DE69013471T2 - Methode zur Stabilisierung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen aus Hefe. - Google Patents
Methode zur Stabilisierung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen aus Hefe.Info
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Description
- Hepatitis-B-Virus-(HBV)-DNA enthält mehrere offene Leserahmen, von denen einer das env-Gen darstellt. Dieses Gen kodiert für 3 eng verwandte Proteine, preS1+preS2+S, preS2+S und S, in ihrer jeweiligen genetischen 5'- und 3'-Ordnung, die die Strukturhülle oder Oberflächen- ("S") -Proteine umfassen. Insgesamt werden die preS1+preS2+S-, preS2+S- und S-Proteine als Hepatitis-B-Virus-OberflächenProteine bezeichnet. Die preS2+5- und S-Proteine sind in der Lage, sich in einer Struktur anzuordnen, die als 22-Nanometer- (22 nm) -Teilchen oder Australia-Antigen bekannt ist. Die 22-nm-Teilchen können aus einer heterogenen Kombination von S-proteinen oder homolog aus einer Form des S-Proteins bestehen. Alle S-verwandten Proteine kommen im intakten HBV-Virion vor.
- Durch Anwendung der DNA-Rekombinationstechnik wurde gezeigt, daß die DNA, die für die 5-proteine kodiert, in verschiedene Wirtszellen eingeschleust werden kann (z.B. E. coli, Hefe-, Insekten- und Säugerzellkulturen), was zur Synthese von preS1+preS2+S-, preS2+S- und S-Proteinen und zur anschließenden Bildung der 22-nm-Teilchen aus den preS2+S- und S-proteinen führt. Alle drei Formen des S-Proteins sind bekanntlich in vivo immunogen, und Antikörper für die S-Proteine sind protektiv, wobei das preS2+S-Protein aufgrund der preS2-Region immundominant ist. Die preS2-Region kann während des Verlaufs der Virusreplikation als zelluläre Membran-Interaktionssegueflz fungieren.
- Die Expression des preS2+S-Proteins in Hefezellen zeigte, daß das preS2+S-Protein mit Hefezellmembranen wechselwirkt, und daß die Reinigung des preS2+S-Proteins aufgrund dieser Eigenschaft erleichtert werden kann.
- Derzeit existiert ein Verfahren zur Reinigung von im wesentlichen reinem membrangebundenem preS2+S-Protein. Dieses Verfahren besitzt mehrere Nachteile, die folgendes umfassen: a) beträchtliche Mengen von verunreinigenden HefeProteinen in den frühen Stadien des Reinigungsschemas, b) eine Proteolytische Zersetzung des preS2+S-Proteins aufgrund der hohen Konzentrationen an verunreinigenden Hefeproteasen, c) die Zugabe (und anschließende Entfernung> von Proteaseinhibitoren, um eine proteolytische Zersetzung des preS2+S-Proteins zu verhindern und d) Verringerung der Produktausbeute aufgrund einer Anhäufung der obigen Faktoren. Ferner wird das so gereinigte Protein als Impfstoff bei Menschen zur prävention der HBV-Infektion verwendet.
- Es kann nicht vorhergesagt werden, welche Reinigungsverfahren für rekombinante Proteine geeignet sind, da rekombinante Proteine in einer Form vorliegen, die im allgeTneinen für die natürliche oder klassische Form atypisch ist. Aus diesem Grund erfordern rekombinante Proteine häufig neue Kombinationen von bekannten Verfahren oder vollständig neue Reinigungsverfahren.
- Ferner erfordern Humanimpfstoff-Präparationen eine extreme Reinheit, die zur einer noch größeren Unvorhersagbarkeit des Ergebnisses eines Reinigungsschemas führt.
- Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur wesentlichen Reinigung von rekoinbinanten Hepatitis-B- Virus-Oberflächenproteinen aus Hefezellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Reinigungsverfahren für das Hepatitis-B-Virus-Oberflächenprotein bereitzustellen, das das Erfordernis beseitigt, Proteaseinhibitoren während der Reinigung einzuführen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Reinigung des rekombinanten Hepatitis- B-Virus-Oberflächenproteins aus Hefezellen bereitzustellen, das zu einem stabileren Oberflächenproteinprodukt führt. Dies und weitere Aufgaben der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.
- Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteinen aus Saccharomyces cerevisiae bereit, das die folgenden Stufen umf aßt:
- (a) Aufbrechen der Hefezellen, die das rekombinante Oberflächenprotein exprimieren, in einen Puffer mit hohein pH-Wert, wobei sich ein Rohextrakt ergibt, (b) Wärmebehandeln des rohen Zellextraktes (a), (c) Entfernen der Zelltrümmer aus dem wärmebehandelten Rohextrakt (b) in Gegenwart oder Abwesenheit von Detergens durch: i) Zentrifugieren oder ii) Mikrofiltration, wobei sich ein wärmebehandelter geklärter Extrakt ergibt, (d) Konzentrieren und Diafiltrieren des wärmebehandelten Extraktes (c), (e) Verringern der Alkalität des wärmebehandelten geklärten Extraktes (d), (f) Abtrennen von verunreinigenden Hefeproteinen von dem Oberflächenprotein durch Zusammenbringen des Produkts von Stufe (d) mit weitporigem Siliciumdioxid, das die Oberflächenproteine, jedoch nicht die verunreinigenden Proteine adsorbiert und zurückhält, (g) Eluieren des adsorbierten Oberflächenproteins von dem weitporigen siliciumdioxid, (h) Unterziehen des Eluats aus Stufe (f) einer Diafiltration um weiterhin niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen und Konzentrieren des Endprodukts, wobei sich ein im wesentlichen gereinigtes Endprodukt ergibt.
- Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen Methoden zur Reinigung von rekombinanten Hepatitis-B-Virus-Oberflächen- proteinen aus Hefezellextrakten. Diese Methoden umfassen die kombinierte Behandlung von Hefezellextrakten mit hoher Temperatur und erhöhtem pH-Wert.
- Selbstverständlich sind die neuen erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren auf eine Reihe von Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine oder auf Teile davon anwendbar, einschließlich des S- preS1+presS2+S- und preS2+S-Proteins, gleich ob das Protein aus menschlichem oder tierischem Serum oder aus rekombinanten Organismen stammt. Gemeinsam werden die presl+preS2+S-, presS2+S- und S-Proteine als Hepatitis-BVirus-Oberf1ächenproteine bezeichnet. Ebenfalls eingeschlossen sind Fusionsproteine, die alles oder Teile von S, presl+preS2+S und von preS2+S enthalten. Ein Hauptbeispiel ist das rekornbinante preS2+S-Protein, das von Hefezellen produziert wird. Dieses Hefeexpressionssystem produziert preS2+S-Aminosäuresequenzen. Ein weiteres Beispiel ist das rekombinante S-Protein, das von Hefezellen produziert wird. Verfahren zur Reinigung weiterer varianter Aminosäuresequenzen des S-Proteins sind in der Erfindung eingeschlossen. Die erfindungsgemäßen Verfahren sollen schnelle und wirksame Methoden zur Reinigung eines jeden S-Proteins oder S-Fusionsproteins, einschließlich von S-Proteinvarianten, sowie von preS1+preS2+S- und preS2+S-Varianten und ihrer entsprechenden Fusionsproteine gemäß den Prinzipien der Erfindung bereitstellen. Beispielsweise führen konservative Substitutionentdefiniert als Reihen in Tabelle 1 von Taylor, W.R., J. Mol. Biol. 188: 233 (1986)] in der preS1+preS2+S- Aminosäuresequenz im allgemeinen nicht zu einer wesentlichen oder neuen Modifikation der Prinzipien und Praktiken der Erfindung. Konservative Substitutionen des S-Antigens sind bekannt, siehe Elfassi, E. et al., J. Theor. Biol. 121: 371 (1986). Außerdem erfordern Deletionen in den S-, preS1- oder preS2+S-Regionen im allgemeinen keinerlei Modifikationen der hier besprochenen Reinigungsverfahren. Selbstverständlich umfaßt in dieser Anmeldung das rekombinante S-Protein oder Oberflächenantigen oder das rekombinante preS1+preS2+S- Protein oder das preS2+S-Protein oder Teile davon sämtliche Variationen in der Aininosäuresequenz, gleich ob durch konservative Aminosäuresubstitution, Deletion oder durch ein weiteres Verfahren, mit der Maßgabe, daß das rekoinbinante S-Protein, das Oberflächenantigen, das rekombinante preS1+S2+S-Protein oder Teile davon mit Antikörpern immunchemisch reaktiv sind, die für das preS1+S2+S-Protein oder für Teile davon, für die 22-nm-Teilchen, das Australia- Antigen, oder für eine weitere natürliche Form der HBV-Oberflächenantigensequenz spezifisch sind.
- Viele Expressionssysteme auf Hefebasis entsprechen sich eindeutig bei der Bereitstellung von Quellen für rekombinante preS2+S- und S-verwandte Proteine. Das Expressionssystem von Saccharomyces cerevisiae soll eine zufällige Quelle sein. Weitere Hefevektoren umfassen Shuttle-Vektoren, Cosmidplasmide, chimäre Plasmide und diejenigen mit Sequenzen, die sich von ringförmigen 2-um-Plasmiden ableiten, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
- Die Gattung Saccharomyces besteht aus einer Reihe von Spezies. Am häufigsten wird S. cerevisiae oder Bäckerhefe als Wirt für die rekombinante DNA-vermittelte Expression einer Vielzahl von Fremdpolypeptiden verwendet.
- Jedoch sind die Unterschiede zwischen den anderen Spezies der Gattung Saccharomvces nicht immer gut definiert. Viele dieser Spezies vermögen mit S. cerevisiae eine Kreuzpaarung einzugehen und besitzen wahrscheinlich regulierbare Promotoren und weitere regulatorische Elemente der Transkription und Translation, die mit denjenigen von S. cerevisiae analog oder identisch sind. Darum ist es für Fachleute offensichtlich, daß sich zur Expression von S-verwandten Polypeptiden die Auswahl eines Wirts auf weitere Spezies der Gattung Saccharomyces ausdehnt, einschließlich carlsbergensis, uvarum, rouxii, montanus, kluyveri, elongrgsrurs, oviformis und diastaticus, jedoch nicht darauf begrenzt.
- Dane-Teilchen (Serotyp adw) wurden als Quelle für HBV- Nucleinsäure zur Isolierung der viralen offenen Leserahmen (ORF) verwendet. Es ist den Fachleuten klar, daß dieses Verfahren sich auf die Verwendung von Nucleinsäure aus HBV- Stämmen mit weiteren serologischen Reaktivitäten erstreckt, die der viralen genetischen Diversität entstammen. Die endogene Polymerasereaktion wurde eingesetzt, um kovalent geschlossene zirkuläre doppelsträngige DNA des HBV-Genoms aus der Nucleinsäureform mit Einzel- und Doppelstrangbruch zu produzieren, die ursprünglich in dem HB-Virion lokalisiert ist. Die DNA wurde isoliert, vollständig mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Schnittstelle von pBR322 kloniert, wodurch pHBV/ADW-1 erzeugt wurde. Die rekombinanten Plasmide, die das HBV-Genom in einer zirkulär permutierten Form an der EcoRI-Schnittstelle der preS-Region enthielten, wurden selektiert. Der vollständige ORF, der für die 55 Aminosäuren (aa) der preS-Region und die 226 aa der 5-Region kodiert, wurde konstruiert, indem zunächst das 0,8 Kilobasenpaar (kbp)-Fragment gereinigt wurde, das nach dem Verdau von pHBV/ADW-1 mit EcoRI und AccI erhalten worden war. Dieses Fragment kodiert für das preS2+S-Polypeptid, dem nur das Startkodon, die aminoterminalen 3 aa, die carboxyterminalen 3 aa und das Stopkodon fehlen.
- Die Oligonucleotide wurden synthetisiert und mit diesem Fraginent ligiert, wodurch es in ein HindIII-Fragment verwandelt wurde, das eine aus Hefe stammende, nicht translatierte 5'-flankierende 10-bp-Sequenz und den vollständigen preS2+S-ORF enthielt. Die Sequenz an der 3'-Flanke des preS2+S ORF wurde so gewählt, daß das Stopkodon direkt an eine natürliche HindIII-Schnittstelle in dem ADHI Terminator der Transkription grenzte, wodurch ein vollständig nativer, von Hefe stammender Kreuzungspunkt ohne zusätzliche auftretende Basen erzeugt wurde. Es ist Fachleuten klar, daß zur Expression von preS2+S irgendein geeigneter hefeaktiver Terminator der Transkription anstelle von ADHI als Ersatz verwendet werden kann.
- Die 5'-flankierende Sequenz wurde zur Konstruktion (ACAAAACAAAA) ausgewählt, so daß sie derjenigen für den nichttranslatierten Leader (NTL) des Hefegens GAP63 (GAP) [Holland, J. Biol. Chem., 225, 2596 (1980)] entsprach und auch mit der GAP-Genfamilie übereinstimmte. Die Konstruktion erfolgte so, daß NTL direkt an das Startkodon des preS2+S-ORF grenzte, ohne daß zusätzliche Basen dazwischen lagen. Darum ist es Fachleuten klar, daß sich zur Expression von Hüllpolypeptiden die Auswahl von NTL-Sequenzen auf weitere Sequenzen erstreckt, die zu den geeigneten Expressionsgraden führen.
- Die Analyse der DNA-Sequenz ergab zwei Basensubstitutionen, die zu aa-Unterschieden im Vergleich zu der preS2+S-Sequenz führten, für die die DNA von pHBpreSGAP347/19T kodiert [Valenzuela et al., Biotechnology, 3(4), 317-320 (1985)]. Um die zufälligen Polypeptide für beide Konstruktionen zu beurteilen, wurden diese Nucleotidsubstitutionen, die T anstelle von C an Base 64 des 846-bp-ORF von HBV-preS+S (das für Phe anstelle von Leu kodiert) und C anstelle von A an Base 352 (die für His anstelle von GIn kodiert) waren, durch gerichtete Mutagenese verändert [Zoller et al., Nucleic Acids Research 10: 6487-6500 (1982)]. Die kodierte aa-Sequenz wurde sodann für die optimierte Konstruktion verifiziert. Es ist Fachleuten klar, daß die Erfindung nicht auf diese Sequenz beschränkt ist und sich auf jede Sequenz erstreckt, in der die DNA für ein Polypeptid mit HBV-Antigenität kodiert.
- Im Anschluß an die Mutagenese wurde das oben beschriebene Fragment verwendet, um, wie bereits beschrieben [Kniskern et al., Gene, 46: 135-141, (1986)), eine Expressionskassette zu konstruieren, die aus folgendem bestand: (a) ca. 1,1 kbp des GAP491-Promotors, (b) einer 10 bp-Flankierungssequenz, die aus Hefe stammt, (c) 846 Basenpaaren des HBV-preS2+S-Gens (Serotyp adw), dem sämtliche viralen flankierenden Sequenzen fehlten, und (d) 90,4 kbp des Hefe-ADHI-Terminators. Diese Expressionskassette wurde in den Hefe-Shuttle-Vektor pCl/l inseriert [Beggs, Nature, 275: 104 (1978); Rosenberg et al, Nature, 312: 77, (1984)], um das Plasmid pyGpresS2S-1 zu bilden, das zur Transformation des Hefestammes CF42 verwendet wurde, wodurch eine im folgenden pF403 genannte Transformante erzeugt wurde. Diese Transformante wurde als gefrorener Vorrat zur Bewertung und für die anschließenden Experimente aufbereitet. Der Elternstamm CF42 wurde wie folgt erhalten: eine spontane ura3-Mutation in dem Hefestamm 2150-2-3 (L. Hartwell, U. of Washington) wurde ausgewählt [Boeke et al., Mol. Gen. Genet., 197: 345-346, (1984)]. Der resultierende Stamm (MATa, adel&supmin;, leu2-04&supmin;, ura3&supmin;, ciro) wurde durch Transformation mit dem Plasmid YCp50-HO diploid gemacht [Jensen et al, P. N. A. S. USA, 80: 3035-3039, (1983)]. Das funktionelle Hefegen HO erlaubt es den Zellen, den Paarungstyp zu verändern. Somit ist die Nachkommenschaft aus einzelligen Transformanten ein Gemisch sowohl von a als auch von a-Paarungstypen, die sich während des Kolonienwachstums paaren. Ein diploider isolierter Klon wurde aus dem Plasmid gereinigt und als CF42 bezeichnet (MATa/a, adel&supmin;, leu2-04&supmin;, ura3&supmin;). Diese Transformanten wurden als gefrorene Vorräte zur Bewertung und für die anschließenden Experimente aufbereitet.
- Rekombinante Hefe aus den gefrorenen Vorräten von pF403 wurde in YEDH-Medium angezogen [Carty et al, J. Industrial Micro, 2, 117-121, (1987)]. Nach dem Wachstum bis zur stationären Phase wurden die Hefezellen geerntet. Lysate wurden hergestellt, durch Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgelöst und ein Immunblot mit Antikörpern gegen HBsAg durchgeführt. Zwei Hauptpolypeptide mit Molekulargewichten von etwa 30 kD und 34 kD wurden in Übereinstimmung mit dem vorhergesagten Molekulargewicht des Translationsproduktes des preS2+S-ORF und seinem glycosylierten Derivat gefunden. Eine weitere polydisperse Glycopeptidbande (Molekulargewicht von etwa 50 kD) wurde ebenfalls nachgewiesen, die der Population von hyperglycosylierten Spezies entsprach und mit Anti-Hefe- sowie mit Anti-HBs-Seren immunreaktiv war. Außerdem waren die Lysate von rekombinanter, jedoch nicht von elterlicher Hefe gemäß Radiomimmuntest (RIA) preS2+S-positiv.
- Die elektronenmikroskopische Prüfung der teilweise gereinigten Hefelysate zeigte hohe Dichten von typischen 22-nm-preS2+S-Teilchen.
- Der aus Hefe stammende Promotor initiiert die Transkription des preS2+S-Gens. Darum ist es Fachleuten klar, daß irgend- eine hefeaktive Promotorsequenz den GAP491-Promotor ersetzen kann. Ferner ist es Fachleuten klar, daß ein geeignetes Testsystem, z.B. ein Immunblot- oder RIA- oder ein enzymverknüpfter Immuntest (EIA) verwendet werden sollte, um die Expression der preS2+S-Polypeptide in diesem System zu testen, so daß die Zeit der Ernte der Kultur zum Erhalt einer maximalen Ausbeute optimiert werden kann.
- Der GAP491-Promotor war zur Expression in Hefe von mehreren Fremdproteinen, einschließlich HBsAg, geeignet [Bitter, et al., Gene, 32: 263-274 (1984), Wampler et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA, 82: 6830-6834, (1985)]. Auf der Grundlage unserer früheren Ergebnisse der Expression von HBsAg zu einem ca. 40 % löslichen Hefeprotein (Kniskern et al, supra) haben wir diesen Promotor verwendet, um die Expression des preS2+S-Antigens in geeigneten Hefewirtszellen voranzutreiben.
- Um die Gylcosylierung des rekombinanten hefeexprimierten preS2+S-Proteins zu kontrollieren und zu definieren, wurde auch das Hefe-Expressionsplasmid (pYGpreS2S-1), das die oben beschriebene Expressionskassette enthielt, verwendet, um den S. cerevisiae-Stamm KHY-107 (cir&spplus;, adel&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;) zu transformieren, der wie folgt konstruiert war:
- Ein Stamm vom Paarungstyp CZ5/LB347-1C (mnn9&supmin;, SUCZ&supmin;) (C. Ballou, U. von Calif.) wurde mit dem a-Typ des Stammes 2150-2-3 (leu2&supmin;, adel&supmin;) (L. Hartwell, U. von Washington) gepaart, indem die Stämme auf einer YEHD-Agarplatte vermischt wurden (Carty et al., supra). Um Diploide zu selektieren, wurden die gepaarten Stämme als Replikate auf Minimalmedien ohne Leucin (leu&supmin;) mit 2 % Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle ausplattiert. Nach der Isolierung der einzelnen Kolonien wurden die Diploide sporuliert, und die Asci wurden durch Standardtechniken abgetrennt. Der KHKY-107-Stamm wurde als Einzelspore isoliert und als cir&spplus;, adel&spplus;, leu2&supmin; und mnn9&supmin; (durch Schiff-Anfärbetechnik) charakterisiert.
- Die transformierten Klone wurden auf minimalem Medium (leu&supmin;), das 1 M Sorbit enthielt, selektiert. Diese klonierten Transformanten wurden als gefrorene Vorräte in 17 % Glycerin zur anschließenden Bewertung und für weitere Experimente vorbereitet.
- Das Expressionsplasmid pYGpresS2S-1 wurde auch verwendet, um KHY-107 (cir&sup0;, adel&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;) zu transformieren, der sich, wie beschrieben (Broach, G.R: "Methods in Enzymology", Bd. 101, Teil C, S. 307-325, 1987, Academic Press, N.Y.), von dem Stamm KHY-107 (cir&spplus;, adel&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;) ableitete. Die transformierten isolierten Klone wurden als gefrorene Vorräte in 17 % Glycerin zur anschließenden Bewertung und für weitere Experimente vorbereitet.
- Die Klone von transformierter Hefe [KHY-107 (cir&spplus;, adel&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;)], die das Expressionsplasmid pYGpreS2S-1 enthielten, wurden auf selektiven 1eu&supmin;-Agarplatten ausplattiert, die 1 M Sorbit enthielten und bei 30 ºC 2-3 Tage lang inkubiert. Diese Hefen wurden in 5-7-ml-Kulturen von komplexem YEHD-Medium (Carty et al., supra), das 1 M Sorbit enthielt, überimpft, und die Kulturen wurden bei 30 ºC unter Belüftung 12-18 Stunden lang inkubiert. Kolben, die 50 ml komplexes YEHD-Medium mit 1 M Sorbit enthielten (im folgenden als YEHDS bezeichnet), wurden mit den obigen Kulturen angeimpft (bis zu einer anfänglichen A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,1) und wurden unter Schütteln (350 Upm) bei 30 ºC 48-72 Stunden lang bis zu einer End-A&sup6;&sup0;&sup0; von 10-16 inkubiert. Proben von 10 A&sup6;&sup0;&sup0;-Einheiten wurden in Röhrchen aufgeteilt, und die Hefezellen wurden bei 2 000 x g 10 Minuten lang pelletisiert. Die Proben wurden entweder direkt getestet oder tiefgefroren bei -70 ºC aufbewahrt. Zur Zeit des Tests wurden die Pellets in 0,4 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert, die 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthielt, und in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen übergeführt. Die Hefezellen wurden aufgebrochen durch: 1) Zugabe von 200-300 mg gewaschenen Glasperlen (0,45 mm) und 15minütiges Rühren auf einem Vortex- Mischer 2) Zugabe von TX-100 bis 0,5 %, 3) 2minütiges Schütteln auf dem Vortex-Mischer und 4) 10minütige Inkubation bei 4 ºC. Zelltrümmer und Glasperlen wurden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 2 000 x g entfernt. Die geklärte Überstandsflüssigkeit wurde entfernt und auf das Protein getestet [durch das Verfahren von Lowry et al, J. Biol. Chem., 193, 265, (1951)] und mittels RIA, der spezifisch auf preS2+S ist, getestet [Hansson et al, Infect. Immunol. 26: 125-130, (1979), Machida et al., Gastroenterology 86: 910-918 (1984)].
- Die Klone wurden parallel bewertet und mit einem äquivalenten Zellpellet von Klon pF403 verglichen, der als Referenz auf einen Wert von 1,0 normalisiert war. Typische relative Werte für die Antigenproduktivität für die fünf Klone wurden, wie in Beispiel 7 aufgelistet, erhalten.
- Klone von transformierter Hefe [KHY-107 (cir&sup0;, adel&spplus;, leu2&supmin;, mnn9&supmin;)], die das Expressionsplasmid enthielten, wurden auf selektiven leu&supmin;-Agarplatten ausplattiert, die 1 M Sorbit enthielten und bei 30 ºC 2-3 Tage lang inkubiert. Diese Hefe wurde in 5-7- ml-Kulturen mit komplexem YEHD5-Medium angeimpft, und die Kulturen wurden unter Belüften bei 30 ºC 12-18 Stunden lang inkubiert. Die Kolben, die 50 ml komplexes YEHDS-Medium enthielten, wurden mit den obigen Kulturen angeimpft (bis zu einer Anfangs-A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,1) und bei 30 ºC unter Schütteln (350 Upm) 48-72 Stunden lang bis zu einer End-A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Dreifachproben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;- Einheiten wurden in Röhrchen aufgeteilt, und die Hefezellen wurden bei 2 000 x g 10 Minuten lang pelletisiert. Die Proben wurden entweder direkt, wie vorstehend beschrieben, getestet oder tiefgefroren bei -70 ºC aufbewahrt.
- Fünf Klone wurden parallel bewertet und mit dem Klon pF403 verglichen, der auf einen Wert von 1,0 als Referenz normiert worden war. Typische relative Werte der Antigenproduktivität für die 5 Klone wurden, wie in Beispiel VIII aufgelistet, erhalten.
- Die Immunblotanalyse des preS2+S-Polypeptids, das aus allen rekombinanten, oben beschriebenen Klonen stammte, in Wirtszellen mit dem mnn9-Phänotyp zeigte zwei Banden mit scheinbaren Molekulargrößen von 30 kD und 34 kD. Die polydispersen hyperglycosylierten Spezies (Molekulargewicht größer als 50 kD) wurden weder mit Anti-Hefe- noch mit Anti-HBs-Seren nachgewiesen.
- Um einen Expressionsvektor zu liefern, in dem die ureigene Natur des exprimierten Proteins die Kontrolle der Glycosylierung von HBV preS2+S definiert, wurde die Erkennungssequenz für die N-verknüpfte Glycosylierung [Asn-X-Thr] innerhalb des preS2+S-ORFs mutiert. Der Klon pUC13preS2S diente als Ausgangsmaterial für diese Konstruktion.
- Um den 5'-Anteil des preS2+S-ORF zu rekonstruieren, wurde ein Paar von Oligonucleotiden synthetisiert, um den ORF stromaufwärts von BamHI bis zum ATG über eine 10-bp-NTL- und eine HindIII-Schnittstelle zu einem an EcoRI kompatiblen Terminus zu rekonstituieren. Die Sequenz dieses 0ligonucleotids, das eine A- bis C-Mutation (an Base 31) und eine T- bis A-Mutation (an Base 33) enthält und das zu einer aa-Änderung an Position 4 der S2-Proteindomäne von Asn zu Gln führen würde, lautet:
- AAT TCA AGC TTA CAA AAC AAA ATG CAG TGG CAA TCC
- GT TCG AAT GTT TTG TTT TAC GCT ACC GTT AGG
- ACT GCC TTC CAC CAA GCT CTG CAG
- TGA CGG AAG GTG GTT CGA GAC GTC CTAG
- Dieses synthetische Oligonucleotidpaar wurde mit pUC19 ligiert, das zuvor mit EcoRI und Bam verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde mit BamHI und Sall verdaut und anschließend mit dem 0,8-kbp-BamHI/SalI-Fragment ligiert, das aus pUC13preS2S herausgeschnitten und gereinigt worden war, um das Plasmid pUC19preS2SWG-1 zu erzeugen, das als HindIII- Fragment den preS2+S-ORF enthält, wobei Gln durch Asn an Position 4 ersetzt ist. Dieser ORF wurde verwendet, um einen Hefeexpressionsvektor auf analoge Weise, wie zuvor beschrieben, zu erzeugen.
- Auf analoge Weise wurde das 0,8-kbp-HindIII-Fragment aus pUC13preS2S isoliert und mit einem pUC19-Vektor ligiert, in dem die EcoRI- und BamHI-Schnittstellen zuvor zerstört worden waren. Der resultierende Vektor wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und mit einem Paar synthetischer Oligonucleotide ligiert, das konstruiert wurde, um den preS2+S-Hüllprotein- ORF aus EcoRI und BamHI mit einer A- zu G-Mutation (an Base+7 des Oligonucleotids), die zu einem Aminosäurewechsel von Thr zu Ala an der Aminosäure+6 der preS2-Domäne führt, wieder zu erzeugen.
- Die Sequenz dieses Oligonucleotids lautet:
- ATT TCC GCT TTC CAC CAA GCT CTG CAA
- GG CGA CGG AAG GTG GTT CGA GAC GTT CTAG
- Diese Konstruktion führte zur Erzeugung von pUC19preS2SWG-2, das den ORF als HindIII-Fragment enthält, wobei Ala durch Thr an Aminosäure 6 der preS2-Domäne ersetzt ist. Dieser ORF wurde verwendet, um einen Hefeexpressionsvektor auf analoge Weise wie bereits beschrieben, zu erzeugen.
- Die preS2+S-Antigenexpression wurde bewertet, wie zuvor beschrieben, und es zeigte sich, daß sie hinsichtlich der Produktivität derjenigen entsprach, die mit den oben beschriebenen Transformanten erhalten worden war. Klone von beiden Mutanten wurden als gefrorene Vorräte für eine weitere Bewertung aufbewahrt. Die Immunblotanalyse, entwickelt entweder mit Anti-HBs-Serum oder Anti-preS2-Serum, wies eine einzelne Hauptspezies mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kD nach, die mit derjenigen konsistent ist, die für das nichtglycosylierte Translationsprodukt des preS2+S-0RF vorhergesagt wurde.
- Für die Bestimmungen der in vivo-Wirksamkeit wurde eine nichthyperglycosylierte preS2-+S-Präparation auf Alaun adsorbiert, und Gruppen von Mäusen wurden abgemessene Mengen des Antigens injiziert. Nach 6 Wochen wurden die Maus-Seren auf Anti-HBs-Antikörper (AUSAB*) und Anti-preS2-Antikörper getestet [gemäß Neurath, J. Med. Virol., 17, 119-121 (1985)]. Die Ergebnisse solcher Experimente zeigten, daß die preS2+S- Präparation ebenso wirksam war wie die HBsAg-Kontrollpräparation bei der Induktion einer Anti-HBs-Antikörperantwort (die wirksame Immunisierungsdosis betrug 0,34 mg für preS2+S, verglichen 0,25 mg für die HBsAG-Kontrolle). Außerdem zeigte die preS2+S-Präparation eine potente Fähigkeit (wirksame Immunisierungsdosis von 0,14 mg), um eine gleichzeitige Antikörperreaktion, die für die preS2-Domäne spezifisch ist, hervorzurufen.
- Die Gattung Saccharomyces besteht aus einer Reihe von Spezies. Am häufigsten wird S. cerevisiae oder Bäckerhefe als Wirt für die rekombinante DNA-vermittelte Expression einer Reihe von Fremdpolypeptiden verwendet. Der Unterschied zwischen weiteren Spezies der Gattung Saccharomyces ist jedoch nicht immer gut definiert. Viele dieser Spezies sind in der Lage, eine Kreuzpaarung mit S. cerevisiae einzugehen und besitzen wahrscheinlich regulierbare Promotoren und weitere Transkriptions- und Translationsregulatorelemente, die mit denjenigen in S. cerevisiae analog oder identisch sind. Darum wird es den Fachleuten leicht klar, daß sich zur Expression von S-verwandten Polypeptiden die Auswahl eines Wirts auf weitere Spezies der Gattung Saccharomvces erstreckt, einschließlich carlsbergensis, uvarum, rouxii, montanus, kluyveri, elongrgsorus, oviformis und diastaticus, jedoch nicht darauf begrenzt ist.
- Es hat sich gezeigt, daß mehrere Hefegattungen, wie Hansenula, Candida, Torulopsis und Pichia, metabolische Wege zur Verwendung von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle zum Wachstum enthalten. Das Gen der Alkoholoxidase - ein Enzym, das an diesem metabolischen Weg teilhat - wurde aus Pichia pastoris isoliert. Der P. pastoris-Alkoholoxidasegenpromotor wurde isoliert, und es zeigte sich, daß er in Gegenwart von Methanol induzierbar ist. Ein solches induzierbares Promotorsystem ist zur Expression von Polypeptiden geeignet, die eine negative Wirkung auf den Wirt besitzen. Insbesondere erwies sich dieser Promotor bei der Regulierung der Expression von S-Polypeptiden in P. pastoris als aktiv, was die Fähigkeit der anderen Hefegattungen unterstrich, als Wirte für die rekombinante DNA-vermittelte Genexpression von S-Polypeptiden in immunologisch aktiver Form zu funktionieren. Darum ist es Fachleuten klar, daß sich zur Expression von preS2+S-haltigen Polypeptiden die Auswahl eines Wirts auf Spezies weiterer Hefegattungen aus den Familien Saccharomycetaceae und Cryptococcaceae, einschließlich Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis, Kluyveromyces und Saccharomycopsis, erstreckt, jedoch nicht darauf begrenzt ist.
- Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung von rekombinantem preS2+S heben die frühere erforderliche Einführung von Proteaseinhibitoren in einer der Reinigungsstufen vollständig auf. Hefezellen, die mit Expressionsvektoren transformiert worden sind, die für ein Hepatitis-B-Virus-Oberflächenprotein oder für Varianten davon kodieren, werden angezogen und geerntet. Die Zellen können auf Wunsch durch Waschen in einer Pufferlösung, z.B. PBS und Bilden einer Zellpaste, die typischerweise tiefgefroren bei -70 ºC aufbewahrt wird, gelagert werden.
- Die Reinigung beginnt typischerweise wie folgt. Eine Charge frischer oder gefrorener Zellpaste wird in einem Puffer, vorzugsweise Tris, bei einem hohen pH-Wert im Bereich zwischen etwa 9,0 und etwa 12,0, vorzugsweise etwa 11,0, suspendiert. Die Zellen werden sodann aufgebrochen, vorzugsweise mechanisch. Das ganze Perlenaufbruchverfahren wurde für größere Ansätze als ungeeignet befunden. Das Aufbrechen mittels eines Hochdruckhomogenisators (etwa 10 000 bis 20 000 psi unter Verwendung eines Gaulin- oder Stansted-Homogenisators) wird aufgrund seines schnellen und wirksamen Betriebes bevorzugt.
- Der Aufbruch der Hefezellen führt zu einem Rohextrakt. Der pH-Wert des Rohextrakts wird sodann eingestellt. Der pH-Wert wird innerhalb des Bereiches von 8,0 bis 11,1 eingestellt, wobei 10,5 bevorzugt wird.
- Zu diesem Zeitpunkt kann es wünschenswert sein, ein Detergens zu dem Rohextrakt zu geben. Die Zugabe eines Detergens erleichtert die Abtrennung von Hefezellmembranen von unerwünschten Zelltrümmern. Es hat sich gezeigt, daß sich das preS2+S-Protein sowie weitere Formen von Oberflächenproteinen mit Hefezellmembranen assoziieren. Eine Reihe von neutralen oder nichtionischen Detergentien können verwendet werden, einschließlich Detergentien der TRITON-N-Serie, der TRITON-X- Serie, der BRIJ-Serie, der TWEEN-Serie und der EMASOL-Serie, Desoxycholat, Octylglycopyranosid oder NONIDET-Np-40, jedoch nicht darauf beschränkt. Zwitterionische Detergentien, wie CHAPS oder CHAPSO, sind ebenfalls nützliche und geeignete Mittel.
- Soll ein Detergens verwendet werden, so ist das bevorzugte Detergens TRITON x-100 bei einer Konzentration von 0,5 %. Es muß betont werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht die Verwendung von Detergens bei diesem Arbeitsschritt erfordert, und daß die Verwendung von Detergentien freigestellt ist.
- Der Extrakt wird anschließend wärmebehandelt. Die Wärmebehandlung ist über einen Bereich von Temperaturen und für den Zeitraum der Behandlungsdauer wirksam. Typischerweise wird ein Temperaturbereich von 45 ºC bis 60 ºC eingesetzt, wobei 50 ºC die bevorzugte Temperatur ist. Die Dauer der Wärmebehandlung reicht typischerweise von 20-40 Minuten, wobei 30 Minuten die bevorzugte Zeit darstellt. Der Extrakt wird in einem geeigneten Gefäß wärmebehandelt, und das Gefäß wird in ein beheiztes Bad eingetaucht, oder es wird ein Wärmeaustauscher verwendet. Das Material wird sodann auf etwa 10 ºC abgekühlt, vorzugsweise indem es in ein Eiswasserbad gegeben wird oder indem ein Wärmeaustauscher verwendet wird. Den Fachleuten wird klar, daß die Reihenfolge, in der die Arbeitsschritte zur Wärmebehandlung und Beseitigung der Zelltrümmer durchgeführt werden, ohne deutliche Auswirkung auf das Ergebnis dieses Verfahrens umgekehrt werden kann.
- Die Entfernung der Zelltrümmer aus dem wärmebehandelten Rohextrakt ist notwendig, um eine physikalische Occlusion während der anschließenden Reinigungsschritte zu verhindern. Die Zelltrümmer können durch Zentrifugation, Mikrofiltration oder Filtration entfernt werden, wodurch ein geklärter Extrakt erzeugt wird. Zentrifugation und Mikrofiltration sind die am meisten bevorzugten Verfahren. Die Zentrifugation kann unterschiedlich lange mit unterschiedlicher Zentrifugalkraft erfolgen. Eine 15minütige Zentrifugation bei etwa 3 000 x g bei 4 ºC wurde als angemessen befunden. Es kann ebenfalls vorteilhaft sein, den Extrakt vor der Zentrifugation zu verdünnen, um die typischerweise viskose Natur des rohen Hefezellextrakts zu verringern. Die Verdünnung ändert keinen der folgenden Schritte des Verfahrens.
- Die Mikrofiltration besitzt den Vorteil, daß Filtration und Dialyse gleichzeitig durchgeführt werden können. Mehrere Typen von Mikrofiltrationseinheiten sind zur Verwendung in diesem Schritt geeignet, z.B. KROSFLO von Mocrogon Inc. oder eine Reihe von Hohlfaserpatronen von Amicon oder A/G Technology. Das bevorzugte Mikrofiltrationsverfahren besteht darin, den Extrakt durch eine Prostak Durapore (Millopore)- Membran zu leiten, eine Platten- und Rahmenmikrofiltrationseinheit mit einer Porengröße von etwa 0,1 um bis 0,2 um, bei einem Einlaßdruck von etwa 2-7 psi unter Verwendung eines Puffers, der aus etwa 0,1 M Tris, pH etwa 10,4 und etwa 0,1 % TRITON X-100 besteht.
- Der Überstand aus der Zentrifugation oder das Filtrat aus der Mikrofiltration kann vor der nächsten Stufe dieses Verfahrens konzentriert werden. Die Zentrifugation kann durch mehrere Methoden erreicht werden, einschließlich Dialyse, Filtration, Lyophilisierung, Ultrafiltration und Diafiltration, ist jedoch nicht darauf begrenzt. Das bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Konzentrierung besteht darin, den geklärten Extrakt über ein Hohlfaser-Ultrafiltrationssystem mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; laufen zu lassen. Das Volumen des geklärten Extraktes wird typischerweise um etwa das 6,5fache für das Mikrofiltrationsprodukt und um etwa das 2fache für das verdünnte zentrifugierte Produkt verringert, wodurch sich ein konzentriertes Retentat ergibt. Im Anschluß an die Konzentrierung wird das Retentat diafiltriert, um noch niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen. Die Diafiltration wird unter Verwendung eines Hohlfasersystems mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; durchgeführt.
- Wurde TRITON X-100 zugegeben, so kann es durch mehrere herkömmliche Verfahren entfernt werden, einschließlich Dialyse, Zugabe von bestimmten organischen Lösungsmitteln, Abkühlen, chromatogaphischer Trennung und Kontakt mit einem Gel oder Harz, das spezifisch die Detergentien bindet, wie Extraktogel (Pierce) und XAD-Harz (Romicon), jedoch nicht darauf beschränkt. Das bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Entfernung von TRITON X-100 besteht darin, den wärmebehandelten Extrakt, der TRITON X-100 enthält, über eine Patrone von XAD-2- oder XAD-4-Harz (Polystyrol-Divinylbenzol) zu zirkulieren. Der wärmebehandelte Extrakt wird über die XAD-Patrone etwa 10 Stunden lang bei 4 ºC zirkuliert und anschließend in einem geeigneten Gefäß, beispielsweise einer fest verschließbaren Glasflasche, gesammelt.
- Der pH-Wert des wärmebehandelten Extrakts wird anschließend zwischen etwa pH 7 und etwa 7,9 eingestellt, mit einem bevorzugten pH-Wert von etwa 7,7. Die Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7,7 nach der Wärmebehandlung bei einem hohen pH-Wert gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erleichtert sehr die Adsorption von Oberflächenproteinen an das weitporige Kieselgel, das in einem anschließenden Schritt verwendet wird. Die Einstellung des pH-Wertes des wärmebehandelten Extrakts kann vor dem Schritt zur Triton X-100-Entfernung durchgeführt werden, ohne daß das Ergebnis des Verfahrens beeinflußt wird. Darum ist es Fachleuten klar, daß gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reihenfolge, in der die Arbeitsschritte zur pH- Werteinstellung und TRITON-X-100-Entfernung vorgenommen wurden, ohne eine deutliche Auswirkung auf das Ergebnis des Verfahrens umgekehrt werden kann.
- Das Oberflächenprotein wird anschließend leicht von den Verunreinigungen abgetrennt, wodurch sich ein im wesentlichen gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenprotein ergibt. Das bevorzugte Verfahren zur Entfernung der Verunreinigungen besteht darin, das Oberflächenprotein auf weitporige Kieselsäure zu adsorbieren. Das am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Adsorption des Oberflächenproteins auf weitporige Kieselsäure mit einem Porengrößebereich von etwa 1 000 bis 1 500 Å und einem Größenbereich von Kieselsäureteilchen von etwa 30 bis 130 um (Amicon). Das Oberflächenprotein tritt leicht in die Poren der Kieselsäure ein und wird zurückgehalten. Verunreinigungen von zellulärem Hefeprotein können darum leicht herausgewaschen werden.
- Die Adsorption des Oberflächenproteins auf weitporige Kieselsäure kann chromatographisch oder nicht chromatographisch chargenweise erfolgen. Die chromatographische Adsorption erfolgt dadurch, daß der im pH-Wert eingestellte Extrakt über ein Bett von weitporiger Kieselsäure in einer Säulenchromatographievorrichtung laufengelassen wird. Typischerweise wird etwa 1 l wärmebehandelter Extrakt auf eine 5 cm ummantelte Säulenvorrichtung aufgetragen, die etwa 300 ml (etwa 100 g Trockengewicht) weitporige Kieselsäureperlen bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 200 ml/h enthält.
- Eine nichtchromatographische Adsorption auf weitporiger Kieselsäure wird typischerweise durch Vermischen des wärmebehandelten Extrakts mit der Kieselsäure in einem geeigneten Gefäß, z.B. einer fest verschließbaren Glasflasche, vorgenommen. Das bevorzugte Verfahren besteht in der Zugabe von 300 ml weitporiger Kieselsäure zu etwa 1 l wärmebehandeltem Extrakt in einer Glasflasche und der Inkubation unter konstantem Mischen. Die Adsorption wird vorzugsweise etwa 1,5 Stunden lang bei etwa 4-8 ºC fortgeführt, obwohl unterschiedliche Zeiten und Temperaturen geeignet sind.
- Das Freiwaschen der mit Oberflächenprotein adsorbierten Kieselsäure von nicht adsorbiertem Material kann auch nichtchromatographisch, wie zuvor für die chromatographische Adsorption beschrieben, erfolgen. Das Waschen der Chargen erfolgt durch Spülen des wärmebehandelten Extrakts auf der weitporigen Kieselsäure und Zugeben mehrerer Volumina eines Puffers, der nicht zur Freisetzung der Oberflächenproteine, die auf der Kieselsäure adsorbiert sind, führt. Der bevorzugte Puffer ist PBS. Die Kieselsäure wird ausgespült, und die Waschschritte werden 3- bis 5mal wiederholt.
- Das chromatographische Waschen der Oberflächenproteinadsorbierten Kieselsäure erfolgt durch Leiten von PBS über die Kieselsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 200 ml/Stunde, bis die Extinktion bei 280 nm konstant ist.
- Das Oberflächenprotein wird aus der gewaschenen weitporigen Kieselsäure unter Verwendung einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 8,5 und 9,5 eluiert. Die Oberflächenproteine werden vorzugsweise unter Verwendung einer Pufferlösung, bestehend aus etwa 0,05 M Borat, bei einem pH-Wert von etwa 8,7 desorbiert. Die Desorption der Oberflächenproteine kann bei erhöhten Temperaturen über einen weiten Bereich erleichtert werden. Die Desorption bei etwa 55 ºC wird bevorzugt.
- Die nichtchromatographische Desorption erfolgt durch Vermischen von 1 200 ml 0,05 M Boratpuffer bei pH 8,7 mit etwa 700 ml gewaschener weitporiger Kieselsäure mit adsorbiertem Oberflächenprotein. Die Desorption erfolgt etwa 25 Minuten lang. Das Eluat wird anschließend gesammelt, die Desorptionsstufen zweimal wiederholt, und das Eluat wird abgekühlt.
- Die chromatographische Desorption erfolgt durch Aufwärmen der ummantelten Säule, der gewaschenen Kieselsäure auf etwa 55 ºC. Anschließend wird 0,05 M Boratpuffer bei pH 8,7 auf 55 ºC erwärmt und sodann auf die Säule mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/Stunde aufgetragen. Das Eluat wird sodann gesammelt und abgekühlt. Das Eluatvolumen entspricht im allgemeinen dem Volumen des auf die weitporige Kieselsäure aufgetragenen wärmebehandelten Extrakts.
- Die Konzentrierung des eluierten Oberflächenproteins ist im allgemeinen erwünscht. Das bevorzugte Konzentrierungsverfahren besteht darin, das Eluat über ein Hohlfaser- Diafiltrationssystem mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; unter Verwendung eines Boratpuffers von 0,05 M, pH 8,7, zu geben. Das Volumen des eluierten Oberflächenproteins kann im allgemeinen bis auf das 16fache unter Anwendung dieses Systems reduziert werden. Das Diafiltrationsretentat kann, falls notwendig, durch Mikrofiltration sterilisiert werden.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne jedoch dieselbe darauf zu beschränken. Die Beschreibung einer jeden, in den folgenden Beispielen erwähnten Referenz ist hiermit als Referenz angegeben.
- HBV-Dane-Teilchen (Serotyp adw) wurden isoliert und aus Humanplasma (Träger) gereinigt, und doppelsträngige DNA wurde durch die endogene Polymerase in den Dane-Teilchen gemäß den Verfahren von Landers et al. [J. Virology, 23, 368-376, (1977)] und Hruska et al. [J. Virology, 21, (1977)] synthetisiert. Die DNA wurde nach Verdau mit Proteinase K in SDS und anschließender Extraktion mit Phenol/Chloroform und durch Ethanolfällung isoliert. Die genomische HBV-DNA wurde mit EcoRI verdaut, wodurch ein einzelnes 3,2 kbp-Fragment erzeugt wurde, das in die EcoRI-Schnittstelle von pBR322 unter Bildung von pHBV/ADW-1 kloniert wurde. Das Vorliegen der HBV-DNA wurde durch EcoRI-Verdau, Southern-Blot-Transfer auf Nitrocellulose und Hybridisierung mit [32P]-markierten spezifischen Oligonucleotidsonden bestätigt.
- Klonieren des preS2+S-Gens in den pGAP-tADH-2-Expressionsvektor
- Das Plasmid pHBV/ADW-1 (beschrieben in Beispiel 1) wurde mit EcoRI und AccI verdaut und das 0,8 kbp-Fragment mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese gereinigt.
- Um den 5'-Anteil des preS2+S-ORF zu rekonstruieren, wurde ein Paar von Oligonucleotiden synthetisiert, das den ORF von der EcoRI-Schnittstelle stromaufwärts zu ATG über eine 10 bp-NTL-Sequenz zu einem HindIII-Terminus wiederherstellt. Die Sequenz dieses Oligonucleotids lautet:
- AGCTTACAAAACAAAATGCAGTGG
- ATGTTTTGTTTTACGTCACCTTAA
- Um den 3'-Anteil des preS2+S-ORF zu rekonstruieren, wurde ein zweites Paar von 0ligonucleotiden synthetisiert, das den ORF von der AccI-Schnittstelle über den Translationsterminator zu einem HindIII-Terminus rekonstruiert. Die Sequenz dieses Oligonucleotids lautet:
- ATACATTTAA
- TGTAAATTTCGA
- Das Plasmid pGAP-tADH-2, das den GAP491-Promotor [Holland et al., J. Biol. Chem., 255: 2596, (1980)] und den ADHI-Transkriptionsterminator in pBR322 enthält, besitzt eine einzigartige HindIII-Klonierungsstelle, in die der oben beschriebene preS2+S-ORF ligiert wurde, was pEGpreS2S-1 ergibt. Das Vorliegen und die Orientierung von HBV-DNA wurde durch Resktriktionsendonucleaseanaylse und Southern-Blot-Transfer bestätigt. Die Expressionskassette, die den preS2+S-ORF enthält, wurde aus pEGpreS2S-1 durch SphI-Verdau entfernt und durch präparative Agarosegelelektrophorese isoliert. Die Die Kassette wurde anschließend in den Shuttle-Vektor pC1/1 kloniert (Beggs, supra; Brosenberg et a., supra), der zuvor mit SphI verdaut worden war, um einen Hefeepxressionsvektor (pyGpreS2S-1) zu erzeugen, der sodann, wie oben beschrieben, zur Transformation von S. cerevisiae verwendet wurde.
- Das resultierende Plasmid pyGpreS2S-1 (aus Beispiel II oben), das die Expressionskassette enthielt, wurde zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes CF42, (MATa/a, adel&supmin; leu2-04&supmin;, ura3&supmin;), verwendet, der wie folgt hergestellt worden war:
- Eine ura3-Mutation wurde in dem Hefestamm 2150-2-3 (L. Hartwell, U. of Washington) ausgewählt (Boeke et al., supra). Der resultierende Stamm (MATa/a, adel&supmin; leu2-04&supmin;, ura3&supmin;, ciro) wurde durch Transformation mit dem Plasmid YCp50-HO diploid gemacht [Jensen et al., PNAS USA, 80: 3035-3039, (1983)]. Ein diploider Stamm wurde von dem Plasmid kuriert und als CF42, (MATa/a, adel&supmin; leu2-04&supmin;, ura3&supmin;) bezeichnet.
- Ein transformierter Klon (pF403) wurde ausgewählt und als tiefgefrorener Vorrat (in 17 % Glycerin) zur Bewertung, wie nachstehend beschrieben, vorbereitet.
- Anzucht und Expression des preS2+2-Gens in Hefe "Wildtyp" zur Glycosylierung
- Der Hefeklon pF403, der das in Beispiel 111 beschriebene Expressionsplasmid enthielt, wurde auf leu&supmin;-Agarplatten ausplattiert und bei 30 ºC 2-3 Tage lang inkubiert. Diese Hefe wurde in Kulturen von 5 bis 7 ml komplexer YEHD-Medien übergeimpft, und die Kulturen wurden bei 30 ºC unter Belüftung 12-18 Stunden lang inkubiert. Kolben, die 50 ml komplexe YEHD-Medien enthielten, wurden mit den obigen Kulturen bis zu einer A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,1 angeimpft und bei 30 ºC unter Schütteln (350 Upm) 48-72 Stunden lang bis zu einer End-A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Dreifachproben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurden in Aliquote in Röhrchen aufgeteilt, und die Hefezellen wurden bei 2 000 x g 10 Minuten lang pelletisiert. Die Pellets wurden entweder direkt getestet oder bei -70 ºC für eine zukünftige Verwendung als interner Referenzstandard zur Bewertung der kontrollierten Glycosylierungsklone aufbewahrt, die nachstehend in den Beispielen VII, VIII, IX und X (für diese Vergleiche wurden die Werte für den Klon pF403 auf 1,0 normalisiert) beschrieben werden. Zur Zeit des Tests wurden die Pellets in 0,4 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 2 M PMSF enthielt, resuspendiert. Die Hefezellen wurden aufgebrochen mittels: 1) Zugabe von 200-300 mg gewaschenen Glasperlen (0,45 mm), 2) 15minütigem Schütteln auf einen Vortex-Mischer, 3) Zugabe von TX-100 zu 0,5 % (Vol./Vol.), 4) 2minütigem Schütteln auf einen Vortex-Mischer und 5) 10minütigem Inkubieren bei 4ºC. Zelltrümmer und Glasperlen wurden durch 10minütige Zentrifugation bei 2 000 x g entfernt. Die geklärte überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und auf Protein [anhand des Verfahrens von Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265 (1951)] mittels RIA, das für preS2+S spezifisch ist [Hansson et al., supra, Machida et al., supra], getestet.
- Das resultierende Plasmid (pYGpreS2S-1) aus Beispiel II vorstehend), das die Expressionskassette enthält, wurde zur Transformation von S. cerevisiae-KHY-107 (cir+) verwendet, welches wie folgt konstruiert wurde:
- Der α-Paarungstypstamm CZ5/LB347-1C (mnn9&supmin;, SUCZ&supmin;) wurde mit dem a-Typenstamm 2150-2-3 (leu2&supmin;, adel&supmin;) gepaart, indem die Stämme auf einer YEHD-Komplettmedium-Platte gemischt wurden. Um Diploide zu selektieren, wurden die gepaarten Stämme nochmals auf leu&supmin;-Minimalmedium ausplattiert, das 2 % Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt. Nach dem Isolieren einzelner Kolonien wurden die Diploide sporuliert und die Asci durch Standardtechniken abgetrennt. Der KHY-107-Stamm wurde als Einzelspore isoliert und als cir&spplus;, adel&spplus;, leu2&supmin; und mnn9&supmin; charakterisiert (anhand von Schiff- Anfärbetechnik).
- Klone wurden auf Minimalmedium (leu&supmin; mit 1 M Sorbit) selektiert, als gefrorene Vorräte (in 17 % Glycerin) aufbereitet und, wie nachstehend beschrieben, bewertet.
- Das Expressionsplasmid, das in Beispiel II vorstehend beschrieben worden ist, wurde zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes KHY-107 (ciro) verwendet, der sich von dem Stamm KHY-107 (cir&spplus;) wie von Broach ["Methods in Enzymology", Bd. 101, Teil C, 307-325, (1983)] beschrieben, ableitete. Klone wurden selektiert, als gefrorene Vorräte, wie vorstehend in Beispiel V beschrieben, vorbereitet und auf die Expression von preS2+S, wie nachstehend in Beispiel VIII beschrieben, bewertet.
- Hefeklone, die das in Beispiel V beschriebene Expressionsplasmid enthielten, wurden auf selektiven leu&supmin;-Agarplatten, die 1 M Sorbit enthielten, ausplattiert und 2-3 Tage lang bei 30 ºC inkubiert. Diese Hefe wurde in 5-7-ml-Kulturen von komplexem YEHDS übergeimpft, und die Kulturen wurden bei 30 ºC unter Belüftung 12-18 Stunden lang inkubiert. Kolben, die 50 ml YEHDS-Medien enthielten, wurden mit den obigen Kulturen angeimpft (bis zu einer Anfangs-A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,1) und wurden unter Schütteln (350 Upm) 48-72 Stunden lang bis zu einer End-A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 bei 30 ºC inkubiert. Proben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurden in Aliquote in Röhrchen aufgeteilt, und die Hefezellen wurden bei 2 000 x g 10 Minuten lang pelletisiert. Die Proben wurden entweder direkt, wie in Beispiel IV beschrieben, getestet oder bei -70 ºC tiefgefroren aufbewahrt. Zelltrümmer und Glasperlen wurden durch 10minütige Zentrifugation bei 2 000 x g entfernt. Die geklärte überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und auf Protein durch einen auf preS2+S spezifischen RIA-Test, wie vorstehend beschrieben, getestet.
- 5 Klone wurden gleichzeitig bewertet und mit einem äquivalenten Zellpellet von Klon pF403 (siehe Beispiel IV oben) verglichen, der auf einen Wert von 1,0 als Referenz normiert worden war. Typische relative Werte der Antigenproduktivität für die 5 Klone waren: relative(1) Einheiten preS2+S/Einheiten Protein relativ (1) mg preS2+S/ml Klon
- (1) Ellis et al., (1987) in "Viral Hepatitis and Liver Disease" A. Zuckerman (Hrsg.), New York: Alan R. Liss Inc., S. 1079 und Kniskern et al., (1988), Hpatology, 8, 82-87.
- Die Immunblotanalyse, entwickelt mit Kaninchen-Anti-HBs oder McAb auf die preS2-Domäne, detektierte eine einzelne Hauptspezies mit einem Molekulargewicht von ca. 34 kD. Klon, "a" oben, im folgenden als Klon 14007-230-1A bezeichnet, wurde zur weiteren Entwicklung ausgewählt.
- Hefeklone, die das in Beispiel VI beschriebene Expressionsplasmid enthielten, wurden auf selektiven leu&supmin;-Agarplatten ausplattiert, die 1 M Sorbit enthielten, und 2-3 Tage lang bei 30 ºC inkubiert. Diese Hefe wurde in 5-7 ml YEHDS-Medium übergeimpft, und die Kulturen wurden bei 30 ºC unter Belüften 12-18 Stunden lang inkubiert. Kolben, die 50 ml komplexes YEHDS-Medium enthielten, wurden mit den obigen Kulturen angeimpft (bis zu einer Anfangs-A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,1) und wurden bei 30 ºC unter Schütteln (350 Upm) 48-72 Stunden bis zu einer End-A&sub6;&sub0;&sub0; von 10-16 inkubiert. Dreifachproben von 10 A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheiten wurden in Aliquote in Röhrchen aufgeteilt, und die Hefezellen wurden bei 2 000 x g 10 Minuten lang pelletisiert. Die Proben wurden entweder direkt, wie bereits beschrieben, getestet oder bei -70 ºC tiefgefroren aufbewahrt. Zelltrümmer und Glasperlen wurden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 2 000 x g entfernt. Die geklärte überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und auf Protein und preS2+S-Antigen, wie bereits beschrieben, getestet.
- 5 Klone wurden gleichzeitig bewertet und mit Klon pF403 (siehe Beispiel IV oben) verglichen, der auf einen Wert von 1,0 als Referenz normiert worden war. Typische relative Werte der Antigenproduktivität für die 5 Klone waren: Klon relativ (1) mg preS2+S/ml relative(1) *Einheiten preS2+S/Einheiten Protein (aus Beispiel VII) siehe Beispiel VII
- Die Immunblotanalyse (siehe Beispiel VII) wies eine einzige Hauptbande mit einem Molekulargewicht von ca. 34 kD nach. Klon "a" oben, im folgenden als Klon 14007-284-1A bezeichnet, wurde zur weiteren Entwicklung ausgewählt.
- Die gefrorene Stammkultur 14007-230-1A (Beispiel VII oben) wurde auf leu&supmin;-Platten, die 1 M Sorbit enthalten, angeimpft.
- Die Platten wurden umgekehrt bei 28 ºC 2-3 Tage lang inkubiert. Die Stammkulturen wurden entweder vorbereitet, wie in Beispiel VII vorstehend beschrieben, oder die gewachsenen Kulturen auf den Platten wurden in YEHDS-Medium resuspendiert, und die resuspendierten gewachsenen Kulturen wurden in 2-1-Erlenmeyerkolben übergeführt, die 500 ml YEHDS enthielten. Die Kolben wurden bei 28 ºC und 350 Upm in einem Schüttelinkubator unter kontrollierter Umgebung 18-22 Stunden lang inkubiert.
- Ein Inokulum (5 % (Vol./Vol.)) aus dem Ausgangskolben wurde in einen 250-ml- oder 2-1-Kolben übergeführt, der 50 ml bzw. 500 ml YEHDS enthielt. Die Produktionskolben wurden sodann, wie vorstehend beschrieben, 40-46 Stunden lang inkubiert. Eine optische Dichte von 8,0 A&sub6;&sub6;&sub0;-Einheiten wurde typischerweise erhalten. Die Zellen aus den Kolben wurden durch 10minütiges Zentrifugieren des Inhalts der Kolben in 500-ml-Zentrifugenflaschen bei 1 300 x g geerntet. Der Überstand wurde abdekantiert und das Zellpellet in 50-100 ml gepufferter Salzlösung resuspendiert.
- Aliquote (0,6 ml) von 20%igen gewaschenen Zellaufschlämmungen wurden unter Verwendung von Glasperlen (0,45-0,52 mm) in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen aufgebrochen. PMSF (6,5 ml von 200 mM Stammlösung) wurde als Proteaseinhibitor hinzugegeben. Die Aliquote wurden nach dem Aufbrechen aus dem Röhrchen genommen und bei -70 ºC für die Immunblotanalyse tiefgefroren. TRITON X-100 wurde zu der verbleibenden Probe in den Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzugegeben, und die Proben wurden kurz vermischt und 20-40 Minuten lang bei 4 ºC inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren entfernt und der geklärte Zellextrakt durch RIA auf preS und durch Lowry auf Protein getestet.
- Ein typischer erhaltener Wert betrug 15,65 mg preS2+S/ml Fermentationsnährlösung und 0,04 mg preS2+S/mg Gesamtprotein.
- Die gefrorene Stammkultur 14007-230-1A wurde auf leu&supmin;-Platten, die 1 M Sorbit enthielten, angeimpft. Die Platten wurden umgekehrt bei 28 ºC 2-3 Tage lang inkubiert. Die gewachsenen Kulturen auf den Platten wurden in YEHDS resuspendiert, und die resuspendierten gewachsenen Kulturen wurden in 2-1-Erlenmeyerkolben übergeführt, die 500 ml YEHDS enthielten. Die Kolben wurden bei 28 ºC und 350 Upm in einem Schüttelinkubator unter kontrollierter Umgebung 18-22 Stunden lang inkubiert. Diese Ausgangskulturen wurden sodann zum Animpfen von Gefäßen im Produktionsstadium verwendet.
- Ein Inokulum (1-5 % (Vol./Vol.) von einem oder mehreren Kolben wurde in einen 16-1- oder 250-1-Fermenter übergeführt, der 10 1 bzw. 200 1 YEHDS enthielt. Die 16-1-Fermenter wurden bei 500 Upm, 5 1/min. Belüftung und 28 ºC betrieben. Die Fermenter wurden 40-46 Stunden nach Animpfen mit der Ausgangskultur geerntet. Optische Dichtewerte von 15,0 A&sub6;&sub6;&sub0;-Einheiten wurden typischerweise erhalten. Die Ernte bestand darin, die Zellen unter Verwendung einer Hohlfaser-Filtervorrichtung zu konzentrieren und anschließend die Zellen in gepufferten Salzlösungen zu waschen. Die Zellaufschlämmungen wurden wie vorstehend getestet oder bei -70 ºC zur weiteren Verarbeitung und Analyse tiefgefroren.
- Kleine Proben (0,6 ml) von 20%igen gewaschenen Zellaufschlämmungen wurden unter Verwendung von Glasperlen (0,45-0,52 mm) in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen aufgebrochen. PMSF (6,5 ml von 200 mM Stammlösung) wurde als Proteaseinhibitor zugegeben. Aliquote wurden nach dem Aufbrechen aus dem Röhrchen entnommen und bei -70 ºC für eine Immunblotanalyse tiefgefroren. TRITON X-100 wurde zu der restlichen Probe in den Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % gegeben, und die Proben wurden kurz vermischt und 20-40 Minuten lang bei 4 ºC inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren entfernt und der geklärte Zellextrakt mittels RIA auf preS und mittels Lowry auf Protein getestet.
- Ein durchschnittlicher Wert der Antigenproduktivität betrug 8,4 mg preS2+S/ml Fermentationsnährlösung und 0,025 mg preS2+S/mg Protein/mg Gesamtprotein.
- Die erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren für rekombinantes HBpreS2+S umgehen die zuvor erforderliche Einführung von Proteaseinhibitoren während einer der Reinigungsschritte vollständig. Die mit den Expressionsvektoren, die für das HBpresS2+S-Protein oder für Varianten davon kodieren, transformierten Hefezellen werden angezogen und geerntet. Die Zellen können auf Wunsch gelagert werden, indem die Zellen mit einer Pufferlösung, z.B. PBS, gewaschen werden und eine Zellpaste gebildet wird, die typischerweise tiefgefroren bei -70 ºC aufbewahrt wird.
- Etwa 6,6 kg einer gefrorenen Zellaufschlämmung (die rekombinantes preS2+S-Protein erzeugt) wurde aufgetaut und mit 1,06 1 PBS und 7,36 l 1 M Tris-Basenpuffer, pH 11,0, verdünnt. Ein roher Zellextrakt wurde hergestellt, indem die Hefezellensuspension zweimal durch einen Gaulin-Hochdruckhomogenisator gegeben wurde. Nach der Homogenisierung wurde TRITON X-100 zu dem rohen Zellextrakt gegeben (0,1 % Endkonzentration). Der rohe Zellextrakt wurde auf 45 ºC erhitzt, 15 Minuten lang bei 45-50 ºC gehalten und anschließend auf weniger als 10 ºC abgekühlt, wobei ein Wärmetauscher verwendet wurde. Nach dem Abkühlen wurde ein Aliquot der wärmebehandelten Aufschlämmung, das etwa 3,25 kg Zellen darstellte, gegen 0,1 M Tris- Basenpuffer, pH 10,1, diafiltriert, der 0,1 % TRITON X-100 enthielt, wobei ein tangentialer Fluß von 0,1 pm bis 0,2 um, und eine Prostak Durapore (Millipore)-Membran, eine Platte mit Rahmendiafiltrationseinheit, verwendet wurden. Das Volumen des resultierenden Filtrats betrug 47,8 l. Das Filtrat wurde sodann konzentriert und unter Verwendung einer Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; diafiltriert, was das Volumen auf etwa 8,6 l verringerte. Das Konzentrat wurde anschließend über ein Einwegfilter mit einer Porengröße von 0,2 um filtriert, und das filtrierte Konzentrat wurde über eine Patrone gegeben, die XAD-4-Harz (etwa 320 g) enthielt, um TRITON X-100 zu entfernen. Das filtrierte Konzentrat wurde über das XAD-4-Harzbett mit etwa 800 ml/h gegeben (Patrone etwa 3,5 in. Durchmesser). Der pH-Wert des harzbehandelten Konzentrats wurde auf 7,8 verringert, und der Extrakt wurde auf eine Chromatographiesäule von 25 cm x 27 cm mit weitporiger Kieselsäure mit einem Porengrößebereich von etwa 1 000 bis 1 500 Angström und einem Größenbereich von Kieselsäureteilchen von etwa 31-130 um (Amicon) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 l/h unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe gegeben, um das preS2+S-Protein zu absorbieren. Die weitporige Kieselsäure wurde anschließend mit 1,5 Volumina PBS (16,8 l/h) gewaschen. Das preS2+S wurde aus der weitporigen Kieselsäure unter Verwendung von 26,25 l 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, aufgewärmt auf 55-60 ºC, mit einer Fließgeschwindigkeit von 16,8 l/Stunde eluiert. Das preS2+S-Proteineluat wurde in einem Volumen von 26,25 l gesammelt und anschließend unter Verwendung einer Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; konzentriert, was das Volumen auf etwa 1,6 l verringerte. Das preS2+S-Protein wurde anschließend gegen 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, unter Verwendung eines Hohlfaserssystems mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; diafiltriert.
- Etwa 210 g gefrorene Hefezellpaste (die rekombinantes preS2+S-Protein produziert) wurden in etwa 630 ml 0,5 m Tris-Basenpuffer, pH 10, suspendiert. Ein roher Zellextrakt wurde hergestellt, indem die Hefezellsuspension dreimal durch einen Stansted-Hochdruckhomogenisator gegeben wurde. Nach der Homogenisierung wurden 43 ml 10 % TRITON X-100 zu dem rohen Hefezellextrakt gegeben und durch sanftes Rühren vermischt. Der rohe Extrakt wurde anschließend bei 55 ºC 30 Minuten lang erhitzt, indem er in ein beheiztes Wasserbad eingetaucht wurde. Der Extrakt wurde anschließend auf etwa 4 ºC in einem Eiswasserbad abgekühlt. Der gekühlte Extrakt wurde bei 3 000 x g 15 Minuten lang bei 4 ºC zentrifugiert. Der Überstand (geklärter Extrakt) wurde in einem Becherglas gesammelt, und 155 g XAD-2-Harz wurden zur Entfernung von TRITON X-100 hinzugegeben. Harz und geklärter Extrakt wurden sanft etwa 90 Minuten lang bei 2-8 ºC gerührt, und das Harz wurde aus dem geklärten Extrakt entfernt, indem er über ein Metallsieb gegeben wurde. Der pH-Wert des Extrakts wurde sodann durch Zugabe von 150 ml 1 M HCl auf etwa 7,6 reduziert. Etwa 230 mg weitporige Kieselsäure mit einer Porengröße von etwa 1 500 Angström und einer Teilchengröße von etwa 100 um wurde zu dem Extrakt gegeben, so daß das preS2+S-Protein adsorbiert wurde. Extrakt und weitporige Kieselsäure wurden sanft etwa 90 Minuten lang bei etwa 2-8 ºC gemischt. Die weitporige Kieselsäure mit adsorbiertem preS2+S wurde sodann fünfmal mit etwa 6 300 ml PBS bei 2-8 ºC gewaschen. Das preS2+S-Protein wurde aus der weitporigen Kieselsäure durch Zugabe von 1 200 ml 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, bei 55 ºC eluiert. Die Elution erfolgte etwa 25 Minuten lang. Die Elutionsschritte wurden dreimal wiederholt. Das eluierte preS2+S wurde anschließend durch Diafiltration gegen 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, konzentriert, wobei eine Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsauschluß von 10&sup5; verwendet wurde.
- Etwa 210 g gefrorene Hefezellpaste (die rekombinantes preS2+S-Protein produziert) wurden in etwa 630 ml 0,5 m Tris-Basenpuffer, pH 10, suspendiert. Ein roher Zellextrakt wurde hergestellt, indem die Hefezellsuspension dreimal durch einen Stansted-Hochdruckhomogenisator gegeben wurde. Nach der Homogenisierung wurde der rohe Extrakt gegen 0,5 M Tris- Basenpuffer, pH 10,4, plus 1,0 % TRITON X-100 diafiltriert, wobei eine Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem tangentialen Fluß von 0,1 um bis 0,2 um verwendet wurde. Das Volumen des resultierenden Filtrats betrug 7,3 l. Das Filtrat wurde anschließend durch Diafiltration unter Verwendung einer Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; diafiltriert, was das Volumen auf etwa 1,3 l reduzierte. Das Konzentrat wurde sodann ungefähr 30 Minuten lang auf etwa 55 ºC erhitzt und auf etwa 2-8 ºC abgekühlt. Das Konzentrat wurde in einem Becherglas gesammelt, und 250 g XAD-2-Harz wurden zur Entfernung des TRITON X-100 hinzugegeben. Harz und konzentrierter Extrakt wurden sanft etwa 90 Minuten lang bei 2-8 ºC gerührt und das Harz aus dem konzentrierten Extrakt entfernt, indem es über ein Metallsieb gegeben wurde. Nach Entfernen des Harzes wurde der pH-Wert auf 7,7 abgesenkt und der Extrakt auf eine Chromatographiesäule von 5 cm x 15 cm mit weitporiger Kieselsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/h unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe aufgetragen, um das preS2+S-Protein zu adsorbieren. Die weitporige Kieselsäure wurde sodann mit 9 Volumina PBS (200 ml/h) gewaschen. Das preS2+S wurde aus der weitporigen Kieselsäure eluiert, indem 1 400 ml 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, aufgewärmt auf 55 ºC, bei einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/h verwendet wurden. Das preS2+S-Proteineluat wurde in einem Volumen von 1,4 l gesammelt und anschließend unter Verwendung einer Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; konzentriert, was das Volumen auf etwa 0,48 l verringerte. Das preS2+S-Protein wurde anschließend gegen 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, unter Verwendung eines Hohlfasersystems mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; diafiltriert.
- Etwa 210 g gefrorene Hefezellpaste (die rekombinantes preS2+S-Protein produzierte) wurde in etwa 640 ml 0,5 M Tris- Basenpuffer, pH 11,3, suspendiert. Ein roher Zellextrakt wurde hergestellt, indem die Hefezellsuspension dreimal durch einen Stansted-Hochdruckhomogenisator gegeben wurde. Nach der Homogenisierung wurde der rohe Extrakt gegen 0,5 M Tris- Basenpuffer, pH 10,4, plus 0,1 % TRITON X-100 diafiltriert, wobei eine Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem tangentialen Fluß von 0,1 um bis 0,2 um verwendet wurde. Das Volumen des resultierenden Filtrats betrug 7,8 l. Das Filtrat wurde anschließend durch Diafiltration unter Verwendung einer Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; diafiltriert, was das Volumen auf etwa 1,1 l reduzierte. Das Konzentrat wurde sodann ungefähr 35 Minuten lang auf etwa 55 ºC für erhitzt und auf etwa 8 ºC abgekühlt. Das Konzentrat wurde in einem Becherglas gesammelt, und 285 g XAD-2-Harz wurden zur Entfernung von TRITON X-100 hinzugegeben. Harz und konzentrierter Extrakt wurden etwa 90 Minuten lang bei 2-8 ºC sanft gerührt und das Harz aus dem konzentrierten Extrakt entfernt, indem es über ein Metallsieb gegeben wurde. Nach Entfernen des Harzes wurde der pH-Wert auf 7,7 abgesenkt und der Extrakt auf eine Chromatographiesäule von 5 cm x 15 cm mit weitporiger Kieselsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/h unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe aufgetragen, um das preS2+S-Protein zu adsorbieren. Die weitporige Kieselsäure wurde sodann mit 9 Volumina PBS (200 ml/h) gewaschen. Das preS2+S wurde aus der weitporigen Kieselsäure unter Verwendung von 1 200 ml 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, aufgewärmt auf 55 ºC, bei einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/h eluiert. Das preS2+S-Proteineluat wurde in einem Volumen von 1,2 l gesammelt und anschließend unter Verwendung einer Hohlfaser-Diafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; konzentriert, was das Volumen auf etwa 0,43 l reduzierte. Das preS2+S-Protein wurde anschließend gegen 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, unter Verwendung eines Hohlfasersystems mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10&sup5; diafiltriert.
- Etwa 146 g gefrorene Hefezellpaste (die das rekombinante S-Protein produzierte) wurden in etwa 800 ml 0,3 M Tris- Basenpuffer, pH 11,3, suspendiert. Ein roher Zellextrakt wurde hergestellt, indem die Hefezellsuspension dreimal durch einen Gaulin-Hochdruckhomogenisator gegeben wurde. Nach der Homogenisierung wurden 11 ml 10 % TRITON X-100 zu dem rohen Hefezellextrakt hinzugegeben und durch sanftes Rühren vermischt. Der Rohextrakt wurde sodann 35 Minuten lang auf 55 ºC durch Eintauchen in ein beheiztes Wasserbad erwärmt. Der Extrakt wurde anschließend auf etwa 4 ºC in einem Eiwasserbad abgekühlt und bei 3 000 x g 15 Minuten lang bei 4 ºC zentrifugiert. Der Überstand (geklärter Extrakt) wurde in einem Becherglas gesammelt, und 40 g XAD-2-Harz wurden zur Entfernung des TRITON X-100 hinzugegeben. Harz und geklärter Extrakt wurden etwa 3 Stunden lang bei 2-8 ºC sanft gerührt. Das Harz wurde aus dem geklärten Extrakt entfernt, indem er über ein Mulltuch gegeben wurde. Der pH-Wert wurde anschließend auf etwa 7,7 reduziert, indem etwa 150 ml 1 M HCl zugegeben wurde. Der Extrakt wurde auf eine Chromatographiesäule von 5 cm x 15 cm mit weitporiger Kieselsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/h unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe aufgetragen, um das S-Protein zu absorbieren. Die weitporige Kieselsäure wurde sodann mit 12 Volumina PBS bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/h gewaschen. Das S-Protein wurde aus der weitporigen Kieselsäure unter Verwendung von 630 ml 50 mM Boratpuffer, pH 8,7, aufgewärmt auf 55 ºC, bei einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/h eluiert.
- Etwa 100 g gefrorene Hefezellpaste (die das rekombinante preS2+S-Protein produzierte) wurden in etwa 300 ml 0,5 M Tris-Basenpuffer, pH 11,5, suspendiert. Ein roher Zellextrakt wurde hergestellt, indem die Hefezellsuspension dreimal durch einen Stansted-Hochdruckhomogenisator gegeben wurde. Nach der Homogenisierung wurden 20 ml 10 % TRITON X-100-Puffer zu dem rohen Hefezellextrakt gegeben und durch sanftes Rühren vermischt. Der Rohextrakt wurde bei 300 x g 15 Minuten lang bei 4 ºC zentrifugiert. Vier Reihen von Proben des Überstands (geklärter Extrakt) wurden nach der pH-Einstellung auf 10, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0 und 7,5 entnommen. Die Proben der Reihe I wurden sofort eingefroren und bei -70 ºC gehalten. Die Proben der Reihe II wurden 48 Stunden lang bei 2-8 ºC gehalten und anschließend bei -70 ºC tiefgefroren. Die Reihen III und IV wurden 30 Minuten lang auf 55 ºC erwärmt. Die Proben der Reihe 111 wurden anschließend bei -70 ºC tiefgefroren, und die Proben der Reihe IV wurden 48 Stunden lang bei 2-8 ºC gehalten, anschließend bei -70 ºC tiefgefroren.
- Die Menge von preS2+S in allen Proben wurde anschließend durch den Radioimmuntest (RIA) gemessen. Äquivalente Mengen von preS2+S-Protein aus jeder Probe von jeder Reihe wurden auf Zersetzung von preS2+S durch Immunblot getestet, wie vorstehend beschrieben. Das preS2+S in allen Proben der Reihe I blieb intakt. Proben der Reihe II enthielten alle im wesentlichen zersetztes preS2+S-Protein. Die Reihen III und IV enthielten bei jedem pH-Wert hauptsächlich intaktes preS2+S-Protein mit wenig Zersetzung. Die Stabilität des preS2+S-Proteins wurde im wesentlichen nach der Wärmebehandlung der Proben bei 55 ºC verbessert. Die Proben, die nicht wärmebehandelt worden waren, zeigten eine deutliche Zersetzung des preS2+S-Proteins bei jedem pH-Wert.
- Während die vorgenannte Beschreibung die Prinzipien der Erfindung lehrt, wobei die Beispiele zum Zwecke der Erläuterung angegeben sind, ist es selbstverständlich, daß die Praxis der Erfindung alle üblichen Variationen, Modifikationen, Anpassungen, Auslassungen oder Zugaben bei Verfahren und Protokollen, die hier beschrieben sind, umfaßt, wie sie innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche liegen.
Claims (8)
1. Verfahren, um rekombinante
Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine im wesentlichen aus einem Hefezellenextrakt zu
reinigen, welches die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Aufbrechen der Hefezellen in einern Puffer mit einem
PH-Wert von etwa 9,0 bis etwa 12,0,
(b) Einstellen des pH-Wertes auf etwa 10,5 und
Wärmebehandlung des Extraktes aus Stufe (a) zwischen etwa
40 ºC bis etwa 60 ºC und anschließendes Abkühlen auf
etwa Umgebungstemperatur.
(c) gegebenenfalls Zugabe von Detergens zu dem Produkt
aus Stufe (b),
(d) Entfernen des unerwünschten Hefezellenabfalls durch
Zentrifugieren,
(e) Entfernen des Detergens von dem Produkt aus Stufe
(f) Einstellen des pH-Wertes des Produkts aus Stufe (e)
auf zwischen etwa 7,5 bis 8,0,
(g) Aufgeben des Produkts aus Stufe (f) auf weitporige
Kieselgelperlen mit einer Porengröße im Bereich von
etwa 1000 bis 1500 Å und einem
Kieselsäureteilchengrößenbereich von etwa 30 bis 130 um, um das
Oberflächenprotein zu adsorbieren,
(h) Eluieren des Oberflächenproteins von den weitporigen
Kieselgelperlen,
(i) Konzentrieren des Eluats aus Stufe (h), wobei sich im
wesentlichen das gereinigte Oberflächenprotein
ergibt.
2. Verfahren, um rekombinate
Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine im wesentlichen aus einem Hefezellextrakt zu
reinigen, das die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Aufbrechen der Hefezellen in einem Puffer mit einem
PH-Wert von etwa 9,0 bis etwa 12,0,
(b) Einstellen des pH-Wertes auf etwa 10,5 und
Wärmebehandlung des Extraktes aus Stufe (a) zwischen
etwa 40 ºC bis etwa 60 ºC und anschließendes Abkühlen
auf etwa Umgebungstemperatur,
(c) gegebenenfalls Zugabe von Detergens zu dem Produkt
aus Stufe (b)
(d) Entfernen des unerwünschten Hefezellenabfalls durch
Mikrofiltration,
(e) Konzentrierung und Ultrafiltration des Produkts aus
Stufe (d)
(f) Entfernen des Detergens aus dem Produkt aus Stufe
(g) Einstellen des pH-Wertes des Produkts aus Stufe (f)
auf zwischen etwa 7,5 bis etwa 7,9,
(h) Aufgeben des Produkts aus Stufe (e) auf weitporige
Kieselgelperien mit einer Porengröße im Bereich von
etwa 1000 bis 1500 Ä und einem
Kieselgelteilchengrößenbereich von etwa 30 bis 130 um, um das
Oberflächenprotein zu adsorbieren,
(i) Eluieren des Oberflächenproteins von dem weitporigen
Kieselgel,
(j) Konzentrieren des Eluats aus Stufe (i), wobei sich im
wesentlichen gereinigtes Oberflächenprotein ergibt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Aufbrechen der
Hefezellen in einem TRIS-Puffer von etwa 0,5 M bei einem
PH-Wert von etwa 10 durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Aufbrechen der
Hefezellen in einem TRIS-Puffer bei etwa 0,5 M bei einem
PH-Wert von etwa 10 durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Stufe (c) der
Detergenszugabe entfällt.
6. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Stufe (c) der
Detergenszugabe entfällt.
7. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Mikrofiltration
der Stufe (d) mit einer Mikrofiltrationsapparatur mit
Platte und Rahmen mit einem Porengrößenbereich von etwa
0,1 um bis etwa 0,45 um durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Überstand aus
Stufe (d) durch Diafiltration konzentriert wird, die in
einer Hohlfaserdiafiltrationsapparatur mit einer
nominalen Molekulargewichtsretention von etwa 100 000
durchgeführt wird.
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