DE3441549A1

DE3441549A1 - Verbesserte mikroorganismenstaemme zur fermentativen herstellung von l-serin

Info

Publication number: DE3441549A1
Application number: DE19843441549
Authority: DE
Inventors: Gerald George Gaithersburg Lovinger, Md.; Susan Anne Columbia Whitehead, Md.
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1983-11-22
Filing date: 1984-11-14
Publication date: 1985-06-05
Also published as: IT8423457A1; IT8423457A0; NL8403540A; AU3560984A; GB2150135A; JPS60120996A; US4528273A; IT1177116B; SE8405868L; GB8428993D0; SE8405868D0; FR2555198A1

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Aminosäure L-Serin aus Glycin durch mikrobielle Fermentation. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verbesserung der Stammeigenschaften eines L-Serin bildenden Mikroorganismus im Hinblick auf die Bildung kommerzieller Mengen von L-Serin innerhalb kürzerer Zeit und mit einem Minimum an verunreinigenden Aminosäuren.

L-Serin ist eine nicht-essentielle Aminosäure, die in erster Linie als Diätzusatz bei parenteraler Ernährung verwendet wird. Die kommerzielle Herstellung von L-Serin findet durch Fermentation bestimmter Mikroorganismen statt, die L-Serin bilden und in der Fermentationsbrühe anreichern. Beispielsweise wird in der US-PS 4 183 786 ein Verfahren zur Umwandlung von Glycin in L-Serin beschrieben, bei welchem ein wäßriges Medium verwendet wird, das Glycin und mikrobielle Zellen einer Mutante von Nocardia butanica enthält. Desgleichen ist es aus der US-PS 3 623 952 bekannt, daß L-Serin durch Kultivieren bestimmter Stämme von Arthrobacter citreus, Brevibacterium helvolum, Corynebacterium sp. und Candida pulcherrima auf herkömmlichen Glycin enthaltenden Medien angereichert werden kann. Ferner beschreibt die US-PS 3 880 741, daß künstlich induzierte Mutanten von Corynebacterium glycinophilum, die leucin-, isoleucin-, methionin-, tryptophan-, serin- oder glycinbedürftig sind, L-Serin in höheren Ausbeuten aus Glycin bilden als der Elternstamm, der diese Nährstoffe nicht benötigt.

Glycin ist eine teure Vorstufe und ist schwer von L-Serin zu trennen. Aus diesem Grunde sind erhebliche Forschungsbemühungen unternommen worden, um die Rate und den Wirkungsgrad der Bioumwandlung zu verbessern und auf diese Weise die L-Serinausbeuten zu steigern und die nach der Fermentation verbleibende Menge des nicht umgewandelten Glycins zu senken.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verbesserung von L-Serin bildenen Mikroorganismen führt zu Fermentationen, die durch eine erhöhte Reaktionsrate und Unwandlungseffizienz sowie gesteigerte Produktausbeuten gekennzeichnet sind. Diese Ergebnisse beruhen auf einer Verbesserung des Mikroorganismen-Elternstammes durch Induktion von Mutationen, die die Mikroorganismen serindehydratase-negativ und resistent gegenüber mindestens einer der drei Aminosäuranalogen Serinhydroxamat, Methioninhydroxamat oder Glycinhydroxamat werden lassen.

Es ist die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizientes und ökonomisches Verfahren zur mikrobiellen Produktion von L-Serin zu schaffen.

5 Im Zusammenhang damit steht die Aufgabe der Erfindung, die bei Abschluß der Fermentation vorhandenen Mengen von nicht umgewandeltem Glycin durch Verbessern des Wirkungsgrades der Bioumwandlung von Glycin zu L-Serin zu senken.

In dem gleichem Zusammenhang steht die Aufgabe der Erfindung, die industrielle Produktivität und Effizienz zu steigern, indem die zum Erreichen der maximalen Anreicherung von L-Serin in der Brühe erforderliche Zeit gesenkt wird.

Zur Lösung dieser Grundaufgaben werden gemäß der Erfindung Mikroorganismenstämme, deren Fähigkeit zum Umwandeln von Glycin in L-Serin bekannt ist, durch aufeinanderfolgendes Einführen von auf chemischem und natürlichem Wege Mutationen verbessert, um die gewünschten Verbesserungen zu erhalten.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein mikrobielles Verfahren zur Bioumwandlung von Glycin in L-Serin zu schaffen, welches nicht auch gleichzeitig die Bildung signifikanter Mengen verunreinigender Aminosäuren zur Folge hat.

Darüber hinaus ist es Aufgabe der Erfindung, Stammverbesserungen zu induzieren, die die Tendenz der Mikroorganismen zum Abbauen von L-Serin senken.

Die Fermentation bestimmter Mikroorganismen in einem Glycin enthaltenden Medium hat die Anreicherung von L-Serin in der Fermentationsbrühe zur Folge. Die Bioumwandlung von Glycin in L-Serin schließt eine Aldolkondensation von Glycin und einer Ein-Kohlenstoff-Gruppe mit Hilfe des Enzyms Serinhydroxymethyltransferase (E.C. 2.1.2.1.) ein. Die Ein-Kohlenstoff-Gruppe kann in dem Medium vorhanden sein oder sie kann enzymatisch durch den Mikroorganismus gebildet werden. Die bei der Aldolkondensation beteiligten Cofaktoren sind Tetrahydrofolat und Pyridoxal-5-phosphat.

Um maximale Ausbeuten von L-Serin zu erhalten, werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen verwendet, bei denen die Steuerung der L-Serinbildung durch Induzieren von Resistenz gegenüber mindestens einer von drei Aminosäureanalogen gestört worden ist.

Zusätzlich wurde bei den erfindungsgemäßen Mikroorganismen der Serindehydratase einschließende L-Serin-Abbauweg zumindest zum Teil inaktiviert. Es wurde gezeigt, daß jeder dieser Aspekte die Reaktionsrate, Effizienz und/oder Ausbeute der Bioumwandlung von Glycin in L-Serin verbessert.

Ein als L-Serin-Bildner bekannter Stamm von Corynebacterium glycinophilum (auch als Corynebacterium sp. bekannt), bezeichnet als ATCC 21341, wurde von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 erhalten. Bei der Fermentation dieses Stammes in Schüttelkolben für einen Zeitraum von 6 Tagen wurden Mengen von 1,5 bis 2,0 g/l L-Serin erhalten. Durch die Sequenz von Verbesserungen des Stammes gemäß der Erfindung wurde die L-Serinbildung um das Vierfache bis zu Ausbeuten von etwa 8,0 oder mehr g/l gesteigert und die Fermentationszeit wurde auf etwa 4 oder 5 Tage verkürzt. In der nachfolgenden Beschreibung

PO und den Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der Verbesserung von Corynebacterium glycinophilum erläutert, aber das erfindungsgemäße Verfahren zur Stammverbesserung kann auch mit anderen L-Serin bildenden Mikroorganismen durchgeführt werden, um gesteigerte Raten, Ausbeuten und/oder Reaktionseffizienz bei der Umwandlung von Glycin in L-Serin zu bewirken.

Entsprechend einem Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Mutationen induziert, die eine Senkung des Abbaus des L-Serin-Endproduktes durch die Mikroorganismen zur Folge haben. Dieser L-Serin-Abbau vermindert signifikant die potentiellen Produktausbeuten in kommerziellen Fermentationsverfahren. Anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens können Mutanten hergestellt werden, die einen minimalen internen L-Serin-Verbrauch aufwei-

sen, so daß der größte Teil, wenn nicht das gesamte während der Fermentation gebildete L-Seriri in der Fermentationsbrühe verbleibt und aufgefangen und abgetrennt werden kann.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden geeignete Mikroorganismenstämme verbessert, indem man die metabolische Steuerung der Bildung von L-Serin aus Glycin stört. Diese Disregulation wird durch die Induktion

"10 von Mutationen ausgelöst, die die Resistenz der Mikroorganismen gegenüber hohen Konzentrationen der Hydroxamatderivate von Serin, Methionin und Glycin, betreffen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Stamm-Verbesserung haben sich nicht alle Analogen von L-Serin für die Steigerung der Fermentationsausbeuten von L-Serin als wirksam erwiesen. Es wurde gefunden, daß Resistenz gegenüber den drei angegebenen Verbindungen in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders wirksam ist.

Es wurde ferner gefunden, ' daß die Kombination dieser Eigenschaften in einem einzelnen Stamm die Produktausbeuten erheblich steigert. Das heißt, es können Mutanten hergestellt werden, die sowohl eine verminderte Abbau-Kapazität für L-Serin als auch Resistenz gegenüber hohen Konzentrationen von Methioninhydroxamat, Serinhydroxamat und/oder Glycinhydroxamat aufweisen. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß die Mutante gegenüber jeder dieser drei Analogen resistent ist.

Diese Stamm-Verbesserungen werden erzielt, indem man den gewählten Mikroorganismenstamm einer Folge von chemischen und spontanen Mutationen unterwirft, wobei verschiedene Mittel zur Ausübung eines Selektionsdruckes angewendet werden, um einen Stamm mit den gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Erfindungsgemäß verwendbare Mutagene schließen ultraviolettes Licht oder jegliche

chemischen Mutagene ein. Breitspektrum-Mutagene, wie ultraviolettes Licht oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin ("NG") lösen eine größere Zahl von Läsionen aus und haben demgemäß einen breiten und signifikanten Effekt auf die Eigenschaften der Mutante. Da jedoch die genetische Schädigung breit gestreut ist, ist die Tendenz dieser Mutagene zum Auslösen nachteiliger Veränderungen ebenfalls größer. Ort-spezifische Mutagene, wie Ethylmethansulfonat ("EMS"), bewirken verhältnismäßig mehr kontrollierte Mutationen sowie Mutationen eines bestimmten Typs, abhängig von dem verwendeten Mutagen. Die Dosierung oder das Expositionsniveau des jeweiligen gewählten Mutagens wird nach herkömmlichen Verfahren auf an sich bekannte Weise bestimmt.
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Bei der nachfolgend im einzelnen beschriebenen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird von einer bestimmten Sequenz von Mutationen Gebrauch gemacht, um den verbesserten Mikroorganismenstamm zu erzeugen. Zu- :0 nächst wird ein Breitspektrum-Mutagen (NG) zum Selektionieren eines serindehydratase-negativen Mutantenstammes verwendet. Es wird davon ausgegangen, daß die durch die Behandlung mit NG hervorgerufenen Läsionen die Mutantenstämme für spätere Mutationen bezüglich der Resi-

!5 stenz gegenüber Analogen prädisponieren. Als nächstes werden Mutanten ausgewählt, die auch resistent gegenüber den drei Hydroxamatderivaten sind, indem man entweder ein ort-spezifisches Mutagen wie EMS verwendet oder indem man sich auf spontane Mutation verläßt.

Diese Sequenz wird als die vorteilhafteste Art der Schaffung eines lebensfähigen Stammes mit den gewünschten Eigenschaften angesehen. In anderen Ausführungsformen kann es jedoch erwünscht sein, eine abgeänderte Selektionssequenz zu verwenden. Insbesondere kann eine geänderte Sequenz für die Induktion der Resistenzen

gegenüber den Hydroxamatanalogen erwünscht sein. Ferner kann es erwünscht sein, während des gesamten Verfahrensablaufs weniger starke ort-spezifische Mutagene zu verwenden.
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Als erster Schritt bei dem bevorzugten Verfahrensablauf wird ein Elternstamm ausgewählt, dessen Fähigkeit zur Umwandlung von Glycin in L-Serin bekannt ist. Beispielsweise kann jeder der in den US-PSen 4 183 786 und 3 62 3 9 52 offenbarten Mikroorganismen geeignet sein. Die Auswahl des Elternstammes liegt im Rahmen des Könnens eines Fachmannes.

Zum Auswählen einer Mutation, die die Serinhydratase-Negativität des Mikroorganismus auslöst, wird das folgende bevorzugte Verfahren verwendet. Eine gesunde Kultur des Elternstammes wird mit dem Mutagen NG behandelt. Mikroorganismen dieser Kultur werden auf einem Vollmedium, d.h. auf einem ein vollständiges Nährstoffspek-

^ trum bereitstellenden Medium ausgestrichen und bei herkömmlichen Temperaturen etwa 2 bis etwa 5 Tage lang inkubiert. Von diesem Medium werden einzelne Kolonien aufgenommen und auf Minimal- und Vollmedium übertragen, um Kolonien zu selektionieren, die nicht L-Serin als Stickstoffquelle abbauen. Das Minimalmedium enthält genügend Nährstoffe, um das Wachstum der Mikroorganismen zu unterhalten. In dem Vollmedium ist die Stickstoffquelle durch L-Serin ersetzt.

Nach Inkubieren dieser Platten für einen zum Nachweis des Wachstums oder des mangelnden Wachstums ausreichenden Zeitraum von etwa 1 bis etwa 7 Tagen, werden Klone ausgewählt, die zwar auf dem Minimalmedium aber nicht auf dem Vollmedium gewachsen sind. Diese Klone erweisen sich als Serindehydratase-negativ, d.h. sie sind un-

fähig, L-Serin zur Nutzung als Stickstoffquelle abzubauen. Es erscheinen zwar Klone in dem frühen Teil der Wachstumsperiode. Da jedoch nicht alle serindehydratase-negativen Klone auch L-Serin bildende Stämme sein werden, ist es bevorzugt, die Platten zumindest einige Tage lang zu inkubieren, um eine größere Menge von Klonen zu erzeugen, aus denen L-Serin-Überproduzenten ausgewählt werden können. Die das meiste L-Serin bildenden Klone werden für den nächsten Mutations- und Selektionszyklus ausgewählt.

Um Methioninhydroxamat-Resistenz hervorzurufen, wird eine mutagen-behandelte Zellpopulation auf einem festen Wachstumsmedium inkubiert, das Methioninhydroxamat in ausreichenden Mengen enthält, um das Wachstum der nicht-resistenten Mikroorganismen zu hemmen. Geeignete Methioninhydroxamatmengen betragen etwa 0,1 bis etwa 1,0 mg/ml Wachstumsmedium. Resistenz gegenüber Analogen kann entweder durch Spontanmutation oder durch Behandein des Organismus mit einem chemischen Mutagen oder ultraviolettem Licht vor dem Auftragen auf das das Analoge enthaltende Medium ausgelöst werden. Nach einer Inkubationszeit von etwa 3 bis 7 Tagen bei herkömmlichen Temperaturen weisen die Platten Kolonien auf, die resistent gegenüber Methioninhydroxamat sind.

Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sollten diese Kolonien ebenfalls serindehydratase-negativ sein. Um nachzuweisen, ob letztere Eigenschaft ebenfalls erworben wurde, kann es wünschenswert sein, die Kolonien nochmals, wie oben angegeben, auf Minimal- und Vollmedium auszustreichen. Wie zuvor werden die serindehydratase-negativen Kolonien auf dem Minimalmedium aber nicht auf dem Vollmedium wachsen.

Um Resistenz gegenüber Serinhydroxamat und Glycinhydroxamat hervorzurufen, werden die gleichen allgemeinen Verfahrensschritte verwendet wie zum Erzeugen der Resistenz gegenüber Methioninhydroxamat. Für die Resistenz gegenüber Serinhydroxamat betragen die geeigneten Serinhydroxamat-Konzentrationen etwa 0,1 bis etwa 1,0 mg/ml. Es zeigt sich jedoch, daß Mikroorganismen gegenüber Glycinhydroxamat eine höhere Sensitivität entwickeln. Es kann daher wünschenswert sein, niedrigere Glycinhydroxamat-Konzentrationen in dem Medium zu verwenden, um das Überleben einer angemessenen Anzahl von Klonen sicherzustellen. Es können beispielsweise Konzentrationen von etwa 0,01 bis etwa 0,8 mg/ml verwendet werden.

Es ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Mutationsablauf serielles Selektionieren von Mutanten des Elternstammes einschließt, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen, d.h. Mutanten, die serindehydratase-negativ ^un<3- resistent gegenüber mindestens einer der Aminosäureanalogen Serinhydroxamat, Glycinhydroxamat oder Methioninhydroxamat sind. "Serielles Selektionieren" soll erfindungsgemäß heißen, daß der bei dem jeweiligen Schritt des Verfahrensablaufs erhaltene Mutantenstamm in dem darauffolgenden Schritt verwendet wird. Das heißt, die induzierten Mutationen sollen kumulativ sein. Beispielsweise wird in der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die serielle Selektion der Mutanten wie folgt vorgenommen:

Stufe 1: Der Elternstamm wird mit dem Mutagen NG behandelt und serindehydratase-negative Mutanten ausgewählt.

Stufe 2: Die nach den Verfahren gemäß Stufe 1 erhaltenen Mutanten werden mit EMS behandelt, auf Methioninhydroxamat enthaltendem Medium angezogen, und die gegenüber Methioninhydroxamat resistenten Mutanten werden ausgewählt.

Stufe 3: Die nach den Verfahren gemäß Stufe 2 erhaltenen Mutanten wurden auf Serinhydroxamat enthaltendem Medium angezogen und die gegenüber Serinhydroxamat resistenten Mutanten werden ausgewählt.

Stufe 4: Die nach den Verfahren gemäß Stufe 3 erhaltenen Mutanten werden auf Glycinhydroxamat enthaltendem Medium angezogen und die gegenüber Glycinhydroxamat resistenten Mutanten werden ausgewählt.

Nach diesem seriellen Selektionsverfahren wurden Mutantenstämme erhalten, die serinhydratase-negativ waren und die ferner resistent gegenüber allen drei Aminosäurenanalogen (Methioninhydroxamat, Serinhydroxamat und Glycinhydroxamat) waren.

Hat man einmal die Stämme mit den gewünschten Eigenschaften erhalten, so können diese in Schüttelkolben oder Fermentern hinsichtlich ihrer L-Serin-Produktion untersucht werden. Auf diese Weise können einer oder mehrere verbesserte Stämme ausgewählt werden, die die gewünschte(n) Eigenschaft(en) aufweisen: Die größten Produktausbeuten, maximale Produktkonzentrationen innerhalb der kürzesten Fermentationszeit und/oder die beste Umwandlungseffizienz (d.h. resultierend in dem geringsten nicht umgewandelten Rest-Glycin).

Diese Testfermentation kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Das Kulturmedium kann jegliches Fermentationsmedium sein, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und, falls gewünscht, andere weniger bedeutende organische Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquelle können fermentierbare Zucker, Proteinhydrolysate und Proteine verwendet werden. Als Stickstoffquelle können Harnstoff, Ammoniumsalze organischer Säuren (beispielsweise Ammoniumacetat oder Ammoniumoxalat) und Ammoniumsalze anorganischer Säuren (beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumchlorid) geeignet sein. Die Mengen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in dem Medium betragen von 0,001 bis 20 Gew./Vol.%. Anorganische Bestandteile (beispielsweise Kaliumphosphat oder Magnesiumsulfat) und/oder Vitamine (beispielsweise Biotin oder Thiamin) können ebenfalls zugegeben werden.

Die herkömmlichen Fermentationstemperaturen betragen etwa 20 bis etwa 45 C, vorzugsweise etwa 26 bis etwa 34 C, abhängig von dem Mikroorganismus. Der pH-Bereich beträgt etwa 5 bis 8, vorzugsweise etwa 6,5 bis etwa 7,5. Die Fermentation ist in etwa 16 bis 17 6 Stunden vollzogen, in Flaschen typischerweise in 96 Stunden, pe wobei sich während dieser Zeit das L-Serin in der Fermentationsbrühe anreichert. Zellen und andere feste Bestandteile der Kultur können mit herkömmlichen Verfahren wie Filtrieren oder Zentrifugieren aus der Brühe beseitigt werden.

Bei Abschluß der Fermentation oder zu irgendeinem Zeitpunkt während der Fermentation können die L-Serintiter durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder nach jeglichem geeigneten Verfahren bestimmt werden.

„,_ Die Glycinkonzentrationen können ebenfalls bestimmt

werden. Anhand dieser Analysenergebnisse können der Klon oder die Klone mit den gewünschten Eigenschaften identifiziert werden.

Wird ein Mikroorganismus für die Fermentation im Laboratorium, in einer Pilotanlage oder für industrielle Fermentation ausgewählt, so kann die L-Serin-Produktion wesentlich gesteigert werden, indem man einen verbesserten Stamm mit den oben angegebenen Eigenschaften wählt.

Die zuvor beschriebenen und in den Beispielen angegebenen Verfahren für Testfermentationen geben geeignete Hinweise für die Herstellung von L-Serin mit den erfindungsgemäß verbesserten Mikroorganismen. Mutantenstamme von Corynebacterium glycinophilum wurden als Träger der bevorzugten Eigenschaften identifiziert: Verminderte Fähigkeit zum Abbau von L-Serin und Resistenz gegenüber Serinhydroxamat, Glycinhydroxamat und Methioninhydroxamat. Zwei dieser Mutanten wurden unwiderruflich bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 30852 ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit hinterlegt und als ATCC 39495 und ATCC 39496 bezeichnet. Wie zuvor angegeben, kann das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls verwendet werden, um andere L-Serin bildende Stämme in gleicher Weise zu verbessern.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert. Die folgenden Abkürzungen wurden bei der Beschreibung der Erfindung verwendet:

EMS - Ethylmethansulfonat

HPLC - Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
NG - N-Methyl-N¹-nitro-N-nitrosoguanidin
UpM - Umdrehungen pro Minute

Die in den Beispielen verwendeten Kulturmedien wurden wie folgt hergestellt:

A. Nitrosoguanidin-Mutationsmedium

Glucose 0,5 %

Pepton 1,0 %

Fleischextrakt 1,0 %

NaCl 0,5 %

Hefeextrakt 0,5 %

Agar 2,0 %

entionisiertes Wasser 94,5 %

Die aufgeführten Bestandteile wurden bis zum Sieden erhitzt und anschließend bei 121 C 15 Minuten lang -| 5 dampf sterilisiert. Die sterile Mischung wurde in Petrischalen gegossen und erstarren gelassen.

Serin- Impfmedium	3,00 %
Glucose	0,30 %
(NH₄)₂SO₄	0,16 %
K₂HPO₄	0,04 %
KH₂PO₄	0,05 %
MgSO₄ · 7H₂O	0,50 %
Hefeextrakt	2,00 %
Pepton	93,95 %
entionisiertes Wasser

Die aufgeführten Bestandteile wurden vermischt und das Medium wurde bei 121°C 20 Minuten lang autoklaviert.

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C. Luria-Brühe

Bacto-Trypton (Difco) 10,0 g

Bacto-Hefeextrakt (Difco) 5,0 g

NaCl 10,0 g

1,0 NaOH 1,5 ml

Wasser zusammengegeben und bei 121 C 15 Minuten lang

Die Bestandteile wurden in einem Liter entionisiertem Wasser zusammengec
dampfsterilisiert.

D. Serin-Produktionsmedium

Glucose	50,00 g/l
(NH₄)₂SO₄	2,00 g/l
NH₄NO₃	3,00 g/l
KH₂PO₄	1,00 g/l
MgSO₄ · 7H₂O	0,50 g/l
Glycin	20,00 g/l
L-GIutaminsäure	0,50 g/l
L-Methionin	0,50 g/l
L-Valin	0,50 g/l
CaCO₃	25,00 g/l
Biotin	0,2 0 gm/1
Thiamin-HCl	1,00 mg/1
Riboflavin	2,00 mg/1
Folsäure	1,00 mg/1
Calciumpantothenat	1,00 mg/1
Nicotinamid	1,00 mg/1
Pyroxidin	1,00 mg/1
Pyridoxal	0,20 mg/1
PABA	1,00 mg/1

Die ersten neun der aufgeführten Bestandteile wurden in den je Liter angegebenen Mengen entionisiertem Wasser vermischt und 12 Minuten lang bei 112 C autoklaviert. Das CaCO, wurde getrennt 15 Minuten lang bei 112 C autoklaviert. Die verbleibenden Bestandteile wurden vermischt, durch Filtrieren sterilisiert und zusammen mit dem CaCO₃ dem abgekühlten Medium zugefügt.

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E. Modifiziertes Serin-Produktionsmedium

Dieses wurde in gleicher Weise hergestellt wie das Serin-Produktionsmedium, mit dem Unterschied, daß 3,0 % Glucose anstelle von 5 % Glucose verwendet wurden.

F. Serinproduktionsminimalmedium

Glucose	O₄	0,500 %
(NH₄) S		0,200 %
KH₂PO₄		0,150 %
K₂HPO₄	7H₂O	0,050 %
MgSO₄ ·		0,050 %
NaCl	7H₂O	0,010 %
FeSO₄ ·	4H₂O	0,001 %
MnSO₄ ·	2H₂O	0,001 %
CaCl₂ ·		0,001 %
Biotin	Thiamin-HCl	100 pg/l
	Agar	1,0 mg/1
	2,000 %

Die Bestandteile wurden in einem Liter entionisiertem Wasser bis zum Sieden erhitzt und 15 Minuten lang bei 121°C autoklaviert. Die Mischum
gegossen und erstarren gelassen.

121°C autoklaviert. Die Mischung wurde in Petrischalen

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G. Serin-Produktionsvollmedium

Dieses wurde in gleicher Weise wie das Serin-Produktionsminimalmedium hergestellt, mit dem Unterschied, daß 0,2 % L-Serin anstelle von 0,2 % (NH₄KSO₄ verwendet wurden.

Beispiel 1

Ein Impfösenfüllung Corynebacterium glycinophilum (a.k.

Corynebacterium sp.) ATCC 21341 wurde von einer gekühlten Nähragar (Difco)-Schrägkultur in 5,0 ml Luria-Brühe in einem 20 ml Reagenzglas überimpft. Das Reagenzglas wurde 24 Stunden lang bei 32 C inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert und in einem Reagenzglas gewaschen mit und resuspendiert in 10 ml 0,IM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) .

N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin ("NG") wurde bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml zu den suspendierten Zellen gegeben. Die NG-Zellen-Puffer-Mischung wurde 30

-15 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Zellen wurden anschließend mit 10 ml Puffer gewaschen, zentrifugiert und weitere 5 Male mit dem Puffer gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 5,0 ml Puffer resuspendiert. Anschließend wurden Teilmengen von 100 μΐ der suspendierten Zellen auf ' Nitrosoguanidin-Mutationsmedium-Platten verteilt. Die Platten wurden 2 Tage lang bei 30°C inkubiert.

Einzelne Kolonien wurden von diesen Platten auf Serin-Produktionsminimalmedium- und Serin-Produktionsvollmedium-Platten übertragen, um die Fähigkeit zur Verwertung von L-Serin als Stickstoffquelle bei jeder Kolonie zu untersuchen. Es wurde ein als SWSER-I bezeichneter Klon identifiziert, der auf dem Minimal- aber nicht auf dem Vollmedium wuchs. Dieser Klon wies eine Mutation auf, die seine verminderte Fähigkeit zum Abbau von L-Serin ausgelöst hatte .

Der Klon SWSER-I wurde 2 Tage lang bei 30⁰C und 26 0 UpM in 5,0 ml Serin-Impfmedium angezogen. Eine Teilmenge von 2,0 ml wurde in 50 ml Serin-Produktionsmedium in einem glattwandigen 250 ml Erlenmeyer-Kolben überführt und 5 Tage lang bei 30°C und 125 UpM angezogen. Dieses Verfahren wurde parallel mit dem Elternstamm ATCC 21341 durchgeführt. Am Ende dieser Zeit wurden Proben der Fermentationsbrühe jedes Stammes mit HPLC analysiert. Der Klon SWSER-I hatte 4,4 mg/ml L-Serin und der Elternstamm ATCC 21341 1,6 mg/ml L-Serin gebildet.

Beispiel 2

Eine frische Nähragar-Schrägkultur des Klons SWSER-I wurde mit 10 ml 0, IM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die resultierende Suspension wurde in ein steriles 20 ml Corning (TM)-Zentrifugenglas überführt. Zu der Suspension wurde Ethylmethansulfonat (EMS) bis zu einer Konzentration von 0,06M EMS in der Zellsuspension gegeben. Die Suspension wurde aufgewirbelt, um die Zellen mit dem Mutagen zu vermischen und anschließend 18 Stunden lang bei 30⁰C inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Zellen abzentrifugiert, zweimal mit 10 ml 0,1M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und in 10 ml Puffer resuspendiert. Bei jedem Waschvorgang wurden die Zellen in saubere Reagenzgläser überführt, um jegliches an den Reagenzglaswänden haftende Mutagen zu beseitigen. Die Suspension der gewaschenen Zellen wurde in Teilmengen von 100 μΐ auf Nähragarplatten verteilt, die 0,5 mg/ml des Aminosäureanalogen Methioninhydroxamat enthielten. Diese Platten wurden 5 Tage lang bei 30⁰C inkubiert. Kolonien, die auf den Methioninhydroxamat enthaltenden Platten wuchsen, verfügten über die gewünschte Mutation(en) betreffend die Resistenz gegenüber diesem Analogen.

Eine dieser Kolonien, bezeichnet als SWSER-1-23 wurde für die L-Serinproduktion ausgewählt. Sie wurde 24 Stunden lang bei 30⁰C und 260 UpM in 5,0 ml Serin-Impfmedium angezogen. Teilmengen von 2,0 ml wurden anschließend in glattwandige 250 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, die 50 ml Serin-Produktionsmedium enthielten, und diese wurden 6 Tage lang bei 30⁰C und 125 UpM inkubiert. Parallel wurde dieses Verfahren mit dem Klon SWSER-I durchgeführt. Gemäß HPLC-Analyse enthielt die Fermentationsbrühe von SWSER-1-23 4,8 mg/ml L-Serin und die Brühe des SWSER-I 3,3 mg/ml L-Serin.

Beispiel 3

Eine Nähragar-Schrägkultur des Klons SWSER-1-23, des in Beispiel 2 erhaltenen Stammes, wurde gewaschen mit und resuspendiert in 10 ml 0,IM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0). Die Suspension wurde in Teilmengen von 100 μΐ auf Nähragarplatten verteilt, die 0,5 mg/ml Serinhydroxamat enthielten.

Die Platten wurden 5 Tage lang bei 30⁰C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde auf der Platte signifikantes Wachstum festgestellt, ein Hinweis darauf, daß der Klon SWSER-1-23 eine Mutation enthielt, die ihm Resistenz gegenüber Serinhydroxamat verlieh.

Beispiel 4

Eine Nähragar-Schrägkultur des Klons SWSER-1-23, des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Stammes, wurde mit 10 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden Teilmengen von 100 μΐ der Zellsuspension auf Serin-Produktionsminimalmedium-Platten verteilt, die 0,5 mg/ml GIycinhydroxamat enthielten. Die Platten wurden 5 Tage

lang bei 30 C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit stellten die auf der Platte wachsenden Kolonien Stämme dar, bei denen eine Spontanmutation stattgefunden hatte, die ihnen Resistenz gegenüber Glycinhydroxamat ausgelöst hatte.

Zwei dieser Kolonien, bezeichnet als SWSER-1-23-18 (jetzt ATCC 39495) und SWSER-1-23-20 (jetzt ATCC 39496) wurden über Nacht bei 31°C in 5,0 ml Serin-Impfmedium angezogen. Die Kulturen wurden anschließend in 50 ml Serin-Produktionsmedium überführt und 6 Tage lang bei 31°C und 300 UpM inkubiert. Dies Verfahren wurde parallel mit dem Klon SWSER-1-23 durchgeführt. Gemäß HPLC-Analyse enthielt die Fermentationsbrühe von SWSER-1-23-18 (ATCC 39495) 4,8 mg/ml L-Serin, die Brühe von SWSER-1-23-20 (ATCC 39496) 5,2 mg/ml L-Serin und die Brühe von SWSER-1-23 2,7 mg/ml L-Serin.

Beispiel 5

Eine Nähragar-Schrägkultur des Klons SWSER-1-23-20 (ATCC 39496) wurde mit 10,0 ml 0,1M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Teilmengen von 2,5 ml der resultierenden Zellsuspension wurden in glattwandige 250 ml Erlenmeyer-Kolben überführt, die 50 ml Serin-Impfmedium enthielten. Die Kolben wurden über Nacht bei 31°C und 260 UpM inkubiert. Anschließend wurden 2,0 ml der Impfkultur in 50 ml modifiziertes Serin-Produktionsmedium in einem glattwandigen 250 ml Erlenmeyer-Kolben überimpft. Der Kolben wurde 5 Tage lang bei 31°C und 260 UpM inkubiert, wobei bei 48 und 74 Stunden 1 % Glucose zugegeben wurden. Mit HPLC-Analyse wurde ein Titer von 8,8 mg/ml Serin am Ende der 5-tägigen Fermentationszeit erhalten.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Verbesserung eines zum Umwandeln von Glycin in L-Serin fähigen Mikroorganismenstammes, dadurch gekennzeichnet, daß man Mutationen in den Stamm einführt, welche zur Ausprägung der folgenden Eigenschaften bei den Mikroorganismen führen:
(1) Serindehydratase-Negativität und (2) Resistenz gegenüber mindestens einem der Aminosäureanalogen (a) Serinhydroxamat, (b) Glycinhydroxamat oder (c) Methioninhydroxamat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die gewählten Eigenschaften durch serielles Selektionieren von Mutanten eines Elternstammes in beliebiger Reihenfolge schafft, wobei man Selektionen aus der folgenden Gruppe vornimmt:

A. Selektion einer Mutante, die durch Serindehydratase-Negativität gekennzeichnet ist,

B. Selektion einer Mutante, die durch Resistenz gegenüber Serinhydroxamat gekennzeichnet ist,

C. Selektion einer Mutante, die durch Resistenz gegenüber Glycinhydroxamat gekennzeichnet ist und

D. Selektion einer Mutante, die durch Resistenz gegenüber Methioninhydroxamat gekennzeichnet

ist,

und wobei Selektion A eine der gewählten seriellen Selektionen sein muß.

PO

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine der Mutationen durch Behandlung mit einem der chemischen Mutagene Ethylmethansulfonat und N-Methyl-N¹-nitro-N-nitrosoguanidin induziert.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Selektion A durchführt, indem man
(a) Kolonien auf eine Minimalmedium-Platte überträgt,

(b) die Kolonien auf eine Platte aus einem Medium

aufträgt, das mit dem der Stufe a übereinstimmt, mit dem Unterschied, daß es L-Serin anstelle der Stickstoffquelle enthält,
(c) die in den Stufen a und b gewonnenen Platten etwa 1 bis etwa 7 Tage lang bei etwa 20 bis

45 C inkubiert und

(d) Kolonien auswählt, die auf der Platte aus Stufe a aber nicht auf der Platte aus Stufe b gewachsen sind.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Selektion B durchführt, indem !nan
(a) Zellen auf ein festes Wachstumsmedium ausstreicht, das etwa 0,1 bis 1,0 mg/ml Serinhydroxamat enthält
(b) die Platte aus Stufe a bei etwa 20 bis 45°C

etwa 1 bis etwa 7 Tage lang inkubiert und
(c) Kolonien auswählt, die auf dieser Platte gewachsen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Selektion C durchführt, indem man
(a) Zellen auf ein festes Wachstumsmedium ausstreicht, das etwa 0,01 bis 0,8 mg/ml Glycinhydroxamat enthält,
(b) die Platte aus Stufe a bei etwa 20 bis 45°C

etwa 1 bis 7 Tage lang inkubiert und
(c) Kolonien auswählt, die auf dieser Platte gewachsen sind.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Selektion D durchführt, indem man
(a) Zellen auf ein festes Wachstumsmedium ausstreicht, das etwa 0,1 bis etwa 1,0 mg/ml Methxonxnhydroxamat enthält,
(b) die Platte aus Stufe a bei etwa 20 bis 45°C

etwa 1 bis etwa 7 Tage lang inkubiert
(c) Kolonien auswählt, die auf dieser Platte gewachsen sind.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man sämtliche vier Selektionen A, B, C und D durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Selektion A als erste serielle Selektion wählt und N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin bei der Durchführung der Selektion A als Mutagen verwendet.

10. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen verbesserten Stamm eines zum Umwandeln von Glycin in L-Serin fähigen Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen kultiviert, wobei der verbesserte Stamm durch die Eigenschaften (1) Serindehydratase-Negativität und (2) Resistenz gegenüber mindestens einem der Aminosäureanalogen Serinhydroxamat, GIycinhydroxamat und Methioninhydroxamat charakterisiert ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das während der Fermentation in dem Medium angereicherte L-Serin aus dem Medium gewinnt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur von 20 bis 45 C und einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 8 etwa 16 bis 176 Stunden lang durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der verbesserte Stamm ein Stamm von Corynebacterium glycinophilum ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, aadurch gekennzeichnet, daß der verbesserte Stamm die Identifizierungseigenschaften von ATCC 39495 oder ATCC 39496 aufweist.

15. Verbesserter Stamm eines L-Serin bildenden Mikroorganismus, gekennzeichnet durch (1) Serindehydratase-Negativität und (2) Resistenz gegenüber mindestens einem der Aminosäureanalogen Serinhydroxamat, Glycinhydroxamat und Methxoninhydroxamat.

16. Verbesserter Stamm nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Resistenz gegenüber mindestens einem der Analogen aufweist, wenn das Analoge bei Serinhydroxamat oder Methxoninhydroxamat in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 1,0 mg/ml bei Glycinhydroxamat oder von etwa 0,01 bis etwa 0,8 mg/ml vorhanden ist.

17. Verbesserter Stamm nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm resistent gegenüber sämtlichen drei Analogen ist.

18. Verbesserter Stamm nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er der Gattung Corynebacterium angehört.

19. Verbesserter Stamm nach Anspruch 18, ausgewählt aus Corynebacterium glycinophilum ATCC 39 49 5 und Corynebacterium glycinophilum ATCC 39496.

20. Verwendung der nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 13 hergestellten Mikroorganismenstämme zur Herstellung von L-Serin aus Glycin.

21. Verwendung von Corynebacterium glycinophilum ATCC 3949 5 und/oder Corynebacterium glycinophilum ATCC 39496 zur Herstellung von L-Serin aus Glycin.