ES2253733T3 - Nuevas glucosa isomerasas con un ph optimo alterado. - Google Patents
Nuevas glucosa isomerasas con un ph optimo alterado.Info
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Abstract
UN METODO PARA LA SELECCION DE RESIDUOS DE AMINOACIDOS QUE A TRAVES DE SU SUBSTITUCION CREARA LA FORMACION DE UN ENZIMA CON UN PH ALTERADO OPTIMO. EL METODO ES ESPECIFICO PARA METALOENZIMAS QUE ESTAN INACTIVADAS A UN BAJO PH DEBIDO A SU DISOCIACION DE IONES DE METAL. SE BASA EL METODO EN ALTERAR EL PK SUB A COORDINANDO RESTOS O ALTERANDO LOS K DE LA ENVOLTURA DE METAL. DE ACUERDO CON ESTE METODO SE PUEDEN DESARROLLAR NUEVAS ISOMERASAS DE GLUCOSA CON UN PH ALTERADO OPTIMO. ESTAS ALTERADAS PROPIEDADES FACILITAN ALMIDON DEGRADADO PARA SER PROGRAMADO A VALORES DE PH MAS BAJOS.
Description
Nuevas glucosa isomerasas con un pH óptimo
alterado.
La presente invención se refiere a la aplicación
de la tecnología de ingeniería de proteínas para la mejora de las
propiedades de las metaloenzimas. Se proporciona método para
seleccionar aminoácidos que después de ser alterados influyen en el
perfil de actividad de pH de las metaloenzimas. Dicho método se
aplica a la glucosa isomerasa. La presente invención también
proporciona moléculas mutadas de glucosa isomerasa con un óptimo de
pH alterado. Específicamente, la parte ácida del perfil de actividad
de pH es desplazada hacia valores de pH menores.
Adicionalmente, la presente invención proporciona
glucosa isomerasas recombinantes que pueden ser aplicadas de forma
ventajosa en la producción de jarabes de fructosa, en particular de
jarabes de maíz de elevada fructosa.
En la degradación industrial del almidón las
enzimas desempeñan un importante papel. La enzima
\alpha-amilasa se usa para la licuefacción de
almidón en dextrinas con un grado de polimerización de
aproximadamente 7-10. Posteriormente, la enzima
\alpha-amiloglucosidasa se usa para la
sacarificación, que da lugar a un jarabe que contiene un
92-96% de glucosa. La isomerización reversible de la
glucosa para dar fructosa se ve catalizada por la enzima glucosa (o
xilosa) isomerasa. La nomenclatura correcta para esta enzima es
D-xilosa-ketol-isomerasa
(EC 5.3.1.5) por la preferencia de la enzima por la xilosa. Sin
embargo, debido a la mayor aplicación de la enzima en la conversión
de glucosa en fructosa, es más comúnmente denominada glucosa
isomerasa. La constante de equilibrio de esta isomerización es
próxima a la unidad, de tal modo que en las condiciones óptimas del
proceso se convierte aproximadamente el 50% de la glucosa. La mezcla
de equilibrio de glucosa y fructosa es conocida como jarabe de
fructosa superior.
La fructosa es mucho más dulce para el gusto
humano que la glucosa o la sacarosa, lo que la convierte en un
sustituto económicamente competitivo del azúcar.
Se han aplicado industrialmente muchos
microorganismos que producen glucosa isomerasa.
Wen-Pin Chen proporcionó una revisión detallada del
uso industrial de las glucosa isomerasas en Process Biochemistry,
15 Junio/Julio (1980) 30-41 y
Agosto/Septiembre (1980) 36-41.
La referencia de Wen-Pin describe
las condiciones de cultivo para los microorganismos, así como los
métodos de recuperación y de purificación de la enzima. Además,
también resume propiedades de las glucosa isomerasas tales como la
especificidad de sustrato, los óptimos de temperatura y los óptimos
de pH, la estabilidad térmica y el requerimiento de iones
metálicos.
La glucosa isomerasa requiere para su actividad
catalítica un catión bivalente tal como Mg^{2+}, Co^{2+},
Mn^{2+} o una combinación de estos cationes. La determinación de
las estructuras 3D de las diferentes glucosa isomerasas ha revelado
la presencia de dos iones metálicos en la unidad monomérica (Farber
y col., Protein Eng. 1 (1987) 459-466; Rey y
col., Proteins 4 (1987) 165-172; Henrick y
col., Protein Eng. 1 (1987) 467-475).
Además de su papel en el mecanismo catalítico,
también se ha descubierto que los cationes bivalentes incrementan
la termoestabilidad de algunas glucosa isomerasas (M. Callens y col.
en Enzyme Microb. Technol. 1988 (10), 695-700).
Además, la actividad catalítica de la glucosa isomerasa se ve
inhibida gravemente por Ag^{+}, Hg^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+} y
Ca^{2+}.
Normalmente, las glucosa isomerasas presentan el
óptimo de pH entre 7,0 y 9,0. Existen varias razones para
justificar porqué sería beneficioso usar glucosa isomerasa con un
valor de pH inferior. Tres de estas razones;
a) la estabilidad de las moléculas de
azúcar,
b) la adaptación a etapas previas y/o
posteriores del proceso y
c) la estabilidad de la enzima,
serán descritas con más detalle a continuación a
modo de ilustración.
- a)
- En condiciones alcalinas y a elevadas temperaturas, la formación de subproductos coloreados y la producción de un azúcar no metabolizable (D-Psicosa) son un problema. El pH de trabajo deseado debería estar entorno a 6,0. Con este pH la degradación de la glucosa y de la fructosa debería ser mínima.
- b)
- También es deseable un óptimo de pH rebajado para la glucosa isomerasa si esta enzima se va a usar en combinación con otras enzimas, o entre otras etapas enzimáticas, por ejemplo en la fabricación de jarabes de fructosa superiores. En este proceso, una de las otras etapas enzimáticas, la sacarificación mediante \alpha-gluco-amilasa se lleva a cabo a pH 4,5.
- c)
- La mayoría de las glucosa isomerasas conocidas se aplican a pH 7,5. Este valor de pH es un compromiso entre una mayor actividad inicial a un pH mayor y una mejor estabilidad de la enzima inmovilizada a un pH menor, dando como resultado una productividad óptima al pH elegido (R. v. Tilburg, Tesis: "Engineering aspects of Biocatalysts in Industrial Starch Conversion Technology", Delftse Universitaire Pers, 1983). La aplicación de la glucosa isomerasa a un pH inferior a 7,5 podría beneficiarse de una mayor vida media y, en combinación con una mejorada y mayor actividad específica, aumentaría en consecuencia la productividad de la enzima inmovilizada a ese menor pH.
De lo anterior se puede concluir que existe una
necesidad de glucosa isomerasas con una mayor actividad a valores
de pH menores en las condiciones del proceso.
Se analizaron muchos microorganismos en busca de
una glucosa isomerasa con un óptimo de pH menor. A pesar de los
esfuerzos, esta estrategia no condujo a nuevas glucosa isomerasas
comerciales.
Con el fin de ser capaces de cambiar el perfil de
actividad-pH de las glucosa isomerasas hacia pH
inferiores mediante el empleo de ingeniería de proteínas, es
importante conocer los efectos subyacentes que dan lugar a un
rápido descenso de la actividad catalítica a pH ácido.
Se pueden prever dos funciones diferentes de los
iones metálicos en las enzimas.
En primer lugar, los iones metálicos pueden
desempeñar un papel estructural. Esto significa que están
involucrados en el mantenimiento de la estructura 3D adecuada y,
por tanto, contribuyen a la estabilidad (térmica) de la molécula
enzimática. Un ejemplo de este tipo de función estructural y
estabilizante es el Ca^{2+} en la familia subtilisina de las
serina proteinasas.
En segundo lugar, los iones metálicos pueden
actuar como un cofactor en el mecanismo catalítico. En este caso la
actividad enzimática depende estrictamente de la presencia del ion
metálico en el centro activo. El ion metálico puede, por ejemplo,
hacer de puente entre la enzima y el sustrato (por ejemplo, el
Ca^{2+} en la fosfolipasa se une al grupo fosfato del sustrato) o
puede activar el agua para convertirse en un ion hidroxilo
fuertemente nucleófilo (Zn^{2+}-OH^{-}).
Ejemplos de esto son las
Zn^{2+}-proteasas, tales como la termolisina y la
carboxipeptidasa, la anhidrasa carbónica (Zn^{2+}), la
fosfolipasa-A_{2} (Ca^{2+}), la nucleasa
estafilococal (Ca^{2+}) y las fosfatasas alcalinas (Mg^{2+},
Ca^{2+}). Entre los ejemplos de enzimas de barril alfa/beta que
requieren cationes para polarizar un grupo carboxilo o uno
carbonilo con el fin de transferir hidrógeno están la glucosa/xilosa
isomerasa (Mg^{2+}), la
ribulosa-1,5-bifosfato
carboxilasa/oxigenasa (RU-BISCO) (Mg^{2+}), la
enolasa (Mg^{2+}), la aldolasa de levadura (Mg^{2+}, K^{1+}),
la racemasa de mandolato (Mg^{2+}), la cicloisomerasa de muconato
(Mn^{2+}). En presencia de agentes quelantes de metales (tales
como el EDTA), estas enzimas pierden su actividad por completo.
La unión de iones metálicos a una molécula
proteica normalmente incluye la coordinación de 4 ó 6 ligandos.
Dependiendo del tipo de ion metálico se tienen diferentes ligandos.
Por ejemplo, el magnesio y el calcio normalmente son ligados
mediante átomos de oxígeno procedentes de un grupo carbonilo de la
cadena principal de la proteína, de un grupo carbonilo de una
cadena lateral de glutamina o de asparagina o del carboxilato de una
cadena lateral de ácido aspártico o glutámico. Los iones de cinc y
de cobre normalmente están ligados a través de átomos de nitrógeno
procedentes de una cadena lateral de histidina, o de átomos de
azufre de cisteína y metionina.
La actividad de una enzima depende del valor de
pH del medio acuoso. Esta dependencia se debe, por un lado, a la
(des)protonación de grupos ionizables en el centro activo de
la enzima, y, por otro lado, a grupos ionizables del sustrato o del
producto (si lo hay). Los grupos ionizables de las proteínas
incluyen las cadenas laterales de los aminoácidos básicos lisina,
arginina e histidina (que portan una carga positiva en la forma
protonada), y los aminoácidos ácidos ácido aspártico, ácido
glutámico, cisteína y tirosina (que portan todos una carga negativa
tras la desprotonación). Además, el grupo amino de los extremos N y
el grupo carboxilo de los extremos C portan respectivamente una
carga positiva y una carga negativa. En la Tabla 1 se presentan los
valores de pK_{a} de algunos aminoácidos.
pK_{a} | |
Carga positiva (base) | |
Extremo N | 7,5-8,5 |
Lisina | 10,5 |
Arginina | 12,5 |
Histidina | 6,0-7,0 |
Carga negativa (ácido) | |
Extremo C | 3,0-4,0 |
Ácido aspártico | 3,9 |
Ácido glutámico | 4,3 |
Cisteína | 8,3 |
Tirosina | 10,1 |
Cabe destacar que estos valores de pK_{a} son
válidos para los compuestos modelo y que se pueden producir grandes
variaciones tanto a nivel de la misma proteína como entre diferentes
proteínas, debido al entorno específico del grupo ionizable. Se sabe
que los efectos electroestáticos desempeñan un papel fundamental en
la función y en la estructura de las enzimas (véase J.A. Matthew y
col., CRC Critical Reviews in Biochemistry, 18 (1985)
91-197). La presencia de una carga positiva cerca de
un grupo ionizable disminuirá su pK_{a}, mientras que una carga
negativa provocará un aumento del pK_{a}. La magnitud del efecto
disminuye con la distancia entre el grupo ionizable y la carga.
Además, la magnitud de esta disminución depende de la constante
dieléctrica del medio. En especial, los residuos catalíticos pueden
revelar valores de pK_{a} que se desvían de estos valores medios
(véase por ejemplo Fersht, Enzyme structure and mechanism, 1985,
W.H. Freeman, Nueva York).
La dependencia de pH de una reacción catalizada
enzimáticamente puede dividirse en la dependencia con respecto al
pH de la constante de Michaelis K_{m} y de la constante cinética
de refresco k_{cat} (equivalente a V_{max}). Estos parámetros
representan la unión del sustrato en su estado fundamental y en
estado de transición, respectivamente. La (des)protonación
dependiente del pH de las cadenas laterales de aminoácidos que
afectan a la unión de ambas formas de sustrato, o que están
involucradas en el evento catalítico (por ejemplo, la captación y
la liberación de protones como en la catálisis básica general), por
tanto, determina el perfil de actividad de pH de una enzima.
Por ejemplo, la protonación de la histidina en la
tríada catalítica de las serina proteasas (tanto la familia de las
tripsinas como de las sutilisinas) es la responsable de la pérdida
de actividad a valores de pH inferiores (<7). En este caso, el
pK_{a} de la actividad enzimática está directamente relacionado
con el pK_{a} de este residuo de histidina.
Como segundo ejemplo pueden mencionarse los dos
residuos de ácido aspártico de las aspartil proteasas, tales como
la pepsina y la quimosina. Estos grupos determinan el óptimo de pH
de estas proteasas. La disposición estructural típica de los ácidos
aspárticos hace que presenten diferentes valores de pK_{a} que
conducen al perfil pH-actividad con forma de
campana.
Se sabe que la alteración de la carga superficial
mediante una modificación química extensiva puede conducir a
cambios significativos en la dependencia de la catálisis con
respecto al pH. Sin embargo, en muchos casos esta estrategia
conduce a la desactivación y/o a cambios estructurales de la enzima
no deseados debido a que estos métodos son bastante poco
específicos. Se ha demostrado que la modificación química selectiva
de las lisinas en el citocromo c presenta un efecto sobre el
potencial redox (D.C. Rees, J. Mol. Biol. 173,
323-326 (1980)). Sin embargo, estos resultados han
sido criticados debido a que el reactivo voluminoso empleados para
la modificación podría perturbar la estructura de la proteína.
Usando la estructura 3D de una proteína para
anticipar la posibilidad de una perturbación estructural y de una
mutagénesis dirigida, es posible modificar la distribución de carga
de una proteína de un modo muy selectivo.
Fersht y colaboradores han demostrado que es
posible manipular el perfil pH-actividad de la
subtilisina mediante mutagénesis dirigida (Thomas y col., Nature,
318, 375-376 (1985); Russell y col., J. Mol.
Biol., 193, 803-813 (1987); Russel y Fersht,
Nature 328, 496-500 (1987)). La introducción
de grupos cargados negativamente a 10-15 Å del
centro activo en la superficie de la proteína eleva el valor de
pK_{a} del centro activo de histidina. Y a la inversa, hacer la
superficie más cargada positivamente disminuye el pK_{a} de los
grupos ácidos. Cambiar el Asp99 a 13 Angstroms o el Glu156 a 15
Angstroms del centro activo por una lisina disminuye el pK_{a}
del centro activo de histidina en 0,6 unidades de pH. Cambiar ambos
residuos simultáneamente para proporcionar un mutante doble con un
cambio de cuatro unidades de carga, disminuye el pK_{a} en 1,0
unidades de pH. Parece que los cambios en las interacciones
Culómbicas pueden ser acumulativos.
El documento WO 89/01520 (CETUR) enumera una
serie de luteínas de la xilosa isomerasa que pueden ser obtenidas a
partir de Streptomyces rubiginosus y que pueden presentar una
estabilidad incrementada. La selección de posibles posiciones que
pueden ser mutadas se basa en criterios que se distinguen de los
usados en la presente invención. Se enumeran más de 300 mutantes,
pero no se presentan datos acerca de las características y de las
alteraciones en las moléculas de enzimas mutantes.
Se pueden desarrollar o descubrir enzimas con
propiedades mejoradas por diferentes vías, por ejemplo mediante
métodos de escrutinio clásicos, mediante modificación química de
proteínas existentes, o mediante el uso de técnicas de genética
moderna y de ingeniería de proteínas.
La mutagénesis dirigida (SDM, del inglés
"site-directed mutagenesis") es el modo más
específico de obtener enzimas modificadas, lo que permite una
sustitución específica de uno o más aminoácidos por otro aminoácido
deseado cualquiera.
La presente invención proporciona métodos que se
refieren a la producción de nuevas metaloenzimas mutantes mediante
la expresión de genes que codifican dichas enzimas que presentan
secuencias de aminoácidos que difieren en al menos un aminoácido
con respecto a las metaloenzimas naturales correspondientes, y que
exhiben propiedades catalíticas alteradas. Específicamente, el
perfil pH-actividad es alterado cambiando la
distribución global de carga en las proximidades del centro
activo.
A este respecto, la invención proporciona un
método para alterar el perfil pH-actividad de una
enzima glucosa isomerasa natural de tal modo que dicho perfil, o su
parte ácida, es desplazada hacia un pH menor, lo que comprende la
sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente por
uno neutro o por uno cargado positivamente, o la sustitución de un
residuo neutro por uno cargado positivamente, en el que dicha
sustitución se produce en una posición seleccionada del grupo que
consiste en: Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258; en el que dichos
residuos de la glucosa isomerasa proceden de Actinoplanes
missouriensis cuya secuencia se muestra en la Figura 2, o la
posición correspondiente en una glucosa isomerasa homóloga.
Adicionalmente, la invención proporciona un
proceso para obtener una molécula mutante de glucosa isomerasa que
comprende: (a) obtener una secuencia de ADN que codifica una glucosa
isomerasa; (b) mutar esta secuencia en las posiciones de
nucleótidos seleccionadas para proporcionar una enzima alterada en
cualquiera de las posiciones Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258 mediante
una sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente
por uno neutro o por uno cargado positivamente, o mediante la
sustitución de un residuo neutro por uno cargado positivamente, en
el que dichos residuos de la glucosa isomerasa proceden de
Actinoplanes missouriensis cuya secuencia se muestra en la
Figura 2, o la posición correspondiente en una glucosa isomerasa
homóloga; (c) clonar la secuencia alterada en un vector de
expresión de tal modo que la secuencia de ADN pueda ser expresada;
(d) transformar un organismo o célula hospedante con dicho vector;
(e) cultivar dicho organismo hospedante; y, (f) aislar la glucosa
isomerasa alterada.
Dicho proceso puede comprender adicionalmente el
uso de la glucosa isomerasa mutante para la producción de un jarabe
de fructosa.
En los anteriores aspectos de la invención, la
glucosa isomerasa natural puede proceder de un microorganismo del
orden Actinomycetales, tal como la Actinoplanes
missouriensis, y, en concreto, las sustituciones de aminoácidos
pueden ser A25K, F61K, Q204K y L258K.
Cuando la glucosa isomerasa es la isomerasa de
Actinoplanes missouriensis de la Figura 2, la sustitución
puede ser F61K+K253R.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática del centro activo de la glucosa isomerasa procedente de
Actinoplanes missouriensis obtenida a partir de la estructura
tridimensional del complejo glucosa isomerasa - xilitol. El
inhibidor se muestra con todo detalle en el centro de la figura. En
el caso de los residuos de aminoácido, sólo se muestran los átomos
que participan en los enlaces de hidrógeno. Los nombres de los
residuos de aminoácido se presentan en recuadros dibujados con
líneas continuas, las moléculas de disolvente se encuentran en
recuadros dibujados con líneas discontinuas. Las posiciones de unión
de metales están indicadas mediante óvalos numerados con 395 y 580.
Las líneas discontinuas indican interacciones electroestáticas: las
líneas delgadas punteadas representan enlaces de hidrógeno, las
líneas gruesas discontinuas representan la ligación propuesta para
los metales. Los residuos conservados estrictamente están marcados
con un asterisco. En el caso de los residuos no conservados, las
sustituciones que se producen están indicadas.
La Figura 2 muestra el alineamiento de las
secuencias de aminoácidos de glucosa isomerasas procedentes de
diferentes fuentes. Se presenta la secuencia completa de la glucosa
isomerasa de Actinoplanes missouriensis. La secuencia de
aminoácidos de la glucosa isomerasa de Ampullariella difiere
de la secuencia publicada (Saari, J. Bacterial., 169, (1987) 612)
en un residuo: se descubrió que la Prolina 177 de la secuencia
publicada era una Arginina.
La secuencia de Streptomyces
thermovulgaris sólo ha sido determinada hasta el aminoácido 346.
Los residuos no determinados están en blanco. Un punto indica la
ausencia de un residuo de aminoácido en la posición indicada en
comparación con cualquiera de las otras secuencias. Las diferentes
especies están indicadas con los siguientes símbolos:
- Ami.:
- Actinoplanes missouriensis DSM 4643
- Amp.:
- Ampullarella species ATCC31351
- Svi.:
- Streptomyces violaceoruber LMG 7183
- Smu.:
- Streptomyces murinus
- Sth.:
- Streptomyces thermovulgaris DSM 40444
- Art.:
- Arthrobacter species
- Bsu.:
- Bacillus subtilus
- Eco.:
- Escherichia coli
- Lxy.:
- Lactobacillus xylosus
La asignación de la estructura secundaria se
realizó en la estructura de la Actinoplanus
missouriensis. Las hélices del barril están marcadas con líneas
continuas. Las cadenas \beta se encuentran en recuadros
sombreados.
La Figura 3 muestra el perfil
pH-actividad de la glucosa isomerasa en presencia de
xilosa 200 mM y de magnesio 10 mM (cuadrados) y manganeso 1 mM
(círculos).
La Figura 4 muestra el esquema de reacción
correspondiente a la isomerización catalizada por la glucosa
isomerasa en presencia de iones metálicos.
E = enzima, S = sustrato, M = ion metálico, P =
producto.
La Figura 5 muestra la dependencia con respecto
al pH de la reacción de la glucosa isomerasa con la xilosa y el
Mg^{2+} tal como se observa en los experimentos de estado
estacionario. K_{1}, K_{2}, K_{3} y K_{4} son las
constantes de equilibrio explicadas en el texto y en el esquema de
reacción de la Figura 4.
La Figura 6 muestra el perfil
pH-actividad correspondiente a los mutantes K294R y
K294Q en presencia de xilosa 200 mM y de magnesio 10 mM.
La Figura 7 muestra los perfiles
pH-actividad correspondientes al E186Q y al E186D en
presencia de xilosa 200 mM y de Mg^{2+} 10 mM.
La Figura 8 muestra los perfiles
pH-actividad correspondientes al E186D y al E186Q en
presencia de xilosa 200 mM y de Mn^{2+} 1 mM.
La Figura 9 muestra el perfil
pH-actividad del mutante D255N en presencia de
xilosa 200 mM y de manganeso 1 mM.
Las Figuras 10 a 20 muestran los perfiles
pH-actividad normalizados correspondientes a los
siguientes mutantes:
F254K (Fig. 10), F94R (Fig. 11), F61K (Fig. 12),
A25K (Fig. 13), D57N (Fig. 14), L258K (Fig. 15), Q204K (Fig. 16),
R23Q (Fig. 17), H54N (Fig. 18), H290N (Fig. 19), T95D (Fig. 20).
Las condiciones son las mencionadas en las
Figuras.
\newpage
La Figura 21 muestra el perfil
pH-actividad normalizado correspondiente al mutante
F61KK253R. Las condiciones son las mencionadas en la Figura.
La presente invención describe la modificación de
enzimas para mejorar su aplicabilidad industrial. La invención hace
uso de técnicas recombinantes de ADN. Dichas técnicas constituyen
una potente herramienta para obtener las sustituciones de
aminoácidos deseadas en la proteína elegida. Debido a la cantidad
virtualmente ilimitada de posibles sustituciones de aminoácidos, es
preferible usar una estrategia selectiva. La presente metodología
se basa en la aplicación bien coordinada de la cristalografía de
proteínas, de la modelización molecular y métodos computacionales,
de la enzimología y la cinética, de la biología molecular y técnicas
de química de proteínas. Las estrategias para la identificación de
mutaciones dirigidas son innovadoras en el sentido de que se
reconoce que las mutaciones puntuales raramente provocan únicamente
perturbaciones locales. Generalmente, las mutaciones afectan
simultáneamente a varias propiedades diferentes de la proteína. Por
tanto, aunque las estrategias descritas hacen uso de relaciones
estructura-función bien establecidas, también
proporcionan un modo racional de evitar o de corregir las
alteraciones no deseadas en propiedades secundarias.
Una investigación bioquímica intensiva sobre los
mutantes diseñados da como resultado la identificación de mutantes
con propiedades mejoradas.
Con "propiedades mejoradas", tal como se usa
aquí en relación con las presentes enzimas de glucosa isomerasa,
nos referimos a enzimas en las que la parte ácida del perfil
pH-actividad está desplazada hacia un óptimo de pH
más ácido en relación a las correspondientes enzimas naturales.
Se estableció que el perfil
pH-actividad de la glucosa isomerasa natural revela
un descenso en la actividad a pH ácido por debajo de 7,0 y a pH
alcalino por encima de pH 8,0 (Ejemplo 1 - Figura 3). Tal como se ha
discutido anteriormente, sería preferible usar glucosa isomerasa a
un menor pH.
Sorprendentemente, se descubrió que la caída en
la actividad en el lado ácido del perfil
pH-actividad está provocada por la protonación de
una o más cadenas laterales de los aminoácidos, que están
directamente involucradas en la coordinación del ion metálico
catalítico de la glucosa isomerasa. Esto se dedujo a partir del
hecho de que las constantes de asociación aparentes para la unión
del metal, determinadas mediante cinética de estado estacionario,
mostraron una dependencia similar con respecto al pH (Ejemplo 1 -
Figura 5). Esto puede describirse mediante el siguiente modelo:
en el que "centro" se refiere
al centro de unión geométrica compuesto por diferentes ligandos
(ionizables). La enzima es activa únicamente cuando la posición
está ocupada por un ion Mg^{2+}, el cual, a su vez, tan sólo
puede unirse a la posición de unión de metal no protonada
("centro") y no a la protonada ("centro:H^{+}"). La
protonación dependiente del pH del centro de unión del metal se
caracteriza por el pK_{a}, mientras que la unión del metal al
centro no protonado se caracteriza por la constante de asociación
K_{as}. La constante de asociación aparente para la unión del
metal es función de la verdadera K_{as}, del pK_{a} y del pH, y
puede describirse de la siguiente
forma:
K_{as}{}^{aparente} = K_{as}
\text{*} \ (1 +
10^{pKa-pH})^{-1}
La velocidad de reacción es proporcional a la
fracción de moléculas de enzima que están acomplejadas con
Mg^{2+}. Esta fracción aumenta cuando aumenta
[Mg^{2+}]*K_{as}{}^{aparente}.
Aunque el modelo presentado fue descrito después
de una observación realizada con la glucosa isomerasa, es obvio que
este modelo, y el método derivado de él, pueden ser usados para
metaloenzimas en general, ya que la desactivación a pH bajo es
debida a la disociación de los iones metálicos.
La caída observada en la actividad a pH alcalino
es debida a un descenso en la velocidad máxima (V_{max}), que
refleja la desprotonación de un residuo de aminoácido que es
esencial para el mecanismo catalítico.
A partir del modelo descrito, que puede ser usado
para explicar el descenso de la actividad en la vertiente ácida del
perfil pH-actividad, se puede deducir que con el fin
de aumentar la actividad de la glucosa isomerasa a valores de pH
más bajos, la K_{as} tiene que ser incrementada y/o el pK_{a}
tiene que disminuir.
Por tanto, las secuencias de ADN que codifican
metaloenzimas tales como las glucosa isomerasa pueden ser mutadas
de tal modo que las proteínas mutantes revelan un cambio en el
perfil pH-actividad como resultado de un cambio en
el pK_{a} de las cadenas laterales de aminoácidos que actúan como
ligandos en la unión de metales.
Con el fin de desplazar los pK_{a}'s de los
ligandos que coordinan metales hacia un pH más ácido, se tienen que
introducir residuos que aumenten la carga global positiva alrededor
del centro de unión del metal en las metaloenzimas. Por
consiguiente, la dependencia con respecto al pH de la actividad de
las metaloenzimas, para las cuales la actividad al lado ácido del
óptimo de pH es generada por el pK_{a} de la unión del metal,
cambiará en consonancia. Esta alteración de cargas estabilizará la
carga negativa de los grupos ionizables que son responsables de la
dependencia con respecto al pH de la unión del metal a través de
efectos electrostáticos de largo alcance.
De acuerdo con una realización preferida, el
desplazamiento del perfil pH-actividad de la glucosa
isomerasa hacia un pH más ácido se logra aumentando la carga
positiva global alrededor del centro activo de la glucosa
isomera-
sa.
sa.
Alrededor del pH neutro se puede obtener un
incremento neto en la carga positiva mediante los siguientes
procedimientos:
- \bullet
- Sustituyendo un residuo cargado negativamente (Asp ó Glu) por uno neutro.
- \bullet
- Sustituyendo un residuo neutro por uno cargado positivamente (Arg ó Lys).
- \bullet
- Sustituyendo un residuo cargado negativamente por uno cargado positivamente.
Para la selección de los residuos adecuados para
ser mutados se pueden formular los siguientes criterios:
- I.
- Seleccionar aquellas posiciones en las que la sustitución dará lugar a un incremento neto de la carga positiva en un radio de 15 Angstroms alrededor de los residuos objetivo. Los residuos objetivo son los grupos ionizables que están involucrados en la coordinación del catión.
- Eliminar de esta colección:
- \bullet
- Todas las posiciones que ya contengan una carga positiva: arginina o lisina.
- \bullet
- Todas las posiciones que no puedan alojar una arginina o una lisina debido a que estos residuos darían lugar a inadmisible solapamiento de Van der Waals con los átomos de la cadena principal de la proteína.
- \bullet
- Todas las posiciones en las que una arginina o una lisina necesitarían una adaptación intensiva de posiciones adicionales en el entorno directo, con el fin de evitar solapamientos de Van der Waals.
- \bullet
- Todas las posiciones en las que la sustitución de una arginina o de una lisina daría lugar a una carga subyacente descompensada en un grupo hidrofóbico.
- \bullet
- Todas las posiciones en las que los residuos no deberían ser sustituidos debido a que están involucrados en disposiciones estructurales típicas tales como: puentes de sal, empaquetamiento de hélices, estabilización de hélices manteniendo una carga negativa en el comienzo de una hélice, iniciación de hélices, por ejemplo las prolinas al comienzo de una hélice, ángulos Phi-psi que se encuentran fuera de la región permitida para el residuo que se va a insertar.
- II.
- En una realización preferida también se eliminan los siguientes aminoácidos de la colección:
- \bullet
- Todos los residuos que están implicados en la catálisis, en la unión del cofactor (tales como los iones metálicos y los nucleótidos).
- \bullet
- Todas las posiciones que parecen estar conservadas de forma estricta entre enzimas homólogas (si se dispone de ellas).
- III.
- Por consiguiente, se puede atribuir una prioridad a cada posición de mutación posible. Esto se realiza mediante la inspección del entorno estructural del residuo, de la distancia de los residuos "objetivo", de la estructura de enlaces de hidrógeno en la que el residuo de dicha posición está involucrado y de la accesibilidad del disolvente.
- Con el fin de evitar el enmascaramiento de las interacciones electrostáticas mediante contraiones, se prefiere la introducción de cargas en posiciones que no pueden ser escudadas de los residuos objetivo por el disolvente. En general, debido a la diferencia en las propiedades dieléctricas entre la proteína y el disolvente, es más probable que las cargas, que no pueden estar completamente solvatadas debido al hecho de que están enterradas en el interior de la proteína o parcialmente enterradas en huecos de la superficie de la proteína, tengan efectos en comparación con las cargas que se encuentran completamente solvatadas. Además, en el caso de la glucosa isomerasa, la conversión de glucosa a fructosa se lleva a cabo con una baja fuerza iónica, y por tanto, se espera que el apantallamiento debido a los contraiones interfiera menos gravemente con la nueva interacción carga-carga diseñada en la nueva glucosa isomerasa descrita en la realización de la invención.
- Los criterios para establecer una baja prioridad a los anteriores centros seleccionados, cuando se sustituyen por una carga positiva, son:
- \bullet
- La introducción de una carga positiva y/o la eliminación de una carga negativa afectará a la integridad de la estructura cuaternaria.
- \bullet
- La posición es completamente accesible al disolvente, de tal modo que se espera que una carga introducida sea apantallada de los residuos objetivo por el disolvente, el cual, por lo tanto, disminuirá el efecto sobre el pK_{a} de los residuos objetivo.
Del mismo modo, el aumento de la carga negativa
global alrededor del centro de unión del metal desplazará los
pK_{a}'s hacia valores más básicos.
En otra realización preferida de la presente
invención, el desplazamiento del perfil pH-actividad
hacia un pH más bajo se logra aumentando la K_{as}.
El desplazamiento del perfil
pH-actividad de las metaloenzimas hacia un pH más
ácido se puede lograr aumentando la constante de asociación
correspondiente a la unión del metal. La constante de asociación de
la unión del metal puede ser aumentada mediante la optimización de
la coordinación de los metales y los ligandos. Esto puede
realizarse mediante la introducción de mejores ligandos o mediante
la introducción de más ligandos. Las interacciones electrostáticas
pueden contribuir a la constante de asociación de la unión del metal
desde distancias mucho mayores.
En otra realización preferida, la vertiente ácida
del perfil pH-actividad de la glucosa isomerasa es
desplazado hacia un menor pH mediante el aumento de la constante de
asociación de la unión del metal.
La glucosa isomerasa se une a dos iones de
magnesio por subunidad, dando como resultado la unión de ocho
cationes por tetrámero, aumentado con ello la carga total en +16
(véase la Figura 1). Ambas posiciones de unión están localizadas en
el extremo C del barril \beta. Las posiciones de unión "Hacia
abajo" están localizadas a bastante profundidad en el barril y,
en el complejo xilitol, se unen directamente a dos oxígenos del
inhibidor. La segunda posición de unión ("Hacia arriba") está
localizada próxima al extremo del barril \beta, cerca de la
hendidura del centro activo y de la interfase de la subunidad.
En general, cuando un ion cargado positivamente
se une a una segunda partícula, las constantes cinéticas de
asociación y de disociación, así como la constante de afinidad de
equilibrio global, dependerán de la carga de la segunda partícula.
Cuando la partícula también está cargada negativamente se produce
una repulsión y entre cargas opuestas se produce una atracción.
Para iones pequeños, y en determinados casos también para
proteínas, este efecto puede ser cuantificado estudiando la
dependencia con respecto a la fuerza iónica de la velocidad de
reacción. La velocidad de asociación de los iones cargados
opuestamente disminuirá al aumentar la fuerza iónica, la velocidad
de asociación de las mismas cargas aumentará al aumentar la fuerza
iónica, y cuando una de las partículas no está cargada no existe
efecto de la fuerza iónica.
La afinidad de la glucosa isomerasa por el
magnesio disminuye al aumentar la fuerza iónica, lo cual es
consistente con una carga negativa global de la posición de unión
de la glucosa isomerasa. La unión del catión puede ser alterada por
la introducción de aminoácidos cargados en la superficie de la
proteína a lo largo de la trayectoria del catión al entrar en el
centro activo. Más concretamente, esta invención se refiere al uso
de fuerzas electrostáticas para alterar la constante cinética de
asociación del catión. La glucosa isomerasa puede ser diseñada
mediante ingeniería para aumentar la velocidad de asociación del
catión mediante la adición de carga negativa (o mediante la
eliminación de carga positiva) cerca del canal del centro activo, o
para disminuir la velocidad de asociación del catión mediante la
adición de carga positiva (o mediante la eliminación de carga
negativa) cerca del canal del centro activo. Puesto que no es de
esperar que el off-rate se vea afectado
sustancialmente, un on-rate alterado dará como
resultado una constante alterada para la asociación global del
catión. Puesto que las regiones de lazo situadas en el extremo C
del barril \beta dan forma a la entrada al centro activo, las
posibles posiciones de mutación son buscadas en estas regiones.
Para evitar posibles interferencias con la estabilidad del barril,
no se considerarán sustituciones en la cadenas \beta o en las
hélices \alpha. Se puede usar el siguiente razonamiento:
- \bullet
- Seleccionar todos los residuos de la región entre los extremos C de las cadenas \beta y los extremos N de las hélices \alpha.
- \bullet
- Rechazar para consideraciones adicionales todos los residuos en los que la sustitución conduce a un descenso de la carga neta positiva en una esfera de 15 Angstroms de radio alrededor de los ligandos del metal. La introducción de cargas negativas demasiado próximas a la posición de unión del metal desplazará el pK_{a} de los ligandos del metal hacia pH mayores, lo que cancelará el efecto de una K_{as} aumentada a bajo pH.
- \bullet
- Computar para cada uno de los residuos remanentes su área superficial accesible en el contexto de la proteína, y usar una sonda de radio 1,4 \ring{A}. Rechazar los residuos que están enterrados en el sentido de que presentan menos de 10 \ring{A}^{2} de área superficial accesible.
La información acerca de la estructura 3D de la
enzima (o del complejo enzima:sustrato o del complejo
enzima:inhibidor) es de gran importancia para poder hacer
predicciones sobre las mutaciones que se pueden introducir.
Se han publicados datos estructurales
correspondientes a la glucosa isomerasa de la Streptomyces
rubiginosus (Carrel y col., J. Biol. Chem. 259 (1984)
3230-3236); Carrel y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 86, (1989) 440-4444), de la
Streptomyces olivochromogenus (Farber y col., Protein
Eng. 1, (1987) 467-475; Farber y col.,
Biochemistry 28 (1987) 7289-7297),
Arthrobacter (Hendrick y col., J. Mol. Biol. 208
(1989) 127-157) y de la Streptomyces
albus (Dauter y col., FEBS Lett. 247,
1-8).
Aunque no se dispone de todos los datos de la
secuencia de aminoácidos de estas enzimas, la homología
3D-estructural con la glucosa isomerasa de la
Actinoplanes missouriensis es sorprendente (véase F.
Rey y col., Proteins 4 (1988) 165-172). Para
mostrar la aplicabilidad general del método descrito en esta
especificación, se han clonado y secuenciado los genes de glucosa
isomerasa procedentes de varias especies. Las secuencias de
aminoácidos de glucosa isomerasas obtenidas de los genes de
Streptomyces violaceoruber, de Streptomyces murinus,
de Arthrobacter spec. y de Streptomyces thermovulgaris
son homólogas. Las secuencias de aminoácidos publicadas para las
glucosa isomerasas de la Ampullariella sp. (Saari,
ibid.) y de la Streptomyces violaceoniger
(Nucl. Acids. Res. 16 (1988) 9337), deducidas de las
secuencias de nucleótidos de los respectivos genes, muestran una
estrecha homología con respecto a la glucosa isomerasa de
Actinoplanes missouriensis. Además, el documento WO 89/01520
describe que la secuencia de aminoácidos de la glucosa isomerasa de
la Streptomyces rubiginosus es homóloga a la glucosa
isomerasa de Ampullariella sp.
A pesar de la ausencia de datos estructurales 3D
para la mayoría de glucosa isomerasas, se puede concluir que todas
las glucosa isomerasas procedentes de Actinomycetales
presentan una organización tetramérica similar.
En general, se puede asumir que cuando la
homología global es superior al 65%, preferiblemente superior al
74% (homología mínima entre las glucosa isomerasas de
Actinoplanes missouriensis y de Streptomyces, de
acuerdo con Amore y Hollenberg, Nucl. Acids Res. 17, 7515
(1989)), y más preferiblemente superior al 85%, y cuando la
estructura 3D es similar, las sustituciones de aminoácidos conducen
cambios similares en el óptimo de pH. En concreto, uno esperaría
que las glucosa isomerasas procedentes de especies que pertenecen
al orden de los Actinomycetales que presentan un elevado
grado de similitud, tuvieran similares alteraciones en el óptimo de
pH debido a sustituciones de aminoácidos en las posiciones
seleccionadas. La Actinoplanes missouriensis es la
fuente preferida de glucosa isomerasa para ser mutada.
La Figura 1 proporciona una representación
esquemática del centro activo de la glucosa isomerasa procedente de
Actinoplanes missouriensis.
La Figura 2 muestra las secuencias alineadas de
aminoácidos de varias glucosa isomerasas.
En la presente especificación se usa tanto el
código de aminoácidos de tres letras como el de una letra (véase
por ejemplo, Stryer, L. Biochemistry, pag. 13, 2ª ed., W.H. Freeman
and Comp., NY, 1981).
La D-glucosa isomerasa (GI) se
usa de forma sinónima para la D-xilosa isomerasa
((D-xilosa) ketol-isomerasa, EC
5.3.1.5), una enzima que convierte la D-xilosa en
D-xilulosa. La D-glucosa isomerasa
procedente de Actinoplanes missouriensis producida mediante
cepas diseñadas por ingeniería de E. coli se designa como
EcoAmi (DSM) GI. Para distinguir el gen de Actinoplanes
missouriensis que codifica la GI procedente del gen análogo de
E. coli xylA, el primero será designado GI.
Los métodos para la manipulación de moléculas de
ADN se describen en Maniatis y col. (1982, Cold Spring Harbor
Laboratory) y en Ausubel y col. (1987, Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. Nueva York). La
clonación y la determinación de la secuencia de AND del gen de
glucosa isomerasa de Actinoplanes missouriensis DSM 43046 se
describe en el documento
EP-A-0351029.
En la Figura 2 se numera y se compara la
secuencia de aminoácidos derivada de la GI con otras glucosa
isomerasas. A partir de aquí, la numeración de los aminoácidos se
refiere a la Figura 2.
Las enzimas GI naturales y mutantes fueron
producidas en la cepa K514 de E. coli, cultivada como se
describe en el documento
EP-A-0351029.
La actividad enzimática de la glucosa isomerasa
fue ensayada tal como se describe a continuación [1 unidad de
actividad enzimática produce 1,0 micromoles de producto
(D-xilulosa ó D-fructosa) por
minuto; por tanto, la actividad específica (spa) se expresa en
unidades por mg de enzimas GI].
La actividad de GI puede evaluarse
directamente midiendo el aumento de la absorbancia a 278 nm
de la xilulosa producida a 35ºC por isomerización de xilosa
mediante glucosa isomerasas. Este ensayo fue llevado a cabo en una
disolución tampón de trietanolamina 50 mM, a pH 7,5, que contiene
MgSO_{4} 10 mM, en presencia de xilosa 0,1 M. La concentración
final de glucosa isomerasa en el ensayo fue ± 0.01 mg/ml, y fue
determinada con precesión, antes de ser diluida en la mezcla del
ensayo enzimático, mediante espectroscopía de absorción usando un
coeficiente de extinción de 1,08 a 278 nm para una disolución de
enzima de 1,0 mg/ml.
La actividad específica fue determinada con el
Ensayo Acoplado de D-sorbitol Deshidrogenasa,
la determinación enzimática de la D-xilulosa fue
llevada a cabo a 35ºC tal como se ha descrito anteriormente
(Kersters-Hilderson y col., Enzyme Microb. Technol.
9 (1987) 145) en trietanolamina 50 mM, a pH 7,5, MgSO_{4}
10 mM, y xilosa 0,1 M, en presencia de D-sorbitol
deshidrogenada ± 2 x 10-8 M
(L-iditol: NAD oxidoreductasa, EC 1.1.14), y NADH
0,15 nM, excepto que el tampón de incubación también incluía ácido
etilenbis(oxietilennitrilo)tetraacético 1 mM (EGTA).
La concentración final de glucosa isomerasa en este ensayo fue de ±
2,5 x 10^{-3} mg/ml, y fue determinada con precisión tal como se
ha descrito anteriormente.
Tomando glucosa como sustrato, la actividad de GI
se puede evaluar mediante la medida de la D-fructosa
producida durante la reacción de isomerización usando el método de
cisteína-carbazol (CCM), que se basa en la reacción
de cetoazúcares con carbazol en ácidos para dar lugar a un producto
púrpura (Dische y Borenfreund, J. Biol. Chem. 192 (1951)
583).
Con el objetivo de determinar el perfil
pH-actividad de la glucosa isomerasa natural y
mutante, se midió la actividad en función del pH
(5,2-8,0) en presencia de MgSO_{4} 10 mM y de
xilosa 200 mM (usando el método de ensayo directo). Para los
mutantes con actividades muy bajas se usó el sistema de ensayo
acoplado de sorbitol deshidrogenasa entre pH 5,8 y 8,4. Se
extremaron las precauciones para que la reacción de sorbitol
deshidrogenasa no fuera la etapa limitante de la cinética a valores
extremos de pH.
En la Figura 3 se muestra el perfil
pH-actividad de la glucosa isomerasa (es decir, la
enzima recombinante natural procedente de Actinoplanus
missouriensis) en presencia de xilosa 200 mM y de diferentes
cationes activantes. Se observa un descenso en la actividad tanto a
pH ácido por debajo de 7,0 como a pH alcalino por encima de
8,0.
El mecanismo cinético de estado estacionario
apropiado para la glucosa isomerasa incluye la formación rápida de
un complejo enzima-metal-azúcar que
se convierte en el producto con una etapa limitante de la cinética
(denominada equilibrio rápido, mecanismo de orden aleatorio, véase
la Figura 4). Las medidas de fluorescencia de equilibrio y de
cinética transitoria (flujo detenido) indican la presencia de dos
posiciones de unión de ion metálico. En el experimento de flujo
detenido los iones metálicos se unen de forma consecutiva. El metal
de elevada afinidad desempeña el papel de mantener una conformación
activa y, por tanto, es denominado centro "conformacional". La
segunda posición de unión de metal acomoda al catión activante, por
lo tanto esta posición normalmente es designada centro
"catalítico". El esquema de reacción que se muestra en la
Figura 4 parece ser adecuado para analizar y comparar los
experimentos de estado estacionario y de flujo detenido. En
principio, los resultados de estado estacionario no distinguen
entre las dos posiciones de unión de metal, pero se asume que el
efecto principal procede de la unión de metal catalítica.
El análisis de la velocidad inicial (v) de la
conversión de xilosa en función de las concentraciones de xilosa y
de magnesio permite determinar cuatro parámetros: la velocidad
máxima, las constantes de equilibrio para la unión de magnesio a la
enzima libre (K_{1}), el complejo enzima-azúcar
(K_{4}), y las constantes de equilibrio de la unión de xilosa a
la enzima libre (K_{2}) y al complejo
enzima-magnesio (K_{3}).
\frac{V_{max}}{v} = 1 +
\frac{1}{K_{3} * [S]} + \frac{1}{K_{4} * [M]} + \frac{1}{K_{3} *
K_{1}*[S]*[M]}
donde [M y [S] representan la
concentración del ion metálico y de la xilosa,
respectivamente.
Mediante una variación sistemática de las
concentraciones de ion de magnesio y de xilosa fue posible obtener
valores para velocidad máxima y para las cuatro constantes de
equilibrio. La Figura 5 muestra la dependencia de estos parámetros
con respecto al pH.
La comparación de los resultados de las Figuras 3
y 5, muestra que la vertiente ácida del perfil de pH está
determinada completamente por la unión del ion metálico.
Los datos de la Figura 5 no son suficientemente
precisos para calcular el número de ionizaciones involucradas. Sin
embargo, la pendiente de las curvas de logK_{1,4} frente al pH
(pendiente > 1) indica que puede haber involucrada más de una
ionización. La similitud en la dependencia con respecto al pH de
K_{1} y K_{4} indica que los mismos grupos ionizantes son
importantes para estos dos procesos (incluyendo la misma
posición).
En el caso de la glucosa isomerasa, los criterios
para la selección de posibles posiciones para la sustitución, como
se ha esbozado en la descripción detallada de esta invención, fueron
aplicados usando las secuencias alineadas procedentes de diferentes
fuentes (Figura 2) y la estructura altamente resuelta de la glucosa
isomerasa de Actinoplanes missouriensis en complejo con el
inhibidor xilitol (véase la Figura 1 y la "Información
Estructural" de la "Descripción detallada de la invención").
La estructura altamente resuelta, con una resolución de 2,2
Angstroms, revela la posición del inhibidor y las dos posiciones de
unión del metal. En la Figura 1 se proporciona una representación
esquemática de la posición activa de la glucosa isomerasa de la
Actinoplanes missouriensis.
De la estructura de la glucosa isomerasa
acomplejada con cobalto y xilitol se seleccionaron los residuos en
los que una sustitución por un residuo de aminoácido más cargado
positivamente conducía a un incremento neto de la carga positiva en
un radio de 15 Angstroms alrededor de los grupos ionizables
objetivo. En el caso de la glucosa isomerasa, los objetivos son los
grupos ionizables que están involucrados en la coordinación de los
iones metálicos requeridos para la actividad. Estos grupos
ionizables objetivo implican los grupos carboxilo de Glu181, Glu217,
Asp245, Asp292 y el NE de His220.
Después de la aplicación del criterio I, se
obtuvieron 80 posibles posiciones de mutación. Estas posiciones se
enumeran a continuación:
Después de descartar los residuos catalíticos y
los residuos conservados estrictamente (criterio II), quedaron los
siguientes 62 residuos:
Posteriormente se atribuyó prioridad a cada uno
de estos 62 posibles centros de mutación de acuerdo con el criterio
III. Las siguientes 24 posiciones fueron atribuidas como de alta
prioridad para la mutagénesis: Ala25, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe61,
Ile85, Thr95, Gln122, Thr133, Tyr145, Tyr158, Gly189, Ile191,
Gln204, Thr218, Gln222, Leu226, Thr229, Gly231, Leu236, Gln256,
Leu258, Tyr293 y Val380.
La mutación de uno o de varios de los 80 residuos
de aminoácido seleccionados para dar residuos cargados positivamente
dará como resultado un descenso del pK_{a} de la unión del metal
a la glucosa isomerasa. Esto puede dar como resultado un
desplazamiento del perfil pH-actividad hacia un pH
menor.
En consonancia, la mutación de uno o de varios de
los 80 residuos de aminoácidos para generar residuos cargados
negativamente dará como resultado un aumento del pK_{a} de la
unión del metal a la glucosa isomerasa. Esto puede dar como
resultado un desplazamiento del perfil pH-actividad
hacia un pH mayor.
Ejemplo de referencia
A
En la posición 294 de la glucosa isomerasa se
encuentra una carga positiva a aproximadamente 8 Angstroms de la
posición de unión del metal más ocupada del complejo glucosa
isomerasa-xilitol (395 de la Figura 1). Se realizó
una mutación en esta posición, sustituyendo la lisina por una
arginina. Esta mutación conserva la carga positiva de la posición
294. En consonancia con esta conservación de la carga positiva se
haya la observación de que el perfil pH-actividad
de este mutante es similar al de la enzima natural.
Sin embargo, si se elimina la carga positiva de
la posición 294 sustituyendo la lisina 294 por una glutamina,
observamos un desplazamiento del perfil pH-actividad
hacia la vertiente alcalina en aproximadamente 0,5 unidades de pH.
Los perfiles pH-actividad correspondientes al K294R
y al K294Q se muestran en la Figura 6.
Este ejemplo ilustra que es posible manipular el
pK_{a} de uno o más grupos funcionales, en el centro activo de la
glucosa isomerasa, cambiando la carga neta de la proteína alrededor
del centro activo.
Ejemplo de referencia
B
En el mutante E186Q se sustituye una carga
negativa por una neutra, lo que da lugar a un incremento neto de la
carga positiva en un radio de 15 Angstroms alrededor de los ligandos
del metal. El perfil pH-actividad del mutante E186Q
en presencia de magnesio se muestra en la Figura 7. La vertiente
alcalina del perfil de pH se ve desplazada significativamente hacia
un pH menor. En presencia de manganeso en lugar de magnesio, el
perfil pH-actividad del E186Q
se ve desplazado hacia un pH menor y a su pH óptimo su actividad es mayor que para la enzima natural (Figura 8).
se ve desplazado hacia un pH menor y a su pH óptimo su actividad es mayor que para la enzima natural (Figura 8).
Para aplicaciones en las que se pueden usar otros
iones metálicos distintos del magnesio, la combinación del E186Q
con manganeso a pH bajo es una opción interesante.
También llevamos a cabo la mutación E186D que es
conservativa en lo que a carga se refiere. El perfil
pH-actividad de este mutante se muestra en las
Figuras 7 y 8. La dependencia de la actividad con respecto al pH
para el mutante E186D no es significativamente diferente a la de la
enzima natural. La eliminación de la carga negativa en la posición
186 desplazó el perfil pH-actividad hacia un pH más
ácido. Este ejemplo confirma que el razonamiento aplicado a la
mutación E186Q es válido.
Ejemplo de referencia
C
La sustitución del ácido aspártico cargado
negativamente de la posición 255, que en realidad es un ligando de
unión de metal de la glucosa isomerasa, por una asparagina neutra,
da lugar a un desplazamiento del perfil
pH-actividad hacia un pH menor en presencia de
manganeso. El óptimo de pH se ve desplazado aproximadamente 2
unidades de pH hacia un pH más ácido.
El perfil pH-actividad se
presenta en la Figura 9.
Los mutantes de glucosa isomerasa que fueron
creados de acuerdo con los métodos descritos en la descripción
detallada de la invención fueron evaluados en relación a su perfil
pH-actividad en las condiciones indicadas en las
Figuras (10 a 20). El perfil pH-actividad de un
mutante es el resultado, por un lado, del efecto de la mutación
sobre el pK_{a} y, por otro, del efecto de la K_{as}.
\global\parskip0.970000\baselineskip
En las Figuras se presentan los resultados
correspondientes a los siguientes mutantes:
F254K (Fig. 10), F94R (Fig. 11), F61K (Fig. 12),
A25K (Fig. 13),
D57N (Fig. 14), L258K (Fig. 15), Q204K (Fig. 16),
R23Q (Fig. 17),
H54N (Fig. 18), H290N (Fig. 19), T95D (Fig.
20).
Para los mutantes en los que se introdujo una
carga positiva (F254K, F94R, F61K, A25K, L258K, Q204K) o en los que
se neutralizó una carga negativa (D57N), se puede observar que la
vertiente ácida del perfil pH-actividad está
desplazada hacia un pH menor.
Para los mutantes en los que se introdujo una
carga negativa (T95D) o en los que se neutralizó una carga positiva
(R23Q, H54N, H290N), se puede observar que el perfil
pH-actividad está desplazado hacia un pH mayor.
Estas dos observaciones están de acuerdo con el
modelo presentado en la descripción detallada de la invención.
Sin embargo, debería destacarse que los mutantes
en los que se ha sustituido un aminoácido conservado (F94R, D57N,
H54N) dan lugar a un descenso drástico de la actividad específica
con xilosa. En la posición 254 de la secuencia (Figura 2) sólo se
encuentran aminoácidos hidrofóbicos. La introducción de un
aminoácido cargado (F254K) en esta posición también conduce a un
descenso drástico en la actividad específica. De este modo, se
puede concluir que aunque se pueden usar posiciones de aminoácidos
(semi)conservadas para alterar las cargas con el fin de
modificar el perfil pH-actividad, no son posiciones
preferidas.
Los mutantes H290N y F61K proporcionan el
desplazamiento esperado en el perfil pH-actividad
tal como se describe en el Ejemplo 6. De estos mutantes, el H290N
fue inmovilizado como se describe en el documento
EP-A-351029 (Ejemplo 7). Se llevó a
cabo un ensayo de aplicación de la glucosa isomerasa natural y de
este mutante tal como se describe en la misma solicitud (Ejemplo
8). La estabilidad se indica mediante la constante de pérdida de
actividad de primer orden (k_{d}, cuanto más baja es la constante
de pérdida de actividad más estable es la enzima). La Tabla 2
proporciona los valores de k_{d} correspondientes a la glucosa
isomerasa natural y a la mutante.
K_{d} (x 10^{6} seg^{-1}) | ||
Natural | 2,5 | |
H290N | 3,1 | |
K253R | 0,7 | |
H290NK253R | 1,6 | |
F61KK253R | 1,4 |
Como puede observarse en la Tabla 2, el H290N se
ve desestabilizado en comparación con la glucosa isomerasa natural.
Se descubrió que el K253R estabilizaba a la glucosa isomerasa
natural por un factor superior a tres. El perfil
pH-actividad correspondiente al mutante K253R es
idéntico al de la enzima natural.
La combinación del mutante de pH H290N con el
mutante de estabilidad K253R demuestra que los mutantes de pH
pueden ser estabilizados introduciendo mutaciones que han demostrado
servir para estabilizar la enzima natural.
Además, la Tabla 2 muestra que el mutante de pH
F61K se ve estabilizado con respecto a la enzima natural después de
la introducción del K253R.
El desplazamiento ácido del perfil
pH-actividad del F61K se mantiene en el mutante
doble (Figura 21). Esto demuestra que las mutaciones que mejoran
diferentes propiedades de una enzima pueden ser combinadas en un
nuevo mutante que engloba las propiedades mejoradas de las
mutaciones individuales (un óptimo de pH mejorado y una estabilidad
mejorada, en este caso).
También debe entenderse que los ejemplos
anteriores pretenden demostrar el concepto de la invención, que se
define en las reivindicaciones. Debería quedar claro que las
combinaciones de las anteriores mutaciones con otras mutaciones que
conduzcan a características alteradas, por ejemplo termoestabilidad,
unión a metales o especificidad de sustrato, también quedan
cubiertas por la presente invención.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Claims (11)
1. Un método para alterar el perfil
pH-actividad de una enzima glucosa isomerasa natural
de tal modo que dicho perfil, o su vertiente ácida, es desplazado
hacia un pH menor, que comprende la sustitución de un residuo de
aminoácido cargado negativamente (Asp ó Glu) por uno neutro o por
uno cargado positivamente, o la sustitución de un residuo neutro
por uno cargado positivamente (Arg ó Lys), en el que dicha
sustitución se produce en una posición seleccionada del grupo que
consiste en:
Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258;
en el que dichos residuos de glucosa isomerasa
proceden de la Actinoplanes missouriensis, cuya
secuencia se muestra en la Figura 2, o de la posición
correspondiente de un glucosa isomerasa homóloga.
2. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la glucosa isomerasa natural se obtiene
de un microorganismo del orden de las Actinomicetales.
3. Un método de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la glucosa isomerasa natural se obtiene
de Actinoplanes missouriensis.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la glucosa isomerasa
contiene al menos una de las siguientes sustituciones de
aminoácidos: A25K, F61K, Q204K y L258K.
5. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la glucosa isomerasa es la isomerasa de
Actinoplanes missouriensis de la Figura 2 y contiene la
sustitución F61K+K253R.
6. Un proceso para obtener una molécula de
glucosa isomerasa mutante que comprende:
- (a)
- obtener una secuencia de ADN que codifique una glucosa isomerasa;
- (b)
- mutar dicha secuencia en las posiciones de nucleótidos seleccionadas para proporcionar una enzima alterada en cualquiera de las posiciones Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258 mediante una sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente (Asp ó Glu) por uno neutro o por uno cargado positivamente, o mediante la sustitución de un residuo neutro por uno cargado positivamente (Arg ó Lys).
- en el que dichos residuos de glucosa isomerasa proceden de Actinoplanes missouriensis, cuya secuencia se muestra en la Figura 2, o de la posición correspondiente de una glucosa isomerasa homóloga;
- (c)
- clonar la secuencia alterada en un vector de expresión de un modo tal que la secuencia de ADN pueda expresarse;
- (d)
- transformar un organismo o una célula hospedantes con dicho vector;
- (e)
- cultivar dicho organismo hospedante; y,
- (f)
- aislar la glucosa isomerasa alterada.
7. El proceso de la reivindicación 6, en el
que la glucosa isomerasa natural se obtiene a partir de un
microorganismo del orden de los Actinomycetales.
8. El proceso de la reivindicación 7, en el
que la glucosa isomerasa natural se obtiene a partir de
Actinoplanes missouriensis.
9. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la glucosa isomerasa contiene al
menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: A25K,
F61K, Q204K y L258K.
10. El proceso de la reivindicación 6, en el que
la glucosa isomerasa es la isomerasa de Actinoplanes
missouriensis de la Figura 2 y contiene la sustitución
F61K+K253R.
11. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, que además comprende el uso de la glucosa
isomerasa mutante para la producción de un jarabe de fructosa.
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