen. De cellen werden in het 1/50 deel van het oorspronkelijke volume van de "release"-buffer geresuspendeerd en onder mild schudden bij 30°C gein-cubeerd. De cellen werden opnieuw door middel van centrifugeren afgescheiden en de supernatant, welke het vrijgemaakte protease bevatte, werd bij 0°C bewaard. De bij het centrifugeren verkregen celpellet werd opnieuw in "release"-buffer gesuspendeerd en bij 30°C geincubeerd. Daarna werden de cellen opnieuw gecentrifugeerd, waarna de twee "release"-frakties werden gecombineerd en de pH op een waarde van 5.4 met geconcentreerd azijnzuur werd ingesteld. Het geïsoleerde protease werd in monsterflesjes opgenomen en bij -80°C bewaard.

F) Het vaststellen van de caseine-degradatie.

0, 5» 10 en 20 μΐ van elke "release"-fraktie werd met 50 pg van asl-, β- en k-caseine in een totaal volume van 50 μΐ 50 mM Na acetaat/fosfaat met een pH van 5»^ gedurende 1 uur bij 30°C geincubeerd. De reacties werden beëindigd door het toevoegen van een gelijk volume van een tweemaal geconcentreerde proteine-gel-monsterbuffer. 40 μΐ van elk monster werd op een 20% SDS-polyacrylamide-gel geanalyseerd.

De toepassing van de bovenstaand aangeduide methoden en materialen wordt onderstaand meer gedetailleerd besproken.

De constructie van L.lactis-stammen met hybride protease-plasmides.

Zoals uit Fig. 2 blijkt, zijn de fysische kaarten van de protease-genen van L.lactis Wg2 en L.lactis SK11 erg gelijkend. Meer in het bijzonder vertonen de protease-genen van beide stammen een nucleotide-sequence-homologie van 98,8%.

Ten aanzien van de constructie van hybride protease-genen werden de plasmiden pNZ521 en pGKV552 toegepast, welke beide het structurele protease-gen (prtP-gen) alsook het essentiële deel van het prtM-gen van L.lactis SK11 resp. L.lactis Wg2 bevatten. Zoals vermeld werden aanvankelijk drie verschillende DNA-fragmenten met de aanduidingen (a), (b) en (c), zoals weergegeven in Fig. 2, tussen de beide protease-plasmiden uitgewisseld, wat resulteerde in de plasmiden pNZ521a, pNZ521b, pNZ521c, pGKV552a, pGKV552b en pGKV552c. Op basis van de resultaten, verkregen met de proteasen, welke door L.lactis-stammen met dergelijke plasmiden worden geproduceerd, werden meerdere hybride protease-plasmiden geconstrueerd. Een derivaat van pGKV552a werd op een zodanige wijze geconstrueerd, dat het tevens fragment (c) van het SKI1-protease-gen bevatte en werd aangeduid als pGKV552ac. Voorts werden er derivaten van het plasmide pNZ521c geconstrueerd, welke slechts een deel van het fragment (c) bevatten, wat resulteerde in de plasmiden pNZ521cl, pNZ521c2 en pNZ521c3 (zie Fig. 2). Een schematische voorstelling van de proteasen, welke door de L.lactis-stammen met de desbetreffende plasmiden zijn gesynthetiseerd, wordt in Fig. 3 weergegeven.

De splitsingsspecificiteit van de hybride Wg2/SKll-proteasen volgens de uitvinding.

Het protease werd uit de L.lactis-stammen geïsoleerd door het vrijmaken van het enzym van het celmembraan door incubatie in een Ca^+- vrije buffer. Voor het vaststellen van de splitsings-specificiteit van de betreffende proteasen werden verscheidene hoeveelheden van alle afzonderlijke protease-preparaten met asl-, β- en k-caseine geincubeerd en werden de verkregen degradatieprodukten op proteine-gels gescheiden.

Het is algemeen bekend, dat het Wg2-protease asl-caseine zeer inefficiënt afbreekt, dit in tegenstelling tot het protease van stam SK11. Dit is bevestigd door de resultaten, welke zijn verkregen met de proteasen, welke door de plasmiden pGKV552 (Wg2) en pNZ521 (SK11) zijn gespecificeerd (zie Fig. 4a). Gebleken is, dat hybride proteasen, waarin alleen fragment (a) of (c) van SKll-protease aanwezig is wel asl-caseine kunnen af breken, echter lang niet zo effectief als, en met een andere splitsingsspecificiteit dan het "wild-type" SKll-protease (Fig. 4a). Een uitwisseling van het fragment (b) beinvloedt niet het splitsen van het asl-caseine. Meer in het bijzonder wordt gesteld, dat het protease, dat door het plasmide pGKV552ac is gespecificeerd, het enige van het Wg2-protease afgeleide hybride is, dat tot efficiënte splitsing van de asl-caseine in staat is. Bovenvermelde resultaten geven aan, dat een van de fragmenten (a) en (c) van het SKll-protease nodig zijn voor afbraak van het asl-caseine en beide fragmenten voor een efficiënte afbraak van het asl-caseine. Het is echter zeer opmerkelijk en bijzonder onverwacht, dat fragment (c) van het SK11 protease nodig is voor afbraak van het asl-caseine, aangezien fragment (c) geen homologie vertoont met subtilisine of andere serine-proteasen, die wel asl-caseine kunnen afbreken.

Zoals algemeen bekend zijn de L.lactis SK11- en Wg2-protease beide in staat tot het degraderen van β-caseine, alhoewel met een duidelijk verschillende specificiteit (zie Visser, S., c.s., Appl, Environ, Micro-biol. f52, (1986), blz. II62-II66). In dit verband wordt opgemerkt, dat de verscheidene hybride proteasen volgens de uitvinding eveneens in staat waren tot het degraderen van β-caseine. Echter veranderden de fragmenten (a) en (c) beide de splitsingsspecificiteit op β-caseine (Fig. 4b en 4c). Deze bevindingen bevestigen de resultaten van de splitsingsspecificiteit van de hybride proteasen op asl-caseine: fragment (a) en (c) beïnvloeden beide de splitsingsspecificiteit van Lactococcus protease op β-caseine, en fragment (b) heeft geen invloed. Opvallend is dat L.lactis MGI363, getransformeerd met hetzij pNZ521a, hetzij met pGKV552c proteasen oplevert, die beide eenzelfde splitsingsspecificiteit lijken te bezitten; hetzelfde geldt voor L.lactis MGI363 getransformeerd met hetzij pNZ521c, hetzij met pGKV552a (Fig.4b). Evenzo blijkt dat L.lactis MG1363, getransformeerd met hetzij pGKV552, hetzij pGKV552b, een identieke splitsingsspecificiteit bezitten. Hetzelfde geldt voor L.lactis, getransformeerd met pGKV552ac, pNZ521, pNZ521b of pNZ521c3, die allen β-caseine op dezelfde wijze afbreken. Deze bevindingen geven aan, dat fragment (a) en fragment (c) essentieel zijn voor het bepalen van de specificiteit, en dat het bij de onderzochte hybride proteasen niet uitmaakt of de overige gedeeltes van het eiwit van stam SK11 of Wg2 afkomstig zijn. Een combinatie van fragment (a) van het ene protease met fragment (c) van het andere protease resulteert in een hybride protease met een specificiteit die afwijkt van zowel SK11 als Wg2 proteasen.

In verband met het bovenstaande wordt naar voren gebracht, dat een groot deel van de degradatieprodukten, welke met de hybride proteasen werden verkregen, konden worden toegeschreven aan SK11- of Wg2-achtige activiteiten, maar sommige van de degradatieprodukten werden niet bij een van de "wild-type" enzymen waargenomen. Voorts werden er banden met een soortgelijke mobiliteit in verschillende hoeveelheden geproduceerd, zodat het aannemelijk is, dat de affiniteit voor sommige splitsings-plaatsen aanzienlijk tussen de verscheidene proteasen varieerde.

Voorts wordt naar voren gebracht, dat fragment (c) correspondeert met een gebied van 592 aminozuren, waarin slechts 8 aminozuur-substitu-ties tussen het SK11- en Wg2-protease zijn gevonden. De degradatie van β-caseine van de proteasen, welke gespecificeerd worden door de plas-mides pNZ521cl, c2 en c3 (zie Fig. 3) werd onderzocht om na te gaan welk van deze substituties de splitsingsspecificiteit beïnvloedt. De verkregen resultaten geven aan, dat de aminozuur-substituties op de posities 747 en 748 (zie Tabel A) in dit verband erg belangrijk zijn, aangezien de proteasen, gespecificeerd door de plasmiden pNZ521c3 en pNZ521 enerzijds en de proteasen, gespecificeerd door de plasmiden pNZ521c, pNZ521cl en pNZ521c2 anderzijds, identieke splitsingspatro'nen (zie Fig. 4c) vertonen. Derhalve is het deel van fragment (c), dat betrokken is bij de substraat-binding, zeer waarschijnlijk rond aminozuren 747 en 748 gelocaliseerd.

TABEL A

Aminozuren, uitgewisseld in de verscheidene hybride proteasen a.a.a) SKllb) Wg2b) fragment*3) 62 V A a 89 K T a 131 S T a 138 K T a 142 A S a 144 V L a 166 N D a 222 S T b 265 Η N b 278 I V b 310 F L b 332 T N b 339 M V b 342 I M b 378 T A b 38Ο A T b 381 M L b 382 L V b 548 R T c 673 K T c,cl 693 K Q c.cl 747 R L c,cl,c2 748 K T c,cl,c2 855 E A c,cl,c2,c3 970 D N c,cl,c2,c3 1026 Μ T c,cl,c2,c3 1064 H D c,cltc2,c3

1095 K E

1117 K N

1126 , κ T

1129 T A

1131 K E

1207 S T

1220 D E

1261 E V

1328 Q K

1336 A S

1363 I V

1486 D A

1525 L H

1532 I V

1535 E A

1722 T S

1761 S I

a) Aminozuur-positie van de specifieke mutatie.

b) Type van het aminozuur op de aangegeven positie van het SK11- en Wg2-protease. De één-lettercode voor aminozuren wordt gebruikt (zie Tabel B).

c) DNA-fragment, dat het aangegeven aminozuur bevat.

De splitsingsspecificiteit van de verscheidene proteasen op k-caseine werd eveneens onderzocht. Hierbij werden soortgelijke resultaten verkregen als bij de degradatie van β-caseine: beide fragmenten (a) en (c) zijn belangrijk voor de splitsingsspecificiteit. Ook hier geldt, dat sommige hybride proteasen verschillende caseinolytische eigenschappen in vergelijking met die van de "wild type"-enzymen bezitten. Dit wordt gekarakteriseerd door (i) een verschillende snelheid en/of efficiëntie van splitsing van peptide-bindingen, welke eveneens door de "wild type"-enzymen werden herkend en/of (ii) de splitsing van peptide-bindingen, welke in geval van de "wild type"-enzymen niet werden gedetecteerd.

Naast de afbraak van caseines werd tevens de splitsingsspecificiteit van de verscheidene hybride en oorspronkelijke proteasen op andere eiwitten onderzocht. Hierbij werden soortgelijke resultaten verkregen als bij de afbraak van caseines.

Voorts heeft Aanvraagster in fragment (a) aminozuur-sequenties gevonden, welke een homologie met de substraat-bindingsgebied van serine-proteasen van de subtilisine-familie vertonen. Aanvraagster neemt in dit verband aan, dat een soortgelijke rol van dit gebied in de lacto-coccen-proteasen optreedt. Echter is de vondst, dat fragment (c) eveneens de splitsingsspecificiteit beïnvloedt verrassend en maakt het aannemelijk, dat, in vergelijking met de subtilisines, de lactococcen-proteasen additionele elementen bevatten voor het bepalen van de splitsingsspecificiteit. De hier beschreven proteasen bevatten derhalve twee gebieden, welke bij de binding en splitsing van substraatmoleculen betrokken zijn. Een gebied, gelegen in fragment (a), is homoloog met het substraatbindingsgebied van serine-proteasen van de subtilisine familie (Wells, J., c.s., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5167-5171; McPhalen, C.A., c.s., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7242-7246; Betzel, C., c.s., (1988), Eur. J. Biochem. 178, 155“171)· Het andere gebied is gelegen bij residuen 7^7 en 748 in fragment (c); een overeenkomstig (homoloog) gebied is echter niet aanwezig in subtilisines of andere serine-proteases.

Mutant proteasen verkregen door plaatsgerichte mutagenese.

Voorts kunnen mutant proteasen met nieuwe splitsingsspecifici-teiten eveneens worden verkregen door het uitvoeren van enkelvoudige aminozuursubstituties. Deze substituties dienen dan in het bijzonder in de gebieden, welke essentieel zijn voor de splitsingsspecificiteit, te worden uitgevoerd. Zo werd aminozuur serine-433 van L.lactis SKll-pro-tease vervangen door alanine, waardoor de zg. S433A mutant SKll-protease werd verkregen (Fig. 5A). Deze S433A mutant bleek geheel inaktief te zijn, hetgeen de hypothese bevestigt, dat S433 het serine residue van de actieve plaats triade vertegenwoordigt. Tevens werden enkelvoudige aminozuur-substituties gemaakt op posities 138 en 166 van L.lactis SKll-protease, waardoor respectievelijk de KI38N en N166D mutant proteasen verkregen werden (Fig. 5A). Zowel de KI38N als de N166D mutant protease bleken α-, β- en k-caseine op andere wijze te splitsen dan "wild type"-SK11- of Wg2-protease. Hiermee is aangetoond, dat de aminozuurresiduen op posities 138 en 166, gelegen op fragment (a) (zie Tabel A), beide de splitsingsspecificiteit beïnvloeden. Tevens zijn enkelvoudige aminozuur-substituties gemaakt op posities 747 en 748 van L.lactis SKll-protease, beide gelegen op fragment (c) (zie Tabel A) en van belang voor de splitsingsspecificiteit, waardoor de R747L, R747Q, K748T en K748E mutant proteasen zijn verkregen (Fig. 5A).

Voorts kunnen mutant proteasen met veranderde eigenschappen verkregen worden door het weglaten (zg. "deletie") of invoegen (zg. "insertie") van een of meer aminozuren. Indien deze deletie of insertie plaatsvindt in een gebied, dat essentieel is voor de splitsingsspecificiteit dan kunnen mutant proteasen verkregen worden met nieuwe katalytische eigenschappen. Zo werd een van L.lactis SKll-protease afgeleide mutant protease gemaakt waarin aminozuren A137. KI38 en T139 ontbreken (Fig. 5B). Hieronder bevindt zich residue KI38, dat mede-bepalend is gebleken voor de splitsingsspecificiteit. Deze Δ 137-139 mutant SKll-protease bleek eveneens α-, β- en k-caseine op andere wijze te splitsen dan "wild type"-SKll- of Wg2-protease. Tevens werd bij de constructie van dit mutant protease-gen een nieuwe AccIII restrictie-enzym split-singsplaats ingevoerd in het DNA-fragment, waardoor het mogelijk werd om een of meer codons in te voegen op de plaats waar de codons voor residuen 137-139 zijn weggelaten. Zo werden ondermeer van SKll-protease afgeleide mutant proteasen gemaakt, genoemd Δ137_139/ins9 en Δ137-139/insl5> waarbij residuen 137“139 (t.w. AKT) werden vervangen door negen residuen (t.w. GSAGTTGTT) en vijftien residuen (t.w. GKTGLAGKTGKTGKT) respectievelijk (Fig. 5B).

Tevens kunnen aminozuur deleties of inserties gemaakt worden in gebieden die andere eigenschappen van het protease bepalen dan splitsingsspecificiteit. Zo werd een van SKll-protease afgeleide mutant protease gemaakt, genoemd Δ205-219/3, waarin het segment met aminozuren E205-M219 vervangen werd door een enkel serine residue (Fig. 5B).

In dit weggelaten segment bevinden zich nl.peptidebindingen die gevoelig zijn voor autoproteolyse, waardoor het "wild type"-SKll-protease zichzelf kan inactiveren. Door het inkorten van dit segment in deze Δ205-219/S mutant zijn deze splitsings-gevoelige peptidebindingen niet meer aanwezig.

Het C-terminale gedeelte van L.lactis serine protease is verantwoordelijk voor binding aan het celmembraan. Door deletie van het C-terminale gedeelte van het SKll-protease vanaf residue 1373 (Sall site in Fig. 2) kan een aktief mutant protease verkregen worden, dat volledig gesecreteerd wordt in het medium (Vos et al., J. Bacteriol. 171, (1989), blz. 2795-2802). In de huidige uitvinding is bepaald welk effekt een verdere verkorting aan de C-terminus heeft op de aktiviteit en stabiliteit van het verkorte, gesecreteerde SKll-protease. Hierbij bleek, dat inkorting tot 1272 aminozuren (Ndel restrictie plaats) nog wel een aktief, gesecreteerd protease oplevert, terwijl inkorting tot 1090 aminozuren (BstEII site in Fig. 2) of 937 aminozuren (BglII site in Fig. 2) geen aktief protease meer opleverde. Hiermee is aangetoond, dat tussen de 1090 en 1272 aminozuren, gerekend vanaf de rijpe N-terminus, minimaal nodig zijn voor produktie van een aktief mutant protease.

Onder verwijzing naar het bovenstaande heeft de uitvinding in het bijzonder betrekking op DNA-fragmenten, welke ten minste een mutant protease-gen omvatten, welk gen opgebouwd is uit delen van protease-genen van meerdere lactococcen-stammen, resp. van een protease-gen van een lactococcen-stam, waarvan de DNA-sequentie op een of meerdere plaatsen is gewijzigd. Met voordeel is een dergelijk mutant protease-gen opgebouwd uit ten minste delen van een protease-gen, in het bijzonder een type I-protease-gen van L.lactis, meer in het bijzonder van L.lactis subsp. cremoris Wg2 en een protease-gen, in het bijzonder een type III-protease-gen van L.lactis. meer in het bijzonder van L.lactis subsp. cremoris SK11.

Tevens heeft de uitvinding betrekking op DNA-fragmenten, welke ten minste een hybride protease-gen omvatten, welke opgebouwd is uit het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waarvan een of meer codons, coderend voor aminozuren zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren A62, T89, T131, TI38, Sl42, Ll44, Dl66, L7^7 en T7^8 zijn gewijzigd in codons, welke coderen voor de aminozuren, aangegeven in Tabel A, op overeenkomstige plaatsen in het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11. Naast deze laatstbedoelde DNA-fragmenten heeft de uitvinding tevens betrekking op DNA-fragmenten met ten minste een hybride protease-gen, dat opgebouwd is uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waarvan een of meer codons, coderend voor aminozuren, zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren V62, K89, S131, KI38, Al42, Vlkk, N166, R7^7 en K748, zijn gewijzigd in codons, welke coderen voor de aminozuren, aangegeven in Tabel A, op overeenkomstige plaatsen in het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op DNA-fragmenten welke ten minste een mutant protease-gen omvat, dat opgebouwd is uit het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waarvan een of meer codons, coderend voor de aminozuren, zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren Aö2, T89, T131, TI38, Sl42, Ll44, Dl66, L747 en/of TjkS zijn gewijzigd in codons, welke niet coderen voor de aminozuren, aangegeven in Tabel A, op overeenkomstige plaatsen in het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11. Daarnaast heeft de uitvinding betrekking op DNA-fragmenten, welke ten minste een mutant protease-gen omvat, dat opgebouwd is uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waarvan één of meer codons, coderend voor aminozuren zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren V62, K89, S131, K138, A142, Vl¥t, N166, R747 en K748, zijn gewijzigd in codons, welke niet coderen voor de aminozuren, aangegeven in Tabel A, op overeenkomstige plaatsen in het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2.

Vervolgens heeft de uitvinding betrekking op DNA-fragmenten, welke ten minste een mutant protease-gen omvatten, welke opgebouwd is uit het type I-protease gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waarvan een of meer codons ontbreken, waaronder bij voorkeur ten minste een codon, coderend voor de aminozuren A62, T89, T131, TI38, Sl42, Llkk, D166, L747 en/of T748 en/of waaraan één of meer codons zijn toegevoegd. Ook heeft de uitvinding betrekking op DNA-fragmenten, welke ten minste een mutant protease-gen omvatten, welke opgebouwd is uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waarvan één of meer codons ontbreken, waaronder bij voorkeur ten minste één codon coderend voor de aminozuren V62, K89, S131, KI38, Al42, VlM, N166, R747 en/of K7H8 en/of waaraan één of meer codons zijn toegevoegd.

Zoals reeds vermeld heeft de uitvinding eveneens betrekking op de cloneringsvektoren, waaronder plasmiden, welke een DNA-fragment volgens de uitvinding bevatten, op gastheercellen, met voordeel lactococcen-stammen, in het bijzonder de L.lactis-stam MGI363, welke met een bovenaangeduide cloneringsvektor zijn getransformeerd, op de met dergelijke gastheercellen verkregen proteasen alsook op de voedingsmiddelen, aroma-stoffen enz. welke met behulp van deze gastheercellen resp. proteasen zijn verkregen. Ten aanzien van dit laatste aspekt wordt naar voren gebracht, dat alhoewel de uitvinding voornamelijk is toegelicht met de bereiding van gemodificeerde genen, de expressie daarvan in melkzuurbacteriën en het splitsen van caseines met de gemodificeerde proteasen, het doel van het onderzoek is, dat tot de uitvinding heeft geleid. De uitvinding is derhalve gelegen in het verschaffen van nieuwe proteasen en deze proteasen bevattende culturen voor de bereiding van allerlei pro-dukten, die met behulp van melkzuurbacteriën bereid kunnen worden, waarbij dan eiwit-splitsingsprodukten worden gevormd, die of als zodanig worden gebruikt of verder worden omgezet. Voorbeelden van dergelijke produkten zijn boter, margarines en andere broodsmeersels, die gefermenteerde melk of taptemelk in de waterfase bevatten; voorts kunnen ook andere gefermenteerde melkprodukten zoals karnemelk en gefermenteerde taptemelk, kwark en andere verse en gerijpte kaassoorten en yoghurt alsmede aromacomposities worden verkregen door gebruikmaking van de gemodificeerde proteasen volgens de uitvinding, terwijl tevens voedingsmiddelen voor mens of dier gebaseerd op andere eiwitten dan melkeiwitten kunnen worden bereid met behulp van de proteasen volgens de uitvinding.

Een belangrijke belichaming van de uitvinding is dan ook de toepassing van een of meer van de hierboven beschreven mutant proteasen of van cultures die een of meer van deze mutant proteasen bevatten voor de bereiding van de zojuist aangegeven produkten, die eiwit-splitsingsprodukten bevatten.

LEGENDA FIGUREN

Fig.l: Nucleotidenvolgorde van het L.lactis SK11 protease-gen en de daarvan afgeleide aminozuuivolgorde van het protease.

De nummeringen van de nucleotiden en aminozuren zijn aangegeven: nucleotidepositie 1 is de eerste base van het startcodon van het protease-gen, terwijl aminozuurpositie 1 het eerste aminozuur (D) van het rijpe protease is. De eerste 10 aminozuren van het rijpe protease zijn bovendien onderstreept. De eerste 17 aminozuren van het PrtM eiwit, dat stroomopwaarts van het prtP gen in omgekeerde volgorde gecodeerd wordt, beginnend met Μ, K, K, K, M, R enz., zijn ook aangegeven. De verschillen in nucleotidevolgorde met het protease-gen van L.lactis Wg2 zijn aangegeven boven elke regel, terwijl de verschillen in aminozuur-volgorde met het protease van L.lactis Wg2 zijn aangegeven onder elke regel. De één-lettercode voor aminozuren wordt gebruikt (zie Tabel B).

Fig. 2: Constructie van hybride protease-plasmiden.

Aan de bovenzijde is het L.lactis SK11 protease weergegeven met het signaalpeptide als een gestippelde, het pro-peptide als een dubbel gearceerde en het rijpe protease als een open balk. De lengte van het protease is aangegeven in eenheden van 100 aminozuren, positie 0 is het begin van het rijpe protease. De verticale streepjes geven bij benadering de posities aan van de aminozuren die verschillen tussen SK11 en Wg2 protease.

De tweede en derde afbeelding van boven geven de protease-gebie-den op plasmiden pSKlll en pWV05 van respectievelijk stam SK11 en Wg2 weer, met links het prtM en rechts het prtP-gen. De open balken geven de coderende gebieden van beide genen aan. De lengtes in kb zijn aangegeven, positie 0 is het initiatiecodon van het protease-gen. De split-singsplaatsen van enkele relevante restrictie-enzymen zijn aangegeven met: B, BamHl; Bg, BglII; Bs, BstEII; C, Clal; E, EcoRl, H, HindlII; K,

Kpnl; M, MstI; P, PstI; RV, EcoRV; S, Sall; Sc, SacII; St, Styl.

Aan de onderzijde zijn de verscheidene DNA-fragmenten weergegeven, die tussen de beide protease-genen zijn uitgewisseld.

Fig. 3: Schematische voorstelling van verscheidene hybride proteasen.

De aard van het protease-gen dat aanwezig is in de diverse plasmides is weergegeven, met de plasmidecode links aangeduid, waarbij de van SKll-afgeleide sequenties als open blokken en van Wg2-afgeleide sequenties als gearceerde blokken zijn weergegeven. De "wild type" SK11- en Wg2-protease-genen zijn aanwezig op respectievelijk plasmide pNZ521 en pGKV552. De groottes van het door deze plasmides gecodeerde rijpe protease is aangegeven in eenheden van 100 aminozuren. Aan de onderzijde van de figuur zijn het protease en subtilisine schematisch weergegeven, met het pre-peptide gestippeld, het pro-peptide dubbel gearceerd en de homologe gebieden in zwart, waarbij D,H,S respectievelijk voorstellen de actieve-plaats-aminozuren asparaginezuur, histidine en serine, en B het substraatbindingsgebied in subtilisine. De verticale streepjes boven het lactococcen-protease geven bij benadering de positie aan van de amino-zuurverschillen tussen de proteasen van stam SK11 en stam Wg2 weer.

Fig.4a: SDS-polyacrylamide-gelpatronen van asl-caseine geïncubeerd met releasefracties van "wild type-" en hybride protease-bevattende L.lactis stammen.

Lanen 1 en 10 bevatten merkereiwitten ovalbumine, carbonic anhydrase, β-lactoglobuline, lysozyme en runder trypsine inhibitor met molecuulgewichten van respectievelijk 43. 29, 18.4, 14.3 en 6.2 kilo-dalton. Laan 9 bevat asl-caseine niet geïncubeerd met releasefractie. Lanen 2 t/m 8 bevatten asl-caseine geïncubeerd met releasefracties van L.lactis MGI363 respectievelijk bevattende plasmiden pGKV552c, pGKV552a, pNZ521c, pNZ521b, pNZ521a, pGKV552 en pNZ521.

Fig.4b: SDS-polyacrylamide-gelpatronen van β-caseine geïncubeerd met releasefracties van "wild type-" en hybride protease-bevattende L.lactis stammen.

Lanen 1 en 10 bevatten merkereiwitten ovalbumine, carbonic anhydrase, β-lactoglobuline, lysozyme en runder trypsine inhibitor met molecuulgewichten van respectievelijk 43, 29, 18.4, 14.3 en 6.2 kilo-dalton. Laan 2 bevat β-caseine niet geïncubeerd met releasefractie. Lanen 3 t/m 9 bevatten β-caseine geïncubeerd met releasefracties van L.lactis MGI363 respectievelijk bevattende plasmiden pNZ521, pGKV552, pNZ521a, pNZ521b, pNZ521c, pGKV552a en pGKV552c.

Fig.4c: SDS-polyacrylamide-gelpatronen van β-caseine geïncubeerd met releasefracties van "wild type-11 en hybride protease-bevattende L.lactis stammen.

Laan 1 bevat β-caseine geïncubeerd met releasefractie van de plasmidevrije, protease-deficiënte stam L.lactis MGI363. Lanen 2 t/m 9 bevatten β-caseine geïncubeerd met de releasefracties van L.lactis MGI363 bevattende respectievelijk de plasmiden pNZ521, pGKV552, pNZ521a, pNZ521b, pNZ521c, pNZ521cl, pNZ521c2 en pNZ521c3-

Fig.5A en 5B: Overzicht van de oligonucleotiden gebruikt bij de plaats-gerichte mutagenese van het L.lactis SK11 protease-gen.

De "wild type" L.lactis SK11 nucleotidenvolgorde is steeds aangegeven op de bovenste regel, met daarboven de aminozuurvolgorde en de positie ervan in het protease. De nucleotidenvolgorde van de gebruikte oligonucleotide, en de daaruit resulterende aminozuurvolgorde is steeds daaronder weergegeven. De veranderde nucleotiden zijn met * aangegeven. In het geval van konstruktie van deletiemutanten, zijn de twee naast elkaar gelegen nucleotiden aan beide zijden van de betreffende deletie door middel van een lijn met elkaar verbonden. In het geval van de konstruktie van de insertiemutanten is de betreffende geinserteerde dubbelstrengs oligonucleotide en de daaruit resulterende veranderde aminozuursequentie weergegeven.

TABEL B

Aminozuur 1-letter code

alanine A

cysteine C

aspartaat D

glutamaat E

fenylalanine F

glycine G

histidine H

isoleucine I

lysine K

leucine L

methionine M

asparagine N

proline P

glutamine Q

arginine R

serine S

threonine T

valine V

tryptofaan W

tyrosine Y

Claims

1. DNA-fragment, ten minste omvattende een mutant protease-gen, waarbij met mutant protease-gen wordt bedoeld - een gen, opgebouwd uit delen van protease-genen van meerdere lacto-coccen-stammen, alsook - een protease-gen van een lactococcen-stam, waarvan de DNA-sequentie zodanig is gewijzigd dat in het protease, waarvoor het gen codeert (a) op ten minste één plaats een ander aminozuur aanwezig is dan het "wild type" protease en/of (b) op ten minste één plaats binnen de eerste 1350 residuen van de aminozuur-sequentie, gerekend vanaf de N-terminus ten minste één aminozuur van het "wild type" protease ontbreekt en/of één of meer aminozuren zijn ingevoegd, of (c) op ten minste twee van elkaar gescheiden plaatsen één of meer aminozuren ontbreken en/of één of meer aminozuren zijn ingevoegd.

2. DNA-fragment volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een protease-gen omvat, opgebouwd uit delen van een type I-protease-gen van L.lactis en een type III-protease-gen van L.lactis.

3. DNA-fragment volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het fragment ten minste een protease-gen omvat, opgebouwd uit delen van protease-genen van L.lactis subsp. cremoris Wg2 en L.lactis subsp. cremoris SK11.

4. DNA-fragment volgens conclusie 2 of 3. met het kenmerk, dat dit ten minste een van de in fig. 3 weergegeven hybride protease-genen omvat.

5. DNA-fragment volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een protease-gen omvat, dat is opgebouwd uit het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waaraan een of meer codons zijn toegevoegd, of waarvan een of meer codons ontbreken en/of vervangen zijn door een gelijk of ander aantal codons.

6. DNA-fragment volgens een of meer der conclusies 1-3 en/of 5, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een hybride protease-gen omvat, opgebouwd uit het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waarvan een of meer codons, coderend voor aminozuren, zoals weergegeven in Tabel A, zijn gewijzigd in codons, welke coderen voor de op de in Tabel A aangegeven overeenkomstige plaatsen in het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11 voorkomende aminozuren .

7· DNA-fragment volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een hybride protease-gen omvat, opgebouwd uit het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waarvan een of meer codons, coderend voor aminozuren A62, T89, T131, TI38, Sl42, Ll44, Dl66, Ljkj en T748, zoals weergegeven in Tabel A zijn gewijzigd in codons, welke coderen voor de aminozuren, aangegeven in Tabel A, op de overeenkomstige plaatsen in het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11,

8. DNA-fragment volgens conclusie 1 en/of 5, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een protease-gen omvat, dat opgebouwd is uit het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waarvan een of meer codons, coderend voor aminozuren zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren A62, T89, T131, TI38, Sl42, Ll44, D166, L747 en/of T748 zijn gewijzigd in codons, welke niet coderen voor de aminozuren, zoals weergegeven in Tabel A op overeenkomstige plaatsen in het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11.

9. DNA-fragment volgens conclusie 1 en/of 5, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een protease-gen omvat, dat opgebouwd is uit het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2, waarvan een of meer codons ontbreken, waaronder tenminste een codon coderend voor de aminozuren zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren A62, T89, T131, T138, 8142, UM, Dl 66, L7^7 en T7^8.

10. DNA-fragment volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een protease-gen omvat, dat is opgebouwd uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waaraan een of meer codons zijn toegevoegd, of waarvan een of meer codons ontbreken en/of vervangen zijn door een gelijk of ander aantal codons.

11. DNA-fragment volgens een of meer der conclusies 1-3 en/of 10, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een hybride protease-gen omvat, opgebouwd uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waarvan een of meer codons, coderend voor aminozuren, zoals weergegeven in Tabel A, zijn gewijzigd in codons, welke coderen voor op de in Tabel A aangegeven overeenkomstige plaatsen in het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2 voorkomende aminozuren.

12. DNA-fragment volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een hybride protease-gen omvat, opgebouwd uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waarvan een of meer codons, coderend voor de aminozuren V62, K89, S131, KI38, Al42, Vl44, Nl66, Kjkl en K748, zijn gewijzigd in codons, welke coderen voor de aminozuren, aangegeven in Tabel A, op de overeenkomstige plaatsen in het Type I-protease-gen in L.lactis subsp. cremoris Wg2.

13· DNA-fragment volgens conclusie 1 en/of 10, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een protease-gen omvat, dat is opgebouwd uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waarvan een of meer codons, coderend voor aminozuren zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren V62, K89, S131, KI38, Klk2, Vlkk, Nl66, R7^7 en K748, zijn gewijzigd in codons welke niet coderen voor aminozuren, zoals weergegeven in Tabel A op overeenkomstige plaatsen in het type I-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris Wg2.

14. DNA-fragment volgens conclusie 1 en/of 10, met het kenmerk, dat dit fragment ten minste een protease-gen omvat, dat opgebouwd is uit het type III-protease-gen van L.lactis subsp. cremoris SK11, waarvan een of meer codons ontbreken, waaronder tenminste een codon coderend voor de aminozuren zoals weergegeven in Tabel A, in het bijzonder de aminozuren V62, K89, S131, KI38, A142, V144, N166, R7^7 en K748.

15· Cloneringsvektor bevattend een DNA-fragment volgens een der conclusies 1-14.

16. Vektor volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat deze een plasmide is.

17. Vektor volgens conclusie 15 of 16, met het kenmerk, dat deze repliceerbaar is in een lactococcen-gastheercel.

18. Getransformeerde gastheerstam, bevattend een DNA-fragment volgens een der conclusies l-l4, of een vektor volgens een der conclusies 15“17·

19. Gastheerstam volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het een lactococcen-gastheerstam is.

20. Gastheerstam volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat het een getransformeerde L.lactis-stam MGI363 is.

21. Mutant-proteasen, verkregen met behulp van een gastheerstam volgens conclusies 18, 19 of 20.

22. Voedingsmiddel, geproduceerd met ten minste een gastheerstam volgens conclusies 18, 19 of 20 respectievelijk een mutant-protease volgens conclusie 21.

23. Aromastof, geproduceerd met ten minste een gastheerstam volgens conclusies 18, 19 of 20 respectievelijk een mutant-protease volgens conclusie 21.