DE3228502A1 - Verfahren zur herstellung des c1-inaktivators und seine verwendung - Google Patents
Verfahren zur herstellung des c1-inaktivators und seine verwendungInfo
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Description
IiI-JHKJ IKlWKKKK ΛΚΤΙ KN(JKHKI,!,.SCHAb1T 82/B 011 = Ma 411
ANR: 1 OOü 76 4 Dr.Sn/g.y,
V erfahreη _zur Herstellung des Cl-Inaktivators und seine
Verwendung
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines als Cl-Inaktivator bezeichneten Proteins und seine Verwendung als
Arzneimittel.
Der Cl-Inaktivator, benannt nach seiner Eigenschaft, die
Cl-Esterase des Komplementsystems zu inaktivieren, "kontrolliert" zusätzlich auch wichtige Enzyme der Blutgerinnung,
speziell der Kontaktphase, nämlich das Präkallikrein und die Faktoren XI und XII, daneben aber
auch Plasmin. Aufgrund dieser Spezifität kommt dem Cl-Inaktivator eine besondere physiologische Funktion zu.
Generell kann man sagen, daß er beim Kontakt von Blut mit Oberflächen (z. B. in einer Herz-Lungen-Maschine)
durch die Neutralisation der dabei entstehenden Enzyme verbraucht wird, aber auch bei Krankheitsabläufen, die
zur Aktivierung der Gerinnungskaskade führen, z.B. Immunkomplexe, wie sie in Verbindung mit chronischen, vor
allem rheumatischen Erkrankungen auftreten. Cl-Inaktivator ist das Medikament der Wahl bei hereditärem Angioödem.
Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Herstellung des Cl-Inaktivators
aus Humanplasma. Neben mehrstufigen Verfahren, z.B. nach Haupt, Heimburger et al.: Beitrag zur
Isolierung und Charakterisierung des Cl-Inaktivators aus
Humanplasma; Eur.0.Biochom. 17, 254-261 (1970) wird auch
die Aftinitätschromatographie verwendet (Reboul et al.:
A simplified procedure for the purification of Cl-inaktivator from human plasma? FEBS Letters 79, 4 5 (1977)).
Solche Verfahren haben gewisse Mangel: Sie sind immer
noch nicht einfach genug, verlustreich und zeitaufwendig. Auch Ionenaustauscherchromatographie, evtl. kombiniert
mit Gelfiltration und Affinitätschromatographie,
hat nicht zu dem gewünschten Erfolg geführt. Das Verfahren nach E.F.Vogelaar u.a., Vox.Sang.26: 118-127 (1974),
wonach Cl-Inaktivator im großen Maßstab für den klinischen
Gebrauch hergestellt werden kann, entspricht nicht den heutigen Vorstellungen, die an ein solches Produkt
zu stellen sind.
Es war daher die Aufgabe gestellt, Cl-Inaktivator nach einem Verfahren herzustellen, das gut reproduzierbar und
mit hoher Ausbeute und Reinheit zu einem therapeutisch gut verträglichen Produkt führt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Cl-Tnaktivator
ein relativ hydrophiles Protein ist und die den Cl-Inaktivator üblicherweise begleitenden, dessen spezifische
Aktivität herabsetzenden Proteine (Begleitproteine) Affinitäten zu hydrophoben Gruppen, insbesondere
aromatischen Verbindungen aufweisen und daß sie somit vom Cl-Inaktivator mit Hilfe solcher Gruppen, die an einen
praktisch wasserunlöslichen Träger fixiert sind, adsorbiert und davon auf diese Weise getrennt wer or? η können.
Bevorzugte aromatische Verbindungen sind Phenyl-Verbindungen. Als Träger sind die an sich bekannten Materialien
geeignet, wie sie für die hydrophobe Chromatographie mit unterschiedlichen, aktiven Gruppen vorwendet
werden. Bevorzugt wird vernetzte Agarose, die ggfs. über einen Spacer gebundene aromatische Gruppen enthält.
Für die Isolierung des Cl-Inaktivators kommen somit Trägerverbindungen
folgender Struktur in Frage:
A-B-Aro.,
wobei A den hochmolekularen, praktisch wasserunlöslichen
Träger, z.
darstellt,
(R) Träger, z.B. vernetzte Agarose, vorzugsweise SEPHAROSE ,
B ein aliphatisches Bindeglied des aromatischen Restes ist, vorzugsweise eine Phenylgruppe, gebunden an diesem
Träger. Auch Spacer genannte Bindeglieder sind bevorzugt,
fH
-0-CH2-CH-CH2-O- und -0-C-N-CH2-CH2-.
OH H
Ein geeignetes Handelsprodukt einer AB-Aro ist PHENYL-SEPHAROSEV
CL-4B. Bevorzugt werden diesem ähnliche Produkte, wie sie z.B. durch Umsetzung einer vernetzten
Agarose, z.B. SEPHAROSEV ' 4B mit Bromcyan und anschliessend
mit einem aromatischen Amin, z.B. Phenyläthylamin erhalten werden können.
Die Adsorption der Begleitproteine des Cl-Inaktivators
an solche hydrophobe Träger und deren Abtrennung davon ist ein erfindungswesentlicher Schritt in dem Verfahren
zur Herstellung eines Reinproduktes, dem gegebenenfalls an sich bekannte Verfahrensschritte vor- oder nachgeschaltet
werden können.
25
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Bevorzugtes Ausgangsitiaterial zur Gewinnung des Cl-Inaktivators
ist menschliches Plasma; der erfindungsgemäße Verfahrensschritt kann jedoch auch auf andere, Cl-Inaktivator
und Begleitproteine enthaltende wässrige Lösungen angewandt werden.
Vorteilhaft ist die Kombination des erfindungsgemäßen
Verfahrensschrittes mit einem nicht hydrophoben Adsorbens, vorzugsweise einem Ionenaustauscher, insbesondere
mit Diäthylaminoäthylgruppen. Auch QAE-Gruppen enthaltende Ionenaustauscher führen ebenso wie mineralische
- - D
- Jf-
- Jf-
Adsorbentien, wie beispielsweise Calciumphosphat zur Anreicherung
des Cl-Inaktivators. Auch Fällungsverfahren
mit Neutralsalzen, wie beispielsweise mit Ammoniuinsulfat
sind als Reinigungsschritte für den Cl-Inaktivator bekannt
und geeignet.
Bei der therapeutischen Anwendung des Cl-Inaktivators ist wesentlich, daß sie für den Patienten gefahrlos erfolgt.
Für den Ausschluß einer Hepatitisübertragung gilt die Annahme, daß über mehrere Stunden bei ca 60° C gehaltene
Proteinlösungen die Hepatitis B nicht mehr übertragen können, selbst wenn diese Lösungen vor dem Erwärmen
infektiöses Hepatitis B-Virus enthielten. In einer Weiterentwicklung der vorliegenden Erfindung stellte
sich deshalb die Aufgabe, das erfindungsgemäß erhaltene
Produkt Hepatitis-frei zur Verfügung zu stellen. Cl-Inaktivator enthaltende Lösungen können praktisch ohne Aktivitätsverlust
über mehrere Stunden bei ca. 60° C gehalten werden, wenn diese Lösungen die Aktivität des Cl-Inaktivators
stabilisierende Verbindungen enthalten. Solche Verbindungen sind Aminosäuren, Zucker und/oder Zukkeralkohole
oder Mischungen derselben. Ohne Aktivitätsverlust läßt sich eine Cl-Inaktivator enthaltende Lösung
über 10 Stunden bei 60° C mit einer Mischung von 2 mol/1
Glycin und 60 % (w/v) Saccharose erhitzen. Allgemein werden Aminosäuren in einer Konzentration von 1-3 mol/1
verwendet, Mono- und Oligosaccharide von 20-60% (w/v) und Zuckeralkohole bis zu 75 % (w/v). Für die Erwärmung
wird die Cl-Inaktivator und Stabilisator enthaltende Lösung auf einen pH-Wert zwischen 5,5 - 8,5, vorzugsweise
6,5 - 7,5, eingestellt. Neben der bevorzugt verwendeten Aminosäure Glycin sind auch folgende Aminosäurr-n für die
Stabilisierung geeignet: L-Asparaginsäure, L-Serin, L-Valin,
L-Lysin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin,
L-Leucin, L-Alanin, L-Methionin, L-Pi'olin, L-Hydroxyprolin,
L-Arginin, α- oder ß-Alanin, Glutamin, a-, ß- oder
- y-
γ-Aminobuttersäure; neben Saccharose folgende Zucker: Arabinose, Glucose, Galactose, Fructose, Ribose, Mannose,
Rhamnose, Maltose, Raffinose; als Zuckeralkohole sind folgende geeignet: Erythrit, Ribitol, Sorbit, Mannit.
5
Durch die genannten stabilisierenden Substanzen laßt
sich eine Cl-Inaktivator enthaltende Lösung 1 min. bis
48 Stunden bei 30 bis 100° C erwärmen, bevorzugt im Hinblick auf die notwendige Vermeidung einer Hepatitisübertragung
werden 10 Stunden und 60° C.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cl-Inaktivator
enthaltende Lösung in Gegenwart von Stabilisatoren solange erhitzt wird, bis die Lösung ihre Infektiosität,
bedingt durch einen Gehalt an Hepatitis B-Virus, verliert.
Entsprechend vorgereinigtes, ggfs. über mehrere Stunden bei ca. 60° C gehaltende, Cl-Inaktivator und Begleitproteine
enthaltendes Material mit einer Reinheit von ca. 23-25 Einheiten Cl-Inaktivator/mg (spezifische Aktivität)
in wässriger Lösung wird erfindungsgemäß mit einem hydrophob-substituierten Adsorbens, A-B-Aro z.B. PHENYL-
SEPHAROSE^R' behandelt. Die Adsorption der Begleitproteine
des Cl-Inaktivators erfolgt bei schwach saurem, neutralem
bis schwach alkalischem pH-Wert, vorzugsweise bei pH 6 bis pH 9. Die Leitfähigkeit der Lösung liegt zweckmäßig
bei 60-120 mS. Vorteilhaft wird der Adsorptionsschritt
mit dem hydrophoben Trägermaterial mit einem Fällungsschritt zur Konzentrierung, bei dem der Cl-Inaktivator
aus der Lösung ausgefällt wird, kombiniert. Danach wird der ausgefällte Cl-Inaktivator mit einer wässrigen
Lösung aufgenommen, die das Fällungsmittel in einer Konzentration enthält, bei welchem der Cl-Inaktivator
nicht ausfällt.
Wird z.B. der Cl-Inaktivator mit einem Neutralsalz, z.B.
Ammoniumsulfat präzipitiert, so kann der Niederschlag
direkt im Anschluß an die Präzipitation mit einer wässrigen
Lösung eines Neutralsalzes aufgenommen werden, bei deren Konzentration der Cl-Inaktivator in Lösung bleibt,
z.B. einer Ammoniumsulfatkonzentration von 7-14 %. Mit
einer solchen Lösung wird erreicht, daß übliche, den Cl-Inaktivator als Verunreinigung begleitende Proteine an
den hydrophoben Träger gebunden werden und der Cl-Inaktivator
in hoher Reinheit von dem Adsorbens, welcher die Verunreinigungen zurückhält, abgetrennt werden kann.
Für die therapeutische Anwendung wird der Cl-Inaktivator mit an sich bekannten Protein-stabilisierenden Substanzen
versetzt, beispielsweise mit einer Aminosäure wie Glyzin. Das durch hydrophobe Chromatographie schließlich
gereinigte Produkt wird nach Sterilfiltration auf die gewünschte, für eine Therapie wirksame Konzentration
eingestellt, abgefüllt und gewünschtenfalls lyophilisiert. Die zugesetzte Aminosäure stabilisiert den Cl-Inaktivator
bei der Gefriertrocknung.
Ein bevorzugtes Verfahren in einer allgemeinen Beschreibung wird beispielsweise wie folgt durchgeführt, wobei
hier als Ausgangsmaterial die Grundsubstanz des Cl-Inaktivators,
menschliches Plasma, zur Anwendung gelangt:
Menschliches Plasma, das z.B. Citrat enthält und frei von Kryoglobulinen und Prothrombin-Faktoren ist, wird
mit einem Anionen-Austauscher behandelt und das Cl-Inaktivator-haltige
Eluat mit Neutralsalzen fraktioniert. Die Begleitproteine des Cl-Inaktivators werden von den
meisten anderen Plasmaproteinen mit einem hydrophoben Adsorbens adsorbiert. Somit kann mittels der hydrophoben
Chromatographie mit einem einzigen Schritt der Cl-Inaktivator mit hoher Reinheit und guter Ausbeute, von Be-
gleitproteinen abgetrennt, gewonnen werden. Der Cl-Inaktivator
passiert in salzhaltiger Lösung entsprechender Konzentration eine hydrophobe Säule aus z.B. PHENYL-SEPHAROSE
, während die meisten Begleitproteine, vor allem das in dieser Fraktion in der Regel stark angereicherte
Ceruloplasmin, zurückgehalten werden.
Der Cl-Inaktivator im Fällungsrückstand kann gewünschtenfalls
nach Lösen in aqua dest. und Zusatz eines Zukkers, z.B. Saccharose auf 60 % (w/v) ohne wesentlichen
Aktivitätsverlust 10 Std. auf 60° C erhitzt werden. Nach Entfernung der Saccharose durch Umfällung mit Ammoniumsulfat
aus verdünnter Lösung kann gleich anschließend ebenfalls mit der Technik der hydrophoben Chromatographie
und in einem einzigen Schritt der Cl-Inaktivator mit hoher Reinheit und guter- Ausbeute, von Begleitproteinen
abgetrennt, gewonnen werden.
Folgendes Beispiel erläutert die Erfindung: 20
Tiefgefrorenes Citratplasma, von Kryoglobulinen befreit,
aus dem Faktor VIII, Cig und Human-Fibrinogen gewonnen wurden, wurde zur Gewinnung von Prothrombin-Konzentrat
mit DEAE-SEPHADEX*R) gemäß P 30 43 857.4, P 30 45 153.7
und P 31 01 752.5 adsorbiert. Nach Abtrennung von DEAE-
SEPHADEX^ wurden dem Plasmaüberstand 10 g QAE-SEPHA-
( R)
DEXV ' pro Liter Plasma zugesetzt und die Suspension 60 min. bei 12° C gerührt; danach wurde das QAE-Adsorbens abgetrennt und mit 0,15 mol NaCl gewaschen.
DEXV ' pro Liter Plasma zugesetzt und die Suspension 60 min. bei 12° C gerührt; danach wurde das QAE-Adsorbens abgetrennt und mit 0,15 mol NaCl gewaschen.
Für die Elution wurde 1,0 mol NaCl, pH 8,0 und 0,0025
mol/1 EDTA verwendet, in einem Volumen von 0,45 1 Puffer-SS
auf 10 1 Plasma. Das QAE-Eluat ist eine tiefblaue Lösung, die neben Ceruloplasmin vor allem Cl-Inaktivator
und Faktor VII enthält. Das Eluat wurde mit flüssigem
Ammoniumsulfat bei 20° C fraktioniert: Durch Zugabe von 1500 ml gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung/1 Eluat wurde
eine 60 % Sättigung erzielt.
5
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Der 60 % Ammoniumsulfat-Rückstand, in dem der Cl-Inaktivator
angereichert war, wurde anschließend der hydrophoben Chromatographie an PHENYL-SEPHAROSE^ ' unterworfen.
Dazu wurde die Fällung mit Aqua dest. zu einer Lösung entsprechend einer OD28O nm ^ 55 aufgenommen, die Ammoniumsulfat-Konzentration
von 7 % und der pH-Wert von 7,2 bis 7,6 eingestellt. Nach einer Klär- und Sterilfiltration
wurden 1,3 1 dieser Lösung über ein Gelbett mit PHENYL-SEPHAROSE(R) in Form einer Säule von 31 cm Höhe
und 12 cm Breite getrennt. Der erste wasserklare Durchlauf enthielt den Cl-Inaktivator, gut getrennt von dem
als blaue Bande die Säule passierenden Ceruloplasmin. Die Cl-Inaktivator enthaltende Fraktion wurde durch Zugabe
von festem Ammoniumsulfat konzentriert: 340 g Ammoniumsulfat
wurden bei 6° C/l der durchlaufenden Fraktion zugesetzt. Die Fällung wurde abzentrifugiert und in Aqua
dest. gelöst. Der Klär- und Sterilfiltration schloß sich eine Dialyse gegen einen 1,5 %igen Glyzinpuffer an. Von
einer Teilmenge der Lösung wurde der Proteingehalt an Cl-Inaktivator mit Hilfe der Technik der radialen Immundiffusion
bestimmt und die Aktivität nach Levy und Lepow (Proc. Soc.Exp.Biol.Med. 101, 608 (1959)) unter Verwendung
von N-Acetyl-L-Tyrosinäthylester als Substrat. Die
Aktivität wurde in Cl-Inaktivator-Einheiten angegeben,
wobei 1 E dadurch charakterisiert war, daß sie 10 E Cl-Esterase inhibierte. Im Durchschnitt erhielt man Präparate
mit ca. 40 E Cl-Inaktivator/mg Cl-Inaktivator-Protein
mit einer Ausbeute von 20 %, bezogen auf das Ausgangsplasma. Das erhaltene Produkt war ca. 90 % rein,
pyrogenfrei, im Tierversuch ohne Nebenwirkungen und in der Therapie des Angioödeins einsetzbar.
!Jer 60 % Ammoniumsulfat-FällunejjäirUckstand konnte gewürmuhtenCalls
mit aqua dest. gelöst, mit 60 % w/v Saeeharose
versetzt, auf pH 7 - 7,5 eingestellt und 10 Std. auf 60e C erhitzt werden. Naeh Abkühlen wurde die Lösung
mit aqua dest· 1:5 verdünnt und zur Abtrennung der Saceharos© durch Zugabe von gesättigter Ammoniumsulffat-Lösung
bii auf 60 % Sättigung erneut gefällt. Daran schließt aich>
die hydrophobe Chromatographie an.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung eines ggfs. Hepatitis-freien,
ggfs. lyophilisierbaren Inaktivators der C1-Esterase
des Komplementsystems {C1-Inaktivator) durch Kombination
von an sich bekannten Fällungs- und Adsorptionsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß als ein Adsorbens
in dieser Kombination ein eine hydrophobe Gruppe, vorzugsweise eine Phenylgruppe enthaltender Träger,
welcher vorzugsweise vernetzte Agarose ist, verwendet wird.
2. Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis-sicheren,
C1-Inaktivator enthaltenden Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet,
daß eine C1-Inaktivator enthaltende Lösung in Gegenwart von Stabilisatoren solange erhitzt
wird, bis die Lösung ihre Infektiosität, bedingt durch einen Gehalt an Hepatitis B-Virus, verliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator eine Aminosäure, ein Zucker und/oder
!0 Zuckeralkohole oder deren Mischung verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des gereinigten, ggfs.
Hepatitis-frei gemachten C1-Inaktivators mit einem Stabilisator versetzt und danach lyophilisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator ein Zucker, vorzugsweise Saccharose
verwendet wird.
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