DE3302691C2

DE3302691C2 - Mittel für die Dichtegradienten-Zentrifugation

Info

Publication number: DE3302691C2
Application number: DE3302691A
Authority: DE
Inventors: Rainer Dipl.-Chem. Kamps; Manfred Dipl.-Chem. 1000 Berlin Miehe; Bodo Dr. Plewinsky; Klaus Dr. Wetz
Original assignee: Berliner Industriebank AG, 1000 Berlin
Current assignee: KAMPS, RAINER, DR., 8621 GRUB, DE PLEWINSKY, BODO,
Priority date: 1983-01-24
Filing date: 1983-01-24
Publication date: 1986-03-13
Also published as: ZA84482B; JPS59145021A; DE3302691A1

Abstract

Es wird ein Mittel zur Dichtegradienten-Zentrifugation in Form von Alkali- und/oder Erdalkalimetawolframaten, gegebenenfalls unter Zusatz von niedermolekularen Elektrolyten, geschaffen, das Dichten bis zu 3,1 g/cm3 ermöglicht, niedrige Viskosität bei hohen Konzentrationen aufweist, neutral und chemisch inert ist.

Description

K Die Dichtegradienten-Zentrifugation stellt eine wichtige analytische und präparative Methode zur

'&'{ Auftrennung und somit zur Identifizierung bzw. Gewinnung von Einzelkomponenten unterschiedlicher

W. 15 Auftriebsdichte bzw. molarer Masse bzw. Sedimentationjkoeffizienten dar.

Sei So beruht z. B. das Prinzip der isopyknischen Dichtegradienten-Zentrifugation darauf, daß in Gegenwart eines

!J ί gelösten Stoffes hinreichend großer molarer Masse unter der Einwirkung eines Zentrifugalfeldes ein Dichte-

Ji' gradient ausgebildet wird. Die maximal erzielbaren Dichteunterschiede hängen exponentiell vom Wert der

f;:= molaren Masse des gelösten Stoffes und der Zeutrifugalbeschleunigung ab.

K| 20 Jedoch ist die maximal erreichbare Dichte einerseits begrenzt durch die Löslichkeit des gelösten Stoffes ψ am Ort der höchsten Dichte und ist andererseits umgekehrt proportional dem Wert des partieiien spezifischen

|? Volumens des Dichtegradientenmaterials.

I* In der Praxis werden derartige Dichtegradienten entweder präformiert oder durch Gleichgewichts-Zentri-

ϊβ. fugation in der Zentrifuge gebildet. Das zu trennende Stoffgemisch kann entweder vor oder nach der Ausbildung

jp 25 des Dichtegradienten zugegeben werden. Die Stoffe banden an den Orten die ihrer Auftriebsdichte in der If Dichiegradientenkurve entsprechen.

|| Man hat bisher als Dichtegradientenmittel für wäßrige Lösungen insbesondei e Cäsiumchlorid und verwandte

β: Verbindungen sowie Sucrose und 2-{3-Acetamido-5-N-methylacetamido-2,4,6-tri-jod-benzamido)-2-desoxy-D-

I■; glucose, die im folgenden als Dichtegradientensubstanz-0 = DGS-O bezeichnet wird, angewandt.

I 30 Im Hinblick auf das geschilderte Verhältnis zwischen molarer Masse und Steilheit des Dichtegradienten hat

f man versucht, Verbindungen mit möglichst großer molarer Masse anzuwenden. Außerdem muß neben guter

g Löslichkeit der Verbindung ein eroßer Wert der Dichte erreichbar sein. Da die Einstellung des Sedimentations-

jtj gleichgewichles wesentlich von der Viskosität der Lösung abhängt, ist es erforderlich, daß auch bei hohen

p Konzentrationen des Dicntügradientenmittels eine möglichst geringe Viskosität der Lösung vorliegt. Das

%i 35 Cäsiumchlorid mit einer molaren Masse von 168 g/mol erlaubt Dichten bis maximal 2,00 g/cm³ bei Raump temperatur. In der Absicht» die molare Masse zu erhöhen und somit steile Dichtegradienten zu erreichen,

1 ist das DGS-O mit einer molaren Masse von 789 g/mol entwickelt worden. Die maximale Dichte beträgt hierbei

ψ, 1,45 g/cm³. Die hohe molare Masse wird bedingt durch den dreifach mit Jod substituierten Phenylrest

ψ, und es ist auch dieser Substituent, der dieser Verbindung eine gewisse Instabilität verleiht. Wdrere Nachteile

40 bestehen darin, daß DGS-O-Lösungen dem bakteriellen Abbau unterworfen sind und die Hersteller davor warnen, eine Aufarbeitung bzw. Rückgewinnung einmal benutzter Lösungen zu versuchen. DGS-O ist außerordentlich kostspielig (6000,- DM bis 8000,- DM pro kg), so daß zahlreiche an sich wünschenswerte Untersuchungen wegen des Kostenfaktors nicht durchgeführt werden können. Cäsiumchlorid ist zwar wesentlich preiswerter (2 000,- DM bis 3 000,- DM pro kg), bedingt aber bei präparativen Arbeiten immer noch erhebliche 45 Kosten.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein neues Mittel für die Dichtegradienten-Zentrifugation zu schaffen, das die Nachteile der vorbekannten Mittel nicht besitzt und insbesondere die folgenden Eigenschaften aufweist: relativ hohe Molmasse zusammen mit guter Löslichkeit und daraus resultierender hoher Dichte, sowie niedrige Viskosität bei der hohen Dichte, nicht toxisch, in der Lösung neutral und chemisch inert. 50 Es wurde in überraschender Weise gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kann durch das Anwenden von Alkali- und Erdalkalimetawolframaten, wie z. B. Nao(H2 WuOw) und Mg3(H2W|204o), und zwar gegebenenfalls unter Zusatz eines niedermolekularen Elektrolyten wie Natriumchlorid bzw. Magnesiumchlorid (ternäre Dichtegradienten-Zentrifugation).

So besitzen Natrium- und Magnesiummetawolframate hohe Löslichkeit in Wasser. Im Falle des Natrium-55 metawolframates führt ein Massenanteil von etwa 80% zu einer Dichte von 3,12 g/cm³. Die relativ geringe Viskosität der Alkali- und Erdalkalimetawolframate führt zu einer schnellen Einstellung des Sedimentationsgleichgewichtes. Die Alkali- und Erdalkalimetawolframate sind die einzig stabilen Polywolframate, die gleichzeitig in Lösung monomolekular vorliegen, wobei die Lösungen neutral reagieren und in einem pH-Bereich von 2 bis 10 aprotisch sind. Metawolframate sind auch in weiteren hydrophilen Lösungsmitteln, wie Methanol, 60 löslich.

Metawolframat-Lösungen neigen zu Übersättigungen, wobei im Falle des Natrium- und Magnesiummetawolframates bei hoher Rotorfrequenz gearbeitet werden kann, ohne daß ein Auskristallisiercn zu befürchten ist. Metawolframat-Lösungen sind auch thermisch stabil und autoklavierbar.

Die Herstellung von Metawolframaten erfolgt in denkbar einfacher Weise durch Umsetzung von Wolfram-65 trioxid mit Alkali- bzw. Erdalkalihydroxid. Zur Herstellung von z. B. Natriummetawolframat legt man eine konzentrierte Natriumhydroxidlösung vor und setzt derselben unter Rühren eine wäßrige Wolframtrioxidsuspension zu. Nachdem die Suspension einige Stunden am Rückfluß gekocht ist, wird filtriert, eingeengt und auskristallisiert; gegebenenfalls empfiehlt es sich, ein weiteres Umkristallisieren vorzunehmen, um so einen

extrem hohen Reinheitsgrwl zu erzielen. Die Alkali- und Erdalkalimetawolframate sind bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar.

Aufgrund des durch die erfindungsgemäße Anwendung von z. B. Natriummetawolframat-Lösungen erzielten steilen Dichtegradienten ist es möglich, Trennungen bzw. Messungen hochmolekularer Verbindungen, wie eines Copolymerisates auf der Grundlage von Acrylamid und Natriumacrylat, DNS (aus der Thymusdrüse vom Kalb), ImmungammagJobulin (IgG vom Kaninchen), Murein (Zellmembran von Staphylococcus aureus) usw. mit mittleren Rotorfrequenzen entsprechend mittleren Zentrifugalbeschleunigungen von 80000 g durchzuführen.

Vergleichende Untersuchungen mit Cäsiumchlorid sowie Alkali- und Erdalkalimetawolframat-Lösungen haben gezeigt, daß das Copolymerisat von Acrylamid und Natriumacrylat in einem erheblichen Umfang Cäsium-Ionen bindet, während Metawolframationen von dieser Substanz praktisch nicht adsorbiert werden. Desgleichen zeigen Schlierenaufnahmen von Copolymerisat enthaltenden Lösungen, die sich im Sedimentationsgleichgewicht befinden, ausgesprochen scharf ausgebildete Peaks in Natriummetawolframat-Lösung, während dieselben in Cäsiumchlorid-Lösung verschwommen sind. Vermittels der erfindungsgemäßen Anwendung von Metawolframaten ist es möglich, auch Substanzen mit sehr kleinen Auftriebsdichten zu untersuchen, wobei man durch Anwendung von z. B. Methanol als Lösungsmittel auch Dichtewerte bis herunter zu 0,8 g/cm³ erreichen kann.

Untersuchungen haben gezeigt, daß unterschiedliche Proteine zu unterschiedlichen Auftriebsdichten führen, was wohl darauf zurückzuführen ist, daß diese Verbindungsgruppe abhängig von ihrem Ladungszustand Metawolframationen verschieden stark bindet Somit kann die Dichtegradienten-Zentrifugatior von Proteinen unter erflndungsgeniäßer Anwendung von Metawolframat-Lösungen als präparatives Trennverfahren eingesetzt werden.

Die Auftriebsdichten von Nukleinsäuren in wäßrigen Magnesiummetawolframat-Lösungen sind wesentlich kleiner als in Cäsiumchlorid-Lösungen. Hieraus ergibt sich, daß Nukleinsäuren keine Magnesiummetawolfiamationen binden. Aufgrund der hohen Molmasse der Metawolframate können Untersuchungen von Nukleinsäuren bei niedrigen Rotorfrequenzen von z. B. 20000 min"¹ durchgeführt werden. Hierdurch kann nun in wäßriger Lösung die Interferenzoptik der analytischen Ultrazentrifuge eingesetzt werden.

Der Erfindungsgegenstand wird nachfolgend vergleichend mit dem Stand der Technik erläutert.

Beispiel 1

Bildung der Dichtegradienten einer wäßrigen Natriummetawolframat-Lösung
und einer wäßrigen Cäsiumchlorid-Lösung (binäres System)

Aufgrund der wesentlich höheren molaren Masse von z. B. Natriumwolframat (2986,16 g/mol) sedimentiert diese Substanz unter sonst gleichen Bedingungen wesentlich stärker. Es bildet sich somit bei der erfindungsgemäß angewandten Verbindung ein wesentlich steilerer Dichtegradient aus. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in der Abbildung 1 wiedergegeben, die auf der Ordinate die Dichte und auf der Abszisse die Frakt'onszahl wiedergibt.

Beispiel 2

Bildung des Dichtegradienten einer wäßrigen Natriumchloridhaitigen Natriummetawolframat-Lösung

(ternäres System)

Elektroi/te in reinem Wasser a:s Lösungsmittel sedimentieren aufgrund ihrer Dissoziation wesentlich geringer als Nichtelektrolyte gleicher molarer Masse. Der Zusatz eines oder mehrerer Fremdelektrolyte bewirkt, sofern der Fremdelektrclyt eine kleine Molmasse aufweist, näherungsweise ein Sedimentationsverhalten des Elektrolyten wie dasjenige eines Nichtelektrolyten gleicher molarer Masse. Dieser Effekt steigt mit zunehmender Ladungsz_/hl des schweren Ions des Elektrolyten an. Aufgrund der hohen Ladungszahl des Metawolframatanions hat somit ein NaCl-Zusatz einen großen Einfluß auf das Sedimentationsverhalten der erfindungigemäß angewandten Verbindung. Die Abbildung 2 zeigt die erhaltenen Werte.

Beispiel j

Dichtegradienten-Zentrifugation eines Copolymerisates in wäßriger Natriummetawolframat-Lösung
im Vergleich zu einer wäßrigen Cäsiumchlorid-I.ösung

Dieses Copolymerisat ist ein wasserlösliches Copolymerisat aus Acrylamid und Natriumacrylat und weist eine Molmassenverteilung von 5 x 10⁵ bis 3 x 10⁶ g/mol auf.

In einen. Cäsiumchlorid-Dichtegradienten wird eine relativ hohe Auftriebsdichte von 1,41 g/cm³ erhalten, wobei von einem Anfangsmassenanteil an Cäsiumchlorid von 39% ausgegangen und mit einer Rotorfrequenz von 56 000 min"¹ gearbeitet wird. In einem Natriummetawolframat-Dichtegradienten ergibt sich eine Auftriebsdichte von 1,00 g/cm³ bei einer Rotorfrequenz von 56000 min¹, wobei lediglich ein Natriummetawolframat-Massenanteil von 0,25% benötigt wird. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt:

	Vergleich	33 02 691	Copolymerisat in Cäsiumchlorid-Lösung
Tabelle I		56 000 min"¹
	Copolymerisat in Natriummetawolframat-Lösung	39
Rotorfrequenz	56 000 min"¹	25° C
Massen, %	0,25	1,41 g/cm³
Temperatur	25° C	SW 65
Auftriebsdichte	1,00 g/cm³
Rotortyp	SW 65	des Sedimentationsverhaltens einer DNS in einem Cäsiumchlorid- nnH pinpm Natrinmmetawnlframat-Dichteeradienten
	Beispiel 4

Gemäß Literaturangaben wird in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten für DNS eine Auftriebsdichte von etwa 1,7 g/cm³ (Rotorfrequenz etwa 50000 min"¹) gemessen, wobei der Massenanteil von Cäsiumchlorid bei 56% liegt.

Im Natriiimmetawolframat-Dichtegradienten wird eine Auftriebsdichte von 1,046 g/cm³ bei Rotorfrequenzen von nur 20000 bis 28 000 min"¹ festgestellt, obei sich der Massenanteil von Natriummetawolframat auf lediglich 5% beläuft.

Die Ergeonisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt:

Tabelle II	DNS (Phagen) in Cäsiumchlorid-Lösung	DNS (Kalbsthymus) in Natriummetawolframat-Lösung
	51000 min'¹	20 000 bis 28 000 min '
Rotorfrequenz	56	5
Massen. V-,	1 MQ σ/rm³	1.046 g/cm³
Auftriebsdichtc	25⁰C	25° C
Temperatur	nicht möglich	möglich
Einsatz der Interferenzoptik	SW 65	SW 65
Rotortvp

Die Abbiidune 3 ordnet die maximal erreichbaren Dichten den Massenanteilen zum einen der Verbindungen nach dem Stand der Technik, und zum anderen der erfindungsgemäß in Anwendung kommenden Verbindung zu. Hieraus ist eindrucksvoll die erfindungsgemäß erzielte maximale Dichtezunahme ersichtlich Die Abbildung 4 gibt ebenfalls vergleichend zu dem Stand der Technik eine Gegenüberstellung der bei der erfindungsgemäßen Anwendung erzielten günstigen Viskositätswene aufgetragen gegen den Gehalt des Dichtegradientenmittels wieder.

Beispiel 5

Vergleich des Sedimentationsverhaltens von einem Immungammaglobulin (IgG), sowie der
Proteinhülle des Poliovirus in einem Cäsiumchlorid- und Natriummetawolframat-Dichtegradienten

Untersuchungen von einem Inimungammaglobulin (Kaninchen) sowie der Proteinhülle (Kapsid) der Poliovirus in eirem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten ergeben Auftriebsdichten von 1,30g/cm³ bzw. 1,29 g/cm .

Eine Trennung dieses Proteins bzw. Proteinkomplexes ist aufgrund der fast gleichen partiellen spezifischen Volumina, deren reziproke Größen die Auftriebsdichten ergeben, in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten nicht möglich.

Bei Vervendung eines Natriummetawolframat-Dichtegradienten zeigt sich hingegen, daß IgG und Viruskapsid vöüig unterschiedliche Auftriebsdichten ergeben, und somit präparativ zu trennen sind.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Vir^sprotein Rotorfrequenz Temperatur

Auftriebsdichtc in Na

1,14 g/cm' 1,97 g/cm-' 30 000 min ' 7° C

Auftriebsdichte
in CsCl

1,29 g/cm³

000 min '/40 000 min~

C

Das erfindungsgemäüe Mittel kann ganz allgemein bei allen einschlägigen Verfahren Anwendung finden, also für jede modifizierte Form der Dichtegradienten-Zentrilugation.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Mittel für die Dichtegradienten-Zentrifugation, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Alkali- und/oder Erdalkalimetallmetawolframat enthält.

2. Mittel, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehrere niedermolekulare Elektrolyten enthält.

3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es niedermolekulare Elektrolyte mit den gleichen Kationen wie die Alkali- und/oder Erdalkalimetawolframate enthält.