CH650154A5

CH650154A5 - Wasserloesliche, biologisch aktive fraktion aus dem interzellularen medium des knochenmarks, verfahren zu deren gewinnung und diese enthaltende pharmazeutische zubereitung.

Info

Publication number: CH650154A5
Application number: CH4957/81A
Authority: CH
Inventors: Walter Pierpaoli; Georges Maestroni
Original assignee: Cell Eng Ag; Choay Sa
Priority date: 1979-11-22
Filing date: 1980-11-21
Publication date: 1985-07-15
Also published as: GB2074864B; DK312081A; FR2469926B1; FR2469926A1; US4540574A; AU544136B2; WO1981001367A1; GB2074864A; AU6486980A; JPS56501525A; SE8104458L

Description

Die Erfindung betrifft eine wasserlösliche, biologisch aktive Fraktion, ein Verfahren zu deren Gewinnung und eine diese enthaltende pharmazeutische Zubereitung gemäss den Oberbegriffen der Patentansprüche 1, 3 und 10.

Als biologische Wirkungen der Fraktion kommen unter anderem in Betracht: Die Beeinflussung der Immunreaktio-5 nen eines Wirtsorganismus gegen allogene Zellen oder allogènes Gewebe, insbesondere der Abstossung des verpflanzten Materials durch den Wirtsorganismus (host versus graft reaction, HVGR) und der sogenannten Abstossung des Wirtsorganismus durch das übertragene Material (graft ver-lo sus host reaction, GVHR) bei der Transplantation von allo-genem unverträglichem Knochenmark, die in vivo-Förde-rung der Verpflanzung allogenen Marks und der Schutz des Wirtsorganismus gegen Strahlung und gegen Strahlungsfolgen.

is Es ist bereits veröffentlicht worden, dass lebensfähige Knochenmarkzellen in der Lage sind, immunologische Reaktionen (HVGR und GVHR) zu beeinflussen und zu steuern, die dann auftreten, wenn immunogenetisch unterschiedliches Knochenmark in einen letal bestrahlten Wirts-20 Organismus transplantiert wird (Immunität). Insbesondere ist bereits gefunden worden, dass Knochenmarkzellen das Einpflanzen von Fremdzellen oder Fremdgewebe (die bzw. das für den Wirtsorganismus allogen oder xenogen sind) erleichtern, wenn man sie nach einem vorbestimmten Schema, 25 das eine Ganzkörperbestrahlung umfasst, die darauf abzielt, das eigene Immunsystem des Wirtsorganismus zu zerstören und dessen Ersatz durch ein Immunsystem fremden Ursprungs zu erleichtern, an den Wirtsorganismus verabreicht.

Es hat sich insbesondere gezeigt, dass die Behandlung 30 von Mäusen, die darin besteht, ihnen Zellen des Knochenmarks von Ratten zu verabreichen, sie dann kurz darauf einer letalen Gesamtkörperbestrahlung zu unterwerfen und anschliessend ihnen neue Knochemarkzellen zu verabreichen, zu einem bemerkenswerten Schutz der Mäuse gegen 35 Strahlungsschäden führt, und - wenn die nach der Ganzkörperbestrahlung verabreichten Knochenmarkzellen xenoge-nen Ursprungs sind (d.h. von der Ratte stammen) - die Einpflanzung des Marks und die Ausbildung eines dauerhaften xenogenen (Ratte) Chimärismus in den Mäusen erleichtert 40 ("A new pre-irradiation conditioning regimen which pro-tects against radiation injury and facilitâtes engraftment of xenogeneic bone marrow", Walter Pierpaoli & Georges J.M. Maestroni, Scand. J. Haematol. 22 (1979), 165-172).

Die der Ganzkörperbestrahlung vorausgehende Behand-45 lung wird auch im folgenden als "Vorbehandlung" bezeichnet, während der Ausdruck "Nachbehandlung" hier und im folgenden für die Verabreichung von aus dem Knochenmark gewonnenem Material nach der Ganzkörperbestrahlung steht.

so Bei der Anwendung des Modells der xenogenen (Ratten an Mäuse) Marktransplantation hat sich gezeigt, dass die kritischen Faktoren des Erfolgs eine ausreichende Anzahl von lebensfähigen Knochenmarkzellen vor und nach der Ganzkörperbestrahlung, den zeitlichen Ablauf und den Weg 55 der Verabreichung umfassen, wobei jeder dieser Faktoren genau berücksichtigt werden muss, um einen Schutz gegen Sekundärerkrankungen, ein langanhaltende Überleben der Tiere und die Entwicklung des Chimärismus sicherzustellen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, 60 dass die lebensfähigen Markzellen diesen überraschend günstigen Effekt über die Synthese und/oder Sekretion von Bestandteilen in dem Wirtsorganismus ausüben, die die Einpflanzung des transplantierten unverträglichen Marks nach der letalen Ganzkörperbestrahlung erleichtern. 65 Insbesondere hat sich gezeigt, dass der oben angesprochene günstige Effekt einer wasserlöslichen, biologisch aktiven Fraktion zugeordnet werden kann, die aus dem physiologischen interzellularen Medium des Knochemarks irgend

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welcher Säugetiere gewonnen werden kann, insbesondere nachdem man die Knochenmarkzellen als solche abgetrennt hat.

Diese Festeilung war um so überraschender, als das physiologische interzellulare Medium (die überstehende Flüssigkeit des Knochemarks, SN) als solches keine wesentliche, wenn nicht besondere Massnahmen ergriffen werden, um die Inaktivierung der biologsich aktiven Fraktion zu verhindern, und reproduzierbare Wirkung in einem Prüfsystem der oben angegebenen Art zeigt und als biologisch aktive Fraktion dazu neigt, inaktiviert zu werden, wenn der pH-Wert neutral ist oder auf weniger als 7,0 absinkt, und sowohl Inhibitoren als auch Aktivatoren der Knochemarkfunktionen enthält.

Die wasserlösliche, biologisch aktive Fraktion der vorliegenden Erfindung ist durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale gekennzeichnet.

Vorzugsweise ist die Fraktion im wesentlichen frei von den Bestandteilen des physiologischen, interzellularen Mediums des Knochenmarks, die Molekulargewichte von weniger als 100 000 aufweisen und aus Inhibitoren der oben erwähnten biologischen Wirkung der Fraktion bestehen. Eine besonders bevorzugte Fraktion ist im wesentlichen frei von diesen Inhibitoren, die mit Hilfe eines Filtrationssystems, wie einer mikroporösen Membran, filtriert werden können, welches Filtrationssystem die Abtrennung und Entfernung von Bestandteilen mit Molekulargewichten von im wesentlichen unter 100 000 von dem physiologischen, interzellularen Medium oder einer Pufferlösung oder einer Salzlösung davon ermöglicht.

Aus den erfindungsgemässen Merkmalen ergibt sich,

dass das gesamte physiologische, interzellulare Medium des Knochenmarks offensichtlich Inhibitoren der Wirkung der erfindungsgemässen biologischen Fraktion enthält, welche Inhibitoren Molekulargwichte aufweisen, die im wesentlichen 30 000 nicht übersteigen.

Das erfmdungsgemässe Verfahren zur Gewinnung der Fraktion aus dem Knochenmark ist Gegenstand des kennzeichnenden Teils des Patentanspruchs 3.

Vorzugsweise hält man den pH-Wert des Mediums ständig bei einem Wert von nicht weniger als 7,0 und vorzugsweise bei einem Wert von 7,2 bis 7,6.

Zur Durchführung der Abtrennung des physiologischen, interzellularen Mediums von den Knochenmarkzellen wird das Knochenmark zuvor vorzugsweise in einer physiologischen Lösung, insbesondere einer Salzlösung oder Pufferlösung, deren pH-Wert auf zwischen 7,2 und 7,6 eingestellt worden ist, suspendiert, wonach die Zellen abgetrennt werden, erforderlichenfalls nach vorsichtiger Zerteilung des Knochenmarkgewebes, die derart gesteuert wird, dass eine mögliche Zerstörung des Zellenmaterials vermieden wird.

Mit Vorteil besteht die Pufferlösung aus dem Hanks-Medium oder dem Earle-Medium mit einem pH-wert von 7,4.

Die Temperatur, bei der sämtliche oben angegebenen Massnahmen durchgeführt werden können, liegt vorzugsweise unterhalb Raumtemperatur und noch bevorzugter zwischen 0 und 5 °C.

Diese Verfahrensweise ermöglicht die Gewinnung einer biologischen aktiven Fraktion, die die Immunreaktionen unter Bedingungen zu beeinflussen und zu steuern vermag, die im wesentlichen die gleichen sind, wie die oben im Zusammenhang mit den vollständigen Knochenmarkzellen angesprochen wurden, wie es nachfolgend noch erläutert werden wird.

Die Wirkung der erfindungsgemässen biologischen Fraktion ist nicht artspezifisch. Sie ist weiterhin völlig frei von toxischer Wirkung.

Die erfindungsgemässe Fraktion zeichnet sich weiterhin durch die Fähigkeit aus, dass sie immunologisch mit Antikörpern reagieren muss, die in einem heterologen Wirtsorganismus gegen die Fraktion gebildet werden, wie sie mit dem hierin definierten Verfahren erhalten werden (nachfolgend als MRF bezeichnet).

Zur Untersuchung der Organ- und Gewebe-Spezifität von markregulierenden Faktoren (MRF) kann man die folgende Methode anwenden, die in ihren wesentlichen Linien erläutert wird.

Man verabreicht durch intramuskuläre Injektion (viermal mit 4 Wochen-Intervallen) an Schafe oder Ziegen wiederholt Human-MRF oder Kaninchen-MRF. Eine Woche nach der letzten Injektion wird Blut gesammelt, das Serum abgetrennt, in aliquote Anteile aufgeteilt und eingefroren. Dann bewirkt man eine weitere Injektion der Tiere und gewinnt eine Woche später wieder das Serum. Die jeweils injizierte MRF-Menge beträgt 10 mg pro Schaf. Vor der Injektion wird das gefriergetrocknete MRF in einer Salzlösung gelöst.

Dann werden aliquote Anteile des Schaf-Anti-Kanin-chen-MRF und des Schaf-Anti-Human-MRF wiederholt an gewaschenen und gepackten Kaninchen-Thymuszellen und -Milzzellen absorbiert, um die Antikörper zu entfernen, die nicht spezifisch gegen MRF, sondern gegen andere, verschiedene und organspezifische Antigene gerichtet sind. Die Antikörper gegen MRF werden durch die direkte Ausfällungsmethode oder die passive Hämagglutinationstechnik unter Verwendung von mit Formaldehyd behandelten und mit Antigen (MRF) beschichteten roten Blutkörperchen von Schafen bestimmt. Durch die Kombination dieser serologischen Methoden mit dem Radio-Immuno-Assay (RIA) von mit radioaktivem Jod (125I) markiertem MRF lässt sich folgendes nachweisen:

1. Die Anwesenheit von Anti-MRF-Antikörpern und ihr Titer;

2. die Anwesenheit von organspezifischen (insbesondere Knochenmark-) Antikörpern;

3. die mögliche Kreuz-Reaktivität von Human- und Kaninchen-MRF (Agglutinations-Inhibierungs-Test);

4. die Anwesenheit von MRF in Gewebeextrakten oder Präparaten unbekannten Ursprungs (immunologische Identifizierung);

5. die mögliche Organspezifität, jedoch nicht die biologische artspezifische Wirkung von Human- und Kaninchen-MRF (z.B. ist Kaninchen-MRF für Human-Knochenmark-zellen und Human-MRF für Kaninchenknochenmarkzellen wirksam).

Zusammenfassend ermöglichen die serologischen Tests und der Radio-Immuno-Assay die Identifizierung von MRF als eine mögliche einzigartige Kombination von Substanzen, die eine organspezifische, jedoch nicht artspezifische biologische Wirkung ausüben.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin pharmazeutische Zubereitungen, die diese Fraktion in Kombination mit pharmakologischen Hilfsstoffen enthalten, die die Verabreichung an einen Wirtsorganismus ermöglichen, beispielsweise auf parenteralem, wie intravenösem Wege.

Die Erfindung sei im folgenden durch die Beschreibung einer bevorzugten Gewinnungsmethode der erfindungsgemässen biologisch aktiven Fraktion aus dem Knochemark von Tieren, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen und Schafen, und ihrer biologischen Eigenschaften erläutert, ohne dass die Erfindung dadurch eingeschränkt werden soll.

Die Lösung des oben angesprochenen physiologischen, interzellularen Mediums in einer Salzlösung wird im folgenden als "überstehende Flüssigkeit des Knochenmarks" bezeichnet, während die erfindungsgemässe biologisch aktive

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Fraktion als "markregulierender Faktor" (MRF) bezeichnet wird.

I. Beschreibung des Verfahrens zur Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit des Knochenmarks, aus dem der markregulierende Faktor (MRF) extrahiert wird

Man tötet junge, ausgewachsene Spender (Gruppen von 10 männlichen oder weiblichen Kaninchen mit einem Körpergewicht zwischen 1,5 und 2,0 kg) durch Genickbruch. Dann isoliert man die langen Knochen und überführt sie in gekühlte TC 199-Lösung oder Salzlösung (0,9% NaCl). Die Knochen werden dann an den Enden zerschnitten und die TC 199-Lösung oder die Salzlösung wird wiederholt durch die Knochen gespült, um das gesamte Mark einschliesslich des Fettgewebes und des Bindegewebes und all das, was das interzellulare Medium des Knochenmarks ausmacht, auszutreiben. Das Material (Markklumpen, Fett und andere Gewebe) wird dann unter Verwendung einer grossen Injektionsspritze ohne Nadel durch vorsichtiges Ansaugen und Ausstossen des suspendierten Materials, das stets in geschmolzenem Eis gehalten wird, zerteilt, bis keine Zellaggregate mehr festzustellen sind. Die Anzahl der Zellen in der Suspension liegt im Bereich zwischen 50 und 100 x 106/ml der überstehenden Flüssigkeit des Knochenmarks (SN). Zu diesem Zeitpunkt wird die gesamte Anfangssuspension des Materials in einer gekühlten Zentrifuge bei 5 °C während 30 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert, wonach das an der Oberseite der Zentrifugenröhrchen gesammelte Fett durch Absaugen entfernt wird. Der Rest der überstehenden Flüssigkeit wird in Plastikbehältern gesammelt und sofort bei —30 °C eingefroren. Die Zellen werden verworfen. Diese Massnahmen werden sämtliche unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit des Knochenmarks (SN) ist das ursprüngliche Suspensionsmedium, in dem die Knochenmarkzellen zerteilt und suspendiert worden sind. Der pH-Wert von sämtlichen Zellsuspensionen und Präparaten der überstehenden Flüssigkeit des Knochenmarks wird bei 7,2 bis 7,5 gehalten oder auf diesen Wert eingestellt.

Gewinnung von MRF aus der überstehenden Flüssigkeit (SN) von Kaninchenknochenmark

Nach dem Auftauen der überstehenden Flüssigkeit wird diese während 20 Minuten bei 40 000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert, um sämtliche vorhandenen Teilchen und Niederschläge zu entfernen. Dann wird die überstehende Flüssigkeit in einer Filterzelle (Amicon Modell 202 Cell)

über eine Filtermembran (Diaflo XM 100 (Ausschlussgrenze des Molekulargewichts: 100 000) der Firma Amicon Co., Oosterhout, Holland) geführt, um die Fraktion abzutrennen, die getrennte Verbindungen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als 100 000 enthalten. Bei einigen Experimenten wird die erhaltene Fraktion anschliessend über eine Filtermembran (Diaflo XM 30, Ausschlussgrenze des Molekulargewichts: 30 000) geführt, um weitere Bestandteile mit Molekulargewichten von weniger als 30 000 zu entfernen. Bei jedem Experiment verwendet man ein gleich grosses Volumen Wasser zum Waschen des Materials, das nicht durch den Filter dringt. Die auf den Filtern verbleibenden Materialien werden mit einer Injektionsspritze abgesaugt und gefriergetrocknet.

Die anschliessend untersuchten verschiedenen Fraktionen werden wie folgt bezeichnet:

- "MW > 100 000" steht für die MRF-Fraktion, die von Bestandteilen mit Molekulargewichten von weniger als etwa 100 000 befreit worden ist;

- "MW > 30 000" steht für die Fraktion, die von Bestandteilen mit Molekulargewichten von weniger als etwa 30 000 befreit worden ist;

- "MW < 100 000" steht für die Fraktion, die von Bestandteilen mit Molekulargewichten von mehr als 100 000 befreit worden ist;

- "MW < 30 000" steht für die Fraktion, die von Bestandteilen mit Molekulargewichten von mehr als 30 000 befreit worden ist.

Diese verschiedenen Fraktionen sind in den nachstehenden Tabellen unter den oben angegebenen Bezeichnungen aufgeführt.

Die biologische Wirkimg der Aktivität der MRF-Frak-tionen, die durch Aktivierung oder Inhibierung der 3H-Thymidin-Aufnahme durch Knochenmarkzellen in vitro gemessen wird, wird durch Absenken des pH-Werts auf unter 7,0 und durch Erhitzen während 30 Minuten auf 70 °C inaktiviert.

Bei einem weiteren Experiment löst man 150 mg des Materials "MW >100 000" in 5 ml eines 0,1 m N-Äthylmor-pholinacetat-Puffers mit einem pH-Wert von 7,4. Nach dem Zentrifugieren während 10 Minuten bei 40 000 g erhält man einen unlöslichen Zentrifugenrückstand, den man mit 2 ml des gleichen Puffers wäscht. Dann vermischt man die überstehende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeit (7 ml) und trägt sie auf eine Säule (2,5 cm x 90 cm) auf, die mit Poly-acrylamidagarosegel-Kügelchen (ULTROGEL AcA 34) gefüllt und mit dem gleichen 0,1 m N-Äthylmorpholinacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 äquilibriert worden ist.

Die Gelfiltration erfolgt unter Anwendung der folgenden Bedingungen:

- Strömungsgeschwindigkeit: 13,5 ml/h

- Volumenfraktionen: 3 ml

- Temperatur: + 4 °C

Das erhaltene Elutionsmuster ist in der beigeführten

Fig. 1 dargestellt, die den UV-spektrophotometrisch (Extinktion bei 276 nm) gemessenen Inhalt der nacheinander eluierten Volumina (in ml) wiedergibt.

Es wurden die vier angegebenen Fraktionen erhalten, nämlich:

- A(27 mg)

- B (74 mg)

- C (18 mg)

-D (3,6 mg)

Gesamtausbeute (auf das Gewicht bezogen): 82%.

Die in der Fig. 1 dargestellten waagerechten Striche, die mit den Ziffern 1, 2, 3,4 und 5 bezeichnet sind, entsprechen Molekulargewichtsmarkierungen, nämlich:

1: Blaues Dextran (Molekulargewicht etwa 2 000 000) 2: Rinderserumalbumin (Molekulargewicht etwa 67 000) 3: Ovalbumin (Molekulargewicht 47 000) 4: Kohlensäureanhydrase (Molekulargewicht 30 000) 5: Chymotrypsinogen (Molekulargewicht 25 000).

Es hat sich weiterhin gezeigt, dass die in der Fig. 1 dargestellte Fraktion B äusserst wirksam ist bei den nachstehend erläuterten Tests, die die Wirkung der "Fraktion MW > 100 000" verdeutlichen.

Die Fraktion B enthält Bestandteile, die grob gesprochen aus Komponenten mit Molekulargewichten von etwa 40 000 bis etwa 70 000 bestehen.

II. Biologische Wirkungen 1. Materialien und Methoden

Tiere: Man verwendet Mäuse, die unter spezifischen, pa-thogenfreien Bedingungen gezüchtet und dann als ausgewachsene Tiere unter strikt standardisierten und gesteuerten hygienischen Bedingungen gehalten werden. Es werden jedoch keine speziellen Vorsichtsmassnahmen ergriffen, um pathogene Bakterien oder Viren zu vermeiden. Weder vor noch nach der Bestrahlung werden Antibiotika über das Trinkwasser verabreicht.

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Als Knochenmarkspender oder -empfänger verwendet man durch Inzucht gezüchtete, junge ausgewachsene (8 bis 12 Wochen) Hybridmäuse C578L/6, DBA/2 und C578LxA/J Fl. Als Kaninchen verwendet man einen aus nicht verwandten Individuen gezüchteten schweizer Stamm mit einem Körpergewicht von 1,5 bis 2 kg. Man verwendet sie als Spender für xenogenes Knochenmark für die Herstellung der überstehenden Flüssigkeit (SN), aus der die die knochenmarkregulierenden Faktoren enthaltende Fraktion abgetrennt wird. Diese Fraktion wird nachfolgend als "MRF" bezeichnet.

Herstellung von Knochenmarkzellsuspensionen

2 bis 3 Stunden vor der Inokulierung bereitet man frische Suspensionen von Knochenmarkzellen. Man tötet die Mäuse durch Genickbruch, isoliert die langen Knochen (Humeri, Tibiae und Femura) und schneidet sie an den Extremitäten ab. Dann spült man eisgekühltes TC 199-Medium wiederholt durch die Öffnungen mit Hilfe einer Injektionsspritze, deren Nadel der Knochengrösse entspricht. Das gesammelte Mark wird dann vorsichtig mit einer nadelfreien Injektionsspritze dispergiert und durch Gaze filtriert. Die Zellen werden dann 2- bis 3-mal durch langsames Zentrifugieren unter Verwendung von eisgekühltem TC 199-Medium gewaschen. Die letztlich erhaltenen Zellsuspensionen werden auf die gewünschte Zellenzahl und das gewünschte Volumen eingestellt. Es lassen sich Mengen von 20 bis 40 x 10® Zellen pro Donormaus gewinnen. Die Zellen werden intravenös in einem Volumen von 0,5 ml pro Maus verabreicht. Trypan-blau-Ausschlussuntersuchungen zeigen, dass mehr als 95% der Zellen unmittelbar vor ihrer Inokulierung lebensfähig sind.

Bestrahlung

Man verabreicht den Empfangern in Abhängigkeit von der bekannten Bestrahlungsempfindlichkeit des Stammes (5) eine Ganzkörperbestrahlung (TBI) von 850 bis 900 rad. Diese Dosis führt im Verlaufe von 8 bis 15 Tagen zum Tode sämtlicher unbehandelten Mäuse. Die Bestrahlung erfolgt mit einer Kobalt-Gamma-Quelle (Kobalt-Gammatron 3, 6000 Curie). Die Feldgrösse beträgt 30 x 30 cm, während die Hauptbrennweite 90 cm beträgt. Es werden keine Filter verwendet.

Transplantation von allogenem Mark a) Vorbehandlungs-Methode:

Wenn diese Methode angewandt wird, injiziert man den Mäusen 1,5 bis 2,5 Stunden vor der Bestrahlung auf intravenösem Wege 1,0,2,5 oder 5 mg Kaninchen-MRF. Dabei wird das gefriergetrocknete Material (Fraktion "MW > 100 000) in dem TC 199-Medium gelöst. Man injiziert ein Volumen von 0,5 ml. Den Kontrolltieren injiziert man die Zellen, das Medium ohne Zellen oder das Medium ohne MRF.

b) Nachbehandlungs-Methode:

Man injiziert den Mäusen 24 Stunden nach der Ganzkörperbestrahlung 35 bis 37 x 106 gewaschene Knochenmarkzellen. In Abhängigkeit von den angewandten Bedingungen des Experiments injiziert man die Zellen alleine oder in Form einer Suspension in dem Medium, das die MRF-Frak-tion enthält. Die Zellen werden kur vor der intravenösen Injektion in dem das Material MRF enthaltenden Medium (TC 199, pH = 7,4) erneut suspendiert. Bei einigen Untersuchungen werden die Zellen und das Material MRF getrennt injiziert (siehe Tabelle I).

Untersuchung des Chimärismus a) Hämoglobin-Wanderungsmuster

In monatlichen Intervallen nach der Ganzkörperbestrahlung werden sämtliche Mäuse einzeln auf den Chimärismus der roten Blutkörperchen untersucht. Es werden einige Bluttropfen aus dem retroorbitalen Plexus entnommen, in heparinisierter Salzlösung suspendiert und wiederholt gewaschen. Die gewaschenen Blutzellen werden in 1:5 Zellwasservolumina hämolysiert. Das Muster der Hämoglobinwanderung wird durch Celluloseacetat-Elektrophorese untersucht. Die erhaltenen Streifen werden mit Amidoschwarz gefärbt. Die Verpflanzung der erythropoetischen Spenderlinie entspricht dem vollständigen Chimärismus, der durch Hautverpflanzung bestätigt wird.

b) Hautverpflanzung

Bei der Kreuz-Transplantation von Knochenmark von oder in das Spender-Empfanger-System C57BL/6 oder DBA/2 überträgt man die Spenderhaut auf Gruppen von allogenen Markempfängern. Die Transplantation erfolgt in üblicher Weise, wobei die Verbände nach 8 bis 10 Tagen entfernt und die Lebensfähigkeit des verpflanzten Materials täglich untersucht werden. Das Transplantat wird als abge-stossen bezeichnet, wenn die ersten Anzeichen von Infiltration, Ödemen und einer Induration auftreten. Die Transplantate werden nur dann als angenommen bezeichnet, wenn keines dieser Anzeichen erkennbar ist und üppig wucherndes Haar auf der transplantierten Haut wächst.

In vitro-Aufnahmen von 3H-Thymidin durch Knochenmarkzellen

Man verwendet 6-3H-Thymidin mit einer Aktivität von 27 Ci/mM der Firma Radio-Chemical Center, Amersham, England. Dann inkubiert man gewaschene Knochenmarkzellen, die frisch aus ausgewachsenen Mäusen des Stammes C57BL/6 gewonnen worden sind, während 1,2 und 3 Stunden in verschlossenen Röhrchen in Gegenwart von 2 (j.Ci 3H-Thymidin. Man verwendet jeweils drei Proben. Jede Probe enthält 2 x 106 gewaschene Knochenmarkzellen, die in 1 ml des Mediums TC 199 oder des Mediums TC 199 zusammen mit 200 (ig der Ultrafiltrationsfraktionen der ursprünglichen überstehenden Flüssigkeit von Kaninchenknochenmark-Zellsuspensionen (siehe die oben angegebene Herstellung des Materials MRF) suspendiert worden sind. Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,5 eingestellt. Nach einer Inkubationszeit von 1,2 bzw. 3 Stunden versetzt man jedes Röhrchen mit 0,1 ml einer 10%-igen Natriumdodecylsulfat-Lösung. Nach heftigem Schütteln fällt man durch Zugabe von 1 ml einer 10%-igen Trichloressigsäure-Lösung zu jedem Röhrchen während 15 Minuten bei 4 °C die DNA aus. Der Niederschlag wird auf einem Glasfaserfilter (Whatmann GF/C) gesammelt, mit 5%-iger Trichloressigsäure und absolutem Äthanol gewaschen. Die Filter werden getrocknet, wonach man die Aktivität mit Hilfe eines Flüssigkeitsszintillations-zählers (LKB-Wallac 81 000) misst.

Die Ergebnisse der verschiedenen Ansätze der Erfindung sind in den nachfolgenden Tabellen zusammengestellt.

Die auf eine jede Tabelle folgenden Kommentare vermitteln die Informationen, die zum Verständnis der Untersuchungsbedingungen erforderlich sind, soweit dies nicht aus der vorliegenden Beschreibung hervorgeht.

Das "MRF/BM-Zellen-Verhältnis" steht für das Verhältnis von der Anzahl der Zellen, die in dem ursprünglichen Knochenmark die Menge des in den Experimenten verwendeten MRF begleiteten, zu der Anzahl der Zellen, die mit der Menge von MRF in dem Lösungsmittel in Kontakt gebracht werden, die ebenfalls in der entsprechenden Spalte angegeben ist.

Die Untersuchungsbedingungen sind in den Überschriften der verschiedenen Tabelle angegeben.

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In den Tabellen I bis V sind in der rechten Spalte die Untersuchungsbedingungen angegeben, insbesondere die Art der miteinander in Kontakt gebrachten Bestandteile.

In der Tabelle VIII stehen die Zahlen in den Unterspalten unter den Überschriften «h~» und «h+» für die Zeitdauer in Stunden zwischen der vorher oder nachher erfolgten MRF-Injektion und der Ganzkörperbestrahlung. In der Unterspalte mit den Überschriften «Anzahl der BM-Zellen ( x 10®)» unter der allgemeinen Überschrift «Nachbehandlung» ist die Anzahl der Knochenmarkzellen angegeben, die zusammen mit der in der links daneben stehenden Unterspalte angegebenen entsprechenden MRF-Menge injiziert worden ist.

Tabelle I

Diese Tabelle zeigt, dass die Wirkung von MRF im Hinblick auf die Förderung der 3H-Thymidin-Aufnahme von dem pH-Wert des Inkubierungsmediums abhängt (vgl. die Zeilen 1,2 und 3, die für die Kontrollversuche stehen, mit den Zeilen 4, 5 und 6).

Sie zeigt weiterhin, dass die Wirkung nicht artspezifisch ist (vgl. die Zeilen 2 und 5 mit 7 und 8). Die Zeilen 5 und 7 lassen erkennen, dass die aus Ratten gewonnene überstehende Flüssigkeit sowohl für Rattenknochenmarkzellen als auch für Mäuseknochenmarkzellen wirksam ist.

Tabelle II und Tabelle III

Die in der Tabelle II angegebene Untersuchung wurde mit der gesamten überstehenden Flüssigkeit (SN) durchgeführt, während die in der Tabelle III angegebene Untersuchung unter Verwendung einer ultrafiltrierten überstehenden Flüssigkeit (MRF) (unter Verwendung eines Membranfilters, Amicon Diaflo Membrane 100 000 und 30 000) durchgeführt worden ist. Die Ergebnisse werden in jedem Fall mit dem verglichen, das mit dem TC 199-Medium erhalten worden ist.

Die Tabelle II zeigt, dass die gesamte überstehende Flüssigkeit (SN) die 3H-Thymidin-Aufnahme weniger stark induziert als das Vergleichsmedium TC 199 (Zeilen 1 und 3).

Die «Fraktion > 30 000» stimuliert die 3H-Thymidin-Aufnahme, während die «Fraktion < 30 000» die Aufnahme inhibiert (Zeilen 1 und 3 und Zeile 2). Weiterhin zeigt die «Fraktion < 100 000» keine Wirkung auf die 3H-Thymidin-Aufnahme (Zeile 4).

Es ist somit ersichtlich, dass die überstehende Flüssigkeit (SN) zusätzlich Inhibitoren enthält, die die Stimulierung der 3H-Thymidin-Aufnahme durch den Aktivierungsfaktor inhibieren.

Diese Untersuchung zeigt, dass die inhibierenden Fraktionen und die stimulierenden Fraktionen durch die Ultrafiltration der überstehenden Flüssigkeit (SN) mit dem Membranfilter (Amicon Diaflo Membrane 100 000) getrennt werden können.

Die weitere Untersuchung 2 der Tabelle II zeigt, dass die Wirkung nicht eine Folge eines nichtspezifischen mitogenen Effekts des heterologen Proteins (in diesem Fall Kaninchen) ist, da Rinderserumalbumin (RSA) die Aufnahme (Zeile 2) nicht über die des TC 199-Mediums hinaus (Zeile 3) beein-flusst.

Tabelle IV

Diese Untersuchung ermöglicht einen Vergleich der Wirkung der .MRF-Fraktion («Fraktion > 100 000») vor und nach dem Erhitzen während 30 Minuten auf 70 °C.

Die in der Tabelle IV angegebenen Ergebnisse zeigen, dass die 3H-Thymidin-Aufnahme des erhitzten Produkts nach 1,2 und nach 3 Stunden wesentlich niedriger ist. Somit scheint das Erhitzen den stimulierenden Faktor zu zerstören.

Tabelle V

In diesem Fall werden ultrafiltrierte MRF-Fraktionen «>100 000» mit Fraktionen «< 30 000» und «< 100 000» im Hinblick auf ihre Stimulierung der in vitro-Aufnahme 5 von 3H-Thymidin untersucht.

Hier ist wiederum zu erkennen, dass lediglich die Fraktion >100 000 MW dazu geeignet ist, die Aufnahme von Thymidin durch Knochenmarkzellen zu stimulieren.

io Tabellen VI und VII

Bei diesen beiden Untersuchungen werden die Fraktion MRF und Thymidin intravenös an Gruppen von Mäusen verabreicht. Man verabreicht den Mäusen auf intravenösem Wege 500 [ig oder 1 mg der Fraktion MRF und 2 oder 4 (iCi is Thymidin in 0,1 oder 0,5 ml Salzlösung. Die Mäuse werden

1 und 2 Stunden nach der Injektion getötet.

Man bewirkt einen Vergleich mit Kontrollmäusen, die mit Rinderserumalbumin und Thymidin oder mit einer «erhitzten» MRF-Fraktion und Thymidin behandelt worden 20 sind.

Man sammelt das Knochenmark einer Tibia, stellt auf

2 x 106-Zellen/ml ein und verarbeitet es in der Weise, wie es oben bezüglich der in vitro-Untersuchung beschrieben ist. Schluss:

25 Die «Fraktion >100 000» bewirkt auch in vivo eine Steigerung der Aufnahme von 3H-Thymidin durch die Knochenmarkzellen der Maus.

Die Untersuchung bestätigt, dass die Wirkung nicht eine Folge eines heterologen Proteins ist (Tabelle VII) und dass 30 sie durch Wärme zerstört wird (Tabelle VI). 2. Pharmakologische Wirkung - Knochenmarktransplantation

Die Knochenmarktransplantation ist eine Therapie, die für bösartige hämatopoetische Störungen, wie beispielsweise 35 Leukämie, aplastische Anämie etc. indiziert ist. Bislang konnte eine solche Transplantation bei genetischer Unverträglichkeit zwischen Spender und Empfänger niemals erfolgreich durchgeführt werden.

Die folgenden Untersuchungen zeigen, dass der Faktor 40 MRF die Verpflanzung von Knochenmark zwischen unverträglichen Spendern und Empfangern ermöglicht, indem er die Einpflanzung des fremden Marks positiv beeinflusst.

Es wurden zwei verschiedene Modelle angewandt: Eines, bei dem die Tiere genetisch vollständig unverträglich sind 45 (DBA 6 als Spender und C57BL/6 als Empfänger, siehe Tabelle VIII), und eines, bei dem halbverträgliche Spender und Empfänger angewandt werden (C57BL/6 als Spender und Hybridmäuse C57BL/6XAJ Fl als Empfänger, siehe Tabelle IX).

so Der Zweck dieser Untersuchung besteht darin, einen dauerhaften allogenen Chimärismus des Knochenmarks zu bewirken. Die Erfolgskriterien (dauerhafter Chimärismus) sind:

- Das Migrationsmuster des Hämoglobins, das durch 55 Celluloseacetat-EIektrophorese nachgewiesen wird. Dabei zeigen der Spender und der Empfänger genetisch verschiedene Hämoglobinmuster, während die Chimären Mäuse das Hämoglobin des Knochenmarkspenders aufweisen;

- Hautverpflanzung: Die permanenten Chimären akzep-6o tieren die Hautverpflanzung von dem Markspender;

- ein weiteres Kriterium für die erfolgreiche Verpflanzung allogenen Marks sind der Gesundheitszustand und das Überleben der Tiere ohne das Auftreten von Sekundärerkrankungen bei üblichen Bedingungen (sogenannte GVHD-

65 oder Runting-Krankheit).

Die Tiere werden in der nachstehenden Weise mit in 0,5 ml TC 199-Medium gelöster ultrafiltrierter MRF-Fraktion behandelt.

7

650154

Tabelle Vili

Diese Tabelle verdeutlicht die Ergebnisse der Versuche, das Überleben eines ersten «erfolgreich vorbehandelten Mäusestamms», der dann bestrahlt und schliesslich nachbehandelt und durch Injektion mit dem Knochenmark eines weiteren Mäusestamms behandelt wird, von dem bekannt ist, dass er normalerweise in dem H2-Bereich mit dem ersten Stamm genetisch vollständig unversträglich ist. Die Untersuchung wird wie folgt durchgeführt.

Man injiziert den Empfangern auf intravenösem Wege 1 bis 2 Stunden vor der Bestrahlung die MRF-Fraktion, wonach sie mit einer letalen Strahlendosis bestrahlt und 24 Stunden nach der Bestrahlung auf intravenösem Wege mit den gewaschenen Knochemarkzellen des Spenders, die in einem die MRF-Fraktion enthaltendenMedium suspendiert worden sind, behandelt werden.

Die Vor- und Nachbehandlung mit der MRF-Fraktion («> 100 000») unter den oben angegebenen Bedingungen ermöglicht ein gutes Überleben und einen dauerhaften Chimärismus, der durch die Hämoglobinmuster und die dauerhafte Annahme der Hautverpflanzung (von DBA/2-Spendern bei den überlebenden Tieren) verdeutlicht wird.

Die nach 6 Monaten überlebenden Tiere befinden sich in ausgezeichnetem Zustand und zeigen keinerlei Anzeichen einer Sekundärerkrankung. Es ist bemerkenswert, festzustellen, dass ein voller Chimärismus bei Mäusen erreicht wird, die mit dem MRF-Faktor sowohl vorbehandelt als auch nachbehandelt werden. Vorzugsweise erfolgt die Nachbehandlung mindestens 24 Stunden nach der Ganzkörperbestrahlung. In diesem Fall kann man sogar auf eine Vorbehandlung verzichten. Im allgemeinen sollte die Transplantation von in einen Wirtsorganismus zu verpflanzendem Gewebe oder zu verpflanzenden Zellen nicht früher als mindestens 24 Stunden nach der Ganzkörperbestrahlung erfolgen.

Es hat sich weiterhin gezeigt, dass das Material MRF dem beschleunigenden Effekt von T-Lymphozyten, insbesondere von Milzzellen, auf die Transplantatabstossung entgegenwirkt.

Die Knochenmarktransplantation von einem Tier auf das gleiche Tier, das einen genetischen Mangel des Immunsystems aufweist, ist dazu geeignet, die Erkrankungen zu verhindern, die in dem letzteren Tier sonst ausgelöst würden.

Tabelle IX

Diese Tabelle verdeutlicht die Ergebnisse, die unter vergleichbaren Bedingungen erhalten wurden, jedoch unter Anwendung von halbverträglichen Spender/Empfänger-Stammkombinationen. Zur Auslösung des Chimärismus ist keine Vorbehandlung notwendig. Bei dieser Untersuchung ist ein voller Erfolg durch die Injektion des Faktors MRF und von Knochenmarkzellen (BM) lediglich nach der Bestrahlung erreicht worden, wobei der permanente Chimärismus durch das Hämoglobinmuster sämtlicher überlebender Tiere verdeutlicht wird.

s 3. Toxizitätsuntersuchung

Nach der Injektion einer 5-mg-Dosis des Materials MRF an jeweils 100 Mäusen konnte kein toxischer Effekt beobachtet werden.

Wiederholte tägliche Injektionen von 2 mg während ei-lo ner Zeitdauer von einem Monat ergaben keinerlei Anzeichen einer Toxizität. Die Tiere bleiben in ausgezeichnetem Zustand. Sie entwickeln sich normal ohne Krankheitssymptome, wobei das Produkt sehr gut toleriert wird.

Die mögliche Erzeugung des Chimärismus durch die er-15 findungsgemässe biologische Fraktion, die mit einer noch grösseren Erfolgsrate als aus den Tabelle hervorgeht dann erreicht werden kann, wenn die Behandlungen mit Empfängertieren unter noch sterileren Bedingungen durchgeführt werden, in Kombination mit der grossen Verträglichkeit, die 2o das Material in vivo zeigt, ermöglicht eine therapeutische und experimentelle Basis zur Bekämpfung der Abstossungs-reaktionen (HVG-Reaktion oder GVH-Reaktion) bei Knochenmarktransplantationen. Die praktische Anwendung dieser erfindungsgemässen Fraktion in der Organ- und Kno-25 chenmarktransplantation, bei Behandlung von Autoimmunerkrankungen und bei der Immunotherapie von Krebs, beispielsweise Leukämie und Brustkrebs, stellen nur einige der interessantesten Bereiche ihrer Anwendung dar.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch pharmazeuti-30 sehe Zubereitungen, welche die Fraktion enthalten, vorzugsweise in Einheitsdosisform in Kombination mit klassischen pharmazeutischen Hilfsstoffen, die für den gewünschten Verabreichungsweg geeignet sind. Die pharmazeutische Zubereitung kann eine injizierbare sterile Lösung mit einem 35 pH-Wert von nicht weniger als 7 und vorzugsweise von etwa 7,2 bis 5, sein, die eine wirksame Dosierung dieser Fraktion enthält. Besonders bevorzugt sind weiterhin gefriergetrocknete Fraktionen oder gefriergetrocknete Präparate, die die Fraktionen in Kombination mit einem derart ausgewählten 40 Hilfsstoff enthalten, dass eine unmittelbare Bildung solcher Lösungen mit einem pH-Wert von etwa 7,2 bis 7,6 lediglich durch Zugabe eines injizierbaren Volumens entweder sterilen Wassers oder irgendeines geeigneten physiologischen flüssigen Trägermaterials möglich wird.

45 Mit der MRF-Fraktion können biologische Standardreagenzien gebildet werden, die insbesondere als Mittel zur Durchführung von Vergleichsuntersuchungen der Wirksamkeit anderer Präparate im Hinblick auf die Steuerung der erreichten Immunität, der Knochenmark-Rekonstitution oder so dem Strahlungsschutz verwendet werden können.

Tabelle I

Mangel der Artspezifität der überstehenden Flüssigkeit und Einfluss des pH-Werts auf die Aufnahme von 3H-Thymidin durch Mäuseknochenmarkzellen in Gegenwart des Faktors MRF

Nr.

Inkubationszeit Vi h Impulse/min + Standardabweichung

4 h Impulse/min ± Standardabweichung pH-Wert

Probe (3 x)

1

10301 ± 280

12377 ± 856

6,2-6,4

106 Mäuseknochenmarkzellen in TC 199

2

8880 + 244

11109 ± 1477

7,0-7,2

10® Mäuseknochenmarkzellen in TC 199

3

8313 ± 403

13783 ± 1464

7,6-7,8

10® Mäuseknochenmarkzellen in TC 199

4

9199 ± 1158

13722 ± 650

6,3-6,4

10® Mäuseknochenmarkzellen in SN-MRF

154

8

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Nr. Inkubationszeit

Vi h Impulse/min ± Standardabweichung

4 h Impulse/min ± Standardabweichung pH-Wert

Probe (3 x)

5

6

7

10373 ± 639 13974 ± 1134 11759 ± 1070 7249 ± 490

19532 ± 1502 24316 ± 198 27318 ± 3660 8351 ± 895

7,0-7,2 10® Mäuseknochen markzellen in SN-MRF 7,6-7,8 10e Mäuseknochen markzellen in SN-MRF 7,0-7,2 10e Mäuseknochen markzellen in SN-MRF 7,0-7,2 10® Mäuseknochen markzellen in TC 199

Knochenmarkzellspender: C57BL/6-Mäuse, männlich, ausgewachsen oder Cararatten, männlich, jung (Körpergewicht : 100 g)

Zellkonzentration der Proben: 106 Knochenmarkzellen/ml

Spender der überstehenden Flüssigkeit: Junge Cararatten, männlich (Körpergewicht = 100 g)

SN-MRF = 50 x 106 Knochenmarkzellen/ml

SN/Maus (oder Ratte) Knochenmarkzellen-Verhältnis: 20/1 (SN von 2 x 10® Rattenzellen)

Medium: TC 199

Markierung: 3H-Thymicin, 2 nCi/0,1 ml/Probe

Tabelle II

Wirkung der vollständigen überstehenden Flüssigkeit des Knochemarks (SN) von Kaninchen auf die 3H-Thymidin-Aufnahme von Mäuseknochenmarkzellen in vitro

Inkubationsdauer (h)

1, Impulse/min 1,5, Impulse/min 2, Impulse/min 3, Impulse/min 4, Impuse/min

1 7990 + 1231 14182+1769 13270+1274 57090±4463 80933+7179

2 10164 + 1824 10436+1318 2967 + 2771 81790 + 3756 100679 + 8583

3 8037+ 554 11053 + 1686 30919 + 1550 79696+1471 115297+7901

2x10® Knochenmarkzellen in der Kaninchen-SN 2x10® Knochenmarkzellen in 0,1 % BSA

2x10® Knochenmarkzellen in TC 199

Spender für Knochenmarkzellen: Männliche ausgewachsene Mäuse C57BL/6 (2 x 10® Knochenmarkzellen/ml)

SN: Überstehende Flüssigkeit von Kaninchenknochenmark in einer Menge entsprechend 50 x 10® Knochenmarkzellen/ml

MRF/Knochenmarkzellen-Verhältnis = 5/1

Markierung mit 3H-Thymidin, 2 (iCi/0,1 ml/Probe

Medium: TC 199, pH = 7,5

BSA: Rinderserumalbumin

Tabelle III

Eine ultrafiltrierte Fraktion mit einem Molekulargewicht > 100 000 aus der überstehenden Flüssigkeit von Knochenmark stimuliert die in vitro-Aufnahme von 3H-Thymidin durch Knochenmarkzellen, während die Fraktion mit einem Molekulargewicht < 30 000 die Aufnahme inhibiert.

Inkubationszeit (h)

1 h, Impulse/min + 2 h, Impulse/min+ 3 h, Impulse/min+

Standardabweichung Standardabweichung Standardabweichung

1 31185 ± 4311 73180 + 6972 126631 + 7842 2 x 10® Knochenmarkzellen + 200 ng

Fraktion MW >100 000

2 18008 ± 1152 19347 + 2059 37868 + 4478 2 x 10® Knochenmarkzellen + 200 \ig

Fraktion MW < 30 000

3 35064 + 2841 62392 + 5909 98586 + 2901 2 x 10® Knochenmarkzellen + 200 [ig

Fraktion MW > 30 000

4 23327 ± 2814 32420 + 4705 49918 + 6752 2 x 10® Knochenmarkzellen + 200 ng

Fraktion MW > 100 000

5 20265 ± 4294 35049 + 5626 65291 + 8203 2x 10® Knochenmarkzellen in TC 199

Die Spender der Knochenmarkzellen sind Mäuse des Stammes C57BL/6 (2 x 10® Knochenmarkzellen/ml) Das Inkubationsmedium ist das Medium TC 199 mit einem pH-Wert von 7,5

Jedem Röhrchen wurden 2 (j.Ci/0,1 ml 3H-Thymidin zugesetzt. Es wurden jeweils drei Proben durchgeführt.

9

650 154

Tabelle IV

Einfluss des Erhitzens der ultrafiltrierten MRF-Fraktion « > 100 000» auf die3 H-Thymidin-Aufnahme

Nr. Inkubationszeit (h)

1 h, Impulse/min 2 h, Impulse/min 3 h, Impulse/min

1 21906 ± 2393 33277 ± 4738 75795 ± 11017 2x 106 Knochenmarkzellen + 200 |xg

«MW> 100 000»

2 15111 ± 408 28595 ± 3274 56483 ± 8390 2x 106 Knochenmarkzellen + 200 (xg

«MW >100 000», jedoch nach dem Erhitzen während 30 min auf 70°C

3 14267 ± 1693 31353 ± 7612 36418 ± 4828 2 x 106 Knochenmarkzellen in TC 199

Spender für die Knochenmarkzellen: Mäuse des Stammes C57BL (2 x 10® Knochenmarkzellen/ml)

Kaninchen-MRF-Fraktion

Medium: TC 199, pH = 7,5

Markierung mit 3H-Thymidin, 2 jj.Ci/0,1 ml/Probe

Tabelle V

Wirkung der ultrafiltrierten MRF-Fraktion «> 100 000» auf die in vitro-Aufnahme von 3H-Thymidin, Vergleich mit Fraktionen «< 100 000» und «<30 000»

Nr. Inkubationszeit (h)

1 h, Impulse/min 2 h, Impulse/min 3 h, Impulse/min

1 29510 + 748 81814 + 1730 93896 + 10605 2 x 10® Knochenmarkzellen + 200 [ig

Fraktion «MW > 100 000»

2 19744 + 1961 24078 + 3511 29500 + 2332 2 x 10® Knochenmarkzellen + 200 jig

Fraktion «MW > 30 000»

3 18893 + 314 22567 + 2378 47168 + 3561 2 x 10® Knochenmarkzellen + 200 (ig

Fraktion «MW > 30 000»

4 19834 + 3576 62750 + 3384 47938 + 3146 2 x 10® Knochenmarkzellen in TC 199

Knochenmarkzellenspender: ausgewachsene Mäuse des Stammes C57BL/6 (2 x 10® Knochenmarkzellen/ml)

Kaninchen-MRF-Fraktion

Medium: TC 199, pH = 7,5

Markierung mi3H-Thymidin, 2 nCi/0,1 ml/Probe

Tabelle VI

In vivo-Wirkung der ultrafiltrierten MRF-Fraktion «>100 000» auf die 3H-Thymidin-Aufnahme durch

Mäuseknochenmark

Gruppen Injektion (0,5 ml in vivo) Testdauer (Stunden nach Impulse/min (2 x 10® Kno-

5 Mäuse/ der Injektion) chenmarkzellen)

Gruppe

1 a 1 mg «MW >100 000» + 4 jiCi Thymidin 1 157+22

1 b 1 mg «MW > 100 000 H» + 4 |iCi 1 100+12

Thymidin

Spender für die Knochenmarkzellen: Mäuse des Stammes C57/BL/6 (2 x 10® Knochenmarkzellen/ml) Kaninchen-MRF-Fraktion

«MW >100 000 H» steht für die Fraktion «MW > 100 000» nach dem Erhitzen während 30 Minuten auf 70°C Behandlung: 1 mg der Fraktion + 4 |iCi Thymidin in 0,5 ml Medium: Salzlösung, pH = 7,5

Tabelle VII

In vivo-Wirkung der ultrafiltrierten MRF-Fraktion « > 100 000» auf die 3H-Thymidin- Aufnahme von Knochenmarkzellen

Gruppen Injektion (0,1 ml in vivo) Testdauer (Stunden nach Impulse/min* (2 x 10® Kno-

5 Mäuse/ der Injektion) chenmarkzellen)

Gruppe la 500 ng «MW >100 000» + (xCi Thymidin 1 60+8

lb 500 Hg BSA + 2 |*Ci Thymidin 1 44+8

2a 500 |jg «MW >100 000» + 2 [iCi Thymidin 2 54+6

2b 500 jxg BSA + 2 [xCi Thymidin 2 44 +9

* Die Zahlenwerte stehen für die Mittelwerte der 5 Tiere der Gruppe, die jeweils 2-fach angewandt wurden

Spender: Ausgewachsene männliche Mäuse des Stammes C57BL/6

Kaninchen-MRF-Fraktion

Behandlung: 500 jxg der Fraktion + 2 (J.Ci Thymidin in 0,1 ml durch intravenöse Injektion BSA: Rinderserumalbumin Medium: Salzlösung, pH = 7,5

650154 10

Tabelle Vili

Allogene Knochenmarktransplantation in vivo mit markregulierendem Faktor (MRF)

Tiere Vorbehandlung Ganzkörper- Nachbehandlung Überlebende bestrahlung

Gruppe An- Alter Ge- Produkt Weg h~ Dosis h+ Produkt Anzahl Weg 6 Mon. Chimärismus zahl (Mon.) schlecht (rad) d. Kno- nach d.

chenmark- Ganzzellen körper-(xlO6) bestrahlung

A

10

3-4

m

5 mg MRF

i.v.

1,5

850

24

3 mg MRF

37

i.v.

6 (60%)

6(100%)

B

10

3-4

m

2,5 mg MRF

i.v.

1,5

850

24

3 mg MRF

37

i.v.

5 (50%)

5 (100%)

C

10

3-4

m

1,0 mg MRF

i.v.

1,5

850

24

3 mg MRF

37

i.v.

4 (40%)

4 (100%)

D

10

3^1

m

TC 199

i.v.

1,5

850

24

3 mg MRF

37

i.v.

9 (90%)

0 (0%)

E

20

3-4

m

TC 199

i.v.

1,5

850

24

3 mg MRF

37

i.v.

0

MRF: Marktregulierender Faktor; durch Membranultrafiltration (Amecon Diaflo Membrane) erhaltene Fraktion (MW >100 000) der überstehenden Flüssigkeit von Kaninchenknochenmarkzellen. Die Knochenmarkspender waren ausgewachsene weibliche Mäuse des Stammes DBA/2, die Empfänger waren 3-4 Monate alte Mäuse des Stammes C57BL/6. MRF oder TC 199 werden 1,5 Stunden vor der Ganzkörperbestrahlung (h ~ ) injiziert. Die allogenen Knochenmarkzellen werden einmal gewaschen und dann in dem Medium TC 199, das MRF enthält, unmittelbar vor der Inokulation suspendiert. Die Zellen werden 24 Stunden (h+) nach der Ganzkörperbestrahlung verabreicht. Der Chimärismus wird durch Hämoglobintypisierung und Hautverpflanzung der einzelnen überlebenden Empfänger (4) bewertet. Bezüglich der Ursache der Mortalität der Gruppen A, B und C siehe den Ergebnisabschnitt.

Tabelle IX

Knochenmarktransplantation unter Verwendung von MRF an Hybrid-Empfängermäuse

Tiere Ganzkörperbestrahlung Nachbehandlung Überlebende

Gruppe Anzahl rad h+ Produkt Anzahl der Weg Nach 6 Chimärismus

Knochenmark- Monaten zellen

A 10 900 24 3 mg MRF 35x10« i.v. 9(90%) 9(100%)

B 40 24 - 35 x IO6 i.v. 8 (20%) 0 (0%)

MRF: Markregulierender Faktor; durch Membranultrafiltration (Amicon Diaflo Membrane) erhaltene Fraktion (MW>100 000) aus der überstehenden Flüssigkeit von Kaninchenknochenmarkzellen. Die Knochenmarkspender waren ausgewachsene Mäuse des Stammes C57BL/6, während als Empfänger 3 bis 4 Monate alte weibliche Fl Hybridmäuse des Stammes C57BL/6xA/J eingesetzt wurden. Die parenteral verabreichten Knochenmarkzellen wurden einmal gewaschen und dann in dem Medium TC 199, das den Faktor MRF enthält, unmittelbar vor der Verabreichung suspendiert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Ganzkörperbestrahlung verabreicht. Der Chimärismus wurde durch individuelle Hämoglobintypisierung jeder überlebenden Empfängerhybridmaus bewertet.

45

50

55

60

65

S

1 Blatt Zeichnungen

Claims

650 154

PATENTANSPRÜCHE

1. Wasserlösliche, biologisch aktive Fraktion aus dem physiologisch interzellularen Medium des Knochenmarks, dadurch gekennzeichnet, dass sie im wesentlichen frei ist von denjenigen Bestandteilen des interzellularen Mediums des Knochenmarks, die ein Molekulargewicht unterhalb 30 000 haben; dass sie ohne Verlust biologischer Eigenschaften gefriergetrocknet werden kann; dass sie die nachstehend definierten biologischen Wirkungen in Form einer Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 7 ausübt; dass sie in vitro und in vivo die 3H-Thymidin-Aufnahme durch das Knochenmark stimuliert; dass sie die Einpflanzung allogenen Knochenmarks ermöglicht und in zuvor letal bestrahlten Tieren einen dauerhaften Chimärismus erzeugt und das Überleben dieser Tiere bewirkt; dass ihre Wirkung nicht artspezifisch ist; dass ihre 3H-Thymidin-Aufnahme durch Erhitzen während 30 Minuten auf 70 °C wesentlich erniedrigt wird; und dass ihr UV-Spektrum ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist.
2. Fraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie im wesentlichen frei ist von denjenigen Bestandteilen des interzellularen Mediums des Knochenmarks, die ein Molekulargewicht unterhalb 100 000 haben.
3. Verfahren zur Gewinnung der Fraktion gemäss Anspruch 1 aus dem Knochenmark, dadurch gekennzeichnet, dass man Knochenmarkzellen vom Knochenmark abtrennt und das interzellulare Medium gewinnt, dann vom interzellularen Medium durch ein Filtrationssystem Bestandteile mit Molekulargewichten von nicht mehr als 30 000 abtrennt, und die von den genannten Bestandteilen mit niedrigerem Molekulargewicht befreite biologisch aktive Fraktion gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Gewinnung der Fraktion gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man mittels des Filtrationssystems Bestandteile mit Molekulargewichten von nicht mehr als 100 000 abtrennt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Filtrationssystem eine mikroporöse Membran verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert des interzellularen Mediums bzw. einer dieses aufnehmenden Lösung ständig bei einem Wert von nicht niedriger als 7,0, vorzugsweise von 7,2 bis 7,6 hält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Knochenmark in einer physiologischen Lösung, insbesondere einer Salzlösung oder einer Pufferlösung, deren pH-Wert auf zwischen 7,2 und 7,6 eingestellt is, suspendiert und die Zellen, erforderlichenfalls nach vorsichtiger Zerteilung des Knochenmarkgewebes, das in der Weise bewirkt wird, dass eine mögliche Zerstörung des Zellenmaterials vermieden wird, abtrennt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Pufferlösung Hanks-Medium oder Earle-Medium mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlungsmassnahmen unterhalb Raumtemperatur, vorzugsweise zwischen 0 und 5 °C durchführt.
10. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend die Fraktion nach Anspruch 1 oder 2 in Kombination mit pharmazeutischen Hilfsstoffen.