DE3320653A1 - Fermentatives verfahren zur herstellung von l-leucin - Google Patents
Fermentatives verfahren zur herstellung von l-leucinInfo
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Description
Die fermentative Herstellung von L-Leucin, L-Valin und anderen Aminosäuren war bereits Gegenstand umfangrei-.
eher Forschungsarbeiten. Dabei sind zahlreiche Mikroorganismengattungen
zusammen mit verschiedenen Aminosäureanalogen angewandt worden. Aus der US-PS 3 865 690 ist
die Herstellung von L-Leucin durch Züchtung eines gegenüber einem Leucinantagonisten resistenten Stammes von
Brevibacterium oder Corynebacterium bekannt. Aus der
US-PS 3 970 519 ist die Züchtung von Stämmen der gleichen
Gattung in Gegenwart verschiedener Aminosäuren zur Herstellung von L-Leucin bekannt. Aus der US-PS
3 893 888 ist bekannt, daß L-Valin von mutanten Stämmen von Brevibacterium gebildet werden kann, die gegenüber
a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (AHV) resistent sind.
Ferner beschreibt die US-PS 3 668 073 die Herstellung von L-Leucin unter Verwendung eines Mikroorganismus der
Gattung Corynebacterium in Gegenwart eines "Promotors" für Isoleucin, Methionin, Phenylalanin oder Valin, wie
beispielsweise Azaleucin oder AHV. Azaleucin ist ebenfalls als Analoges für die Herstellung von L-Leucin
verwendet worden, vgl. Wang et al. "Fermentations und Enzym-Technologie", John Wiley und Söhne, Inc., 1979,
Seiten 18 bis 20. Die US-PS 3 759 789 beschreibt die Verwendung von Arthrobacter alkanicus-Kultüren, welche
gegenüber L-Threonin resistent sind. L-Leucin- und L-Isoleucin-precurser können zugegeben werden, um die
Ausbeute zu verbessern.
Die nachfolgend genannte Literatur ist relevant:
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I* ft · * · »θ
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10
10
9. Kisumi, M., S. Komatsubara and I. Chibata. (1977)
Syntheseweg der Isoleucinbildung aus Pyruvat durch enzymatische Leucinbiosynthese bei Leucin-akkumulierenden
Isoleucinrevertanten von Serratia marces-
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10. Kisumi, M., J. Kato, S. Komatsubara, I. Chibata. (1973) Bildung von Isoleucin, Valin und Leucin
durch Regulations-Mutanten von Serratia marcescens. "Genetics of Industrial Microorganismus - Bacteria".
11. Rogerson, Α., and M. Freundlich. (19 69). Steuerung
der Isoleucin-, Valin- und Leucinbiosynthese. VIII. Mechanismus der Wachstumshemmung durch Leucin bei
Relaxed- und Stringent-Stämmen von Escherichia coli K-12. Biochimica et Biophysica Acta, BRA 26302.
Ferner wurden allgemeine Artikel über Biosynthesewege für L-Leucin ebenso wie für andere Aminosäuren veröff"entlicht,
vgl.:
12. Szentirmai, A. and I. Horvath. (1976). Regulation
der Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren. Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung., 23, 137-149.
— D ""
13. Umbarger, H. E. (1974). Die bei der multivalenten
Regulation der enzymatischen Biosynthese von Isoleucin und Valin bei Enterobacteriaceaen beteiligten
Elemente. Proceedings of the 1st. Intersectional Congress of IAMS, ]L, Tokyo.
14. Umbarger, H.E. (1973). Genetische und physiologische
Regulation der enzymatischen Biosynthese von Isoleucin, Valin und Leucin bei Enterobacteriaceaen.
"Genetics of Industrial Microorganisms."
15. Umbarger, H.E. (1978). Aminosäurebiosynthese und
ihre Regulation. Ann. Rev. Biochem., AJ_, 533-606,
563.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin durch Züchtung von gegenüber einem Analogen
von L-Leucin resistenten Stämmen von Arthrobacter citreus unter aeroben Bedingungen.
Für die Mutation ausgewählte Wildstämme von Arthrobacter citreus (beispielsweise ATCC 17775) sind durch eine
Überproduktion von Glutaminsäure gekennzeichnet. Der Biosyntheseweg, auf dem Mikroorganismen L-Leucin bilden
ist allgemein bekannt, vgl. Umbarger, "Aminosäurebiosynthese
und ihre Regulation", Ann. Rev. Biochem. 1978, 47, 563-565. Wie in dieser Literaturstelle angegeben
ist, nimmt man an, daß die Synthese über folgende Stufen verläuft: Pyruvat, ot-Acetolactat, α ,ß-Dihydroxyisovaleriat,
a-Ketoisovaleriat, a-Isopropylmalat, ß-Isopropylmalat,
a-Ketoisocapronat, L-Leucin.
Bestimmte Analoge der natürlich auftretenden Aminosäuren eignen sich zur Isolierung der erfindungsgemäßen
mutanten Stämme. Diese Analogen sind für Stämme
toxisch, welche keine Überproduktion von L-Leucin haben. Beispiele für derartige Analoge sind a-Amino-ßhydroxyvaleriansäure,
D-Leucin, a-Aminoisoamylsulfonsäure,
Norvalin, Norleucin, Methallylglycin , a-Amino-ßehlorbuttersäure,
Valin, a-Chlorleucin, Isoleucin,
ß-Hydroxynorleucin, ß-Hydroxyleucin, Cyclopentenalanin,
3-Cyclopenten-l-alanin, 2-Amino-4-methylhexensäure,
5',5",5'-Trifluorleucin, 4-Azaleucin.
Die gegenüber Leucinanalogen resistente Mutante kann
durch ultraviolette Bestrahlung eines Wildtypstammes von Arthrobacter citreus oder durch Behandlung des WiIdstairanes
mit einer inutagenen Substanz wie beispielsweise Ethylmethansulfonat, N-Methyl-N,-nitro-N-nitrosoguanidin
usw. erhalten werden. Anschließend kann der Stamm in Gegenwart des Analogen angezogen werden, um die
Kolonien mit L-Leucin-Überproduktion zu isolieren.
Eine lebensfähige Kultur einer L-Leucin erzeugenden Mutante von Arthrobacter citreus, die gegenüber Azaleucin
(Produkt aus Beispiel 1) resistent ist, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn
Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Nr. ATCC 39103 hinterlegt. Auf die gleiche Weise wurde eine
Kultur des Produktes aus Beispiel 2 unter der Nr. ATCC 39106 hinterlegt.
Die Fermentation der isolierten Mutanten von Arthrobacter
citreus kann durch Schüttelkultivierung oder submerse Fermentation unter aeroben Bedingungen bewirkt werden.
Die Fermentation wird bei 25 bis 40° C und einem pH-Wert von 5 bis 8 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5) durchgeführt.
Für die Einstellung des pH-Wertes des Mediums können Calciumcarbonat und/oder Ammoniak verwendet werden.
Alternativ können Morpholinsulfonsäurederivate
verwendet werden, vgl- Beispiel 1. Das Fermentationsmedium
enthält eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie weitere Elemente. Zur Fermentation geeignete
Kohlenstoffquellen schließen fermentierbare Zucker, Proteinhydrolysate
und Proteine ein. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniumsalze von
organischen Säuren (beispielsweise Ammoniumacetat und Amoniumoxalat) und Ammoniumsalze anorganischer Säuren
(beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder
-IO Ammoniumchlorid). Die Mengen der Kohlenstoff- und Stickstoff
quellen in dem Medium betragen von 0,001 bis 20 % (Gew./Vor). Auch organische Nährstoffe (beispielsweise
Maisquellwasser, Pepton, Hefeextrakte, Sojabohnenextrakte)
und/oder anorganische Elemente (beispielsweise
Ι 5 Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Vitamine wie Biotin
und Thiamin und Aminosäuren, z.B. Valin) können dem Medium zugefügt werden. Die Fermentation ist innerhalb
von 16 bis 17 6 Stunden beendet, wobei L-Leucin in der Fermentationsbrühe angereichert wird.
Nach Abschluß der Fermentation, d.h. nachdem sich 0,1 bis 0,8 % (Gew./Vol.) L-Leucin in der Brühe angesammelt
haben, werden die Zellen und andere feste Bestandteile der Kultur nach herkömmlichen Verfahren aus der Fermentationsbrühe
entfernt, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Zur Gewinnung und/oder Reinigung des L-Leucins
aus dem Filtrat oder dem Überstand können bekannte Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann die
filtrierte Fermentationsbrühe mit einem starken Kationenaustauscherharz behandelt werden. Das Harz wird
anschließend mit einer verdünnten alkalischen Lösung, z.B. wäßrigem Ammoniak, eluiert. Die L-Leucin enthaltenden
Eluate werden vereinigt und eingeengt. Zu der konzentrierten Lösung wird ein Alkanol wie Methanol oder
Ethanol gegeben. Die ausgefällten Kristalle können aus
einem wäßrigen Alkanol wie wäßrigem Methanol oder wäßrigem Ethanol umkristallisiert werden, um reine Kristalle
von L-Leucin zu erhalten.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen
erläutert.
EMS-Mutation und Resistenz gegenüber niedrigen
Konzentrationen von Azaleucin
Konzentrationen von Azaleucin
Eine frische Schrägkultur von Arthrobacter citreus (ATCC 17775) wurde mit 0,1 molarem Kaliumphosphatpuffer
gewaschen. Die gebildete Zellsuspension wurde in ein
steriles Teströhrchen dekantiert, zu dem eine ausreichende Menge Ethylmethansulfonat (EMS) gegeben wurde,
um eine 0,05 molare Konzentration zu erhalten. Das Röhrchen wurde 18 Stunden bei 30° C inkubiert. Die Zellsuspensionen
wurden anschließend zentrifugiert, der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in frischem Puffer
resuspendiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen zum Beimpfen eines das folgende Medium (Medium
E) enthaltenden Röhrchens verwendet. Es wurde 10 %iges Inokulat verwendet.
- ίο -
Glucose
NH4Cl Harnstoff
K2HPO4 KH2PO4
MgSO4 · 7H2O
Biotin Thiamin HCl
3-(N-Morpholin)-propansulfonsäure (i.e. "MOPS",
Sigma Chemical Company)
Spurenelementlösung (siehe unten)
Medium E | /5 | g |
,5 | g | |
,5 | g | |
Je Liter entionisiertes H2° |
g | |
50 | g | |
5 | ,9 | g |
5 | . μ9 | |
0 | mg | |
0 | . g | |
0 | ml | |
100 | ||
1 | ||
20 | ||
1 | ||
Der pH-Wert des Mediums wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt.
Das Medium wurde 15 Minuten bei 112° C autoklaviert. Zur Herstellung von Medium E Agar wurden X5 g/l
20 Agar Nobel (Difco) zu der Medium Ε-Lösung gegeben.
- 11 -
Die Spurenelementlösung setzte sich wie folgt zusammen;
ZnSO
FeSO4 · 7H2O CuSO4 · 5H£0
Na2B4O7 · 10H2O
Na2Mo2O4 · 2H2O
MnSO4 · H2O
CoCl2 · 6H2O
CaCl
Je Liter entionisiertes
Wasser
Wasser
8,8 gm
10,0 gm
60 mg
88 mg ' |
53 mg
7,5 gm
120 mg ;
55 mg
Der pH-Wert der Spurenelementlösung wurde mit H„S0. auf
2 eingestellt und die Lösung in einer dunklen Flasche bei etwa 2 bis 0° C aufbewahrt.
Die Zellen wurden 17 Stunden bei 30° C in einem Gyrotary-Schüttler
bei 300 Upm inkubiert und anschließend auf Medium E Agar (modifiziert - nur 2 % Glucose, der
pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren auf 7,8 eingestellt), zu dem nach dem Autoklavieren unterschiedliche
Mengen (d.h. von 0,2 bis 10 g/l) Azaleucin gegeben worden waren, plattiert. Die Platten wurden bei 30° C
inkubiert. Wenn sich Kolonien bildeten (z.B. nach etwa 2 bis 4 Inkubationstagen) wurden diese auf frische
Medium E Agarplatten übertragen.
Die isolierten Azaleucinkulturen wurden in Röhrchen mit
Medium E und Isoleucinmedium 5 überimpft und 3 Tage bei 30° C und 300 Upm inkubiert.
Per Liter E.I.— H-O
Glucose 100 g
(NH)2SO4 50 g
MgSO4 · 7H2O 0,4 g
CaCO3 50 g
KH2PO4 3 g
2/
Bacto-soytone—' 0,6 g ·
Biotin 100 yg
Thiamin HCl 1 mg
Spurenelementlösung 1 ml
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,8 eingestellt. 15
—D.I. = entionisiert
2/
— Ein enzymatisches Hydrolysat aus Sojabohnenmehl, vertrieben
von Difco Laboratories, Inc.
0 Eine isolierte Kultur mit der Bezeichnung 17775/14,
resistent gegenüber 4 g/l Azaleucin, lieferte 4,56 g/l Leucin in Isoleucinmedium 5, bestimmt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC).
5 Für die HPLC-Analyse wurden die Aminosäuren in ihre
Dansylderivate (siehe unten) überführt, anschließend getrennt und jede Komponente.nach Standardverfahren quantitativ
analysiert. Das nachfolgende Verfahren gibt die Umsetzung der Aminosäuren zur HPLC-Analyse an:
Dansylchlorid (l-Dimethylaminonaphthalen-5-sulfonylchlorid)
reagiert mit der Aminogruppe von Aminosäuren. Die Dansylderivate können durch Flüssigchromatographie getrennt
und durch Ultraviolettabsorption nachgewiesen werden.
Die folgenden Reagenzien wurden bei der HPLC-Analyse
verwendet:
■ " .
1. Puffer: Es wurden 2,956 g Lithiumcarbonat in einen
1-Liter-Kolben eingewogen und mit destilliertem Wasser bis zu der Markierung aufgefüllt. Der pH-Wert
wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 9,5 eingestellt.
2. Dansylchloridlösung: 75 mg Dansylchlorid wurden in
einen 25 ml Meßkolben eingewogen und bis zur Markierung mit Acetonitril aufgefüllt.
20
3. Löscher: 5,0 g Methylaminhydrochlorid wurden in
einen 250 ml Meßkolben eingewogen und mit destilliertem Wasser bis zur Markierung aufgefüllt.
4. Essigsäure
5. Aminosäurestandard H (Pierce Chemical Co., Kat. No.
20088).
6· Triethylamin
8. Lösungsmittelmischung: 877 ml destilliertes Wasser
100 ml Methanol
14 ml Essigsäure
20 ml Tetrahydrofuran
1,7 ml Triethylamin.
o 0
."..'·. .--.■ .·■-"■" oozuuüo
- 14 -
Verfahren
A. Herstellung der Standardlösungen
A. Herstellung der Standardlösungen
1. Unter Verwendung einer Mikrospritze wurden jeweils 50, 100 und 200 μΐ des Pierce Aminosäurestandards
in 5 ml Meßkolben überführt.
2. Die 5 ml Meßkolben wurden in einen Vakuumexsiccator
gebracht und unter Vakuum bis zur Trockne evaporiert (gewöhnlich wird dazu 1 Nacht benötigt).
3. In jeden Meßkolben wurden 2,0 ml Puffer (Reagenz 1 siehe oben) pipettiert.
4. In jeden Meßkolben wurden 1,0 ml Dansylchlorid (Reagenz 2 siehe oben) pipettiert.
5. Es wurde gründlich gemischt und die Kolben 30 Minuten in ein Wasserbad von 30 C gesetzt.
6. Zu jedem Meßkolben wurden 100 μΐ Löscher gegeben
(Reagenz 3).
7. Es wurde gründlich gemischt und man ließ die Kolben etwa 5 Minuten stehen.
8. Zu jedem Kolben wurden 75 μΐ Essigsäure (Reagenz
4) gegeben und gemischt.
9. Es wurde mit Lösungsmittelmischung (Reagenz 7) bis zur Markierung aufgefüllt und gemischt.
Anmerkung: Die Standardlösungen sollten bis zur Verwendung gekühlt werden.
35
35
B. Probenherstellung;
Anmerkung: Alle zur Analyse vorgesehenen Proben müssen
gekühlt werden.
5
5
1. Eine Teilmenge von 50 μΐ jeder Probe wunde in einen
5 ml Meßkolben überführt.
2. Die Umsetzung wurde beginnend mit Schritt A/3 wie oben angegeben fortgesetzt.
Anmerkung: Alle umgesetzten Proben wurden bis zur Analyse gekühlt.
Zweite EMS-Mutation und Resistenz gegenüber höheren
Konzentrationen von Azaleucin
Die gemäß Beispiel 1 hergestellte gegenüber Azaleucin resistente Mutante 17775/14 wurde nochmals in der gleichen
Weise wie vorstehend beschrieben einer Behandlung mit Ethylmethansulfonat unterzogen.
Nach der EMS-Mutation und Inkubation bei 30° C in Medium
E über Nacht wurden die Zellen einmal mit 0,1 molarem Phosphatpuffer gewaschen und auf Medium E Agar plattiert,
welcher Azaleucin (nach dem Autoklavieren zugegeben) in Konzentrationen von 4 bis 20 g/l enthielt. Der
pH-Wert des 12 bis 20 g/l Azaleucin enthaltenden Agars war vor dem Autoklavieren mit NaOH auf 9,6 eingestellt
worden. Die Zugabe von 20 g/l Azaleucin nach dem Autoklavieren ließ den pH-Wert auf 5,6 fallen.
Die Platten wurden 3 bis 7 Tage bei 30° C inkubiert.
Die resistenten Kulturen wurden auf frische Medium-E
.- -"" ΟόΔΌΌΌΟ
- 16 -
Platten übertragen, von denen sie in Röhrchen mit Isoleucinmedium
5 überimpft wurden. Nach Inkubation bei 30° C und 300 Upm für 3 Tage wurden die gewonnenen
Brühen mit HPLC analysiert, wie im einzelnen in Beispiel 1 beschrieben. Eine isolierte Kultur mit der Bezeichnung
17775-14-7, resistent gegenüber 20 g/l Azaleucin, zeigte einen Titer von 8,0 g/l Leucin.
Claims (8)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung von L-Leucin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante von Arthrobacter citreus, die resistent gegenüber Analogen von L-Leucin ist, unter aeroben Bedingungen züchtet, um eine Fermentationsbrühe zu erhalten, und das angereicherte L-Leucin aus der Fermentationsbrühe gewinnt«
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante Arthrobacter citreus ATCC 39103 verwendet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur von 25 bis 40° C für 16 bis 176 Stunden durchführt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einem pH-Wert des Fermentationsmediums von 5 bis 9 durchführt.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante Arthrobacter citreus ATCC 39103 verwendet und die Fermentation bei 25 bis 40° C für 16 bis l'<
5 bis 8 durchführt.4 0° C für 16 bis 17 6 Stunden bei einem pH-Wert von - 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Analoges a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure , D-Leucin, cx-Aminoisoamy lsulf onsäure , Norvalin, Norleucin, Methallylglycin, a-Amino-ß-chlorbuttersäure, Valin, α-Chlorleucin, Isoleucin, ß-Hydroxynorleucin, ß-Hydroxyleucin, Cyclopentenalanin, 3-Cyclopenten-l-alanin, 2-Amino-4-methylhexensäure, 5',5',5'-Trifluorleucin und 4-Azaleucin verwendet.
- 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 3, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante eine Mutante von ATCC 39103 verwendet.
- 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 3, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutante ATCC 39103 verwendet.
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1983
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