DE2404265A1

DE2404265A1 - Verfahren zur gewinnung von immunglobulinen

Info

Publication number: DE2404265A1
Application number: DE2404265A
Authority: DE
Inventors: Hans Mueller
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-01-30
Filing date: 1974-01-30
Publication date: 1975-07-31
Also published as: DE2404265B2; DE2404265C3; ES434100A1

Description

Verfahren zur Gewinnung von Immunglobulinen Die vorliegende Br-find1lng betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Immunglobulinen, insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung von Immunglobulinkonzentraten, die einerseits weitgehend reines IgG, andererseits neben Igü IgA oder IgM stark angereichert enthalten.
Bei der immunologischen Abwehr des Körpers gegen Mikroorganismen und deren Stoffwechselprodukte spielen die Immunglobuline als humorale Antikörper eine bedeutende Rolle. Die Immunglobuline sind jedoch nicht einheitlich; sie unterscheiden sich nicht nur hinsichtlich ihres chemischen Aufbaus, ihres Molekulargewichts und ihres mengenmässigen Vorkommens im Serum, sondern auch dadurch, dass sich beispielsweise in der als Immunglobulin A (IgA) bezeichneten Fraktion hohe Antikörperaktivitäten gegen bestimmte Viren, z.B. gegen Poliomyelitis, Masern und Influenza finden.
In der Fraktion der Immunglobulinklasse M (IgM)finden sich vorwiegend die Antikörper gegen gramnegaiive Erreger, z.B. Antikörper gegen Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (Bact. pyocyaneum), B. proteus, Haempoh. Influenza, H. pertussis, Klebsiellen (Klebs. pneumonlae), Salmonellen und Shigellen. Allgemei.n werden Antikörper gegen Kohlen hydrate vorzugsweise als IgM anzutreffen sein, während Proteinantigene in wesentlichen die Bildung der Immunglobuline der Klasse G (IgG) induzieren. Daraus ist zu ersehen, dass eine fortschrittliche Immuntherapie von bakteriLlen und viralen Infektionen eine spezifische Substitution und eine gezielte Anwendung von Immunglobulinen derjenigen Klassen erfordert, die bei dem. Krankheitsbild eine wesentliche Bedeutung haben.
Für die Gewinnung der Immunglobuline, aufgetrennt nach Klassen, stehen zwei bekannte Verfahren zur Verfügung: einerseits das auf Cohn und Oncley zurückgehende Fällung verfahren mit Äthanol, weiterentwickelt in der USPatentschrift 3.597.409; andererseits die Methode von Heide und Haupt, die die Kombination von Fällungsachritten mit Acridinderivaten und Ammoniumsulfat verwenden. Insbesondere die letztgenannte Methode erfordert häufig noch elektrophoretische und chromatographische Schritte zur Auftrennung und Weiterreinigung der angereichterten Immunglobulinfraktionen. Dadurch ist die Methode verlustreich und führt bei Anwendung im technischen Maßstab zu unbefriedigenden Ausbeuten.
Die nach dem Stand der Technik hergestellten handelsüblichen Immunglobulinpräparate enthalten hauptsächlich nur IgG, wenig IgA und in Spuren IgM.
Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von nach Klassen getrennter, Immunglobulinkonzentraten gefunden, die IgA, IgM und IgG in hoher Reinheit und guter Ausbeute enthalten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Immunglobulinen bzw. Immunglobulinkonzentraten, die einerseits weitgehend reines IgG, andererseits neben IgG, IgA oder IgM stark angereichert enthalten. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man: a) aus Serum oder defribriniertem Plasma mit einem kurzkettigen primären Alkohol eane rohe Immunglobulinfraktion ausfällt, b) die Fällung der Stufe--(a) in wässrige Lösung bringt und daraus die Euglobuline durch Einstellen einer niedrigen Leitfähigkeit und eines schwach sauren pH-Wertes ausfällt, c) aus dem Überstand der Stufe (b) durch Adsorption an ein mineralisches Adsorbens die proteolytischen Fermente abtrennt, d) im Überstand der Stufe (c) den überwiegenden Teil des IgM neben anderen Proteinen an ein schwerlösliches Phosphat adsorbiert und das Adsorbat abtrennt, e) aus dem Adsorbat der Stufe (d) eine IgM-hal.tige Fraktion desorbiert und das IgM durch Fällung mit einem kurzkettigen primären Alkohol anreichert, f) die Fällung der Stufe (e) in wässrige Lösung bringt, zur Beseitigung von Verunreinigungen mit Alumi.niumhydroxydversetzt und dieses wieder abtrennt, g) aus dem durch Adsorption von IgM befreiten Überstand der Stufe (d) das IgG und IgA mit einem kurzkettigen primären Alkohol ausfällt und h) ge-inschtenfalls zur Trennung von IgG und IgA das IgA selektiv an Aluminiumhydro,xy%'adsorbiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner die nach dem Verfahren hergestellten bezüglich IgA, IgM und IgG angereicherten Immunglobulinkonzentrate, deren Verwendung als Therapeutikum und diagnostische Reagenzien sowie Präparate, die die genannten Immunglobuline enthalten.
Die Entferrnrng des Fibrinogens aus dem als Ausgangsmaterial dienenden Plasma erfolgt auf an sich bekannte Weise, vorteilhaft als Fällung mit einem nIedrigen Alkohol oder auch durch Recalzifizierung oder als Cryopräzipitation.
Die Abscheidung der rohen Immunglobulinfraktionen in Stufe (a) erfolgt vorzugsweise mittels Äthanol bei einer Konzentration zwischen 18 und 35%, vorzugsweise 25%, in einem pH-Bereich von 5,6 bis 8,5, vorzugsweise be 7,7, bei einer Temperatur von o bis -100C, vorzugsweise -5oC. Anstelle von Äthanol kann hier wie auch in den folgenden Verfahrensstufen jeder andere kurzkettige primäre aliphatische Alkohol verwendet werden, sofern er mit Wasser hinreichend mischbar iC z.B. Methanol.
Äthanol wird jedoch wegen seiner physiologischen keit bevorzugt.
Entsprechend Stufe (b) wird der Niederschlag der Stufe (a) in der 5- bis 50-fachen Menge vorteilhaft in der 20-fachen Menge des Niederschlagsgewichts, vorzugsweise destilliertem Wasser, in wässrige Lösung gebracht. Dem Wasser können gewünsohtenfalls geeignete Zusätze wie Aminosäuren, vorzugsweise Glycin, in geringer Konzentration hinzugefühgt werden. Sodann wird die Leitfähigkeit durch Zusatz eines Salzes, vorteilhaft Natriumchlorid, auf 5,0 x 102 bis 8,0 x 10³ µS eingestellt.
Durch Ansäuren auf pH 4,5 bis 6, vor7ugsweise auf pH 5,1, werden die Fuglobuline im Temperaturbereich von 0 bis +200C, vorzugsweise bei +5C, ausgefällt.
Zur Adsorption von Proteinasen, insbesondere von Plasminogen, wird dem euglobulinfreien Uberstand der Stufe (b) ein mineralisches Adsorbens, besonders vorteilhaft Silikate, z.B.
Kaolin oder das im Handel erhältliche mit Pharmasorb Regular bezeichnete Attapulgit, in einer Menge von 0,3 bis 1, vorzugsweise 0,7o (g:v), bei einer Leitfähigkeit von 5,0 x 102 bis 1,0 x 104 po, vorzugsweise bei 6,0 x 103 FSa bei pH-Wert 4,5 bis 6,5, vorzugsweise bei pH 5,5, zugesetzt und 30 Minuten bis 3 Stunden einwirken gelassen.
Nach Abtrennung des Adsorbens durch Zentrifugation oder Filtration wird dem Abguss ein wasserlösliches Calciumsalz und ein wasserlösliches Phosphat zugesetzt, wobei das Calciumsalz gegenüber dem Phosphat im Uberschuss, vorzugsweise in etwa dreifach molarem Uberschuss, vorliegen soll. Vorteilhaft wird sekundäres Natriumphosphat und Calciumacetat verwendet. Die Konzentration des Calciumsalzes soll etwa 0,025 bis 0,1 molar, vorteilhaft 0,07 molar, sein. Der pH-Wert wird anschliessend auf 5,8 bis 8,5, vorzugsweise auf 7,9, eingestellt, wobei das sich bildende Calciumphosphat das IgM adsorbiert.
Die IgM-haltige adsorbierte Fraktion wird nach Abtrennung des Calciumphosphats durch Zentrifugation oder Filtration durch Behandlung mit dem 5- bis 10-fachen Volumen einer auf pH 4,0 bis 8,0, vorzugsweise auf pH 5,0, eingestellten wässrigen Salzlösung, vorteilhaft einer Kochsalzlösung, deren Konzentration 0,8 bis 4% beträgt, oder einer Aminosäurelösung, vorteilhaft einer Glyzinlösung, deren Konzentration 1 bis 8% beträgt, oder einer wässrigen Lösung eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, vorteilhaft mit Alkalisalzen der Äthylen-Diamin-Tetraessigsäure in einer Konzentration von 2 bis 7%, vorzugsweise 4,59S, oder einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure und Komplexbildner eluiert.
Aus dem IgM-haltigen Eluat wird das IgM nach Einstellung des pH-Wertes auf pH 5,0 bis 8,0, vorzugsweise pH 7, durch Zugabe eines kurzkettigen primären Alkohols, vorteilhaft durch Zugabe von Äthanol, bis zu einer Konzentration von etwa 20 bis 25%, ausgefällt.
Die durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennte Fällung der Stufe (e) wird in einer möglichst. geringen Menge liner Verdünnten wässrigen Salzlösung, vorzugsweise einer 0,, bis 0,75%igen Natriumchleridlösung, wieder aufgelöst, der pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 eingestellt, die Leitfähigkeit durch Zugabe eines Salzes, vorzugsweise Kochsalz, auf etwas über 1 x 104 p'S eingestellt. Sodann werden die Verunreinigungen der mit IgM angereicherten Fraktion durch Zusatz von 0,1 bis 0,3% eines Al(CH)3-Gels (berechnet als Al2O3) adsorbiert und damit nach Abtrennen des Adsorbens eine IgM-haltige Lösung guter Ausbeute verhalten.
Aus dem überstand der Calciumphosphat-Adsorption der Stufe (d) wen das IgG und das IgA mit einem kur7kettigen primären Alkohol, vorteilhaft Äthanol, bei einer Konzentration von 20 bis 40%, vorzugsweise .25%, bei pH 6,5 bis 8,0, vorzugsweise 6,8, bei 0 bis -100C, vorzugsweise -5°C, ausgefällt.
Die. Trennung von IgG und IgA nach Auflösung der erhaltenen Äthanolfällung in Wasser oder einer verdünnten Salzlösung in solcher Menge, dass die Eiweisakonzentration der Lösung etwa 1% beträgt, geschieht bei pH 4,5 bis 5,5, vorzugsweise pH 5,0 und einer Leitfähigkeit von etwas über 1 x 104 durch Zusatz von 0,05 bis 0,2, vorzugsweise 0,1% eines Al(OH)3-Gels (berechnet als Al203). IgA wird unter diesen Bedingungen adsorbiert, während IgG im Uberstand verbleibt.
Das im Adsorbat enthaltene IgA wird nach Abtrennung in an sich bekannter Weise,vorteilhaft mit einer 1/3 M sekundären Natriumphosphatlö sung, desorbiert, IgA und IgG können auch auf bekannte Weise durch Fällungsverfahren, chromatographisch oder durch Zonenelektrophorese voneinander getrennt werden.
Wenn dies gewünscht und erforderlich erscheint, können die in Stufe (g) durch Alkoholfällung erhaltenen Pasten der Immunglobuline IgA und IgG durch Lyophilisation vom Alkohol befreit werden. Die Befreiung der Immunglobuline vom Fällungsmittel kann auch durch Gelfiltration oder Dialyse der Immunglobulinlösung erfolgen.
Den Endprodukten kann gewünschtenfalls ein bakteriostatisches Agens zugesetzt werden. IgA und IgG können in gefriergetrocknetem Zustand aufbewahrt und in der für Immunglobuline bekannten Weise, beispielsweise in 0,3%iger Kochsalzlösung oder in 2,2596 iger Glyzin-Lösung wieder aufgelöst werden.
Die Reinheit und Ausbeute der Immunglobuline wird mit der radialen Immundiffusionstechnik nach Becker, Rapp, Schwick und Störiko, Z. Klin. Chem. 6, 113 (1968) bestimmt.
Die erfindungsgemäss hergestellten IgM-, IgA- und IgG-Präparationen sind nach Kriterien der Elektrophorese 95% reine Immunglobuline.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird eine native IgM-Präparation in einer Reinheit erhalten, die bis zu 70% aus IgM und einem Restgehalt von überwiegend IgG und geringen Mengen IgA besteht. Die Ausbeute beträgt bis zu 30% des ursprünglichen Plasmagehalts an IgM. Wegen der hohen Viskosität der verfabrensgemäss erhaltenen TgM-Lösungen empfiehlt sich vor der weiteren Verwendung eine Verdünnung mit einer wässrigen Lösung eines Plasmaproteins, vorzugsweise einer IgG-haltigen Immunglobulinlösung, auf einen Gehalt von etwa * Die vor dem letzten Trennungsschritt (Enae der Stufe (g)) erhaltene Mischung von IgG und IgA setzt sich aus etwa 85% IgG und 15°/ IgA zusammen. Dabei wird IgA in einer Ausbeute von' 60%, IgG in einer Ausbeute von 90% -- bezogen auf die im Ausgangsplasma enthaltenen Immunglobulinmengen -wiedergewonnen.
Die erfindungsgemässe Auftrennung von IgG und IgA liefert Konzentrate, die einerseits ca. 40-50% IgA mit dem Restgehalt an IgG, andererseits ein praktisch reines IgG enthalten. Die Auftrennung von IgG und IgA nach beksnnten Verfahren zur Gewinnung von IgA beispielsweise durch die wesentlich aufwendigere Zonenelektrophorese liefert keine weitergehende Auftrennungals das erfindungsgemässe Verfahren.
Diese Verfahrensendprodukte fallen frei von Pyrogen und bei der Verwendung von Austalia-Antigen-haltigem Plasma auch frei von in der Überwanderungselektrophorese nachweisbarem Australia-Antigen an.
Neben den aufgezeigten Grundzügen des Verfahrens steht es dem Fachmann frei, verschiedene Variationen einzuführen.
Insbesondere ist es nicht unbedingt erforderlich, die erfindungsgemäss zu gewinnenden IgA, IgM und IgG alle nach dem vorliegenden Verfahren herzustellen. Es kann beispielsweise nur .IgM nach diesem Verfahren isoliert werden, die Auftrennung der übrigen Immunglobuline könnte jedoch nach anderen Methoden erfolgen, insbesondere wenn man bereit ist, im Interesse einer vereinfachten Aufarbeitung Ausbeuteverluste in Kauf zu nehmen. Für die Gewinnung cs IgM in guter *20% IgM bezogen auf den Gesamtproteingehalt Ausbeute lässt sich beispielsweise statt der vorgeschlagenen Adsorption der Verunreinigungen mittels Al (OH)3-Gel auch eine im gleichen Milieu durchzuführende Fällung mit einem niedrigen Alkohol, vorteilhaft Äthanol, in einer Konzentration von. 10-204, vorteilhaft von 15%, bei 0 bis -10°C, vorteilhäft bei -5 0C anwenden.
Die selektive Desorption kann einerseits durch Erhöhung der Leitfähigkeit der Elutionslösung, andererseits durch partielle Komplexbildung der Elutionslösung mit dem Adsorbens, oder aber durch sinnvolle Verknüpfung beider Maßnahmen erfolgen.
Die vorliegende Erfindung verwendet mit Vorteil ungiftige bzw. physiologisch gut verträgliche Agenzien. So wii Äthanol vorteilhaft gegenüber Methanol verwendet, da letzteres bekanntlich giftig ist. Doch lassen sich die Anreicherungsfällungen sowohl mit Äthanol wie mit Methanol oder mit Isopropanol durchführen. Da Kochsalz als Bestandteil von Infusionslösungen seit Jahrzehnten verwendet wird, wird Natriumchlorid bevorzugt zur Erhöhung der Leitfähigkeit der Lösungen verwendet. Dem Fachmann steht es Jedoch frei, zu diesem Zweck ein anderes wasserlösliches Salz auszuzählen.
Als Ausgangsmaterial dient vorteilhaft frisch gewonnenes, mit Zitronensäure und Glucose (ACD) oder mit Zitronensäure, Glucose und Phosphat (CPD) stabilisiertes menschliches Plasma, das die Immunglobuline in einer normalen Verteilung enthält.
Es kann jedoch auch Immunplasma verwendet werden, d.h. Plasma von Spendern, denen zur Erzielung hoher Antikörpertiter bestimmte Antigene verabreicht worden waren. Neben frischem Plasma kann auch eingefrorenes Plasma verwendet werden. Durch den besonderen Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens, dass dIe Endprodukte' frei von Pyrogenen gewonnen-werden, kann als Ausgangsmaterial auch bereits mikrobiell kontaminiertes, überaltertes Plasma eingesetzt werden. Antibakterielle Zusätze sind beim Aufarbeitungsgang nicht erforderlich. Wenn vor Anwendung des Verfahrens geeignete Milieubedingungen geschaffen werden, können auch andersartig gewonnene, rone Immunglobulinkonzentrate dem Verfahren unterworfen werden. Serum ist als Ausgangsmaterial verwendbar, wenn beispielsweise durch Salzzusatz eine einem Plasma entsprechende Isotonie hergestellt wird. Bedingt durch einen weiteren Vorzug des erfindungsgemässen Verfahrens, dass die Endprodukte in der Uberwanderungselektrophorese zum Nachweis von Australia-Antigen negativ sind, könnte auch Australia-Antige Ausgangsplasrna in das Verfahren eingesetzt werden.
Die Endprodukte des Verfahrens sind für die klinische Applikation an menschen als spezifische Immanprophylaktika und -therapeutika sehr gut geeignet. Im besonderen werden die Präparate beisielsweise zur prophylaktischen Substitution bei Fchlen oder Verminderung von IgM oder IgM + IgG oder IgA einschlicßlich transitorischem Antikömpermangelsyndrom bei Frühgeborenen und jungen Säuglingen, bei gebäuften Infektionen speziell durch grammegative Erreger, IgA insbesondere bei einigen Lungenerkrankungen, bei denen eine Verminderung des IgA-Spiegels beobachtet wurde, ferner zur Therapie bei schweren bakteriellen E rkrankungen, die durch gramnegative Erreger wie E. coli, Pseudomonas aeruginosa, H. influenzae und pertussis, B. proteus, Klebsiellen, Salmonellen und Shigellen hervorgerufen werden, eingesetzt.
Zur Prophylaxe wird häufig die Verabreichung von 4 - 8 mg der Immunglobuline IgA.und IgM und >32 mg IgG pro kg Körpergewicht empfohlen. Dabei sollte die Applikation mit der gleichen Dosis nach 10 - 14 Tagen, danach in Abständen von jeweils 4 Wochen wiederholt werden.
Zur Therapie werden Je nach dem klinischen Bild vorteilhaft 10 - 20 mg der Immunglobuline IgA und IgM und >80 mg IgG pro kg Körpergewicht verabreicht. Die Wiederholung der InJektion im Abstand von jeweils 1 Woche bis zum klinisch sichtbaren Erfolg, d.h. bis zur Überwindung der Infektion, wird angeraten.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäß gewonnenen Immunglobuo line intramuskulär verabreicht. Sie werden auch nach wiederholter Anwendung gut ertragen.
Das beanspruchte Verfahren liefert die Immunglobuline frei von Australia-Antigen, das in der Überwanderungselektrophorese nachgewiesen werden könnte. Da ein Australia-Antiger.-freies Präparat auch/frei von Hepatitisvirus angesehen werden kann, ist hierin ein wesentlicher Fortschritt in der Immunglobulin-Therapie zu sehen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der Produkte gemäss der erfindung liegt im Bereich der klinischen Diagnostik, Die Substanzen eignen sich besonders als Standardpräparate bei der Bestimmung der Immunglobuline IgA, IgG und IgM. Die Immunglobuline sind zur Herstellung von gegen sie gerichteten Anti.seren verwendbar, die zum Nachweis und zur Bestimmung der Immunglobuline in der Diagnostik eingesetzt werden können.
Die Erfindung wird durch das nachfolgend aufgeführte Beispiel erläutert.
Beispiel 20 l menschliches Mischplasma von pH-Wert 7,6 werden bei mit mit 1,82 1 Äthanol (96%ig) versetzt und zur Abtrennung des ausgefällten Fibrinogens bei 200 zentrifugiert.
Der Überstand wird erneut mit 5,15 1 Äthanol (96%ig) bei -5°C versetzt und der Niederschlag bei -5°C in einer Zentrifuge abgetrennt.
Die als Rückstand erhaltene Paste wird in 18 1 einer 1%igen wässrigen Glycin-Lösung aufgenommen und nach Einstellung der Leitfähigkeit auf 1 x 10S luS mit gesättigter Kochsalzlösung durch Zugabe von 86 ml l n HCl auf pH 5,1 eingestellt. Das danach auftretende Präzipitat wird abzentrifugiert.
Der Überstand wird mit gesättigter Kochsalzlösung auf eine Leitfähigkeit von 6,0 x 10³ µS gebracht und mit 131 g Pharmasorb (Chemie-Mineralien-0Bremen) versetzt. Der pH-Wert wird mit 1 n HCl auf pH 5,5 nachreguliert und das Adsorbens abfiltriert.
Zu dem 22 1 betragenden Filtrat werden 1640 ml 1 molarer Calcium-Acetat-Lösung und 1640 ml 1/3 molarer Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung unter Rühren zugegeben. Der pH-Wert wird mit 2 n NaOH auf pH 7,9 eingestellt und das ganze sodann 12 Stunden sich selbst überlassen. Danach wird das Adsorbens durch Zentrifugation gewonnen. Der Uberstand enthält IgG und IgA. Seine Aufarbeitung wird weiter unten beschrieben.
Der erhaltene Calciumphosphat-Niederschlag wird in 3,7 1 einer 0,85%igen Kochsalzlösung suspendiert und bis zu einer Endkonzentration von 4,5% mit Äthylen-Diamin-Tetraessigsäure-di-Natrium-Salz versetzt. Mit 2 n Natronlauge wird der pH-Wert auf 5,0 gehalten. Die Temperatur beträgt +50C. Nach 24 Stunden wird der verbleibende Calciumphosphat-Rückstand abzentrifugiert und verworfen.
Der Uberstand wird auf -5 CC abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von 2 n NaOH und 2% Äthylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz auf 7,0 eingestellt. Die so erhaltene klare Lösung (4,15 l) wird mit 1460 ml Äthanol (96%ig), entsprechend 25% versetzt und 2 Stunden stehengelassen.
Sodann wird der Niederschlag durch Zentrifugation gewonnen und in einer wässrigen Lösung von0,3% Kochsalz und 1% Glycin aufgelöst, wobei soviel der wässrigen Lösung genommen wird, dass der Eiweissgehalt 1% beträgt. Die Leitfähigkeit wird durch Verdünnen auf 1,5 x 104 µS und der pH-Wert 4,8 gebracht. Bei 5°C wird sodann 146 ml entsprechend 10% (v:v) einer Suspension eines Al(OH)3-Gels (Gehalt: 2%ig berechnet als A1203) hinzugefügt. Nach 1 Stunde wird das Al(QH)3 durch Zentrifugation von der IgM-Lösung abgetrennt. Die erhaltene Lösung kann vor ihrer Verwendung nach üblichen Verfahren dialysiert und/oder beispielsweise mittels eines Ultrafilters auf einen Eiweissgehalt von 10% konzentriert werden. Für die parenterale Applikation wird das IgM-Konzentrat auf einen Gehalt von 20,' IgM und 80% IgG eingestellt und nach Ergänzung des Salzgehaltes auf 0,3,' NaCl (g:v) und 2,25% Glycin (g:v) keimfrei filtriert.
Eine besonders vorteilhafte Verfahrensvariante für die Gewinnung von reinem IgM laßt sich im letzten Schritt der Gewinnung dieses Proteins einfügen, ii%jdem statt der Adsorption der Verunreinigungen mittels Al(OH)3 eine abormalige Fällung mit i\thanol durchgeführt wird. Hierzu wird statt der Zugabe des Al(Oll)3 zu der auf 1% Protein eingestellten Lösung bei pH 7,0 und einer Leitfähigkeit von etwas über 1 x 104 ElS Äthanol bis zu einer Konzentration von 15% bei -einer Temperatur von -5°C zugesetzt. Der dabei auftretende Niederschlag enthält IgM in hoher Reinheit und kann wie oben ausgeführt weiterverarbeitet werden.
Die Immunglobuline IgG und IgA werden aus dem Überstand der Calciumphosphat-Adsorption, dessen Volumen 25- 1 beträgt, nach Einstellung des pH-Wertes mit 1 n HCl auf 6,8 durch Zugabe von 9000 ml Äthanol (96%ig) bei -50C ausgefällt. Die durch Zentrifugation gewonnene Paste wird durch Gefriertrocknung vom Fällungsmittel befreit. Wenn dies gewünscht oder erforderlich ist, können die hier nebeneinander vorliegenden Immunglobuline IgA und XgG nach Auslösung in geeigneten Lösungsmitteln und einer keimfreien Filtration ohne weitere Aufarbeitung als Therapeutikum oder Prophylaktikum angewandt werden.
.gA und IgG können aber auch getrennt werden vorteilhaft durch spezifische Adsorption und Desorption des IgA von dem in Lösung verbleibenden IgG. Hierzu werden 360 g der durch Zentrifugation gewonnenen, noch alkoholfeuchten Paste mit 14 1 einer 0,3%igen Kochsalzlösung bei +50C aufgelöst. Der Eiweissgehalt beträgt 1, der pH-Wert wird durch Zugabe von 30 ml 1 n HCl auf pH 5 eingestellt und die Leitfähigkeit durch Zusatz von 345 ml einer gesättigten Kochsalzlösung auf 1,5 x 104 µS eingestellt. Den so erhaltenen 14,4 1 der Lösung, die IgA und IgG enthält, werden unter Rühren bei 5 0C 720 ml eines 2%igen Al(OH)3-Gels zugesetzt und die Suspension 1 Stunde gerührt. Danach wird bei 50C das Al (CH)3-Absorbens abzentrifugiert.
Zur Resorption der IgA-angereicherten Fraktion vom Al(OH)3-Adsorbens wird der Al(OH)3-Niederschlag bei Zimmertemperatur zweimal mit 1,8 1 einer 1/3 M Lösung von sekundärem Natriumphosphat jeweils 1 Stunde lang gerührt und anschliessend zur Gewinnung der Überstände zentrifugiert. Die vereinigten Überstände (3600 ml) werden bei-5°C mit 1640 ml Äthanol versetzt.
Dabei wird die IgA-angereicherte Fraktion im Niederschlag gewonnen. Nach Abtrennen des Niederschlags und dessen Wiederauflösen in destilliertem Wasser lässt sich das Protein nach bekannten Methoden entsalzen und beispielsweise mit Hilfe eines Ultrafilters konzentrieren. Statt Äthanol lässt sich für die Präzipitation beispielsweise auch eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung einsetzen, die bei den oben gezeigten Volumenverhältnissen nach Zusatz von 1940 ml die IgA-haltige Proteinfraktion optimal zu präzipitieren vermag. In beiden Fällen beträgt der Anteil des IgA etwa 43%, der des IgG etwa 57,' der vorhandenen Proteinmenge.
Für die Gewinnung des IgG aus dem Überstand der Al(OH)3-Adsorption, von dem bei der Zentrifugation 44,6 l gewonnen wurden, wird vorteilhaft eine Präzipitation mit Äthanol vorgenommen. Dazu wird die IgG-Lösung unter Rühren mit 2 n Natronlauge bis zu einem pH-Wert von 6,8 versetzt und anschliessend auf OOC abgekühlt. Während einer weiteren Abkühlung der Lösung auf -5 0C werden 5200 ml 96%igen Äthanols unter Rühren zugegeben. Die sich ausbildende Fällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt ist weitgehend reines IgG.
Ähnlich gute Ergebnisse werden erhalten, wenn IgA und IgG durch Zonenelektrophorese und Fällung mit ZnS04 entsprechend Progr. immunobiol. Standard Vol. 4 pp 86-91 (Karger, Basel/ Miinchen/New York 1970) voneinander getrennt und spezifischen Erfordernissen der Therapie entsprechend gesondert eingesetzt werden.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung bzw. Anreicherung der Immunglobuline IgG, IgA und IgM aus Serum oder Plasma, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus Serum oder defribriniertem Plasma mit einem kurzkettigen primären Alkohol eine rohe Immunglobulinfraktion ausfällt, b) die Fällung der Stufe (a) in wässrige Lösung brIngt und daraus die Euglobuline durch Einstellen einer niedrigen Leitfähigkeit und eines schwach sauren pH-Wertes ausfällt, c) aus dem Uberstand der Stufe (b) durch Adsorption an ein mineralisches Adsorbens die proteolytischen Fermente abtrennt, d) im Uberstand der Stufe (c)den überwiegenden Teil des IgM neben anderen Proteinen an ein schwerlösliches Phosphat adsorbiert und das Adsorbat abtrennt, aus dem Adsorbat der Stufe (d) eine IgM-haltige Fraktion - Besorbiert und das IgM durch Fällung mit einem kurzkettigen primären Alkohol anreichert, f) die Fällung der Stufe (e) in wässrige Lösung bringt, zur Beseitigung von Verunreinigugen mit Aluminiumhydroxyd versetzt und dieses wieder abtrennt, g) aus dem durch Adsorption von IgM befreiten überstand - der Stufe (d) das IgG und IgA mit einem kurzkettigen primären Alkohol ausfällt und h) gewünschtenfalls zur Trennung von IgG und IgA das IgA selektiv an Aluminiumhydroxyd adsorbiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abscheidung der rohen Immunglobulinfraktion mittels Äthanol In Stufe (a) bei einer Konzentration zwischen 18 und 35% in einem pH-Bereich von 5,6 bis 8,5 bei einer Temperatur von O bis -10°C erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe (b) die Euglobuline der wässrigen Lösung der Immunglobulinfraktion bei einer Leitfähigkeit von 5,0 x 10² bis 8,0 x 10³ pS durch Ansäuren auf pH 4,5 bis 6 im Temperaturbereich von O b +20°C ausgefällt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im euglobulinfreien Uberstand der Stufe (b) ein mineralisches Adsorbens in einer Menge von 0,3 bis 1% (g:v), bei einer Leitfähigkeit von 5,0 x 102 bis 1,0 x 104 US, bei pH-Wert 4,5 bis 6,5,zugesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe (c) ein in situ hergestelltes Calciumphosphat verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des Calciumphosphats ein wasserlösliches Calciumsalz und ein wasserlösliches Phosphat der IgM-haltigen Eiweisslösung zugesetzt werden, wobei das Calciumsalz in etwa dreifach molarem Überschuss vorliegt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sekundäres Natriumphosphat und Calciumacetat verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Calciumsalzes 0,025 bis 0,1 molar, vorteilhaft 0,07 molar, ist und dass der pH-Wert auf 5,8 bis 8,5 eingestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorba1t der Stufe (d) nach Abtrennung des Calciumphosphats durch Behandlung mit dem5- bis ?fachen Volumen einer auf pH 4,0 bis 8,0 eingestellten wässrigen Salzlösung, deren Konzentration 0,8-bis 4% beträgt, oder einer Aminosäurelösung, deren Konzentration 1 bis 8% beträgt, oder eincr wässrigen Lösung eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, in einer Konzentration von 2 bis 7%, oder einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure und Komplexbildner eluiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das IgM aus dem IgM-haltigen Eluat nach Einstellung des pH-Wertes auf pH 6,5 bis 7,5 durch Zugabe eines niedrigen Alkohols, bis zu einer Konzentration von etwa 20 bis 25%, ausgefällt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällung der Stufe (e) durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt, in einer wässrigen Salzlösung wieder aufgelöst, der pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 eingestellt, die Leitfähigkeit durch 4 Zugabe eines Salzes auf etwa über 1 x 104 pS eingestellt wird und die Verunreinigungen der mit IgM angereicherten Fraktion durch Zusatz von 0,1 bis 0,3% eines Al(OH)3-Gels (berechnet als A1203) abgetrennt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Uberstand der Stufe (d) IgG und IgA mit einem niedrigen Alkohol bei einer Konzentration von 20 bis 40%, bei pH 6,5 bis 8,0 bei O bis -100C,äusgefällt werden.

*) 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällung der Stufe (g) bis zu einer Eiweisskonzentration von etwa 1'2b aufgelöst wird, dass z dieser Lösung bei pH 4,5 bis 5,5, einer Leitfähigkeit von etwas huber 1 x 104 µS 0,05 bis 0,2% eines Al(OH)3-Gels (berechnet als Al2O3) zugesetzt und dass das IgA nach Abtrennung des Adsorbens mit einer etwa 1/3 M sekundären Natriumphosphatlösung desorbiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution des IgM von Calciumphosphat mit einer 4,5%igen Lösung von Äthylen-Diamin-Tetraessigsäure-di-Natrium bei pH 5,0 durchgeführt wird.

15. Immunglobuline IgA, igM und IgG hergestellt nach Verfahren gemäss Ansprüchen 1 - 14.

16. Verwendung von Immunglobulinen IgA, IgM und. IgG hergestellt nach Ansprüchen 1 - 14 als Prophylaktikum und Therapeutikum.

17. Immunglobulinpräparate enthaltend IgA hergestellt nach Anspr-üchen : - 14.

18. Immunglobulinpräparate enthaltend IgM hergestellt nach Ansprüchen 1 - 14.

19. Immunglobulinpräparate enthaltend IgG hergestellt nach Ansprüchen 1 - 14.

*) IgG und IgA enthaltende 20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als mineralisches Adsorbens in Stufe (b) Kamin oder Atapulgit verwendet wird.

21. Verwendung von Immunglobulinen IgA, IgM und IgG,hergestellt nach Ansprüchen 1 - 14, als diagnostische Reagenzien.