DE3246090A1

DE3246090A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von phosphatidyl-glycerin

Info

Publication number: DE3246090A1
Application number: DE19823246090
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Hideo Tagata Shizuoka Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1981-12-16
Filing date: 1982-12-13
Publication date: 1984-02-16
Also published as: FR2518117B1; IT8224763A0; FR2518117A1; IT1155384B; IT8224763A1; GB2111677B; DE3246090C2; JPS58107199A; CA1201047A; GB2111677A

Description

Ohitocho-Mifuku, Tagata-gun, Shizuoka, Japan

"Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidylglycerin"

beanspruchte Priorität:

16. Dezember 1981, Japan, Nr. 203074/81

Die Zahl der Todesfälle von Neugeborenen mit zu geringem Gewicht konnte in letzter Zeit dank der verbesserten Behandlung von Neugeborenen gesenkt werden, jedoch stellt das Atemnot-Syndrom (RDS) in der perinatalen Periode ein großes Problem dar und die dadurch verursachten Todesfälle machen einen hohen Prozentsatz der Gesamttodesfälle aus. Es wird vermutet, daß das Atemnot-Syndrom auf einen Mangel an Lungenbenetzungsmittel zurückzuführen ist. Dieses Mittel ist wichtig zur Verhinderung der Alveolen-Kontraktionen der Lunge, die sich sofort .nach der Geburt ausdehnen. Der Mangel an diesem Lungen-Benetzungsmittel verursacht die Atelektase der Atmung und das Aufkommen von RDS. Folglich könnte das Auftreten von RDS verhindert oder zu einem milden Fall begrenzt werden, wenn das Auftreten von RDS in einer frühen Periode festgestellt werden könnte und die Behandlung des Neugeborenen früh begonnen werden könnte. Dementsprechend ist die Bestimmung dieses Lungen-Benetzungsmittels eine Notwendigkeit. Grob eingeteilt gibt es dazu ein Verfahren zur Bestimmung, in dem die physikalischen Eigenschaften des Lungen-Benetzungsmittels verwendet werden, und ein anderes, in dem die Bestandteile des Lungen-Benetzungsmittels biochemisch untersucht werden. Letztere Methode wurde bisher so durchgclührt, daß das Verhält-

' ψ'

nis der Lipide bestimmt wurdp, wie das Verhältnis von Lecithin 711 ,'; 11 (11 ii'i'iiiiyo I I π , oilm .lan v«>n IMioHpha I I tly.l-tj ί yonr I η sr.u PhoBphrt'-tidy l-Inosit, oder daß Dipalni Ltoyl-Phosphatidyl-cholin durch Dünnschichtchromatographie quantitativ bestimmt wurde (Am. J. Obstet. Gynecol. , 440, 109 (1971); 613, 125 (1976); 894, 133 (1979); Obstet. & Gynecol., 295, 57 (1981); Am. J. Obstet. Gynecol., 697, 138 (1980)). Aus den Ergebnissen dieser verschiedenen Untersuchungen wurde kürzlich erkannt, daß das Vorhandensein von Phosphatidyl-glycerin ein wichtiger Faktor für das Auftreten von RDS ist. Die quantitative Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin war jedoch sehr schwierig, da die auftretende Menge so gering wie etwa 1/10 der Lecithinmenge ist. Zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-oglycerin ist bisher die Dünnschicht-Chromatographie bekannt, in der, nach Entfernen der Zellen aus dem Fruchtwasser durch Zentrifugieren die Lipide aus dem Überstand extrahiert werden, die Bestandteile dieses Extrakts durch Dünnschichtchromatographie getrennt werden., jedes Phc spho'lipid quantitativ bestimmt wird, die Verhältnisse der verschiedenen Phospholipide berechnet werden und die Menge an Phosphatidyl-glycerin indirekt aus dem Wert der Gesamtphospholipide erhalten wird, der vorher durch quantitative Bestimmung der Phosphorsäure gemäß der Naßverbrennungsmethode erhalten worden ist (Am.J. Obstet. Gynecol. 613, 125 (1976); 1079, 135 (1979); 899, 133 (1979); 440, 109 (1971)}. Ein anderes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-g-lycerin ist die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie (Journal of Chromatography, 277, 223 ' (1981)). Diese Methode der Dünnschichtchromatographie hat jedoch die Nachteile, daß f.ür die Extraktion der Lipid-Komponenten aus dem Fruchtwasser 2 bis 3 Tage benötigt werden, komplizierte Maßnahmen und außerdem ein Erhitzen auf hohe Temperatur zum Flockennachweis notwendig sind. Weitere Nachteile sind, daß sie eine indirekte Methode zur Bestimmung darstellt, die auf den Verhältnissen von relativen Fleckenmengen und Gesamtphospholipid beruht, und daß wegen der Verwendung der Dünnschichtchromatographie nicht gleichzeitig mehrere Proben untersucht werden können.

Die Erfinder haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob in der Flüssigkeit, die"verschiedene zu unter-

suchende Lipide enthält/ wie Fruchtwasser, nur Phosphatidylglycerin quantitativ auf einfache, zweckmäßige und genaue Weise in kurzer Zeit bestimmt werden kann.

Die Erfinder haben überraschenderweise dabei festgestellt, daß Phospholipase D auf Phosphatidyl-glycerin wirkt und Glycerin und Phosphatidsäure bildet. Sie fanden eine zufriedenstellende Methode zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin durch quantitative Bestimmung des in der Reaktion gebildeten und dann extrahierten Glycerins. Vorzugsweise kann in diesem Verfahren nur Phosphatidyl-glycerin quantitativ sehr zufriedenstellend bestimmt werden durch Einvirkenlassen der Phospholipase D auf die zu untersuchende Flüssigkeit .:ur Bildung von Glycerin, dann Einwirkenlassen von Glycurinkinase auf dieses Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Dcaors, wie Adenosintriphosphat (ATP) , schließlich Einwirkenlassen von Glycerinphosphat-Oxidase auf das Produkt und Bestimmen der verbrauchten Sauerstoffmenge oder des in der Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxids.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin in der zu Untersucheiden Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Glycerin durch die Wirkung eines Enzyms, das die Rolle des Katalysators in der Reaktion zur Bildung von GLycerin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-glycerin und Wasser spielt, freigesetzt wird und anschließend das freigesetzte Glycerin quantitativ bestimmt wird.

Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin in der zu untersuchenden Flüssigkeit , das dadurch gekennzeichnet ist, daß folgende Stufen (a), (b), (c) und (d) durchgeführt werden:

(a) Freisetzen von Glycerin durch Einwirkenlassen von Phospholipase D auf Phosph'atidyl-glycerin;

(b) Bilden von Glycerin-3-phosphat durch Einwirkenlasr.en von Glycorinklnase auf das Glycerin in Gegenwart <> Ine; phor,ph,\ il-Donors;

-ί-

' (c) Einwirkenlassen von Glycerin-phosphcit-Oxidase auf das GIycerin-3-phosphat und

(d) Bestimmen der Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an in der Reaktion gebildetem Wasserstoffperoxid.

Die Erfindung bietet die Vorteile, daß iedes Reagenz für die quantitative Bestimmung in einer Packung vorbereitet werden kann, die quantitative Bestimmung bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt werden kann, sie; außerdem einfach durchzuführen ist und wenig Zeit für die Reaktion benötigt.

Außerdem kann das Phosphatidyl-glycerin bis zu einer sehr niedrigen Konzentration genau bestimmt werden, der dabei direkt bestimmte Wert für Phosphatidyl-glycerin erweist sich als sehr zweckmäßig. Da die Bestimmung leicht und zweckmäßig in kurzer Zeit durchgeführt werden kann, können gleichzeitig mehrere Proben untersucht werden, d.h. , die Erfindung stellt ein geeignetes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidylglycerin zur Verfügung.

Fig.1 zeigt die Eichkurve des Beispiels 1, Fig.2 die Ergebnisse einer quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin bei Untersuchung verschiedener Proben von Fruchtwasser-Bestandteilen. Fig.3 zeig: di2 Eichkurve des Beispiels 3.

Als Beispiel für das Enzym, das die Rolle des Katalysators in der Reaktion zur Bildung von Glyceiin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-gl/cerin und Wasser spielt, kann Phospholipase D stehen. Diese Phospholipase D ist als Enzym bekannt, das die Reaktion von je 1 Mol Phosphatidsäure und Cholin aus je 1 Mol Lecithin und Wasser katalysiert. Als Präparat, das als Katalysator in der erwähnten Enzymreaktion dient, kann jedes Präparat verwendet werden, wie eines, das durch Extraktion von Phospholipase D enthaltenden Zellen erhalten worden ist, oder ein im Handel erhältliches Enzympräparat, z.B. ein aus Mikroorganismen stammendes Enzy \, das aus der Kultur von Phospholipase D produzierenden Mikroor* anismen erhalten worden ist, die zu

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der Gattung Streptomyces gehören, wie Streptcmyces hac lijoensis A-1143 (FERM-P No. 1329, vgl. JA-PS 39918/1977), Strep .omyees chromofussus A-0848 (FERM-P Nr. 3519, ungeprüfte JA-Pa.entanmeldung Nr. 130984/1977). Auch ein im Handel erhältliches Phospholipase D-Präparat ist geeignet.

Die Menge an zu verwendender Phospholipase D sollte entsprechend modifiziert und an die für die Bestimmung benötigte Zeit sowie an die Konzentration von Phosphatidyl-Glycerin angepaßt werden; sie unterliegt keiner besonderen Begrenzung. Zum Beispiel kann man für eine Bestimmung Phospholipase D In einer Menge im allgemeinen nicht unter 0,1 Einheiten, vorzugsweise etwa 1 bis 10 Einheiten, verwenden. Außerdem wird diese Phospholipase D vorzugsweise verwendet, nachdem sie in einem Puffer aufgelöst worden ist, wie einem schwach sauren bis schwach alkalischen Tris-SaIzsäurepuffer, Zitronensäure-Puffer, Borsäure-Puffer, PIPES-NaOH-Puffer. oder Imidazol-Puffer und, wenn notwendig, wird d&r Lösung ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie AlkylarylpolyätheralkohoIe (Triton X-100) oder Serum-Albumin, zugesetzt. Die so eingestellte, Phospholipase D enthaltende Enzymlösung und die zu untersuchende Flüssigkeit werden vermischt. In der zu untersuchenden Flüssigkeit bilden sich Glycerin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-Glycerin unter Verbrauch von Wasser. Das Mischungsverhältnis der beiden ist nicht besonders begrenzt/ man kann sie in einem solchen Verhältnis mischen, daß vorzugsweise etwa 1 bis 10 Einheiten Phospholipase ο je Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit enthalten sind. Die Reaktionstemperatur kann etwa 37⁰C betragen und die Reaktionszeit " sollte für die Freisetzung von Glycerin .

genügen, im allgemeinen nicht unter 5 Minuten, vorzugsweise nicht unter 10 Minuten. Das durch diese Reaktion freigesetzte Glycerin wird dann quantitativ bestimmt. Aus dem Wert dieser quantitativen Bestimmung erhält man den Wert für Phosphatidyl-Glyoirin in der zu untr rsurhenden Flüssigkeit.

Für die quantitative Bestimmung des Glycerins können

verschiedene bekannte Methoden für die quantitative chemische

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"" ft

Bestinimung odor solche, die Enzyme verwenden, eingesetzt werden.. Eine bevorzugte, einfache und zweckmäßige enzymatische Methode zur quantitativen Bestimmung ist die, in der eines oder mehrere Enzyme, deren Substrat Glycerin ist, eingesetzt werden, und dio nachweisbare Änderung der Enzymwirkung in der Reaktion quant .tativ bestimmt wird. Zum Beispiel ist das GK-GPO-Verfahr<:n zur quantitativen.Bestimmung besonders einfach Und zweckmäßig, indem Glycerin-3-phösphat und Adenosin-diphos-

phat (ADP) aus Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Donors, wie Adenosin-tr!phosphat (ATP) und Glycerinkinase (GK) gebildet werden, dann Glycerinphosphat-Qxidase (GPO) auf das GIycerin-3-phosphat einwirken gelassen wird, so daß der Sauerstoff in der Reaktionsflüssigkeit zur Bildung von Wasserstoffperoxid verbraucht wird.

Dabei wird die Menge an in der Reaktionsflüssigkeit verbrauch-

und

tem Sauerstoff mit einer Sauerstoffelektrode gemessen, die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid wird mit einer Wasserstoffperoxid-Elektrode als elektrische Veränderung gemessen oder die Menge an Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid wird mit einer Enzymelektrode bestimmt, die mit immobilisierter Glycerinphosphat-Oxidase zu einer Sauerstoff- oder Wasserstoffperoxid-Elektrode kombiniert worden ist. Die immobilisierte GPO kann in einer membranähnlichen, fiberähnlichen/ granulatähnlichen oder röhren ähnlichen Form vorliegen, um das Anbringen des Enzyms im Detektorteil der Sauerstoff- oder Wasserstofffperoxid-Elektrode zu erleichtern. In dieser Anordnung kann die Elektrode mit einer geringen Enzymmenge arbeiten. Phospholipase D oder die verwendete Glycerinkinase können auf gleiche Weise oder entsprechend immobilisiert werden. Immobilisierte Enzyme können auf verschiedene Weise hergestellt werden, z.B. durch Polymerisat-Einschluß in z.B. Acrylamid, durch Vernetzen unter Verwendung eines Vernetzungsmittels für ein Gemisch mit einem Protein, wie Albumin, durch Einschluß unter Verwendung von Collagen oder Fibroin, durch Adsorption oder durch kovalentes Binden auf einem porösen organischen Polymerisat oder durch Einschluß unter Verwendung eines lichthärtenden Harzes oder

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-Tf-

-S-

durch kovalentes Binden unter Verwendung eines aminierten Glases.

Die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid kann auch mit spektrophotometrischen Verfahren, durch Verwenden eines Indikators, der durch die Reaktion mit Wasserstoffperoxid gebildet wird, durchgeführt werden. Als Indikator werden im allgemeinen solche Präparate verwendet, deren Veränderungen quantitativ durch spektroskopische Mittel bestimmt werden können, z.B. eine Farbreagenzmischung, deren Farbe sich, im sichtbaren Bereich verändert, ein Fluoreszenz-Reagenz, das fluoresziert, oder ein durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht Licht erzeugendes Reagenz. Beispielsweise kann man als Farbreagenz ein Material verwenden, das eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität und ein Chromogen enthält. Als Substanz mit Peroxidase-Aktivität wird im allgemeinen die aus Meerrettich stammende Peroxidase verwendet und als Chromogen die Kombination eines Elektronenakzeptors und eines Wasser:-toff-Donors. Als Elektronenakzeptor werden solche Verbindungen verwendet, wie z.B. 4-Aminoantipyrin, 2-Hydrazin-benzothiazol, 3-Methyl-2-benzothiazolon-hydrazin oder 2-Aminobenzothiazol. Als Wasserstoff -Donor werden Verbindungen verwendet, wie z.B. Phenol, 3-Methyl-N-äthyl-N-(ß-hydroxyäthyl)-anilin, 3,5-Xylenol, N,N-Dimethylanilin oder Ν,Ν-Diäthylanilin.

Als leuchtende Substrate in einem Fluoreszenz-Reagenz oder einer Licht erzeugenden Reagenzmischung können verschiedene bekannte Verbindungen verwendet werden, z.B. Bis-(2,4,6-trichlorphenol)-oxalat, Phenylthiohydantoin, Homovanillinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, Vanillylamin, 3-Methoxyäthylamin, Phloretinsäure, Hordenin, Luminol-Monoanion oder Lucigenin. Jede dieser Verbindungen kann, wenn es notwendig ist, zusammen mit einem Elektronenakzeptor und/oder einer Substanz mit Peroxidase-Aktivität für die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendet werden.

Es besteht keine besondere Begrenzung für die Menge des Enzyms oder des verwendeten Chromogeny. So sollte man ν,.Ίλ. für eine* Untersuchung im allgemeinen nicht weniger als °'^ϋ1 Einheiten,

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' Ab'

vorzugsweise 0,05 bis 100 Einheiten Glycerinkinase, nicht weniger als 0,05 Einheiten, vorzugsweise 0,1 bis 200 Einheiten Glyce::in-phosphat-Oxidase und im allgemeinen nicht weniger als 0,05 3inhe..ten, vorzugsweise 0,1 bis 500 Einheiten, Peroxidase verwe.iden. Auch kann man eine Lösung verwenden, die so eingestellt ist, daß die Konzentration eines Elektronen-Akzeptors oder 2 ines Wasserstoff-Donors im allgemeinen nicht unter 0,1 mMol ist, und eine so eingestellte Lösung, daß die Konzentration eines Phosphat-Donors, wie ATP oder Cytosin-triphosphat, nicht unter 0,1 mMol ist. Vorzugsweise wird zur Erhöhung der Glycerinkinase-Aktivität ein wasserlösliches, Magnesiumionen

sz * r, ι z.B.Jiaonesiumchlorid/,, .

frexsetzendes Salz verwendet,raas in aestilliertem Wasser oder schwach saurem oder schwach alkalischem Puffer gelöst werden kann. Diese; Reagenzien können getrennt von der Phospholipase D -Lösung verwendet oder mit dieser vermischt werden, ferner können diese Reagenzier als integrierte Verbund-Präparate durch Aufbringen auf FJlterpapier oder Filme■ konfektioniert werden.

Dieses GK-GPO-Verfahren zur quantitativen Bestimmung zeigt eine hohe Empfindlichkeit für das in der zu untersuchenden Flüssigkeit gebildete Glycerin, und da es durch die Verunreinigungen in der zu untersuchenden Flüssigkeit nicht beeinträchtigt wird, is; es eine ausgezeichnete Methode, die eine genaue Bestimmung erlaubt.

Als Glycerinkinase für diese quantitative Bestimmung kann jedes Enzym verwendet werden, solange es Glycerin-3-phosphat und ADP aus Glycerin und ATP bildet, z.B. Enzyme aus der Leber einer Ratte oder einer Taube,("J.Biol.Chem.", 211, S. 951 (1954) und "Biochem.Z.", 329, S.320 (1957)), Enzyme, die aus Mikroorganismen stammen, z.B. aus dem Kulturmedium von GK-produzierenden Mikroorganismen, wie Candida mycoderma oder Streptomyces canus A-2408 (FERM-P 4977); "Biochem.Z." 333, S. 471 (1961), ungeprüfte JA-Patentanmeldung Nr. 162987/ 1980)) und im Handel erhältliche Präparate.

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Die für dieses Bestiinimmgsverfahren verwendete Glycerinphophat-Oxidase kann beliebig sein, solange sie die Rolle eines Katalysators in der Reaktion zur Bildung von Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid aus Glycerin-3-phosphat und Sauerstoff spielt, und z.B. aus aen Stämmen Streptococcus, Lactobacillus oder Leuconostoc stammen; es kann auch Glycerinphosphat-Oxidase sein, die von Bakterien, die dem Stamm Pediococcus angehören (ungeprüfte JA-Patentanmeldung Nr. 72892/1978) produziert wird, ein Enzym, d,^r;S aus der Kultur von Glycerinphosphat-Oxidase produzier;nden Bakterien erhalten wird, die zum Stanm Aerococcus gehören (Aerococcus viridans IFO 12219 und IFO 12317, ungeprüfte JA-Patentanmeldung Nr. 15746/1980) und auf dem Markt erhältliche Enzyme.

Bei einem anderen enzymatischen Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin wird Glycerinkinase auf Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Donors, wie ATP, einwirken gelassen; man erhält Glycerin-3-phosphat und ADP. Dann wird Glycerinphosphat-Dehydrogenase auf dieses Glycerin-3-phosphat einwirken gelasser in Gegenwart von Nikotin-Ädenin-Dinucleotid (NAD) zur Bildung von Dihydroxyaceton - ' · und NADH. Dieses NADH wird dann quantitativ bestimmt und daraus wird die Menge an Glycerin berechnet. Bei der quantitativen Bestimmung des NADH wird im allgemeinen die Absorption bei

direkt °^^r
etwa 340 nm/gemessen / nach Entwickeln einer Farbe mit einem wasserlöslichen Tetrazolium-Salz, wie 3-(4,5-Dimethyl)-2-thiazolyl-2H-tetrazolium-bromid, 2-(p-Jodphenyl)-3- (p-Nitrophenyl) -S-phenyl-^H-tetrazolium-chlorid, 3,3 '- (3,'3 '-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis/2-(p-nitrophenyl-5-pheny1-2H-tetrazoliumchloridy (Nitrototrazoleumblau) oder 2,6-Dichlorphenol-indophenol in Gegenwart von Diaphcrase oder Phenazinmethosulfat, wobei die Farbe bei Absorptionen gemessen wird, die den speziellen Absorptionswellenlängen entsprechen.

Ein anderes als das erwähnte Verfahren zur quantitativen Bestimmung ist dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin-Dehydrogenase auf Glycerin in Gegenwart von NAD einwirken gelassen wird zur Bildung von Dihydroxyaceton und NAD!' und daß dieses

-KJ-NADII quantitativ bestimmt wird.

Auch ein anderes Verfahren ist geeignet, in dem Glycerinkinase auf Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Donors, wie Ai¹P, einwirken gelassen wird zur Bildung von Glycerinphosphat und ATP, dann Pyruvatkinase auf dieses ATP in Gegenwart von Phosphorenolpyruvat einwirken gelassen wird zur Bildung/Brenztraubensäure und ADP, wobei diese Brenztraubensäure quantitativ bestimmt wird. Zur quantitativen Bestimmung dieser Brenztraubensäure kann man ein Verfahren verwenden, in dem ein Hydrazin, wie 2,4-Dinitrophenylhydrazin, auf die Brenztraubensäure einwirkt zur Bildung einer Farbe, deren Absorption bei einer Wellenlänge von etwa 440 nin gemessen wird. In einem anderen Verfahren wird Laktat-Dehydrogenase auf die Brenztraubensäure in Gegenwart von NADH einwirken gelassen zur Bildung von NAD und Milchsäure, die verminderte Menge an NAD im Reaktionssystem wird durch Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von etwa 340 nm bestimmt. Man kann aber auch Pyruvat-Oxidase auf die Brenztraubensäure einwirken lassen und cie Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an Wasserstoffperoxid im Reaktionssystem durch die elektrische Veränderung messen oder die Brenztraubensäure spektrophotometrisch unter Verwendung eines Indikators für Wasserstoffperoxid bestimmen.

Ein anderes als die oben erwähnten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin ist dadurch gekennzeichnet, daß man Glycerin-Oxidase auf Glycerin einwirken läßt und die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an Wasserstoffperoxid oder an im Reakt.-onssystem gebildetem Glycerinaldehyd bestimmt.

was. die Enzyme und Reagenzien betrifft, so ist es einfach und zweckmäßig, die im Handel erhältlichen Präparate zu verwenden und die einzusetzenden Mengen entsprechend zu wählen. Außerdem kann man, wenn es notwendig ist, ein oberflächenaktives Mittel oder einen Stabilisator verwenden.

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Als Flüssigkeit, die im erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden soll, ist jede Probe geeignet, solange sie Phosphatidyl-glycerin enthält, z.B. CörperflüssigkeIten, wie Proben von Fruchtwasser.

Wird amniotische Flüssigkeit als zu untersucht nde Flüssigkeit verwendet, so wird si& vorzugsweise aus einem Phosphatidyl-glycerin enthaltenden/ entnommen;beisDielsweise können 5-6 ml Fruchtwasser mit 15-18 ml Chloroform/Methanol im Verhältnis 2:1 extrahiert werden; die Chloroformphase wird durch Zentrifugieren bei 2000 UpM gesammelt und unter Stickstoff bis zur Trockene eingedampft. Auf diese Weise erhält man das Gesamtlipid, das in einer.bestimmten Menge einer Iprozentigen Lösung von Alkylarylpolyätheralkoholen (Triton X-100) gelöst

jede
wird* Auf diese Lösung kann/Enzymlösung, wie die der Phospholipase D oder die der Glycerinphosphat-Oxidase oder der Glycerinkinase für die quantitative Bestimmung, sowie andere Reagenzien gleichzeitig oder nacheinander einwirken. Das Verhältnis von zu untersuchender Flüssigkeit zu Enzymlösung ist nicht besonders begrenzt, im allgemeinen werden etwa 0,1 bis 3 ml Enzymlösung für 0,01 bis 1 m. zu untersuchender Flüssigkeit verwendet. Die Bestimmung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 37⁰C durchgeführt, die Reaktionszeit kann beliebig sein, solange die Reaktion vollständig abgelaufen ist; sie beträgt im allgemeinen nicht unter 5 Minuten, vorzugsweise nicht unter 10 Minuten. Als Reaktionsmedium kann Wasser oder eine schwach saure oder schwach alkalische Pufferlösung als Lösungsmittel für jedes Reagenz dienen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin in der zu untersuchenden Flüssigkeit kann direkt in sehr kurzer Zeit durchgeführt werden, man kann so geringe Konzentrationen an Phosphatidyl-glycerin wie 2,0 η Mol, d.h. Phosphatidyl-glycerin in einer Menge von 0,03 mg/dl in einer Fruchtwasserprobe von 5 bis 6 ml bestimmen. Das bedeutet, daß die Menge an Phosphatidylglycerin extrem niedrig ist, verglichen mit einem Wert von 0,2 mg/1, der als kritischer Wert für das Auftreten von RDS

BAD ORfGlNAt

-Yi-

- 4-

angeschen wird. Außordem sind keine- komplizierten Maßnahmen notwendig, das Verfahren kann bei normaler Temperatur durchgeführt werden.

Die Aktivität der Phospholipase D und die Aktivität der Glycerinphosphat-Oxidase und der Glycer; nkinase können wie folgt bestimmt werden:

(a) Aktivität der Phospholipase D

0,1 ml einer 4prozentigen Lösung von Phosphatidyl-äthanolamin aus Eidotter werden mit 0,8 ml 0,05 m Tris-Salzsäurepuffer, pH 7,5, 0,3 ml einer Iprozentigen Lösung von Alkylarylpolyätheralkoholen (Triton X-100), 0,3 ml Wasser und 0,2 ml einer wässrigen,0,01 m Calciumchloridlösung versetzt und vermischt. Das Gemisch wird 10 Minuten ultrabeschallt, dann mit 0,2 ml Äthyläther und 0,1 ml Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen, dann mit 0,3 ml 20prozentiger Trichloressxgsaure zur Unterbrechung der Reaktion versetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wird 2 Mal mit je 4 ml Äthyläther gewaschen. 1 ml der wässrigen Phase wird mit 0,5 ml 0,2 η citratpuffer, pH 5,0, versetzt, dann werden 0,1 ml einer 2prozentigen wässrigen Zinnchlorid-Lösung und 2 ml einer 2prozentigen Ninhydrin-Lösung zugegeben. Das Gemisch wird Minuten bei 100⁰C erhitzt, um das Äthanolamin zu extrahieren, dessen Farbreaktion mit Ninhydrin bei einer Absorption OD = 570 πιμ gemessen wird. Die Aktivität des Enzyms, das 1 μg Äthanolamin je Minute freisetzt, ist als eine Einheit definiert.

(b) Aktivität der Glycerinkinase

Aus folgenden Reagenzien wird ein Reaktionsgemisch hergestellt:

0,2 m Tris-Salzsäurepuffer, pH 9,0 0,4 ml

0,1 m Glycerin 0,05 ml

10 mMol ATP 0,1 ml

10 mMol MgCl₂ 0,1 ml

Nitrotetrazolium-Blau (0,25%ig) 0,1 ml

Rinder-Serumalbumin dprozentig) 0,14 ml

10 mMol NAD 0,1 ml

BAD ORIGiNAL

Phenazin-methosulfat (0,05%ig) 0,01 ml Glycerinphosphat-Dehydrogenase (hergestellt von Boehringer & Sohn AG, 2 mg/ml, 65 U/ml) 5 μΐ

Ein ml dieses Reaktionsgemisches wird während 5 Minuten bei 37⁰C vorinkubiert und mit 50 μΐ einer Glycerinkinase-Lösung versetzt (10 mMol Phosphatpuffer, der 10 mMol Glycerin enthält und entsprechend auf einen pH 7,5 verdünnt worden ist). Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen, dann wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 η Salzsäure unterbrocher. Die entwickelte Farbe wird bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen (A 550 nm). Eine Einheit Glycerinkinase ist definiert als die Aktivität, die 1 μΜοΙ Glycerin-3-phosphat je Minute produziert. Die Aktivität wird nach folgender Gleichung berechnet :

_χ 1 ψ

U/ml = _χ 1 ψ _{χ Verdünnungs}.

0,05 χ 10 verhältnis

(c) Aktivität der Glycerinphosphat-Oxidase 1 ml das folgenden Reaktionsgemisches wird in einem kleinen Proberöhrchen 3 Minuten bei 37⁰C vorinkubiert:

0,2 m Tris-Salzsäurepuffer, pH 8,0, 0,2 ml

Peroxidase (0,5 mg/ml , 45 U/ml) 0,1 ml

0,3 g/100 ml 4-Aminoantipyrin 0,1 ml

0,1 m DL-Glycerin-3-phosphat 0,1 ml

0,2vol.%iges N,N-Dimethylanilin 0,2 ml

destilliertes Wasser 0,3 ml

Dieses Gemisch wird mit 20 μΐ Enzymlösung versetzt und 10 Minuten reagieren gelassen. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 2,0 ml 0,25 g/100 ml Natrium-laurylbenzol-sulfonat unterbrochen, die Absorption des Produkts wird bei einer Wellenlänge von 565 nm gemessen.

Die Aktivität des Enzyms wird nach folgender Gleichung berechnet;

J.ktivität des Enzyms (D/ml) = ^- x {Ά-

6 , O ¹ °

wobei Aa die Absorption während 10 Minuten bei einer Wellenlänge von 56 5 nm ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Erstellen einer Eichkurve

Folgende Lösungen werden hergestellt:

(1) Phosphatidyl-glycerin enthaltende Lösung

Es wird eine Lösung hergestellt, die 1,0 μΜοΙ/ml Phosphatidyl-glycerin und 1,0% Alkylarylpolyätheralkohole (Triton X-100) enthäLt.(Der Gehalt an Phosphatidyl-glycerin wird durch quantitat .ve Bestimmung des Phosphats festgestellt).

(2) Ci -Ionen enthalten es Pufferreaktionsmedium

0,1 Mol Tris-HC:-Puffer (pH 8) 1 Mol CaCl₂
destilliertes Wasser

8,	0	ml
o,	2	ml
1,	8	ml

10 ml

(3) Phosph ilipase D enthaltende Lösung

ml ■

Es werden 1 0/ einer Lösuig (pH 8) verwendet,die aus 121,1 mg Tr is-Puffer bes.eht und 3 5 U/.nl(0,6 mg/ml) Phospholipase D, 50,0 rg Rinder-tarumalbumin, ( , 5 ml einer 20prozentigen Lösung von J.lkylarylpolyätheralkoholen (Triton X-100) und Wasser enthält.

(4) 60 mMol EDTA

(5) Eine Lösung, die 40 mMol MgCl₂ und 160 mMol ATP enthält Dazu werden 1,0 ml 0,2 Mol ATP, 0,10 ml 0,5 Mol MgCl₂ und 0,15 ml destilliertes Wasser vermischt, so daß 1,25 ml der Lösung erhalten werden.

_BAD .

- YS-

. 41.

(6) Glycerinkinase-Lösun'j

Es wird eine Lösung verwendet, die in 10 mMol Tris-HCl-Puffer 2 mg/ml Glycerinkinase enthält (pH 8).

(7) Glycerinphosphat-Oxidase-Lösung

10 ml einer Glycerinphosphat-Oxidase-Lösung, die aus 10 mg Rinder-Serumalbumin besteht, das 3 mg/ml Glycerinphosphat-Oxidase, 560,75 mg Ammoniumsulfat, 1,0 ml nines 0,1 m Tris-Salzsäurepuffer,pH 8,und 9 ml Wasser enthält, werden hergestellt.

(8) Flüssiges, Glycerin^hosphat-Oxidase enthaltendes Indikatorgemisch

4-Aminoantipyrin

wässrige Phenollösung (10 mg/ml)

%ige
1,25 / Alkylarylpolyätheralkohol-Lösung

(Triton X-100)

0,5 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,

Peroxidase (90 U/ml in destilliertem Wasser) 0,8 Glycerinphosphat-Oxidase-Lösung (3 mg/ml)

destilliertes Wasser

20,0 ml

Zu je 0 bis 0,1t?ml der Phosphatidyl-glycerin enthalte nden Lösung wird Iprozentige Alkylarylpolyätheralkohol-Lösung (Triton X-100) zugegeben, so daß die Gesamtmenge 0,1 ml beträgt. Dieses Gemisch wird mit 0,1 ml Ca -Puffer versetzt und 5 Minuten auf 37°C erhitzt. Es werden 0,05 ml Phospholipase D-Lösung zugegeben, das Gemisch wird 10 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen. Nach der Reaktion werden 0,04 ml 60 mMol EDTA und 0,075 ml einer 0,04 m Magnesiumchlorid-· Lösung, die 160 mMol ATP und 0,03 ml der Glycerinkinase-Lösurg enthält,^zu9^e^^ek^en· Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Nach der Reaktion wird 1,0 m., de; Indikatorgemisches zugegeben, das Gemisch wird 20 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen, dann wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 500 nm (OD 500) gemessen.

0,24	ml
0,16	ml
0,8	ml
1,6	ml
) 0,8	ml
0,8	ml
15,6	ml

- ver - ' -Μ-

Die Ergebnisse sind in Fig.1 angegeben. Eine zufriedenstellende lineare Beziehung erhält man im Bereich von 0,005 bis 0,1 ml Phosphatidyl-glycerin enthaltender Lösung (Phosphatidyl-glyceringehalt von I- bis 100 nMol) .

Man erhält eine lineare Beziehung, wenn der Phosphatidyl-glyceringehalt größer als 2 nMol ist, die Empfindlichkeit ist ausgeprägt.

Beispiel 2

5 bis 6 ml einer Fruchtwasser-Probe werden in 18 ml Chloroforiti/M-ethanol im Verhältnis 2:1 gelöst und bei 2000UpM zentrifugiert. Es bilden sich 3 Phasen,, wovon die Chloroformphase unter Stickstoffschutz zur Trockene eingedampft wird. Man erhält die Gesamtlipide, die in 0,1 ml Chloroform gelöst und auf eine Kieselgel-Säule (0,3 g) aufgegeben werden. Durch Elution mit 10 ml Chloroform/Methanol im Verhältnis 19:1 erhält man das neutrale Fett, die Phosphatidyl-glycerin enthaltende Fraktion wird durch Elution mit 10 ml Chloroform/Methanol im Verhältnis 2:1 gewonnen. Das Lösungsmittel wird entfernt, der Rückstand wird in 0,1 ml einer Iprozentigen Alkylarylpolyätheralkohol-LÖsung (Triton X-100) gelöst und mit 0,1 ml des Ca -Puffers versetzt. Das Gemisch wird während 5 Minuten auf 37⁰C vorgewärmt, dann mit 0,05 ml der Phospholipase D-Lösung versetzt und 10 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen. Nach der Reaktion werden erst 0,04 ml einer 60 iriMol EDTA enthaltenden Lösung, dann 0,075 ml einer 0,04 m MgCl₂-Lösung, die 160 mMol ATP und 0,03 ml der Glycerinkonase-Lösung enthält, zugegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen, dann mit 1,0 ml dos flüssigen Indikatorgemisches versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen. Die Absorption wird bei einer Wellenlänge von 500 nm gemessen, der Gehalt an Phosphatidyl-glycerin (mg/dl) in den Fruchtwasser-Proben wird aus der Eichkurve erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig.2 angegeben, wobei X die Todesfälle, O das Auftreten von RDS,^ das Auftreten von milden RDS-Fällen und Φ kein RDS bedeuten.

.- -■ - ■-. _ _::/ 3H6090

- rf-

Beispiel 3 * 43 ·

Aus folgenden Bestandteilen wird ein ReaktLonsgemisch zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-< lycerin hergestellt:

0,2 Mol Tris-HCl-Pi ffer, pH 7,5 0,2 ml

10 mMol CaCl₂

10 mMol MgCl₀

10*^igj§lkylarylpolyätheralkohole (Triton X-100)

10 mMol ATP

Lösung, enthaltend 20 U/ml Phospholipase D, 5 U/ml Glycerinkinase und 50 U/ml Glycerinphosphat-Oxidase

45 U/ml Peroxidase

%iges
0,3 / 4-Aminoantipyr-in

%iges
0,3 j 3-Methyl-N-äthyl-N-(ß-h/droxyäthyl)anilin 0,2 ml

destilliertes Wasser

mit
2,0 ml dieses Gemisches werden/50 μΐ dor zu untersuchenden Flüssigkeit, die verschiedene Mengen an Phosphatidyl-glycerin (von 20 bis 100 nMol enthält) versetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 37⁰C reagieren gelassen, dann wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 550 nm (O⁰C₅₀) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig.3 dargestellt, man erhält eine Eichkurve, die eine zufriedenstellende lineare Beziehung in bezug auf den Gehalt an Phosphatidyl-glycerin in der zu untersuchenden Flüssigkeit zeigt.

0,2	ml
0,2	ml
0,05	ml
0,2	ml
0,1	ml
0,1	ml
0,2	ml
0,2	ml
0,55	ml
2,00	ml

BAD 0R!6!NAt

Claims

Patentansprüche

1. Ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-glycerin in einer zu untersuchenden Lösung, dadurch gekennzeichnet , daß man auf das Phosphatidylglycerin ein Enzym einwirken läßt, das Glycerin freisetzt,und anschließend das freigesetzte Glycerin quantitativ bestimmt.

2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzyn eines verwendet, das die Rolle des Katalysators in der Reaktion zur Bildung von Glycerin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-glycerin und Wasser spielt.

3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung gemäß Anspruch 1 und 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym, das die Rolle des Katalysators in der Reaktion zur Bildung von Glycerin und Phosphatidsäure aus Phosphatidyl-glycerin und Wasser spielt, Phospholipase D ist.

4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Flüssigkeit eine Körperflüssigkeit ist.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidyl-

gemäß Anspruch 1,

gLycerin in einer zu untersuchenden.Flüssigkeit dadurch gekennzeichnet, daß folgende Schritte durchgeführt werden:

(a) Freisetzen von Glycerin durch Einwirkenlassen von Phospholipasc D auf Phosphatidyl-glycerin,

(b) Bilden von Glycerin-3-phosphat durch Einwirkenlassen von Glycerinkinase auf Glycerin in Gegenwart eines Phosphat-Donors,

(c) Einwirkenlassen von Glycerinphosphat-Oxidase auf Glycerin-3*-phosphat und anschließend..

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Phosphat-Donor Adenosin-triphosphat ist.

7. Verfahren zur quantitativen Bestimmung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung des Wasserstoffperoxids unter Verwendung einer Indikator-Zusammensetzung, die mit Wasserstoffperoxid zu einem nachweisbaren Produkt reagiert, durchgeführt wird.

8. Verfahren zur quantitativen Bestimmung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikator-Zusammensetzung eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität und ein Chromogen enthält.

9. Verfahren zur quantit itiven Bestimmung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, da-J das Chromogen 4-Aminoantipyrin und Phenol ist.

10. Verfahren zur qt.ant .tativen Bestimmung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen 4-Aminoantipyrin und 3-Methyl-N-äthyl-N-(ß-hydroxyäthyl)-anilin ist.

11. Verfahren zur quantitativen Bestimmung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durch Messen der Absorption bei einer Wellenlänge von etwa 500 nm durchgeführt wird.

12. Verfahren zur quantitativen Bestinu ung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durch Messen der Absorption bei einer Wellenlänge von etwa 550 nm durchgeführt wird.

BAD ORIGINAL