DE3280468T2

DE3280468T2 - Synthese von menschlichen Virusantigenen durch Hefe.

Info

Publication number: DE3280468T2
Application number: DE3280468T
Authority: DE
Inventors: Gustav Ammerer; Benjamin D Hall; William J Rutter; Pablo D T Valenzuela
Original assignee: Washington Research Foundation; University of California
Current assignee: Washington Research Foundation; University of California
Priority date: 1981-08-04
Filing date: 1982-08-04
Publication date: 1995-12-07
Anticipated expiration: 2002-08-05
Also published as: DK114791D0; DK114791A; EP0072318A2; SG58191G; JPS5877823A; DK163931B; PT75374B; IE65996B1; DK347682A; DK169152B1; ES8400877A1; ES514712A0; CA1341642C; DK163931C; DE3280186D1; EP0072318A3; PT75374A; EP0072318B1; GR76274B; JPH0526798B2

Description

GRUNDLAGE DER ERFINDUNG UND STAND DER TECHNIK:

Die vorliegende Erfindung betrifft die Biosynthese eines Antigens des Human-Hepatitis-B-Virus (HBV) durch Hefe, welche Biosynthese durch Anwendung von Arbeitsverfahren mit rekombinanter DNA zustandegebracht wird. Das Hepatitis-B-Virus wird als ein großes, weltweites Problem der öffentlichen Gesundheit anerkannt. Zusätzlich zu dem weitverbreiteten Vorkommen von Virus-Hepatitis und dem Persistieren von asymptomatischen Trägerzuständen ist das Hepatitis-B-Virus auch in die Ätiologie von Leberzellenkarzinom einbezogen worden. Ein Bericht jüngeren Datums üer die Molekularbiologie des Hepatitis- B-Virus findet sich in dem Aufsatz von P. Tiollais und Mitarbeitern in Science 213, 406 (1981).
Eine Hauptanstrengung im Zuge der gängigen Forschung liegt in der Erzeugung einer geeigneten Vakzine, welche einen Schutz gegenüber einer Virusinfektion durch Immunität ergibt. Eine Art und Weise, das Problem der Herstellung einer geeigneten Vakzine anzupacken, hat in Versuchen bestanden, die hauptsächliche Antigenkomponente des Virus, nämlich das Oberflächenantigen, zu reinigen. Nachstehend wird das Symbol HBsAg verwendet, um das HBV-Oberflächenantigen zu identifizieren, welches aus Präparaten des intakten Virus (Dane- Teilchen) erhalten worden ist, oder welches aus dem Serum von Hepatitisträgern durch Reinigung isoliert worden ist. J. Skelly und Mitarbeiter haben in Nature 290, 51 (1981), über die Reinigung von wasserlöslichen Proteinmizellen von gereinigtem HBsAg berichtet. Eine signifikante Beschränkung dieser Angriffsmethode besteht darin, daß die Menge des Materials, welches hergestellt werden kann, von der Verfügbarkeit von Spendern abhängt. Es ist kein Arbeitsverfahren zum Züchten des Virus in einer Kultur bekannt; daher besteht zusätzlich zu den Beschränkungen hinsichtlich der Menge an Quellenmaterial die Gefahr einer Verunreinigung der Vakzine mit aktivem Virus oder mit anderen Komponenten des Spenderserums, sowie die Gefahr einer möglichen Heterogenität in den aus verschiedenen Spendern erhaltenen Produkten.
Eine zweite Methode, das Problem anzupacken, bestand in dem Versuch, Peptide zu synthetisieren, welche Antikörper gegen das HBsAg hervorrufen und welche auf der Aminosäurensequenz des Proteins basieren, welches des Oberflächenantigen umfaßt (S-Protein), und Musteruntersuchungen durchzuführen, aufgrund derer die wahrscheinlichsten Antigendeterminanten vorhersagbar waren. Siehe z.B. R.A. Lerner und Mitarbeiter in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 3403 (1981). Diese Arbeiten befinden sich noch in einem recht frühen Vorbereitungsstadium, und es mag schwierig sein, zu beurteilen, ob man nach dieser Methode auf kostensparende Art und Weise Antigene erzeugen kann, welche ein praktisch annehmbares Ausmaß an Immunogenität aufweisen.
Eine dritte Methode, das Problem anzupacken, nämlich unter Anwendung von Arbeitsverfahren mit rekombinanter DNA, ist die Synthese von S-Protein, HBsAg oder einem immunologisch reaktiven Äquivalent davon, durch einen Mikroorganismus, und zwar dadurch, daß man einen Mikroorganismus mit der genetischen Fähigkeit ausstattet, das S-Protein, HBsAg oder ein immunologisch reaktives Äquivalent davon in großen Mengen und beim Fehlen von anderen Virusgenprodukten, zu erzeugen. Bei dieser Methode ist die Möglichkeit einer Verunreinigung durch das Virus oder durch andere Viruskomponenten ausgeschaltet; und diese Methode ermöglicht eine Großfabrikation mit Einsparungen im Ausmaß. Außerdem ist es durch entsprechende Manipulationen des genetischen Materials möglich, die Sequenz des die Vakzine bildenden Proteins zu modifizieren, un dessen Nebenwirkungen zu modifizieren, oder um die Vakzine mehrwertig zu machen. Zu diesem Zweck ist das gesamte Genom des HBV in E. coli kloniert worden, und die gesamte Nukleotidsequenz dieses Genoms ist bestimmt worden (P. Charnay und Mitarbeiter, Nucl. Acid Res. 7, 335 (1979); F. Galibert und Mitarbeiter, Nature 281, 646 (1979); P. Valenzuela und Mitarbeiter, Animal Virus Genetics (B. Fields, R. Jaenisch und C.F. Fox, Hsg.), Academic Press, New York, N.Y. (1980), S. 57). Es wurde gefunden, daß eine einzige Region des Genoms für das S-Protein und auch für eine große Vorsequenz von 163 Aminosäuren kodiert. Es wird angenommen, daß die Struktur des HBsAg aus zwei S-Proteinketten besteht, welche durch intermolekulare Disulfidbildungen miteinander verbunden sind, und welche durch zusätzliche intramolekulare Disulfidbindungen in einer vorgeschriebenen Anordnung gehalten werden. Es hat den Anschein, daß eine der zwei Ketten glykosyliert ist. Im Serum von Trägern erscheint das HBsAg häufig in der Form von kugelförmigen Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 2 nm, von welchen angenommen wird, daß es sich dabei um Aggregate der soeben beschriebenen S-Proteindimeren handelt, und daß sie möglicherweise Lipide enthalten. In der Virushülle ist das HBsAg mit der lipidhältigen Virushülle assoziiert, von welcher angenommen wird, daß sie aus Membrankomponenten der Wirtszelle stammt.
Die Antigenität und Immunogenität des HBsAg hängen von mehreren Faktoren ab, von denen nicht alle wohlverstanden sind. Es ist beobachtet worden, daß eine Reduktion der Disulfidbindungen die Antigenität und Immunogenität signifikant verringert (S. Mishiro und Mitarbeiter, J. Immunol. 124, 1589 (1980)). Es wird daher angenommen, daß die durch die intramolekularen und intermolekularen Disulfidbindungen beigesteuerte Tertiärkonfiguration zu der Antigenität und Immunogenität beiträgt. Der Beitrag, den andere Faktoren, wie z.B. das Ausmaß und die Art der Glykosylierung und eine Assoziation mit einem Lipid, leisten, ist unklar, obgleich angenommen wird, daß alle diese Faktoren bis zu einem gewissen Grad ihren Beitrag leisten. Es wird angenommen, daß die Aggregation zu Teilchen, wie den obgenannten 22-nm-Teilchen, signifikant zu einer Erhöhung der Immunogenität beiträgt.
Das S-Protein ist in E. coli in der Form eines Fusionsproteins synthetisiert worden (J.C. Edman und Mitarbeiter, Nature 291, 503 (1981)). Das Produkt umfaßte 183 Aminosäuren von Prä-β-lactamase, 5-10 Glycinreste, sowie 204 Aminosäuren des S-Proteins, wobei aber 22 Aminosäuren des Endes mit endständiger Aminogruppe fehlten. Das Fusionsprotein war mit Anti-HBsAg-IgG immunausfällbar.
Da es bekannt ist, daß S-Proteindimere (Mishiro und Mitarbeiter, l.c.) und 22-nm-Teilchen mit einem Gehalt an HBsAg (G.A. Cabrall und Mitarbeiter, J. Gen. Virol, 38, 339 (1978)) stärker antigen als das damit verbundene S-Protein sind, wäre es in hohem Maße erwünscht, ein biologisches System zu finden, welches befähigt wäre, das HBsAg oder ein immunologisch reaktives Äquivalent davon, direkt und in wesentlichen Mengen zu erzeugen.
Die einzelnen Schritte bei der Umwandlung des S-Proteins zu dem HBsAg oder zu den 22-nm-Teilchen werden nicht ganz verstanden, noch ist es bekannt, in welchem Ausmaß diese Schritte wirtszellenspezifisch sind. Außerdem kodiert das S-Protein-Gen offensichtlich für eine ungewöhnlich lange Vorsequenz von 163 Aminosäuren, deren funktionelle Bedeutung, falls eine solche vorhanden ist, unbekannt ist. Tatsächlich ist es nicht bekannt, ob die Vorsequenz in der mit dem Virus infizierten Zelle tatsächlich translatiert wird. Hefe (Saccharomyces cerevisiae) wurde aus den folgenden Gründen als Wirtszelle ausgewählt, in der eine Expression des HBsAg zu versuchen wäre: Hefe läßt sich leicht in einer Kultur in großen Mengen züchten. Tatsächlich ist die Technologie der Hefekultur in großtechnischem Maßstabe wohlverstanden. Außerdem ist Hefe ein Eukaryont, so daß die Hoffnung berechtigt schien, daß einigeder posttranslationalen Verarbeitungsstufen, die in einer normalen Wirtszelle durchgeführt werden, in Hefe ausführbar sein könnten. Im Hinblick auf die Komplexität der posttranslationalen Ereignisse, aufgrund deren das S-Protein in das HBsAg umgewandelt wird, und von denen einige wirtszellenspezifisch sein können, wird mit der in den vorliegenden Unterlagen angewendeten Nomenklatur die Absicht verbunden, verschiedene, im Rahmen der in den vorliegenden Unterlagen beschriebenen Arbeit erkannte, antigene Formen voneinander zu unterscheiden. Das unverarbeitete Translationsprodukt des Strukturgens für Oberflächenantigen wird als S-Protein bezeichnet. Das Antigen, welches aus dem Plasma von infizierten Spendern, aus Dane-Partikeln, oder aus Human-Hepatom-Zellkulturen isoliert worden ist, wird als HBsAg bezeichnet. Das Expressionsprodukt des Oberflächenantigen-Gens in Hefe wird als Y-HBsAg bezeichnet. Der Ausdruck: "immunologisch reaktives Äquivalent von HBsAg" ist eine allgemeine Bezeichnung für irgendeine immunologisch kreuz reaktive Zusammensetzung, welche das S-Protein oder einen Teil davon enthält, wofür Y-HBsAg ein Beispiel ist.
Bisher ist die Hefe noch niemals für eine Expression der Gene eines Virus verwendet worden, das sich normalerweise in einem von Hefe unterschiedlichen Organismus vermehrt. Zum Stande der Technik gehörende Versuche, heterologe Proteine in Hefe zu exprimieren, haben zu gemischten Ergebnissen geführt. Ein Versuch, das Kaninchen-Globin unter der Regulation von dessen eigenem Promotor zu exprimieren, scheint hinsichtlich der Translation des Proteins erfolglos gewesen zu sein (J.D. Beggs und Mitarbeiter, Nature 283, 835 (1980)). Es wurde berichtet, daß ein für ein Drosophila-Gen kodierendes Gen befähigt ist, eine Hefe-ade-8-Mutante zu komplementieren, und zwar unter den Bedingungen eines selektiven Druckes für eine genetische Komplementation. Über die Isolierung eines funktionellen Proteins aus dem Hefe-Stamm wurde nichts berichtet. Das Gen für Human-Leukozyten- Interferon ist in Hefe unter der Regulation des Hefe-ADH1-(Alkoholdehydrogenase)-Promotors exprimiert worden. In diesem Falle hat die erfolgreiche Produktion eines aktiven Proteins keine posttranslationale Verarbeitung oder kein posttranslationales Zusammenfügen von Komponenten erfordert.
Es sind DNA-Transfervektoren entwickelt worden, welche sich für den Transfer und die Replikation in Hefe eignen (J.R. Broach und Mitarbeiter, Gene 8, 121 (1979); J.L. Hartley und Mitarbeiter, Nature 286, 860 (1980)). Die meisten, in gängigem Gebrauch stehenden Hefevektoren stammen von E.-colo-Vektoren, wie z.B. pBR322, in welche ein Hefe-Replikationsstartpunkt (Origin) eingesetzt worden ist. Es stehen zwei Arten von Hefe-Replikationsstartpunkten zur Verfügung. Die erste Art, welche aus einem allgegenwärtigen, natürlich vorkommenden Hefe-Plasmid stammt, welches allgemein als der 2-um-Kreis bezeichnet wird, verleiht die Fähigkeit zu einer Replikation unabhängig von Hefe-chromosomaler DNA. Eine andere Klasse von Vektoren enthält eine mit ars1 ("autonomous replication sequence") bezeichnete Replikationsstartpunktsequenz, welche aus dem Hefe-chromosomalen Replikationsstartpunkt stammt, und welche ebenfalls die Fähigkeit zu einer autonomen Replikation verleiht. Da in ein- und demselben Vektor sowohl bakterielle als auch Hefe-Replikationsstartpunkte vorliegen, können diese Vektoren in jedem dieser zwei Organismen verwendet werden. In bakteriellen Systemen kann für eine Selektion dadurch gesorgt werden, daß man Gene für eine Resistenz gegen Antibiotika, wie z.B. die Gene des pBR322 für eine Resistenz gegen Ampicillin bzw. Tetracyclin, einverleibt. Für eine Selektion in Hefesystemen kann typischerweise dadrch gesorgt werden, daß man ein Hefe-Gen einverleibt, welches in einem geeigneten auxotrophen Wirtsstamm eine Mutation komplementiert. Bei den Untersuchungen, über welche im Rahmen der vorliegenden Unterlagen berichtet wird, werden zweckmäßig Hefevektoren verwendet, welche einen Promotor enthalten, der aus dem für Alkoholdehydrogenase kodierenden Hefe-Gen (ADH1) isoliert worden ist. (J.L. Bennetzen und Mitarbeiter, J. Biol. Chem., Bd. 257, S. 3018 (1981)).
Die ADH1-Promoter-Region wurde aus dem 5'-flankierenden Bereich des Hefe-ADH1-Gens isoliert. Ein Fragment, welches annähernd 1600 Basenpaare der ADH1-Sequenz enthält und sich von den Positionen -1550 bis +17 innerhalb der Kodierungsregion erstreckt, wurde mit der Hefe-CYC1-Kodierungssequenz fusioniert. Untersuchungen über die Transkription der gebundenen CYC1-Kodierungssequenz zeigten, daß die Transkript-Startspezifität von einem Hefe-Gen auf ein anderes übertragen werden konnte. Anschließend wurden kleinere Fragmente aufgebaut, bei welchen die gesamte ADH-Kodierungsregion fehlte, und es wurde gezeigt, daß diese kleineren Fragmente bei der Expression von Human-Interferon funktionell sind. Ein solches Fragment, das mit 921 bezeichnet wird, ist nach der Position -9 terminiert, und ist in den vorliegenden Untersuchungen verwendet worden.
Da Substanzen, die mit Anti-HBsAg-Antikörper rekativ sind, in mehreren Formen vorhanden sind, wurde im Rahmen der vorliegenden Unterlagen eine Nomenklatur aufgestellt, um zwischen diesen Formen zu unterscheiden. Das Translationsprodukt des HBV-Oberflächenantigen-Gens wird als S-Protein bezeichnet. Das S-Protein weist 226 Aminosäuren auf, auf deren Sequenz aus der Nukleotidsequenz des Gens des S-Proteins und teilweise durch Sequenzanalyse geschlossen worden ist. Der Ausdruck HBsAg, wie er im Rahmen der vorliegenden Unterlagen verwendet wird, umfaßt die hauptsächliche Oberflächenantigenkomponente des HBV, welche Komponente in dem Serum von infizierten Patienten und in Alexander-Zellen, nämlich in einer Leberzellenkarzinom-Zell-Linie, welche 22-nm-HBsAg-Partikeln synthetisiert und sezerniert (J.J. Alexander und Mitarbeiter, S. Afr. Med. J. 50, 1124 (1976)), vorgefunden wird. Sowohl das S-Protein als auch das HBsAg sind antigen, doch ist das letztgenannte in stärkerem Ausmaß reaktiv gegen Anti-HBV- Antikörper und wird auch als in höherem Maße immunogen angesehen. Da die Struktur des HBsAg nicht vollständig gekennzeichnet worden ist, und da die Beiträge zur Antigenität und Immunogenität von verschiedenen Modifizierungsstufen nicht vollständig verstanden werden, wird der Ausdruck HBsAg im Rahmen der vorliegenden Unterlagen dahingehend verwendet, daß er eine jedwede modifizierte Form des S-Proteins umfaßt, welche zu dessen antigenen und immunogenen Eigenschaften beiträgt, zu welchen Formen die Dimerisierung, Glykosylierung und das Zusammenfügen von Partikeln gehören, welche Formen aber nicht darauf beschränkt sind.
Allgemeine Informationen betreffend das für das Hepatitis-B-Virus-Antigen kodierende Gen und dessen Expression in einer Wirtszelle finden sich in den folgenden Schriften:
EP-A-73 657; Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77 (1980), S. 4549-4553; EP-A 38 765; und Nature, 280 (1979), S. 815-819.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese von HBsAg in Hefe. Hefe-Expressionsvektoren, welche einen Hefepromotor, ADH1, umfassen, sind aufgebaut worden. Die für das S-Protein kodierende Region des HBV-Genoms, ausschließlich einer möglichen, 163 Aminosäuren umfassenden Vorsequenz, ist auf den Hefeexpressionsvektor transferiert worden.
Unter Verwendung des beschriebenen Hefevektors ist die erfolgreiche Synthese des HBsAg durch Hefe gelungen. Das Produkt ist antigen (reaktiv mit Anti-HBsAg), und ein wesentlicher Teil davon wird assoziiert mit Partikeln vorgefunden, welche in ihrem Aussehen unter dem Elektronenmikroskop identisch mit denjenigen Partikeln sind, die im Serum von HBV-infizierten Patienten und in Alexander- Zellen vorgefunden werden, die aber einen kleineren Teilchengrößendurchmesser aufweisen. Das durch Hefe synthetisierte HBsAg zeigt das gleiche Sedimentationsverhalten wie gereinigte, natürlich vorkommende, aus Alexander-Zellen isolierte HBsAg-Partikeln, und zwar gemessen aufgrund einer Sedimentation in einem Saccharose-Gradienten. Die vorliegende Erfindung demonstriert die Synthese und das Zusammenfügen einer Mehrkomponentenstruktur von höherer Ordnung, welche Struktur das Ergebnis der Expression eines heterologen DNA-Kodierungssegmentes in einem Mikroorganismus ist.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Es wird angenommen, daß die vorliegende Erfindung der erste Fall einer Biosynthese und des Zusammenfügens von Partikeln eines Virusproteins in einem heterologen Wirt ist, wobei der heterologe Wirt (in diesem Fall die Hefe) auf der Evolutionsskala von dem normalen Wirt (dem Menschen) weit entfernt ist. Die Erfindung wurde durch die Entwicklung eines autonom replizierenden DNA-Transfervektors für Hefe und auch durch das Klonieren und die Kennzeichnung des HBV-Genoms in Bakterien ermöglicht. Bei der vorliegenden Erfindung wurde der Promotor für das Hefe-ADH1-Gen verwendet, um für ein hohes Ausmaß an einer Transkription der eingefügten, für das S-Protein kodierenden Region zu sorgen. Prinzipiell könnte anstelle dieses Promotors ein beliebiger Hefepromotor, und vorzugsweise ein aktiver Promotor, verwendet werden, der für ein hohes Ausmaß an Transkription sorgt. Andere geeignete aktive Promotoren von Hefe umfassen diejenigen für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Aldolase, Pyruvatkinase und Phosphoglyceratkinase. Möglicherweise können auch heterologe Promotoren, wie z.B. der HBV-S-Protein-Promotor, verwendet werden. Gegenwärtig wird jedoch die Verwendung von Hefepromotoren bevorzugt.
Auch andere Proteine des HBV, wie z.B. das Kernantigen, sollten unter Anwendung der Prinzipien und Arbeitsverfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls synthetisierbar sein. Darüber hinaus ist die Erfindung auch in einem beliebigen System anwendbar und wird dort besonders vorteilhaft sein, wo posttranslationale Verfahren zur Herstellung eines biologisch funktionellen Endproduktes erwünscht sind, darunter Verfahren wie Glykosylierung, Zusammenfügen von Partikeln, und möglicherweise spezifische Proteinspaltungsrekationen.
Das S-Protein-Gen hat drei potentielle Stellen für den Beginn der Translation. Die beiden ersten Stellen sind AUG-Codone, welche annähernd 70 bzw. 90 Basenpaare von dem mutmaßlichen HBV-S-Protein- Promotor entfernt angeordnet sind. Die dritte Stelle, wo die bekannte Kodierungssequenz das reifen S-Proteins beginnt, ist 522 bzw. 489 Basenpaare von der ersten bzw. zweiten Stelle entfernt angeordnet. Der dritte potentielle Startpunkt ist daher von dem HBV-S-Protein- Promotor viel weiter entfernt. Derzeit ist nicht bekannt, welches der AUG-Codone der tatsächliche Startpunkt für die Translation ist. Beginnt die Translation entweder an dem ersten oder an dem zweiten potentiellen Start-Codon, dann umfaßt das Transkript entweder die Kodierungssequenz für einen ungewöhnlich langen Anfangsteil von 163 Aminosäuren, der durch eine posttranslationale Behandlung entfernt werden muß, oder es weist ein ungewöhnliches Intron auf, welches durch eine posttranskriptionale Behandlung entfernt wird. Stellt das dritte AUG-Codon den tatsächlichen Initiationspunkt dar, dann besteht ein ungewöhnlich großer Abstand zwischen dem Promotor und dem Start-Codon.
Die in den vorliegenden Unterlagen dargebotenen Daten zeigen, daß das Y-HBsAg ein teilchenförmiges, immunologisch kreuzreaktives Äquivalent des ist, das sich von dem letztgenannten in mehrfacher Hinsicht unterscheidet, obgleich sein morphologisches Aussehen im Elektronermikroskop demjenigen des HBsAs ähnlich ist. Außerdem zeigen diese Daten, daß das Y-HBsAg wenigstens so stark antigen, je Gewichtseinheit, wie das HBsAg sein kann, und daß das Y-HBsAg wenigstens ebenso wirksam wie das HBsAg im Hervorrufen eines mit dem HBsAg reaktiven Antikörpers in Nagetieren und Primaten sein kann.
Die Expressionsrate des für das S-Protein kodierenden Abschnittes kann durch eine Vielfalt von Mitteln erhöht werden. Diese Mittel umfassen das Modifizieren der Expressionsvektoren, um den Abstand zwischen dem Promotor und dem Start-Codon des Kodierungsabschnittes zu optimieren, und um so die Geschwindigkeit der Translationsinitiation zu optimieren. Das Hinzufügen einer Terminatorsequenz, welche die Termination der Transkription an einer Stelle in der untranslatierten 3'-Region im Anschluß an das Stop-Codon des Kodierungsabschnittes dirigiert, verstärkt die Expression, und zwar vermutlich aufgrund einer Stabilisierung der mRNA-Transkripte. Beim Fehlen eines Terminationssignals ist beobachtet worden, daß eine Optimierung der Länge der untranslatierten 3'-Region an sich die Expression verstärkte.
Die Anwendung von Mitteln zur Verbesserung der Vektorstabilität führt ebenfalls zu einer Erhöhung der Ausbeute an dem Expressionsprodukt aus einer Kultur. Viele für das Klonieren in Hefe angepaßte Vektoren enthalten genetische Marker, um das Wachstum der transformierten Hefezellen unter Selektionsdruck zu gewährleisten; beispielsweise enthalten sie ein TRP1-Gen, um das Wachstum eines trp1&supmin;-Wirtes in einem Medium zu ermöglichen, in welchem das Tryptophan fehlt.
Wirtzellkulturen mit einem Gehalt an solchen Vektoren können eine große Anzahl von untransformierten Segreganten enthalten, wenn sie unter nicht-selektiven Bedingungen gezüchtet werden, insbesondere wenn sie zu hohen Zelldichten gezüchtet werden. Es ist daher vorteilhaft, Expressionsvektoren zu verwenden, welche kein Wachstum unter Selektionsbedingungen erfordern, um ein Wachstum bis zu hohen Dichten zu ermöglichen, und um den Anteil von untransformierten Segreganten zu minimieren. Vektoren, welche einen wesentlichen Anteil an dem natürlich vorkommenden 2-um-Kreis-Plasmid enthalten, sind zu einer stabilen Replikation mit nur minimaler Segregation von untransformierten Zellen, selbst bei hohen Zelldichten, befähigt, wenn sie in Wirtsstämme hineintransformiert werden, in denen zuvor 2-um-Kreise gefehlt haben. Solche Wirtsstämme werden als Nullkreisstämme ("circle zero"-(cir&sup0;) -Stämme) bezeichnet. Außerdem kann die Geschwindigkeit des Zellwachstums bei niedrigen Zelldichten dadurch erhöht derden, daß man eine regulatorische Kontrolle über den Promotor derart einbaut, daß die Expression der S-Protein-Kodierungsregion in verdünnten Kulturen, wie z.B. in der frühen bis zur mittleren log-Phase, minimiert wird, und dann bei den hohen Zelldichten für eine maximale Expression eingeschaltet wird. Eine solche Kontrollstrategie erhöht die Effizienz des Zellwachstums im Fermentationsprozeß und vermindert weiterhin die Häufigkeit einer Segregation von nicht-transformierten Zellen.
Bei den nachstehend Beispielen sind viele der Techniken, Reaktionen und Abtrennungsverfahrensweisen auf dem betreffenden Fachgebiet bereits wohlbekannt. Alle Enzyme sind, soweit nicht anderes angegeben ist, von einer oder mehreren Handelsquellen erhältlich, wie z.B. von New Englang BioLabs, Beverley, Massachusetts; Collaborative Research, Waltham, Massachusetts; Miles Laboratories, Elkhart, Indiana; Boehringer Biochemicals Inc., Indianapols, Indiana; und von Bethesda Research Laboratory, Rockville, Maryland, um nur einige wenige, repräsentative Quellen zu nennen. Die Puffer und Reaktionsbedingungen für die Digestion mit Restriktionsenzymen wurden je nach den Empfehlungen angewendet, die von dem hersteller für jedes Enzym angegeben sind. Teilweise Digestionen mit Restriktionsenzymen wurden unter Verwendung einer verringerten Enzymkonzentration durchgeführt, welche aufgrund von vorbereitenden Versuchen für jede Enzymcharge im veraus bestimmt wurde. Die Standardmethodik für andere Enzymreaktionen, Trennungen durch Gel-Elektrophorese, und die Transformation von E. coli findet sich in "Methods of Enzymology", Bd. 68; Ray Wu, Hsg., Academic Press (1979). Die Transformation von Hefeprotoplasten wurde im wesentlichen wie von Beggs (in Natur 275, 104-109 (1978)) beschrieben durchgeführt.
Für eine Transformation brauchbare Stämme von E. coli umfassen: X1776; den K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446); RR1 und HB101. Für Hefetransformationen wurden die Hefestämme XV610-8c mit dem Genotypus (a ade2 ade6 leu2 lys1 trp1 can1) und GM-3C-2, G. Faye und Mitarbeiter, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78, 2258 (1981), Genotypus: (α Leu2 Trp1 His4 CYC1-1 CYP3-1), verwendet. Die Bakterien wurden nach den Arbeitsverfahren gezüchtet und selektioniert, die von J.R. Miller in "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972), beschrieben worden sind. Die Hefen wurden auf den folgenden Medien gezüchtet: YEPD mit einem Gehalt von 1 % (Gew./Vol.) an Hefeextrakt, 2 % (Gew./Vol.) an Pepton, und 2 % (Gew./Vol.) an Glucose; und im Falle von Plattierungsmedien, 3 % (Gew./Vol.) Agar. YNB plus CAA enthielt 6,7 g Hefestickstoffbasismedium (Difco Laboratories, Milleapolis, Minnesota), 10 mg Adenin, 10 mg Uracil, 5 g handelsübliches, säurehydrolysiertes Casein ("casamino acids", CAA) (Difco), 20 g Glucose; und, im Falle von Plattierungsmedien, 30 g Agar pro Liter. Die Selektion auf Tryptophanprototrophie wurde auf Platten mit einem Gehalt von 6,7 g an Hefestickstoffbasismedium (in welchem Aminosäuren fehlten), und welches mit sämtlichen Wachstumserfordernissen des zu transformierenden Stammes, ausgenommen mit Tryptophan, ergänzt war, durchgeführt.

BEISPIEL 1

Aufbau von Hefevektoren:

Es wurden zwei Hefevektoren aufgebaut, der eine mit einem ars1-Replikationsstartpunkt, und der andere mit einem Gehalt an einem 2-um-Kreis-Replikationsstartpunkt.
Das Plasmid pFRP-921 ist schon früher von Hitzeman und Mitarbeitern in Nature 293, 717 (1981) beschrieben worden. Der Vektor enthält die Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und den Replikationsstartpunkt des bakteriellen Plasmides pBR322, den Hefe-Replikationsstartpunkt ars1 und das trp1-Gen zusammen mit dem ADH1-Promoter- Fragment, welches mit 921 bezeichnet wird, und welches nach der Position -9 in der Nukleotidsequenz beendet ist. Eine Karte des pFRP-921 ist in der Fig. 1 dargestellt.
Das Plasmid pMA56 enthält die Sequenz des bakteriellen Plasmides pBR322, ein Hefe-trp1-Gen für eine Selektion in Hefe, den Hefe-2-um- Kreis-Replikationsstartpunkt, und ein mit 906 bezeichnetes ADH1-Promotor-Fragment, welches nach dem Nukleotid -15 an dem 3'-Ende beendet ist. Die Stufen der Konstruktion des pMA56 werden nachstehend umrissen und sind schematisch in der Fig. 2 dargestellt.
Als Ausgangsmaterial wurde das Plasmid YRp7' (D.T. Stinchcomb und Mitarbeiter, Nature 282, 39 (1979)) verwendet, welches die Hefe-trp1- und -ars1-Sequenzen enthält, welche Sequenzen an der EcoRI-Stelle des pBR322 eingefügt sind. Als Ergebnis der Insertion der Hefesequenzen enthielt das Plasmid zwei EcoRI-Stellen (Fig. 2). Eine dieser Stellen wurde durch eine teilweise Digestion mit EcoRI-Endonuclease deletiert, bei welcher Digestion durchschnittlich nur eine der zwei Stellen je Molekül digeriert wurde. Die so entstandenen, ungepaarten Enden der linearen Moleküle wurden durch eine mit DNA-Polymerase-I (Klenow- Fragment) katalysierte Reaktion ausgefüllt, und die so entstandenen stumpfen Enden wurden in einer durch DNA-Ligase katalysierten Reaktion erneut miteinander verbunden, um erneut ein geschlossenes, kreisförmiges DNA-Molekül zu erstellen. Eines der so entstandenen Plasmide, welches mit pFRT bezeichnet wird, wurde ausgewählt, weil es die EcoRI-Stelle benachbart zu der ars1-Region beibehalten hatte.
Wie aus der Fig. 2 ersichtlich ist, war der ars1-Replikationsstartpunkt durch eine PstI-Stelle und eine EcoRI-Stelle begrenzt. Gleichzetig enthielt das Plasmid YEp13 (Broach und Mitarbeiter, l.c.) den 2-um-Kreis-Replikationsstartpunkt, der in gleicher Weise von einer PstI-Stelle und von einer EcoRI-Stelle begrenzt war. Daher ergab die Spaltung von pFRT bzw. YEp13 mit PstI- bzw. EcoRI-Endonucleasen ein großes lineares Fragment, in welchem ein Hefe-Replikationsstartpunkt fehlte, aus dem pFRT, bzw. ein kleines DNA-Fragment, welches den 2-um-Kreis-Replikationsstartpunkt enthielt, aus dem YEp13. Das Plasmid pFRT wurde mit PstI-Endonuclease unter Partialdigestionsbedingungen digeriert, um die Häufigkeit eines Spaltens an der PstI-Stelle innerhalb des Ampicillin-Resistenz-Gens herabzusetzen. Die gewünschten Fragmente wurden durch präparative Gel-Elektrophorese gereinigt, miteinander vermischt, und in einer durch DNA-Ligase katalysierten Reaktion kovalent aneinander gebunden. Das entstandene plasmid, welches mit pMW5 bezeichnet wurde, wurde aufgrund seiner Fähigkeit, eine Ampicillin-Resistenz zu verleihen, selektioniert.
Das ADH1-Fragment 906 war in das pBR322 zwischen den BamHI- und EcoRI-Stellen eingefügt. Das Promotorfragment wurde durch Digestion mit BamHI- und EcoRI-Endonucleasen freigesetzt. Ein Fragment von 1,5 Kilobasen (kb), das ADH1-906-Fragment, wurde durch präparative Gel-Elektrophorese isoliert. Das Plasmid pMW5 wurde in ähnlicher Weise mit EcoRI- und BamHI-Endonucleasen digeriert. Das große Fragment, welches ein EcoRI-spezifisches Ende und ein BamHI-spezifisches Ende aufweist, wurde durch präparative Gel-Elektrophorese isoliert, mit dem ADH1-906-Fragment vermischt, und durch eine mit DNA-Ligase katalysierte Reaktion kovalent damit verbunden. Das so entstandene, mit pMA56 bezeichnete Plasmid, welches in der Fig. 2 schematisch dargestellt ist, wurde aufgrund von Ampicillin-Resistenz in E. coli selektioniert.
Die Plasmide pFRP-921 und pMA56 sind strukturell ähnlich; sie unterscheiden sich voneinander in erster Linie dadurch, daß das eine von ihnen, nämlich (pFRP-921), einen ars1-Replikationsstartpunkt aufweist, und daß das andere von ihnen, nämlich (pMA56), einen 2-um-Kreis-Replikationsstartpunkt aufweist. Außerdem unterscheiden sich die ADH1-Promoterfragmente geringfügig, wie dies beschrieben worden ist. Beide gleichen einander darin, daß sie bakterielle Replikationsstartpunkt und Selektionsmarker für ein Wachstum in E. coli aufweisen. Beide enthalten ein Hefe-TRP1-Gen, um eine Selektion in Hefe-trp1-Wirtsstämmen zu ermöglichen.

BEISPIEL 2

Aufbau eines Hefeplasmides, welches die S-Protein-Kodierungsregion enthält:

Eine Analyse der Nukleotidsequenz der HBV-DNA, wie sie von P. Valenzuela und Mitarbeitern in Animal Virus Genetics, Academic Press, New York, N.Y. (1980), S. 57-70, angegeben worden ist, zeigte die Lokalisierung der S-Protein-Kodierungsregion. Diese Region ist innerhalb des TacI-HpaI-Fragmentes mit einer Länge von 835 Basenpaaren enthalten. Dieses Fragment enthält 26, dem AUG-Codon für das N-Terminale Methionin des S-Proteins vorangehende Basenpaare. (Der größte Teil der Region, welche für die oben beschriebene, mutmaßliche Vorsequenz kodiert, sowie die ersten zwei AUG-Codone fehlen in dem TacI-HpaI-Fragment). Das Fragment enthält auch die gesamte S-Protein-Kodierungsregion (678 bp), ein TAA-Stop-Codon und 128 bp nach dem Stop-Codon. S-Protein
Annähernd 500 ug DNA aus dem Plasmid pHBV-3300 (P. Valenzuela und Mitarbeiter, Nature 280, 815 (1979)) wurden bis zur vollständigen Beendigung mit einer Kombination der Restriktionsenzyme EcoRI und HpaI digeriert. Annähernd 60 ug des Fragmentes EcoRI-HpaI von 965 Basenpaaren wurden durch präparative Gel-Elektrophorese in Agarose isoliert. Dieses Fragment wurde dann bis zur vollständigen Beendigung mit dem Restriktionsenzym TacI digeriert. Annähernd 30 ug des 835- bp-TacI-HpaI-Fragmentes wurden durch präparative Gel-Elektrophorese in Agarose isoliert.
Das 835-bp-Fragment wurde durch Zugabe von EcoRI-Linker-Oligonukleotiden (die im Handel von der Firma Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, erhalten worden sind) dahingehend behandelt, daß nunmehr EcoRI-spezifische Enden vorhanden waren. Die Linker-Oligonukleotide wurden mit annähernd 3 bis 5 ug des Fragmentes durch Stumpfend-Ligation, die durch T4-DNA-Ligase katalysiert war, verbunden. Das Fragment wurde dann mit EcoRI-Endonuclease digeriert, um nicht umgesetzte und mit sich selbst ligierte Linker zu spalten und um EcoRI-spezifische, ungepaarte ("klebrige") Enden zu erzeugen.
Zur Verhinderung einer Selbst-Ligation wurde das Plasmid pFRP-921 mit EcoRI-Endonuclease digeriert und mit alkalischer Phosphatase behandelt (J. Shine, US-PS Nr. 4,264.731). Ein Gemisch aus dem TacI-HpaI- Fragment mit EcoRI-Enden und EcoRI-digeriertem pFRP-921 wurde mit DNA-Ligase inkubiert, um eine kovalent geschlossene, kreisförmige DNA zu bilden, bei welcher das S-Protein-Kodierungsfragment in dem Hefevektor eingefügt ist. Die so entstandenen Plasmide wurden zum Transformieren von E. coli verwendet, wobei aufgrund der Ampicillin- Resistenz selektioniert wurde. Beide möglichen Ausrichtungen der S-Protein-Kodierungssequenz in bezug auf den Hefe-Promotor wurden isoliert und aufgrund der Spaltprodukte gekennzeichnet, die als Ergebnis einer Behandlung mit einem Restriktionsenzym erhalten worden waren, welches letztere auf eine asymmetrisch angeordnete Stelle innerhalb des HBV-Einsatzstückes einwirkt. Die Plasmide pHBS-11 (mit der richtigen Ausrichtung) und pHBS-12 (mit der entgegengesetzten Ausrichtung) wurden selektioniert und in E. coli amplifiziert.
Die vorstehende Verfahrensweise wurde in der beschriebenen Weise angewendet, wobei aber das pMA56 anstelle des pFRP921 zum Einfügen des TacI-HpaI-S-Protein-Kodierungsfragmentes in das pMA56 an der EcoRI-Stelle verwendet wurde. Zwei Plasmide wurden isoliert und gekennzeichnet, nämlich das pHBS-16, welches das virale Gen in der richtigen Ausrichtung in bezug auf den ADH1-Promotor enthielt, und das pHBS-20, welches das S-Protein-Gen in der entgegengesetzten Ausrichtung aufwies.

BEISPIEL 3

Synthese des HBsAg in Hefe.

Protoplasten des Hefe-Rezipienten-Stammes XV610-8C oder GM3 C-2 wurden getrennt mit DNA aus jedem der vier Plasmide pHBS-11, pHBS-12, pHBS-16 und pHBS-20 unter den beschriebenen Transformationsbedingungen inkubiert, und auf Agarplatten mit einem Medium, in welchem Tryptophan fehlte, platiert. Die überlebenden Kolonien, die zur Tryptophanprototrophie transformiert worden waren, wurden isoliert. Zur Prüfung auf eine HBsAg-Synthese wurden Hefestämme, die mit jedem der vier Plasmide transformiert worden waren, getrennt in flüssigen Kulturen gezüchtet, und zwar in einem Medium, in welchem Tryptophan fehlte, und in der Mitte der log-Phase geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, und Zellextrakte wurden dadurch hergestellt, daß man die Zellen mit Glaskügelchen in einem 0,01M-Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), welcher 0,01M β-Mercaptoethanol und 0,1 % (Vol./Vol.) NP-40 -Detergens [Polyoxyethylen-(9)-octaphenol] enthielt, vermahlte. Auf das Vorliegen des HBV-Oberflächenantigens wurde unter Verwendung einer Radio-Immuno-Test-Ausstattung geprüft, welche im Handel von der Firma Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, erhältlich ist. Qualitative erzeugten diejenigen Plasmide, welche das Oberflächenantigen-Kodierungsfragment in der richtigen Ausrichtung enthielten, nämlich die Plasmide pHBS-11 und pHBS-16, leicht nachweisbare Mengen des Oberflächenantigens, während in den Extrakten von Zellen, welche mit den Plasmiden pHBS-12 oder pHBS-20 transformiert worden waren, kein nachweisbares Oberflächenantigen gefunden wurde. Quantitativ erzeugte eine 200-ml-Kultur des XV-610-8C, welche das pHBS-16 enthielt, 1-2 um des Oberflächenantigenproteins. Zellen, welche das pHBS-11 enthielten, produzierten nur die Hälfte bis zu einem Drittel der Menge des Oberflächenantigens, was möglicherweise auf eine niedrigere Anzahl von Kopien je Zelle an den Plasmiden, welche den ars1-Replikationsstartpunkt enthalten, zurückzuführen ist.
Alle Zellextrakte wurden durch Saccharosegradienten-Sedimentation analysiert. Vorgeformte Saccharosegradienten von 5 % (Gew./Vol.) bis 30 % (Gew./Vol.) wurden mit einem Extrakt von XV610 -8C/pHBS-16- Zellen beschichtet, welche Zellen in der beschriebenen Art und Weise hergestellt worden sind, und Kontrollgradienten wurden mit einem Präparat von HBsAg beschichtet, welches aus einer Alexander-Zellkultur durch Reinigung isoliert worden war. Die Gradienten wurden in einem Schwenkbecherrotor während 8 h bei 27.000 U/min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde die Fraktionen gesammelt und nach dem oben beschriebenen Radio-Immuno-Test geprüft. Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch Hefe synthetisiertes HBsAg genau die gleichen Sedimentationseigenschaften aufweist wie HBsAg, welches aus Alexanderzellen isoliert worden ist. Für beide HBsAg-Präparate wurde ein Sedimentationswert von annähernd 60S errechnet.
Das durch Hefe synthetisierte HBsAg wurde anhand einer Kombination von Gleichgewichtszentrifugation in Cäsiumchlorid und von einer Sedimentation in einem Saccharosegradienten gereinigt. 100 ml Zellen, die auf eine optische Dichte (O.D.) von 2,0 bei 650 nm gezüchtet worden waren, wurden durch Zentrifugieren geerntet, wobei 0,150 ml an gepackten Zellen erhalten wurden. Die Zellextrakte wurden (wie oben beschrieben) durch Vermahlen der Zellen mit Glaskügelchen auf solche Art und Weise hergestellt, daß nach einem Zentrifugieren bei 6.000 U/min während 15 min, um alle Zellabfälle zu entfernen, ein Gesamtvolumen von 0,5 ml an Extrakt erhalten wurde. Der Extrakt enthielt etwa 30 mg/ml Protein und insgesamt etwa 1 ug HBsAg. Der Extrakt wurde auf einen diskontinuierlichen Cäsiumchloridgradienten von 1,1 g/cm³ bis 1,4 g/cm³ aufgeschichtet und in einem Schwenkbecherrotor vom Typus SW41 der Firma Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornien, bei 30.000 U/min während 24 h zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurden die Fraktionen gesammelt und wie oben beschrieben geprüft. Als Marker wurde ein Kontrollröhrchen, welches aus Alexanderzellen stammendes HBsAg enthielt, in identischer Weise behandelt. Das Hefe-HBsAg wanderte gemeinsam mit dem Alexander-Zellen- HBsAg-Peak, mit einer Schwimmdichte von 1,19 g/cm³. Die Fraktionen, welche Hefe-HBsAg enthielten, wurden zusammengegeben, dialysiert, auf einen vorgeformten Saccharosegradienten von 5 bis 30 % (Gew./Vol.) aufgebracht und während 36 h bei 30.000 U/min zentrifugiert. Auch hier wieder, wie schon früher beobachtet worden ist, fiel der Peak des Hefe-HBsAg genau mit demjenigen des HBsAg aus Alexanderzellen zusammen. Die vereinigten Peak-Fraktionen hatten eine Gesamtproteinkonzentration von 0,01 mg/ml und ergaben eine Gesamtausbeute an HBsAg von 15 %.
Aufgrund der Sedimentationsdaten war es offensichtlich, daß das HBsAg in der Hefe in der Form von Teilchen oder Aggregaten synthetisiert worden ist. Die Art dieser Teilchen wurde durch Elektronenmikroskopie weiter gekennzeichnet. Die aus Hefe synthetisierten HBsAg-Teilchen, die wie oben beschrieben gereinigt worden waren, wurden auf Kohlenstofffilmgittern adsorbiert und mit Uranylacetatfarbstoff (2 %ig (Gew./Vol.) während 7 min) angefärbt. Unter dem Elektronenmikroskop wurden in Hefe synthetisierte HBsAg-Teilchen beobachtet, welche das gleiche Aussehen, aber einen kleineren Durchmesser, im Vergleich zu einem HBsAg aus Alexanderzellen hatten. Bei diesen Untersuchungen hatten die Alexanderzellen-HBsAg-Teilchen einen Durchmesser von etwa 20 nm, während die Y-HBsAg-Teilchen einen Durchmesser von etwa 16 bis etwa 17 nm aufwiesen (siehe Fig. 3). Es wird angenommen, daß diese Ergebnisse erstmals das Zusammenfügen eines heterologen Proteins in einem Wirtsmikroorganismus zu einer Struktur höherer Ordnung demonstrieren.
Bei verwendung des Hefestammes GM3C-2 als Wirt wurden höhere Ausbeuten, nämlich bis zu dem 5-fachen, erhalten. Dieser Stamm ist ein zierlicher Stamm, dessen erhöhte Abhängigkeit von einem Kohlenhydratstoffwechsel zu einer erhöhten Aktivität für den ADH-Promotor führen kann. Das hohe Ausmaß an Expression, das in dem GM-3C-2-Stamm beobachtet wird, kann auch das Ergebnis der Verwendung eines modifizierten Vektors, nämlich des Plasmides pHBS-25, sein, welches Plasmid das S-Protein-Kodierungsfragment, von einem ADH1-Promotorfragment und einem ADH-Terminationsfragment flankiert, enthält. Das Tac1-HpaI- HBV-Kodierungssegment wurde mit HindIII-Oligonukleotid-Linkern ausgestattet und an dem 5'-Ende mit dem ADH1-Promotorfragment ADH1-906 verbunden, welches an seinem 3'-Ende in einer HindII-Linkersequenz terminierte. Das 3'-Ende des HBV-Abschnittes wurde mit einem 450-bp-HindIII-BamHI-Fragment des ADH1-Gens verbunden, welches die Kodierungsregion für die 43 C-terminalen Aminosäuren des ADH, das Stop-Codon TAA und einen Teil der untranslatierten 3'-Region enthielt (siehe Bennetzen und Mitarbeiter, J. Biol. Chem., Bd. 257, S. 3018 (1982)), und zwar derart, daß beide Fragmente in der gleichen Richtung der Transkription ausgerichtet waren. Das so entstandene Verbundsegment, nämlich der ADH-H-5-S-Protein-ADH-Terminator, war von BamHI-Stellen flankiert, welche an der BamHI-Stelle die Insertion von pMA56 ermöglichten. Wenn dieses letztere Plasmid derart eingefügt wurde, daß der ADH-Terminator-Abschnitt benachbart zu dem ADH1-906-Promotorfragment angeordnet war, dann wurde der so entstandene Vektor mit pHBS-25 bezeichnet.
Die Konstruktion von Vektoren der zu dem pHBS56-3 bzw. pHBS56-5 (Beispiel 6) analogen 25-Reihe kann leicht dadurch bewirkt werden, daß man die Verbundgene für das S-Protein, jeweils flankiert von den ADH-Promotor- bzw. Terminatorsegmenten, die im Beispiel 6 beschrieben sind, verwendet. Das aus dem pHBS16-3 abgeleitete Verbundgen wird an der Sph1-Stelle des pMA56 eingefügt, durch Sph1-Digestion linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt, um eine Rekonstitution des pMA56 beim Fehlen des eingefügten Verbundgens zu verhindern, wie dies von Shine in der US-PS 4,264.371 beschrieben worden ist. Bei dieser Konstruktion unterscheiden sich das pHBS25-3 und das pHBS-25-5 von dem pHBS25 dadurch, daß das Verbundgen an der Sph1- Stelle des pMA56, statt an der nahe dazu gelegenen BamHI-Stelle des pMA56, eingefügt ist.
Der Transfervektor pHBS-16 und ein Hefestamm, welcher den durch das Plasmid pHBS-16 transformierten Stamm XV610-8C umfaßt, sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, hinterlegt worden.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel zeigt das Entfernen eines untranslatierten 5'-Segmentes von einer HBV-DNA. Das die S-Protein-Region umfassende DNA-Segment, welches wie im Beispiel 2 beschrieben isoliert worden war, enthielt am 5'-Ende der Kodierungsregion ein untranslatiertes 26-bp-Segment, welches zwischen dem Promotor und dem ATG-Start-Codon gelegen war. Die folgende Verfahrensweise wurde entwickelt, um alle, oder alle bis auf eine, der Basen der untranslatierten 5'-Region der HBV-DNA, welche Basen vorangehend zu der S-Protein-Kodierungsregion angeordnet waren, zu entfernen.
Das Plasmid pHBS-5 wurde mit EcoRI-Endonuclease digeriert, wobei ein Fragment entstand, welches annähernd 850 Basenpaare, einschließlich der S-Protein-Kodierungsregion und der diese flankierenden, untranslatierten 3'- und 5'-Regionen, umfaßte und welches von EcoRI- Linker-Oligonukleotidsegmenten beendet wurde. Das HBV-DNA-Segment wurde durch präparative Gel-Elektrophorese erneut isoliert, elektroeluiert und auf Proben aufgeteilt, welche während unterschiedlicher Zeitabschnitte von 0,5 bis 30 min bei 37º C mit der Exonuclease Bal-31 digeriert wurden. Das Ausmaß der Exonuclease-Digestion wurde qualitativ dadurch gekennzeichnet, daß man einen Teil von jeder Probe mit XbaI-Endonuclease digerierte. Die S-Protein-Kodierungsregion enthält eine XbaI-Stelle, und zwar beginnend in einem Abstand von 92 Basenpaaren von der ersten Base des Start-Codons weg. Daher würden Proben, bei welchen die Bal-31-Digestion über die XbaI-Stelle hinaus fortgeschritten war, bei der Gel-Elektrophorese nach einem Inkubieren mit XbaI-Endonuclease nur ein einziges Fragment ergeben, während Proben, bei denen nur eine geringere Anzahl von Basen entfernt worden ist, zwei Klassen von Fragmenten ergeben würden: nämlich ein homogenes, großes Fragment und ein kleines Fragment von heterogener Größe. Proben, welche nur ein einziges XbaI-Fragment ergaben, wurden verworfen. Proben, welche zwei Größenklassen von Fragmenten ergaben, wurden durch Inkubation mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment, siehe H. Klenow und Mitarbeiter, Proc. Nat. Acad. Sci. 65, 168 (1970)) in Gegenwart von allen vier Desoxynukleotidtriphosphaten stumpfendig gemacht. Linker-Oligonukleotide mit einem Gehalt an der EcoRI-Erkennungsstelle wurden durch Stumpfend-Ligation unter Verwendung von T4-DNA-Ligase hinzugefügt. Durch Digestion mit EcoRI-Endonuclease wurden EcoRI-spezifische, kohäsive Enden erzeugt. Die modifizierte DNA wurde durch Gel-Elektrophorese isoliert, elektroeluiert und in einer durch DNA-Ligase katalysierten Reaktion an mit EcoRI-Digeriertes, mit alkalischer Phosphatase behandeltes pBR322 gebunden. Die Rekombinanten-Plasmide wurden dann zum Transformieren von E. coli HB-101 verwendet.
Es wurden zwei Strategien zum Aussortieren und Kennzeichnen von Klonen mit gekürzten, untranslatierten 5'-Segmenten angewendet. Bei der ersten dieser Strategien wurden einzelne Kolonien auf das Vorliegen der S-Protein-Kodierungsregion durch in-situ-Hybridisierung der Kolonien unter Verwendung von markierter S-Protein-Kodierungs-DNA als Gen-Sonde untersucht. Kolonien, die dabei ein positives Ergebnis hinsichtlich des Vorliegens der S-Protein-Kodierungsregion ergaben, wurden zum Ansetzen von Kulturen verwendet, aus welchen Vektor-DNA hergestellt wurde. Die Vektor-DNA wurde mit EcoRI-Endonuclease inkubiert, um die S-Protein-Kodierungsregion herauszuschneiden.
Die so hergestellte S-Protein-Kodierungs-DNA wurde analysiert, und zwar entweder durch Bestimmung der Größe der Fragmente, die durch Xba1-Endonuclease-Digestion erzeugt worden waren, oder durch DNA-Sequenzieranalyse der 5'-terminalen Sequenzen (A. Maxum und Mitarbeiter, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977)).
Eine zweite Sichtungsstragetie wurde zum Auffinden von Klonen angewendet, in welchen die untranslatierte 5-Region etweder vollständig entfernt worden war, oder gerade eine Base vor dem Start-Codon terminiert worden war. Bei dieser Methode wurde die Beobachtung ausgenützt, daß die ersten vier Basen der S-Protein-Kodierungssequenz, nämlich ATGG, wenn dieselben an einem EcoRI-Linker-Oligonukleotid (GGAATTCC) angeheftet wurden, eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease NcoI: nämlich CCATGG, erzeugten. Die so erzeugte NcoI-Stelle wäre eine singuläre in dem Vektor, da weder das pBR322 noch die S-Protein-Kodierungsregion eine NcoI-Stelle enthält. Daher wäre jedes beliebige S-Protein-Kodierungssegment, bei welchem die Bal-31- Digestion genau an dem ATG-Start-Codon beendet wurde, durch das Entstehen einer neuen NcoI-Stelle gekennzeichnet, wenn dieses Segment an ein EcoRI-Linker-Oligonukleotid angeheftet worden ist. In der HBV-DNA liegt nun gerade neben dem ATG-Start-Codon der S-Protein- Region, in der untranslatierten 5'-Region, ein C-Rest vor. Daher werden Bal-31-Digestionsprodukte, welche nur den letzten C der untranslatierten 5'-Region beibehalten, auch eine NcoI-Erkennungsstelle bilden, wenn sie an ein EcoRI-Linker-Oligonukleotid angeheftet worden sind. Auf diese beiden spezifischen konstruktionen wurden die Klone dadurch sortiert, daß man sie mit einer Kombination von NcoI- und XbaI-Endonucleasen inkubierte und anschließend die entstandenen Fragmente einer Gel-Elektrophorese unterwarf, falls solche Fragmente überhaupt vorhanden waren. Diejenigen Klone, welche ein 96-bp-Fragment ergaben, wurden daher ausgewält, da bei diesen Klonen alle, oder alle bis auf eine, der untranslatierten 5'-Basen entfernt worden waren, diese Klone aber das ATG-Start-Codon beibehalten hatten. Die genaue Sequenz wurde dann unter Anwendung der Verfahrensweise von Maxum und Mitarbeitern durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Das so entstandene Plasmid, bei welchem das pBR322 mit einem modifizierten HBV-Segment verbunden worden war, aus welchem Segment die gesamte, untranslatierte 5'-Region des S-Protein-Gens entfernt worden war, und welches Segment an der EcoRI-Stelle eingefügt worden war, wurde mit pHBS5-3 bezeichnet (siehe Fig. 4). Übrigens war das HBV-DNA-Segment in dem pHBS5-3 auch durch die Entfernung von etwa 40 Basenpaaren aus der untranslatierten 3'-Region modifiziert worden, und zwar aufgrund der gleichzeitigen Einwirkung der Bal-31-Exonuclease an dem 3'-Ende.
Es wurde eine Konstruktion eines Expressionsvektors durchgeführt, der analog zu dem im Beispiel 2 beschriebenen pHBS16 war, und zwar durch Insertion des modifizierten HBV-DNA-Segmentes des pHBS5-3 anstelle des entsprechenden Segmentes bei dem pHBS16. Zu diesem Zweck wurde durch EcoRI-Endonuclease-Digestion und Religation ein Vektor vom "16-Typus" hergestellt, und wurde anschließend eine Selektion aufgrund eines Vektors durchgeführt, bei welchem die HBV-DNA deletiert worden war. Expressionsvektoren, welche durch Insertion von modifizierten HBV-DNA-Segmenten an der EcoRI-Stelle des Vektors vom 16-Typus konstruiert worden sind, wurden durch die Bezeichnung pHBS16-X gekennzeichnet, worin X eine Zahl ist, welche die Modifikation der an der EcoRI-Stelle eingefügten HBV-DNA kennzeichnet. So entstand bei der Überführung des HBV-DNA-Segmentes von dem pHBS5-3 auf den 16-Vektor ein Expressionsplasmid, welches mit pHBS16-3 bezeichnet wurde. (Siehe Fig. 5.) Alle Konstruktionen wurden aufgrund der richtigen Ausrichtung der S-Protein-Kodierungsregion in bezug auf den ADH1-Promotor sortiert, und zwar durch eine kombinierte Digestion mit BamHI und eine XbaI-Endonuclease- Digestion. Die richtige Ausrichtung ergab ein Bam-Xba-Fragment mit einer Länge von annähernd 1600 Basenpaaren, während eine unrichtige Ausrichtung ein längeres Fragment ergab.
Die Wirtsstämme für die 16-Reihe von Expressionsvektoren waren Saccharomyces cerevisiae AB 35-D3-D a, leu2-3, leu2-112, ura3-52, trp1-289, his4-580, ade2 oder Saccharomyces cerevisiae AB 35-14-D. Probekulturen des Wirtsstammes, der entweder mit pHBS16 oder mit pHBS16-3 transformiert worden war, wurden unter äquivalenten Bedingungen gezüchtet, und das Y-HBsAg wurde qualitativ durch einen Radio-Immuno- Test geprüft, wie dies im Beispiel 3 beschrieben ist. Zellen, die mit pHBS16-3 transformiert worden waren, erzeugten ungefähr 2,2-mal soviel Y-HBsAg pro Zelle wie die durch pHBS16 transformierten Zellen.

BEISPIEL 5

Es wurde ein weitere Modifikation an der im Beispiel 4 beschriebenen Vektorkonstruktion durchgeführt, wobei die während der Bal-31-Digestion entfernte, untranslatierte 3'-Region wiederhergestellt wurde. Die Strategie dieser Konstruktion bestand darin, daß man an der XbaI-Stelle, innerhalb der S-Protein-Kodierungsregion, ein aus dem pHBS5-3 stammendes Fragment der Kodierungsregion, welches wie in Beispiel 4 beschrieben modifiziert worden war, zusammen mit einem unmodifizierten Fragment aus dem pHBS5, das eine intakte, untranslatierte 3'-Region aufwies, anheftete.
Das HBV-DNA-Segment des pHBS5, welches Segment die untranslatierte 5'-Region und den zu dem Promotor nächstgelegenen Teil der S-Protein- Kodierungsregion enthielt, wurde durch die aufeinanderfolgende Einwirkung von ClaI-Endonuclease und XbaI-Endonuclease entfernt. Das Plasmid wurde zuerst mit der ClaI-Endonuclease gespalten. Die so entstandenen, ungepaarten Enden wurden unter Verwendung eines DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragmentes in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate gefüllt, wobei ein linearer Vektor mit stumpfen Enden entstand. Die DNA wurde dann mit XbaI-Endonuclease und alkalischer Phosphatase digeriert. Diese letztgenannte Behandlung wurde in der Absicht vorgenommen, zu gewährleisten, daß die durch die vorhergehende Reihe von Schritten geschaffenen Enden sich in Gegenwart der DNA-Ligase nicht wieder miteinander verbinden konnten (Shine und Mitarbeiter, l.c.).
Die modifizierte HBV-DNA des pHBS5-3 mit einem Gehalt an dem zu dem Promoter nächstgelegenen Teil der Kodierungsregion für S-Protein wurde auch durch aufeinanderfolgende Endonuclease-Digestion hergestellt. Das Plasmid pHBS5-3 wurde zuerst mit EcoRI-Endonuclease gespalten und mit Hilfe von DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate mit stumpfen Enden versehen. Dann wurde die DNA mit Xba-Endonuclease gespalten. Das kleine Fragment, welches bei der Spaltung mit XbaI entstanden war, und welches annähernd 100 Basenpaare umfaßte, und welches ein stumpfes EcoRI-Ende und ein XbaI-Ende aufwies, wurde durch Gel-Elektrophorese und Elektroeluierung isoliert. Der Zweck der aufeinanderfolgenden Endonuclease- Behandlungen lag in beiden Fällen darin, zu gewährleisten, daß das 100 Basenpaare umfassende Fragment in der richtigen Ausrichtung mit der DNA des gespaltenen Vektors verbunden werde. Das aus dem pHBS5-3 stammende, 100 Basenpaare umfassende Fragment wurde mit modifizierter Vektor-DNA vermischt, welche aus dem pHBS5 stammte, und zwar in der Gegenwart von DNA-Ligase und unter Bedingungen, welche sowohl eine Ligation von stumpfendiger DNA ermöglichen als auch eine Verbindung der paarigen Enden ermöglichen, welche aus den XbaI-Schnittstellen stammen. Die Transformanden wurden selektioniert und durch das Vorliegen einer NcoI-Stelle identifiziert, welche letztere aus dem kleinen Fragment aus dem pHBS5-3 stammte (siehe Beispiel 4).
Es war erwarten, daß die neben der NcoI-Stelle befindliche EcoRI- Stelle durch die angewendete Konstruktionsstrategie regeneriert werden würde. Ein Basenpaar in der angefüllten EcoRI-Stelle wurde jedoch durch die Behandlung mit der DNA-Polymerase nicht regeneriert. Demzufolge wurde die EcoRI-Stelle nicht in der erwarteten Weise regeneriert. Zum Glück regenerierten die wieder miteinander verbundenen Sequenzen jedoch in der Tat die ClaI-Stelle.
Die DNA-Nukleotidsequenzanalyse des entstandenen, mit pHBS6 bezeichneten Vektors, der schematisch der Fig.4 dargestellt ist, bestätigte, daß die HBV-DNA-Region des Vektors die gesamte S-Protein-Kodierungsregion und die untranslatierte 3'-Region enthielt sowie eine Deletion der untranslatierten 5'-Region aufwies, wie die für pHBS5-3 beschrieben worden ist. Das wie in dem pHBS6 modifizierte HBV-DNA-Segment wurde wie folgt in einen Expressionsvektor der 16-Reihe überführt: Die HBV-DNA-Region des pHBS6 wurde durch die kombinierte Einwirkung von NcoI- und EcoRI-Endonucleasen isoliert und durch Inkubieren mit DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate mit stumpfendiger DNA versehen. Das so entstandene 820-bp-Fragment wurde durch Gel-Elektrophorese und Elektroelution isoliert. Der Expressionsvektor pHBS16, oer der im Beispiel 4 beschriebene "16-Vektor", wurde durch die Einwirkung von EcoRI-Endonuclease gespalten, unter Verwendung von DNA-Polymerase-I- Klenow-Fragment in Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate mit stumpfendiger DNA versehen und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das HBV-DNA-Fragment wurde dann an den behandelten 16-Vektor durch Stumpfend-Ligation unter Verwendung von T4-DNA-Ligase angeheftet. Bei richtiger Ausrichtung der Fragment wurde eine EcoRI-Stelle zwischen dem ADH-Promotor und dem Start-Codon der S-Protein-Kodierungsregion regeneriert. Eine DNA-Nukleotidsequenzanalyse wurde durchgeführt, wobei die Struktur der entstandenen Konstruktion bestätigt wurde; welche Konstruktion mit pHBS16-5 bezeichnet wurde, und welche Konstruktion schematisch in der Fig. 5 dargestellt ist.
Die relative Rate der Expression des Y-HBsAg für Hefezellen, die mit dem pHBS16-5 transformiert worden waren, wurde unter den gleichen Bedingungen wie für das im Beispiel 4 beschriebene pHBS16-3 gemessen. Die Rate der Expression des Y-HBsAg durch Saccharomyces cerevisiae AB-35-D3-D, welcher durch pHBS16-5 transformiert worden war, war annähernd 2,8 mal größer pro Zelle, gemessen in einem Radiuo-Immuno-Test, als jene der Expression durch Zellen, welche mit dem pHBS16 transformiert worden waren.
Eine verwandte Konstruktion, bei welcher das HBV-DNA-Segment des pHBS6 verwendet wurde, wurde unter Verwendung einer identischen Verfahrensweise durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß das HBV-DNA-Fragment mit einem EcoRI-Endonuclease-Präparat, welches eine gewisse EcoRI*-Aktivität aufwies, herausgeschnitten wurde. Nach der Ligation mit dem 16-Vektor, der wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war, wurde gefunden, daß der Expressionsvektor sowohl die EcoRI-Stelle als auch die NcoI-Stelle neben dem ATG- Start-Codon der S-Protein-Kodierungsregion verloren hatte. Das so entstandene Expressionsplasmid wurde mit pHBS16-4 bezeichnet. Die Nukleotidsequenz neben dem S-Protein-Start-Codon war 5'...ACTATCTGGCATGG...3'. Die Expressionsgeschwindigkeit in Hefezellen, die mit dem pHBS16-4 transformiert worden waren, war mit derjenigen von Zellen vergleichbar, die mit dem pHBS16-5 transformiert worden waren, und zwar innerhalb der Fehlergrenzen der Versuchsanordnung. Die Struktur des pHBS16-4 ist schematisch in der Fig. 5 dargestellt.
Die Nukleotidsequenz neben dem S-Protein-Start-Codon des pHBS-16-3 war 5'...ACTATCTGGAATTCCCATGG...3'. Die Sequenz für pHBS-16-5 war 5'...ACTATCTGGAATTCATGG...3'. Der Sequenzunterschied zwischen 16-3 und 16-5 war eine Folge der Ausstattung der DNA mit stumpfen Enden nach der EcoRI-Digestion des pHBS-6.

BEISPIEL 6

In diesem Beispiel sind Einzelheiten der Konstruktion einer Reihe von Vektoren für die Expression beschrieben, welche Vektoren dadurch gekennzeichnet sind, daß sie innerhalb ihrer Sequenz die gesamte 2-um-Kreis-Plasmid-DNA-Sequenz zusammen mit DNA-Segmenten aufweisen, welche die Promotor- und Transkriptionsterminatorsequenzen des Hefe-ADH-Gens umfassen, wobei die S-Protein-Kodierungsregion zwischen der ADH-Promotor-Region und der ADH-Terminator-Region eingefügt ist. Diese Vektoren wurden als Vektoren der "56"-Reihe bezeichnet, und ihre Nomenklatur steht im Einklang mit der Nomenklatur der 16-Reihe von Expressionsvektoren. Somit enthält der Expressionsvektor pHBS56-3 das S-Protein-Gen, welches wie für das pHBS16-3 beschrieben modifiziert worden ist, während das pHBS56-5 eine HBV-DNA enthält, welche wie für das pHBS16-5 beschrieben modifiziert worden ist, wie dies in den Beispielen 4 bzw. 5 beschrieben worden ist. Die in voller Länge vorhandene 2-um-Kreis-DNA sorgt für eine stabile Replikation in einem Kreis-Null-Wirtsstamm beim Fehlen eines Stoffwechselselektionsdruckes. Der ADH-Terminator wurde zur Erhöhung der Stabilität der S-Protein-mRNA-Transkripte vorgesehen.
Das parentale Plasmid für die Konstruktion der Vektoren vom 56-Typus war pCl/1, welches ein Hybridplasmid zwischen dem pBR-322 und einem 2-um-Kreis-Plasmid war, welche an deren EcoRI-Stellen miteinander verbunden waren. Der 2-um-Kreis-Teil war zuvor dahingehend modifiziert worden, daß er ein eingefügtes LEU2-Gen von hefe enthielt, und war aus dem von J. Beggs und Mitarbeitern in Nature 275, 104 (1978), beschriebenen Plasmid pJBD219 erhalten worden. Die Restriktionskarte des pCl/1 ist in der Fig. 6 dargestellt.
Aus der Fig. 6 ist zu ersehen, daß durch eine Digestion des pCl/1 mit der Endonuclease SphI ein Teil des Plasmides, nämlich derjenige Teil, welcher die 2-um-pBR-322-Verbindungsstelle überspannt, deletiert worden ist. Es ist beobachtet worden, daß der aktive Teil der ADH1-Promoterregion innerhalb eines SphI-HindIII-Fragmentes mit einer Länge von annähernd 300 Basenpaaren enthalten war (siehe "The Sequence of the ADH1-Gene", von J.L. Bennetzen und B.D. Hall in J. Biol. Chem. 257, 301 (1982)). Die Erkennungssequenz für SphI ist GCATGC, und eine solche Sequenz liegt in dem ADH-Promotor, beginnend bei der Position -413, vor. In ähnlicher Weise war die Hefe-Terminatorsequenz innerhalb eines HindIII-SphI-Fragmentes von etwa 330 Basenpaaren enthalten. In beiden Fällen war die SphI- Stelle distal zu der Kodierungsregion angeordnet, so daß die HBV-S- Protein-Kodierungsregion dazwischen eingefügt werden konnte, wenn dieselbe an ihren Termini mit HindIII-Stellen ausgestattet war. Die Vorläuferquelle für die ADH-Promotor- bzw. Terminatorsegmente war das Plasmid pAAH5, welches ein 1500-bp-ADH1-Promoterfragment, das an der Position -9 in der Nukleotidsequenz beendet ist (R.A. Hitzeman und Mitarbeiter, l.c.), und eine ungefähr 450 Basenpaare umfassende Terminatoreinheit von den Nukleotiden 913 bis 1368 in der ADH-Gen-Nukleotidsequenz enthält, welches Promoterfragment bzw. welche Terminatoreinheit durch eine HindIII-Stelle zwischen den Fragmenten miteinander verbunden sind un jeweils an einer BamHI-Stelle in den Vektor YEp13 hineinkloniert worden sind. (J. Broach und J. Hicks, Gene 8, 121 (1979)). Das HBV-DNA-Segment des pHBS5 wurde durch EcoRI-Digestion herausgeschnitten. Die hervorstehenden Enden wurden unter Verwendung des DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragmentes ausgefüllt und an beiden Enden mit HindIII-Linker-Oligonukleotiden mit der Sequenz CAAGCTTG verbunden. nach einer HindIII-Endonuclease- Digestion, um unpaarige, HindIII-spezifische Enden auf dem HBV-DNA- Segment freizusetzen, wurde das Segment an das Plasmid pAAH5, das mit HindIII zerschnitten worden war, angeheftet, wodurch die HBV-S- Protein-Kodierungssequenz zwischen dem ADH-Promotor- bzw. Terminatorfragment angeordnet wurde. Ein Plasmid mit dem S-Protein-Gen in der richtigen Ausrichtung in bezug auf das Promotor- bzw. Terminatorfragment, wobei diese richtige Ausrichtung durch Restriktionsanalyse bestimmt wurde, wurde mit pHBS-22 bezeichnet. Es wurde gefunden, daß die ADH-Promotorsequenz bzw. die ADH-Terminatorsequenz jeweils eine SphI-Stelle (Erkennungssequenz GCATGC) enthielten, wodurch es ermöglicht wurde, das gesamte Verbundgen, welches etwa 400 Basenpaare des ADH1-Promotors, die HBV-S-Protein-Kodierungsregion, und etwa 330 Basenpaare des ADH1-Terminators umfaßte, durch Digestion mit SphI-Endonuclease herauszuschneiden. Eine Digestion des pHBS22 mit SphI-Endonuclease ergab das intakte Verbund-Gen in einem Fragment aus annähernd 1500 Basenpaaren. Das Fragment wurde mit dem durch SphI zerschnittenen Vektor pCl/1 verbunden. E. Coli-HB101-Transformanden wurden aufgrund ihrer Ampicillin-Resistenz und aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin aussortiert, da bei dem Segment, das bei der SphI-Endonuclease-Digestion des pCl/1 herausgeschnitten worden war, ein Teil des Tetracyclin-Resistenz-Gens des pBR322-Segmentes deletiert worden ist. Die Struktur des entstandenen Vektors, der mit pHBS56 bezeichnet wurde, wurde weiterhin durch Restriktionsanalyse bestätigt. E. coli-HB101-Transformanden, welche aus den Produkten der Ligase-Reaktion erhalten worden waren, wurden auf Ampicillin enthaltenden Platten kloniert. Die Plasmid-DNA aus den Produkten, die aus den einzelnen, in der Kultur gezüchteten Kolonien isoliert worden waren, wurde durch eine Analyse mit Restriktionsendonuclease auf die Insertion und auf die richtige Ausrichtung der S-Protein-Kodierungsregion geprüft. Das selektionierte Plasmid, pHBS-56, welches die HBV-S-Protein-Kodierungsregion in richtiger Ausrichtung in bezug auf das ADH-Promotor- bzw. ADH-Terminatorsegment enthält, ist in der Fig. 6 dargestellt.
Es wurden zwei zusätzliche Vektoren vom 56-Typus unter Verwendung eines Promotorfragmentes und der dem Promotor nächstgelegenen Region des S-Protein-Kodierungssegmentes, welches aus dem pHBS16-3 bzw. aus dem pHBS16-5 erhalten worden waren, konstruiert. Diese Konstruktionen wurden mit pHBS56-3 bzw. pHBS56-5 bezeichnet. In jedem dieser zwei Fälle war ein SphI - XbaI-Fragment in einer durch DNA-Ligase katalysierten Reaktion mit dem größeren der zwei SphI - ZbaI-Fragmente verbunden worden, welche letzteren durch Digestion von pHBS56 erhalten worden waren. Das größere Fragment, von annähernd 1080 Basenpaaren, erstreckt sich von der XbaI-Stelle innerhalb der S-Protein-Kodierungsregion bis zu der SphI-Stelle der ADH-Terminatorregion. Dieses Fragment wurde noch vor dem Anheften an das SphI - XbaI-Fragment von entweder dem pHBS16-3 oder dem pHBS16-5, in einer durch DNA-Ligase katalysierten Reaktion, durch Gel-Elektrophorese und Elektroelution isoliert. Die beiden so konstruierten Verbundgene waren identisch, wenn man von der Sequenz der untranslatierten 5'-Region zwischen dem ADH-Promotor und dem S-Protein-Start-Codon absieht, wobei diese Unterschiede auf Unterschiede in den jeweiligen als Quelle dienenden Vektoren, nämlich pHBS16-3 bzw. pHBS16-5, zurückzuführen sind. Beide Verbundgene wurden - in getrennten Reaktionen - subkloniert, und zwar an der SphI-Stelle des pBR322, welche zwischen der BamHI- Stelle und der SalI-Stelle des pBR322 gelegen ist, und zwar zu dem Zweck, vervielfachte Mengen an Verbundgen-DNA zu erhalten. Die Subklonierungsvektoren wurden aufgrund ihrer Fähigkeit selektioniert, Transformanden vom Phänotyp E. coli HB101 eine Ampicillin- Resistenz und eine Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin mitzuteilen.
In der letzten Stufe wurde das große Fragment, das durch eine SphI-Spaltung des pHBS56 erzeugt worden war, mit alkalischer Phosphatase behandelt und durch Gel-Elektrophorese und Elektroelution isoliert. In ähnlicher Weise wurden die Verbundgene aus deren Subklonierungsvektoren durch SphI-Spaltung herausgeschnitten und durch Gel-Elektrophorese und Elektroelution , jedoch ohne Phosphatasebehandlung, isoliert. Diese Gene wurden, in getrennten Reaktionen, mit dem großen SphI-Fragment des pHBS56 vereinigt und in durch DNA-Ligase katalysierten Reaktionen damit verbunden, wobei pHBS56-3 bzw. pHBS56-5 erhalten wurden. Die E. coli-HB101-Transformanden wurden aufgrund ihrer Ampicillin-Resistenz und aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin selektioniert und durch Restriktionsanalyse weiter gekennzeichnet. Eine schematische Darstellung der Konstruktionsstufen und karten der relevanten Vektoren sind in der Fig. 7 dargestellt. Obgleich die Nomenklatur der Vektoren vom 56-Typus parallel zu derjenigen der Vektoren vom 16-Typus ist, versteht es sich von selbst, daß sich die Unterschiede in dem Falle der Vektoren der 56-Reihe jeweils nur auf die untranslatierte 5'-Region beziehen, und daß die untranslatierte 3'-Region bei jedem Glied in der Reihe die gleiche ist. Im speziellen fehlt bei dem pHBS56-3 die 40 Basenpaare umfassende Deletion in der untranslatierten 3'-Region, welche Deletion aber bei dem pHBS-16-3 vorkommt.
Nach der Klonierungsselektion und der Kennzeichnung wurden die Vektoren der 56-Reihe zum Transformieren eines Kreis-Null-Hefestammes, der mit 2150-2-3 bezeichnet wird, verwendet. Der Stamm war durch eine genetische Kreuzung zwischen dem Stamm Y379-5-D cyh2 nibl (rho&supmin;); D. Livingston, Genetics 86, 73 (1977); und dem Stamm DC 04 a AdeI AdeX leu2-04 (cir&sup0;) (J. Broach, Cell, 21, 501 (1980)), erhalten worden. Der aus der Kreuzung stammende, diploide Stamm wurde Sporen bilden gelassen, und Tetraden wurden nach einer Standardverfahrensweise in zwei Teile zerschnitten. Eine der haploiden Sporen ergab den Stamm 2150-2-3 a AdeI Leu2-04 (cir&sup0;). Hefetransformanden wurden aufgrund des Leu&spplus;-Phänotyps selektioniert, welcher Phänotyp durch das Vorliegen der Plasmide der pHBS-56-Reihe mitgeteilt wird.
Die relativen Raten der Y-HBsAg-Expression in verschiedenen Plasmid-Wirts-Kombinationen wurden in der folgenden Art und Weise miteinander verglichen: Eine Zellkultur mit einem Volumen von 1 Liter wurde bis zu ihrer Grenzzelldichte gezüchtet, und die Zellen wurden in Rohlysaten geerntet, welche Lysate auf den Gesamtgehalt an löslichem Protein und auf das Y-HBsAg analysiert wurden, und zwar unter Anwendung von Radio-Immuno-Tests, wie dies oben beschrieben worden ist. Die Ergebnisse wurden sowohl als ug Y-HBsAg je Liter der Kultur als auch als Y-HBsAg als Gew.-% des gesamten löslichen Hefeproteins ausgedrückt. Der letztgenannte Wert stellt ein Maß für das Ausmaß des Zellstoffwechsels, der der Produktion von Y-HBsAg gewidmet ist, dar, während der erstgenannte wert ein Maß für die Gesamtausbeute an dem Y-HBsAg, welche beim Züchten von Kulturen bis zu deren Grenzdichte erhältlich ist, darstellt. Unterschiede ergeben sich insbesondere im Falle der Vektoren der 56-Reihe, weil die diese Vektoren tragenden Zellen in reichen Medien ohne Selektionsdruck gezüchtet werden können, während die Vektoren der 16- und 25-Reihe ein Wachstum in einem speziellen Medium, in welchem Tryptophan fehlt, erforderlich machen, um eine Anhäufung von untransformierten Segreganten zu verhindern. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angeführt. Die in der Tabelle angegebenen Gewichte des Y-HBsAg wurden nach einem handelsüblichen Radio-Immuno-Test unter Verwendung von gegen das HBsAg gezüchtetem Antikörper bestimmt. Daher mögen die angeführten Mengen des Y-HBsAg kein absolutes Maß für die Masse darstellen, sondern mögen als firmenintern folgerichtig für Vergleichszwecke angesehen werden. Y-HBsAg-Ausbeuten Vektor pHBSWirt Kulturdichte (optische Dichte bei 660 nm) Gew.-% an löslichem Hefegesamtprotein ug-Y-HBsAg je Liter der Kultur

BEISPIEL 7

Herstellung einer Vakzine mit einem Gehalt an von Hefe synthetisiertem HBsAg.

Y-HBsAg-Teilchen werden aus Zellextrakten nach der Methode des Beispiels 3, oder nach geeigneten, auf dem Fachgebiet bekannten Methoden, wie solche z.B. in den US-PS'en 4,088.748 oder 4,181.713 beschrieben sind, durch Reinigung gewonnen. Die gereinigten HBsAg- Teilchen werden gegen physiologische Kochsalzlösung oder gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert und auf eine Endkonzentration von 100 ug Protein/ml eingestellt. An Meerschweinchen wird subkutan in Zeitabständen von 9, 14 und 56 Tagen jeweils 1 ml des HBsAg-Präparates verbreicht. Proben des Serums der Versuchstiere werden an den Tagen 0, 28, 56 und 84 entnommen und auf ihren Antikörpertiter gegen Dane-Teilchen, oder gegen HBsAg, das aus Alexander- Zellen durch Reinigung gewonnen worden ist, geprüft. Es wird der im Beispiel 3 beschriebene Radio-Immuno-Test angewendet, oder, als eine Alternative dazu, der Radio-Immuno-Test, der von F. Hollinger und Mitarbeitern in J. Immunol. 107, 1099 (1971), beschrieben worden ist. Die Mehrheit der Tiere zeigt 84 Tage nach Verabreichung der Teilchen Antikörper, welche eine Kreuzreaktion mit dem HBsAg aufweisen. Ähnliche Ergebnisse erhält man bei der Injektion in Affen. Demzufolge ist das von Hefe synthetisierte HBsAg immunogen und ist befähigt, Antikörper hervorzurufen, welche eine Kreuzreaktion mit natürlich vorkommendem HBsAg zeigen.
Das durch Hefe synthetisierte HBsAg hat den Vorteil, in signifikant größeren Mengen als jenes HBsAg verfügbar zu sein, welches aus Dane-Teilchen oder aus Trägerserum erhalten wird. Es ist ein einheitlicheres Produkt bei vorteilhaften Kosten je Einheit erhältlich, von welchen Kosten anzunehmen ist, daß sie bei einem zunehmenden Produktionsvolumen abnehmen werden. Außerdem besteht keine Gefahr einer zufälligen Infektion, weil in dem aus Hefe erzeugten Oberflächenantigen kein intaktes HBV vorhanden ist, und auch gar nicht vorhanden sein kann. Im Gegensatz hierzu besteht bei den viralen Proteinen, die aus Serum oder aus anderen natürlichen Quellen durch Reinigung gewonnen worden sind, stets die Gefahr einer Verunreinigung durch das Virus.

BEISPIEL 8

Wie dies im Beispiel 7 gezeigt worden ist, ist das von hefe synthetisierte HBsAg befähigt, Antikörper hervorzurufen, welche mit natürlich vorkommenden HBsAg eine Kreuzreaktion zeigen. Daraus folgt somit, daß solche Antigene und Antigenaggregate, wenn sie in der beschriebenen Art und Weise gereinigt worden sind und in einem physiologisch annehmbaren Medium verabreicht werden, eine Vakzine zum Schutz gegen eine Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus darstellen.
Sechzehn Schimpansen werden auf drei Gruppen aufgeteilt. Die Gruppe A (sechs Tiere) wird intravenös mit 1 ml eines Standard-Heptatitis-B- Virus-Präparates des Bureau of Biologics geimpft; die Gruppe B (vier Tiere) wird intravenös mit 1 ml eines Präparates geimpft, welches 200 ug HBsAg in physiologischer Kochsalzlösung enthält, welches HBsAg in Hefe synthetisiert worden ist und wie im Beispiel 3 beschrieben gereinigt worden ist; die Gruppe C (sechs Tiere) ist die Kontrollgruppe und erhält keine Impfung. Alle Schimpansen der Gruppe A weisen innerhalb von 40 Wochen Anzeichen einer klinischen Hepatitis B (entweder Antigenämie, erhöhte Enzymwerte und/oder Antikörperantwort) auf. Keines der Tiere in den Gruppen B oder C zeigt irgendwelche Anzeichen einer klinischen Hepatitis-B-Infektion in dem gleichen Zeitraum von 40 Wochen. Die Schimpansen der Gruppe B sind gegenüber einer späteren Infektion in der Form einer intravenösen Impfung mit 1,0 ml eines Hepatitis-B-Virus-Präparates des Bureau of Biologics immun geworden.

BEISPIEL 9

Das Y-HBsAg unterschied sich in mehrfacher Hinsicht von einem aus Plasma stammenden HBsAg. Die Durchmesser der HBsAg- und der Y-HBsAg- Teilchen wurden anhand von negativ angefärbten, mit einem Elektronenmikroskop erhalten, mikrographischen Darstellungen gemessen. Das aus der Hefe stammende Antigen hatte einen Durchmesser in einem Bereich von etwa 14 bis etwa 18 nm, während das aus Plasma stammende Antigen einen Durchmesser in einem Bereich von etwa 20 bis etwa 24 nm aufwies.
Das Y-HBsAg war bei einem pH-Wert von 2 unbeständig, und es war gegenüber Pepsin bei einem pH-Wert von 2 unbeständig, während das aus Plasma stammende HBsAg unter den gleichen Bedingungen stabil war. Zu 1 ml einer Suspension des gereinigten Y-HBsAg wurden 0,03 ml 1N HCl zugesetzt, um den pH-Wert auf 2,0 herabzusetzen. Die Probe wurde in zwei Hälften geteilt, und zu der einen Hälfte wurde 1 ug Pepsin hinzugefügt, während zu der anderen Hälfte kein Enzym hinzugefügt wurde. Beide Proben wurden 16 h lang auf 37º C gehalten, und dann wurden 0,03 ml 1N NaOH zu jeder der proben hinzugefügt, um den pH-Wert auf 7,0 anzuheben. Die beiden Proben wurden hinsichtlich ihrer Antigen-Bindungsaktivität in einem quantitativen Radio-Immuno- Test (RIA) gemessen. Bei jeder Probe waren mehr als 95 % der RIA- Aktivität verloren gegangen. Unter den gleichen Bedingungen behielt das aus dem Plasma stammende HBsAg seine gesamte Antigen-Bindungsaktivität bei.
Eine Probe von gereinigtem Y-HBsAg wurde in Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2-Mercaptoethanol bei 90º C während 5 min erhitzt.Die Probe wurde dann einer Elektrophorese durch ein 10 %iges Polyacrylamidgel mit einem Gehalt an 0,1 % SDS unterworfen. Das anschließende Anfärben des Gels mit Proteinfarbstoffen ergab eine einzige Bande bei einer Stelle, welche einem Molekulargewicht von etwa 25.000 entsprach. Eine Probe eines aus Plasma durch Reinigung gewonnenen HBsAg zeigt nach einer identischen Behandlung zwei Banden nach dem Anfärben: eine Bande bei etwa 25.000 Dalton, und eine zweite Bande bei etwa 28.000 Dalton.
Im Gegensatz zu aus Plasma stammendem HBsAg zeigte das Y-HBsAg keine Bindung an einen monoklonalen Antikörper (HBsAb), der gegen das HBsAg selektioniert worden war. Ein Rohextrakt von Hefezellen mit einem Gehalt an dem Oberflächenantgen wurde durch eine Affinitätsadsorptionssäule geführt, welche dadurch hergestellt worden war, daß man einen monoklonalen HBsAb an ein Agarosegel chemisch kuppelte. Eine Messung der aus der Säule austretenden Flüssigkeit ergab, daß 90 % des auf die Säule aufgebrachten Y-HBsAg in der austretenden Flüssigkeit vorhanden waren. Wenn ein aus einem Plasma stammendes HBsAg durch die gleiche Säule des monoklonalen HBsAb geführt wurde, ergab sich, daß weniger als 10 % des auf die Säule aufgebrachten Antigens in der aus der Säule austretenden Flüssigkeit vorhanden waren.
Das Y-HBsAg zeigte eine höhere Aktivität in Wirkungstests bei Mäusen. Das Y-HBsAg wurde vor der Verabreichung an einem Aluminiumhydroxidgel adsorbiert und wurde dahingehend verdünnt, daß es jeweils 10, 2,5, 0,62, 0,15 bzw. 0,0375 ug/ml enthielt. Mengen von jeweils 1 ml der vorstehenden Konzentrationen wurden intraperitoneal in jede von fünf Gruppen von fünf Wochen alten, weiblichen Mäusen injiziert. Jeweils eine dieser Konzentrationen wurde in eine der fünf Gruppen injiziert, wobei jede Gruppe zehn Mäuse enthielt. Das von der Hefe erzeugte Antigen hatte einen ED&sub5;&sub0;-Wert (d.i. die Konzentration des Antigens, welche erforderlich ist, um bei der Hälfte der Mäuse Antikörper zu erzeugen) von etwa 0,05 ug/ml, während das aus einem Plasma stammende Antigen bei der gleichen Verfahrensweise einen ED&sub5;&sub0;-Wert von etwa 0,5 ug/ml ergab.
Das in der beschriebenen Weise gereinigte Y-HBsAg war im wesentlichen frei von verunreinigenden Chemikalien. Eine Messung des Lowry-Proteins des Y-HBsAg zeigte 53 ug/ml, während eine Messung der RIA-Antigen- Bindungsfähigkeit dieses Antigens eine Konzentration von 12 ug/ml ergab. Die Messung des Lowry-Proteins und der RIA-Antigenbindungsfähigkeit eines reinen Präparates von aus einem Plasma stammendem HBsAg zeigte eine Proteinkonzentration von 44 ug/ml und eine Bindungsaktivität von 50 ug/ml.
In den physikalischen, chemischen oder antigenen Eigenschaften des Y-HBsAg, das aus Zellen erzeugt worden ist, welche ihrerseits mit dem pHBS-16, -25 oder -56 transformiert worden sind, wurden keine Unterschiede beobachtet.

BEISPIEL 10

Vergleichende Untersuchung der Wirkung in Mäusen von aus Hefe stammendem Antigen mit aus einem Plasma stammendem Antigen.

Eine Gesamtanzahl von 80 fünf Wochen alten, weiblichen Mäusen wurde auf zwei Gruppen von jeweils 40 Mäusen aufgeteilt, und jede Gruppe wurde weiterhin auf vier Untergruppen von jeweils 10 Mäusen unterteilt. Die 10 Mäuse aus jeder Untergruppe erhielten eine intraperitoneale Injektion von entweder dem Antigen, das gemäß Beispiel 3 unter Verwendung des Vektors pHBS-25 hergestellt worden war, oder eines aus einem Plasma stammenden Antigens, und zwar bei einer Konzentration von jeweils 10, 2,5, 0,625 bzw. 0,156 ug/ml. Erforderlichenfalls wurde ein Kochsalzlösungs-Alaun-Placebo als Verdünnungsmittel zum Verdünnen der Antigenkonzentration zur Erzielung der obgenannten Konzentrationen verwendet. Nach 28 Tagen wurden die Mäuse einzeln ausgeblutet und getötet. Die Antikörperbestimmungen wurden nach dem Ausab- (Abbott) -Radio-Immuno-Test durchgeführt. Die serologischen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt, in welcher die Titer als "in Ausab-Einheiten bewertet" angegeben sind. Gruppe Material Serologische Umwandlung Anti-HBs-Titer, in Ausab-Einheiten bewertet aus Hefe stammendes Antigen aus Plasma stammendes Antigen (Lowry)

BEISPIEL 11

Vergleichende Untersuchung der Wirkung in Afrikanischen Grünen Meerkatzen von aus Hefe stammendem Antigen und von aus einem Plasma stammendem Antigen.

Eine Gesamtanzahl von 32 Afrikanischen Grünen Meerkatzen wurde auf zwei Gruppen von jeweils 16 Affen aufgeteilt, wobei jede Gruppe noch weiter auf vier Untergruppen von jeweils vier Affen unterteilt wurde. Jede Untergruppe erhielt eine intramuskuläre Injektion, an den Tagen Null und 28, von aus Hefe stammendem Antigen oder von aus Plasma stammendem Antigen, und zwar in einer Konzentration von 10, 2,5, 0,625 oder 0,156 ug/ml, und unter Verwendung eines Kochsalzlösungs-Alaun-Placebos als Verdünnungsmittel zum Verdünnen der Antigenkonzentration, wo dies erforderlich war, um die obgenannten Konzentrationen zu erzielen. Entnommenes Blut wurde in Zeitabständen von einer Woche während 14 Wochen gesammelt, und es wurden nach dem Ausab- (Abbott) -Radio-Immuno-Test Antikörperbestimmungen durchgeführt, wobei die Titer als "in Ausab-Einheiten bewertet" ausgedrückt worden sind. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen zusammengefaßt. (Hefe-Alaun) Zeit/Woche/Titer in Ausab-Einheiten Tier Nr. * Impfung: 1 ml, intramuskulär, am Tag Null, und nach 4 Wochen; (Plasma) (Alaun) Zeit/Woche/Titer in Ausab-Einheiten Tier Nr. * Impfung: 1 ml, intramuskulär, am Tag Null, und nach 4 Wochen; D = eingegangenALLGEMEINE SCHLUSSWORTE:
Die vorliegende Erfindung stellt einen wesentlichen Fortschritt bei der Anwendung der DNA-Rekombinations-Technologie dar. Das praktische Ziel einer Synthese des HBsAg in einem Mikroorganismus als Wirt ist erreicht worden. Modifikationen zur Erhöhung der HBsAg-Produktion und zur Verbesserung der Ausbeute an HBsAg nach der Reinigung, welche Modifikationen unter das Fachwissen eines Durchschnittsfachmannes fallen, werden im Rahmen der beanspruchten Erfindung als äquivalente Varianten angesehen. Beispiele solcher Modifikationen könnten verbesserte Promotorsysteme, produktivere Wirtszellenstämme, Verbesserungen in der Reinigungstechnik und Modifikationen zur Verbesserung der Antigenität des Produktes, oder von dessen Immunogenität, umfassen.
Die nachstehenden Plasmide und transformierten Hefestämme wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive; Rockville, Md. 20852, USA, hinterlegt: Beschreibung Hinterlegungsdatum Hinterlegungsnummer Plasmid S. Cerevisiae
Die Hinterlegungsstelle wurde ersucht, die oben beschriebenen Hinterlegungen gemäß den Statuten und Bedingungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patenterteilungsverfahrens zu behandeln.

Claims

1. DNA-Expressionsvektor, der zur Replikation und phänotypischen Auswahl in Hefewirtsstämmen tauglich ist, enthältend einen mit einem Hefewirtsstamm kompatiblen Promotor und eine DNA-Sequenz, die das Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodiert, wobei diese Sequenz zusammen mit Translationsstartsignalen und -terminationssignalen positioniert ist in dem Vektor, gesteuert von dem Promotor, so daß sie in einem Transformandenhefestamm exprimiert wird, um Hepatitis- B-Oberflächenantigen in Teilchenform herzustellen, mit einer Sedimentationsgeschwindigkeit, die praktisch identisch ist mit der von authentischen 22 nm Hepatitis-Oberflächenantigenteilchen.

2. Hefestamm, transformiert durch den DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 1.

3. Hefestamm nach Anspruch 2, erhalten durch Transformation eines leu2 auxotrophen Hefestammes.

4. Hefestamm nach Anspruch 2, erhalten durch Transformation des Stammes XV610-8C.

5. Fermentationskultur, enthaltend eine transformierte Hefe nach Anspruch 2, 3 oder 4.

6. Vektor nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz, die das Hepatitis-B- Oberflächenantigen kodiert, nur das reife Hepatitis-B- Oberflächenantigen-Strukturgen kodiert.

7. Verfahren zur Herstellung von Hepatitis-B-Oberflächenantigen in Teilchenform, geeignet zur Verwendung zur Erzeugung von Immunität gegen Hepatitis-B-Virus bei empfänglichen Menschen, welches umfaßt:

a) Bereitstellen eines transformierten Hefestammes nach den Ansprüchen 2 bis 4 [transformiert mit einem DNA-Transfervektor, der zur Replikation und phänotypischen Auswahl in Hefewirtsstämmen tauglich ist, worin der DNA-Transfervektor einen mit dem Hefewirtstamm kompatiblen Promotor und ein Segment, das das Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodiert, umfaßt];

b) dem Transformandenstamm zu erlauben, unter Fermentationsbedingungen zu wachsen, bis das Hepatitis-B- Oberflächenantigen darin produziert ist; und

c) Gewinnen des Hepatitis-B-Oberflächenantigens in Teilchenform, mit einer Sedimentationsgeschwindigkeit, die identisch ist mit der von authentischen 22 nm Oberflächenantigenteilchen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Segment, das das Hepatitis-B- Oberflächenantigen kodiert, in Reihenfolge von dem 5'-Ende seines kodierenden Stranges ein Translationsstartcodon, Nukleotide, die das Hepatitis-B-Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Genoms kodieren, und ein oder mehrere Translationsterminationssignale umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Hefestamm von Stufe (a) XV610- 8C ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9, worin der Promotor von Stufe (a) aus der Hefe-PGK-Promotorregion hergeleitet ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Startkodon der Startkodon von reifen Hepatitis-B-Oberflächenantigen-Strukturgegen ist.