DE69433875T2

DE69433875T2 - Verfahren zur präparation von humanem aktiviertem protein c

Info

Publication number: DE69433875T2
Application number: DE69433875T
Authority: DE
Inventors: Yoichi Kumamoto-shi OGATA; Toshinobu Kumamoto-shi NOUCHI; Shinji Kumamoto-shi NAKAHIRA
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Teijin Ltd
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Teijin Ltd
Priority date: 1993-10-29
Filing date: 1994-10-27
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2014-10-28
Also published as: CN1123639C; AU8003294A; CA2175201C; CA2175201A1; JPH07115972A; US5831025A; JP3043558B2; KR100383063B1; EP0726311B1; KR960705921A; ATE270327T1; DE69433875D1; AU680563B2; CN1138349A; EP0726311A1; WO1995011966A1; ES2224109T3; EP0726311A4

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von humanem aktiviertem Protein C mit einer hohen spezifischen Aktivität, das durch Aktivierung von humanem Protein C durch Thrombin erzeugt wird, wobei Protein C von Plasma abgeleitet ist oder durch das genetische Rekombinationsverfahren erzeugt wird.
Technischer Hintergrund
Protein C (nachfolgend als „PC" bezeichnet) ist eine Art eines Vitamin-K-abhängigen Proteins, das in der Leber synthetisiert wird. Es ist ein Enzymvorläufer mit einem Molekulargewicht von 62 000 bestehend aus zwei Ketten, d. h. einer L-Kette (Molekulargewicht 21 000) und einer H-Kette (Molekulargewicht 41000). Protein C wird durch einen Thrombin-Thrombomodulin-Komplex teilweise in vivo abgebaut, wobei an Thrombomodulin gebundenes Thrombin auf der Membranoberfläche vaskulärer endothelialer Zellen vorkommt und wodurch ein Peptid, das 12 Aminosäuren umfasst, vom Aminoterminus der H-Kette zur Bildung von aktiviertem Protein C (hier als „APC" abgekürzt) freigesetzt wird. APC ist eine Serinprotease, die eine starke anti-koagulierende Aktivität durch spezifische Degradation und Inaktivierung der Blutkoagulationsfaktoren V und VIII (hauptsächlich die aktivierte Form Va, VIIIa) aufweist und die Freisetzung von Plasminogen-Aktivator aus der vaskulären Zellwand zur Beschleunigung des fibrinolytischen Systems fördert. Demgemäß erwartet man, dass APC als therapeutisches Agens verwendet werden kann.
APC ist aus dem Stand der Technik bekannt und umfasst jene APCs; die durch In-vitro Aktivierung von Protein C mit dem Thrombin oder Thrombin-Thrombomodulin-Komplex erhalten wird, das Protein C, das aus Plasma abgeleitet ist oder anhand genetischer Rekombinationsverfahren erzeugt wurde (Blood, 63, Seiten 115–121 (1984); J. Clin. Invest., 64, Seiten 761–769 (1979); J. Clin. Invest., 79, Seiten 918–925 (1987)); oder jene, die direkt durch genetische Rekombinationsverfahren als APC exprimiert werden (Japanisches Patent Erste Publikation (Kokai) Nr. 61-205487, Japanisches Patent Erste Publikation (Kokai) Nr. 1-2338 und Japanisches Patent Erste Publikation (Kokai) Nr. 1-85084) und ähnliche.
Bei der Präparation von APC, insbesondere in Fällen, in denen Protein C aus Plasma fraktioniert und dann aktiviert wird, um das gewünschte Protein zu erzeugen, gibt es verschiedene Probleme, die überwunden werden müssen, um kontaminierende Proteine, die physiko-chemische Eigenschaften aufweisen, die denen von APC stark ähneln, effizient zu entfernen, um hoch aufgereinigtes APC zu erhalten, so dass ein APC mit einer gewünschten hohen spezifischen Aktivität erhalten wird. Es verbleiben zum Beispiel immer noch eine Reihe von Problemen, die hinsichtlich der wirksamen Aktivierung von Protein C zu APC, der nachfolgenden Entfernung eines aktivierenden Agens und der Aufreinigung von APC gelöst werden müssen.
Bekannte Verfahren zur Aktivierung von Protein C umfassen zum Beispiel Aktivierung mit Trypsin, RVV-X, Thrombin, Thrombin-Thrombomodulin, Aktivierung mit Gel, wobei RVV-X an Zepharose immobilisiert ist, Aktivierung mit Gel, wobei ein Thrombin-Thrombomodulin-Komplex immobilisiert ist und ähnliche (J. Biol. Chem., 251, 3052–3056 (1976); Biochemistry, 15, 4893–4900 (1976); Biochemistry, 16, 5824–5831 (1977); J. Clin. Invest., 64, 761–769 (1977); Biochem. Biophys. Res. Commun., 94, 340–347 (1980); J. Clin. Invest., 77, 416–425 (1986)):
WO 91/12320 offenbart ein Verfahren zur Aktivierung von Plasma Protein C oder rekombinantem Protein C durch Thrombin, wodurch ein Protein entsteht, das im Wesentlichen die Aktivität von humanem aktiviertem Protein C aufweist. Protein C wird aus den Zellen durch Ultrafiltration von Protein-C-enthaltenden Medien isoliert, durch Immunaffinitätschromatografie aufgereinigt und mit einem Chelat-bildenden Agens eluiert.
WO 89/12685 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem humanem Protein C, wobei Protein C durch In-Kontakt-bringen von Protein C mit Thrombin, das an Zepharosekügelchen gebunden ist in niedriger Salzkonzentration aktiviert wird.
Die hier vorstehend genannten Verfahren sind jedoch, im Hinblick auf die Herstellung von APC im industriellen Ausmaß, nicht zufriedenstellend. Zur Aktivierung einer großen Menge von Protein C, ist es bevorzugt, Protein C bei einer hohen Konzentration mit einer kleinen Menge aktivierendem Agens zu aktivieren. Die vorstehend genannten Verfahren erfüllen auch diese Anforderung nicht.
Im Hinblick auf die Aufreinigung von aktiviertem Protein C nach Aktivierung von Protein C kennt man ein Verfahren, wobei APC in einer Eluatfraktion durch SP-Sephadex-Chromatografie entwickelt wird, und wobei Thrombin, das während der Aktivierung von Protein C hinzugegeben wird, adsorbiert und entfernt wird (Biochemistry, 16, 5824–5831 (1977); J. Clin. Invest., 64, 761–769 (1979); J. Biol. Chem., 251, 3052–3056 (1976); Biochemistry, 20, 2156–2161 (1981)). Es ist jedoch schwierig, Thrombin, das während der Aktivierung von Protein C zugegeben wurde, mit einem Kationenaustauscher auf einen klinisch anwendbaren Spiegel zu entfernen. Tatsächlich muss nach der Kationenaustauscherbehandlung die Konzentration von APC angereichert werden und somit ist, während der Konzentration von APC, die Autolyse von APC unvermeidbar. Deshalb wurde gegenwärtig eine APC-Zubereitung mit einem hohen Reinheitsgrad und einer hohen biologischen Aktivität ohne Kontaminierung durch verschiedene Proteine noch nicht erhalten.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, um die vorstehend genannten Probleme zu lösen. Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass Protein C mit einer kleinen Menge von Thrombin effektiv aktiviert werden kann, wobei Protein C in einer hohen Konzentration verwendet wird; dass eine humane aktivierte Protein-C-Zubereitung, die im Wesentlichen kein Thrombin und/oder Protein C enthält, das nicht aktiviert wurde, durch In-Kontakt-bringen mit einer Lösung erhalten werden kann, wobei die Lösung aktiviertes Protein C nach Aktivierung mit einem Kationenaustauscher enthält, so dass Thrombin oder eine äquivalente Protease und aktiviertes Protein C an den Austauscher adsorbiert werden, und wobei nachfolgend aktiviertes Protein C alleine bei einer geeigneten Salzkonzentration eluiert wird, wobei überraschenderweise die auf diese Weise hergestellte Präparation von humanem aktiviertem Protein C eine extrem höhere spezifische Aktivität aufweist, als humanes aktiviertes Protein C, das nach herkömmlichen Verfahren erhalten wurde, und somit wurde die vorliegende Erfindung vollständig ausgeführt. Das heißt, ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung einer humanen aktivierten Protein-C-Zubereitung mit einer hohen spezifischen Aktivität herzustellen, die im Wesentlichen frei von Thrombin oder einer äquivalenten Protease und/oder Protein C ist, das keiner Aktivierung unterzogen wurde.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE-Analyse der erfindungsgemäßen Präparation und einer herkömmlichen Präparation.
Beste Ausführungsart der Erfindung
Die erfindungsgemäße Zubereitung von humanem aktiviertem Protein C zeigt eine spezifische Aktivität von 3 500 Einheiten/mg oder mehr, wobei die Einheit spezifischer Aktivität definiert ist als Menge, die die aktivierte Thromboplastin-Zeit (APTT) von normalem humanem Plasma zweifach verlängert, und im Wesentlichen frei von Thrombin oder einer äquivalenten Protease und/oder Protein C ist, das keiner Aktivierung unterzogen wurde. Gemäß dem Verfahren zur Herstellung der Zubereitung der vorliegenden Erfindung wird nach Aktivierung des humanen Protein C mit Thrombin eine Lösung, die humanes aktiviertes Protein C enthält, mit einem Kationenaustauscher unter Bedingungen von pH 5,0 bis 6,0, einer NaCl-Konzentration von 80 mmol oder weniger in Kontakt gebracht, um die Adsorption von Thrombin und aktiviertem Protein C an den Austauscher zu ermöglichen, und dann wird humanes aktiviertes Protein C alleine unter den Bedingungen einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,35 M eluiert, um ausschließlich eine hoch aufgereinigte humane aktivierte Protein-C-Präparation zu gewinnen.
Zur Aktivierung von Protein C in der vorstehend genannten Lösung, die Protein C und Thrombin enthält, wird Thrombin zu einer Lösung, die Protein C enthält in einer Konzentration von 0,5 bis 8,0 mg/ml bei einem Thrombin/Protein C-Verhältnis von 1 bis 20 Einheiten/mg, zugegeben und die Aktivierung wird unter einer pH-Bedingung von 6,0 bis 8,0 zur wirksamen Aktivierung einer großen Menge von Protein C durchgeführt. Nachfolgend werden Verfahren zur Entfernung des aktivierenden Agens und zur Aufreinigung von APC durchgeführt, wobei eine Lösung, die APC nach der Aktivierung enthält, mit einem Kationenaustauscher bei pH 5,0 bis 6,0, NaCl-Konzentration von 80 mmol oder weniger in Kontakt gebracht wird, um die Adsorption sowohl von Thrombin als auch von APC an den Austauscher zu ermöglichen und dann wird aktiviertes Protein C alleine bei einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,35 M vom Austauscher eluiert.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Aktivierung von humanem Protein C ist es möglich, Protein C in einer hohen Konzentration mit einer kleinen Menge von Thrombin wirksam zu aktivieren. Dies ist vorteilhaft, insofern, dass der Abbau von Protein C während der Aktivierung vermindert wird, und dass die nachfolgende Entfernung von Thrombin leichter wird. Das nachfolgende Verfahren zur Aufreinigung von APC stellt eine Thrombinkonzentration im Eluat von 0,001 Einheiten/ml oder weniger bereit, und somit kann APC quantitativ rückgewonnen werden. Weiterhin kann konzentriertes APC gewonnen werden, da APC nach dessen Adsorption eluiert wird. Zusätzlich hat die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnene APC-Zubereitung eine extrem höhere spezifische Aktivität, als jene Zubereitungen, die durch herkömmliche Verfahren gewonnen werden.
Der hier verwendete Begriff „spezifische Aktivität" der humanen aktivierten Protein-C-Präparation bezeichnet ein Verhältnis der APC-Aktivität gegenüber der Gesamtmenge an Protein (mg). Eine Einheit von APC-Aktivität wird definiert als Menge, die eine aktivierte Thromboplastin-Zeit (APTT) von normalem humanem Plasma zweifach verlängert. Daher wird die tatsächliche Messung der APC-Aktivität wie folgt durchgeführt: die APTT (Sekunden) wird für humanes normales Plasma gemessen, zu dem eine verdünnte Probe hinzugegeben wird, und die Verdünnung bei der der gemessene APTT-Wert zweimal so hoch ist, wie der der Kontrolle (Puffer), wird als Aktivität von APC der Probe bestimmt.
Der Hauptbestandteil der erfindungsgemäßen Präparation, APC, und das Ausgangsmaterial des Prozesses zur Präparation der vorliegenden Erfindung, Protein C, kann aus jeder Quelle, vorzugsweise aus humanem Plasma, abgeleitet werden.
Der Aktivierungsschritt in den vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verfahren wird wie folgt durchgeführt: Thrombin wird zu einer Lösung, die Protein C enthält, in einer Konzentration von 0,5 bis 8,0 mg/ml in einem Verhältnis von Thrombin/Protein C von 1 bis 20 Einheiten/mg zugegeben und die Reaktion wird bei pH 6,0 bis 8,0 einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,15 M z. B. bei 37°C für 5 bis 6 Stunden durchgeführt.
Die entstehende Reaktionslösung nach der vorstehend genannten Aktivierungsprozedur, nach Einstellung des pHs oder einer gewünschten Salzkonzentration, wird dann einer Behandlung mit einem Kationenaustauscher zur Aufreinigung von APC unterzogen. Diese Behandlung mit einem Kationenaustauscher entfernt Thrombin und weitere kontaminierende Proteine wie Protein C, die keiner Aktivierung unterzogen wurden. Wie hier verwendet, kann ein Kationenaustauscher jeder Austauscher sein, solange er ein unlöslicher Träger mit einer Kationaustauschergruppe (z. B. Sulfogruppe, Carboxylgruppe) ist, und umfasst jeden Kationenaustauscher, der herkömmlicherweise im Stand der Technik verwendet wird, z. B. ein Kationenaustauscherharz wie S-Sepharose (Handelsname), SP-Sephadex (Handelsname), die beide von Pharmacia hergestellt werden, SP-Toyopearl (Handelsname), TSK-Gel SP-5PW (Handelsname), die beide von Toyo Soda K. K. hergestellt werden. Von diesen werden SP-Sephadex und SP-Toyopearl bevorzugt. Dieser Schritt kann entweder durch einen Säulenprozess oder ein Stapelverfahren durchgeführt werden. Hinsichtlich der Entfernungseffizienz kontaminierender Proteine wird ein Säulenprozess bevorzugt.
Das erfindungsgemäße Aufreinigungsverfahren von APC ist insofern charakteristisch, als dass die Reaktionslösung der Aktivierung mit einem Kationenaustauscher in Kontakt gebracht wird, um die Adsorption sowohl von Thrombin als auch APC an den Austauscher zu ermöglichen, und dass dann aktiviertes Protein C alleine bei einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,35 M eluiert wird. Die durch eine solche Aufreinigungsmethode erzeugte APC-Präparation ist im Wesentlichen frei von Thrombin und/oder Protein C, das keiner Aktivierung unterzogen wurde, und hat eine extrem hohe spezifische Aktivität von 3 500 Einheiten/mg oder mehr.
Die vorliegenden Erfinder haben ebenfalls Untersuchungen angestellt, um Mängel des herkömmlichen Verfahrens in einer Reihe von Schritten zur Präparation von APC mit einer hohen spezifischen Aktivität ausgehend von einer Fraktion von Protein C zu eliminieren, und haben als Ergebnis einige nützliche Verbesserungen gefunden, um die Effekte der vorliegenden Erfindung weiter zu verstärken.
Es gab bekannte Verfahren zur Aufreinigung von Protein C, wobei Protein C, nachdem es durch Adsorption und Prezipitation mit Bariumzitrat, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und DEAE-Sephadex Säulenchromatografie aufgereinigt wurde, weiteren Aufreinigungsverfahren wie präparative Polyakrylamide-Gel-Elektrophorese, Dextran-Sulfat-Agarose-Chromatografie, etc. oder einem Verfahren zur Aufreinigung unterzogen wurde, durch Verwendung eines Gels, in dem ein Antikörper gegen Protein C immobilisiert ist, und ähnliche (J. Biol. Chem., 251, 355–363 (1976); J. Clin. Invest., 64, 761–769 (1979); Blood, 54, 1272– (1979); FEBS LETTERS, 191, 75–81 (1985); J. Biol. Chem., 261, 11097–11105 (1986)). Die vorstehend genannten Verfahren sind jedoch nur für ein Labor geeignet, aber nicht für industrielle Herstellung in großem Ausmaß im Hinblick auf Ertrag, Arbeitseffizienz, etc. Weiterhin wird im Falle der Aufreinigung mit einem Gel, in dem ein Antikörper gegen Protein C immobilisiert wird, ein stark chaotropes Ion oder ein saurer pH oder ein starkes Chelat-bildendes Agens wie EDTA für die Elution verwendet, so dass eine Restmenge des Antikörpers gegen Protein C unvorteilhafterweise aus dem Gel freigesetzt wird und im Eluat enthalten ist.
Die gegenwärtigen Erfinder haben entdeckt, dass die Freisetzung des Antikörpers gegen Protein C aus dem Gel durch Elution von Protein C mit einer Zitratpuffer-Lösung anstelle eines starken Chelat-bildenden Agens, EDTA, verringert wird. Die erhaltene Lösung, die Protein C enthält, wird dann bei einem pH von 7,0 bis 9,0 mit einem Anionenaustauscher in Kontakt gebracht, um die Adsorption von Protein C an den Austauscher zu ermöglichen, wodurch eine Restmenge des Antikörpers gegen Protein C entfernt wird, gefolgt von Elution von Protein C bei einer Salzkonzentration von 0,3 bis 1,0 M. Dieses Verfahren kann fast die Gesamtmenge Antikörper gegen Protein C entfernen.
Basierend auf den vorstehend genannten Erkenntnissen, wird erfindungsgemäß ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Protein C in industriellem Maßstab bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(1) In-Kontakt-bringen einer Lösung, die humanes Protein C enthält, mit einem Anionenaustauscher, um die Adsorption von Protein C an den Austauscher zu ermöglichen, und nachfolgende Elution von Protein C zur Erzeugung einer Fraktion des humanen Proteins C, das eine Gla-Domäne aufweist;
(2) In-Kontakt-bringen der Lösung, die humanes Protein C enthält, mit einem Adsorbens, d. h. einem unlöslichen Träger, an den ein Antikörper, der Protein C spezifisch erkennt, und der an Kalziumionen gebunden ist, angeheftet ist, in Anwesenheit von Kalzium zur Ermöglichung der Adsorption von Protein C an das Adsorbens, und wobei danach Protein C durch eine Zitratpuffer-Lösung eluiert wird;
(3) In-Kontakt-bringen der Lösung, die Protein C enthält, mit einem Anionenaustauscher zur Ermöglichung der Adsorption von Protein C an den Austauscher, wobei danach Protein C vom Austauscher zur Entfernung des Antikörpers gegen Protein C aus der vorstehend genannten Lösung, die Protein C enthält, eluiert wird;
(4) Aktivierung von humanem Protein C mit Thrombin, wobei Thrombin zu der Lösung, die Protein C enthält, in einem Verhältnis von Thrombin/Protein C von 1 zu 20 Einheiten/mg bei einem pH von 6,0 bis 8,0 zugefügt wird; und dann
(5) In-Kontakt-bringen der Lösung, die humanes Protein C nach der Aktivierung enthält, mit einem Kationenaustauscher bei einem pH von 5,0 bis 6,0, einer Salzkonzentration von 80 mmol oder weniger, um die Adsorption sowohl von Thrombin als auch von aktiviertem Protein C an den Austauscher zu ermöglichen und dann wird humanes aktiviertes Protein C alleine vom Austauscher bei einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,35 M eluiert und gewonnen, wobei das aufgereinigte humane aktivierte Protein C eine spezifische Aktivität von 3500 Einheiten/mg oder mehr aufweist, wobei die Einheiten spezifischer Aktivität als eine Menge von APC definiert ist, die eine aktivierte Thromboplastin-Zeit (APTT) von humanem normalem Plasma zweifach verlängert und eine Thrombinkonzentration im Eluat von 0,001 Einheiten/ml oder weniger und/oder Protein C, das keiner Aktivierung unterzogen wurde.

Bei Verwendung von aufgereinigtem aktiviertem Protein C zur Therapie, insbesondere, wenn das aufgereinigte aktivierte Protein C aus humanem Plasma abgeleitet ist, besteht ein Risiko zur Infektion mit Viren, die in Ausgangsmaterial vorkommen (z. B. Hepatitis-Virus, HIV, etc.), und somit ist die Entfernung und Inaktivierung von Viren notwendig. Schutz vor Virusinfektion im Falle von Bluterzeugnissen wurde durch Entfernung von Viren durch Screening des Ausgangsmaterials, Membranfiltration, Adsorption, Säulenchromatografie, Prezipitationsfraktionierung oder Inaktivierung durch eine Lösungsdetergens-Methode, β-Propiolakton, Erhitzung, elektromagnetische Strahlung, etc. oder eine Kombination davon durchgeführt. Es ist jedoch schwierig, Viren zu entfernen und zu inaktivieren, ohne ein Protein zu denaturieren, seine physiologische Aktivität zu verringern, den Ertrag zu verringern, etc. Die gegenwärtigen Erfinder haben herausgefunden, dass die Entfernung und Inaktivierung von Viren für aktivierte Protein-C-Präparationen effektiv durch Entfernung von Viren mit einer Membranfiltration unter Verwendung einer Virus-entfernenden Membran in Kombination mit Gefriertrocknungserhitzung unter Verwendung eines stabilisierenden Agens wie Albumin bei 0,5–10% (W/V) durchgeführt werden kann. Mit einem solchen Verfahren können Viren effektiv entfernt und inaktiviert werden, ohne die Denaturierung des aktivierten Proteins C, einer Verminderung der physiologischen Aktivität und des Ertrags.
Die vorliegenden Erfinder haben Untersuchungen angestellt zur Entwicklung eines wirksamen Prozesses zur Aufreinigung und Aktivierung von Protein C und weiterhin zur Entwicklung eines Verfahrens zum Schutz vor viraler Infektion für die therapeutische Anwendung, und haben als Ergebnis gefunden, dass die Verwendung einer Zitratpuffer-Lösung für die Elution bei der Aufreinigung von Protein C durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Antikörpers gegen Protein C, die Aktivierung von Protein C in einer hohen Konzentration, und die Aufreinigung von aktiviertem Protein C durch Adsorption an einem Kationenaustauscher effektiv sind. Basierend auf diesen Aufreinigungsverfahren und in Kombination mit der Entfernung von Viren durch eine Virus-entfernende Membran und virale Inaktivierung durch Gefriertrocknungserhitzung, haben die vorliegenden Erfinder ein Verfahren etabliert, um wirksam eine große Menge an aktiviertem Protein C von hoher Reinheit für die therapeutische Anwendung mit hohem Ertrag herzustellen. Die erfindungsgemäße APC-Präparation ist zusätzlich zu ihren verminderten Konzentrationen kontaminierender Proteine insofern charakteristisch, dass sie eine höhere spezifische Aktivität (APC-Aktivität/Gesamtmenge an Protein (mg)) zeigt, als APCs, die durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, z. B. durch das in Biochemistry, 16, 5824–5831 (1977) offenbarte Verfahren. Tatsächlich zeigt die erfindungsgemäße APC-Präparation eine spezifische Aktivität von 1,5- bis 2fach höher, als die herkömmlicher Zubereitungen. Der Hauptgrund, warum ein solcher Anstieg der spezifischen Aktivität beobachtet wurde, ist noch unklar, aber es wird vermutet, dass die Entfernung von kontaminierenden Proteinen (Abbauprodukte von APC, Protein C, das keiner Aktivierung unterzogen wurde, koagulierte Proteine, etc.), welche die herkömmlichen Verfahren nicht erreichen konnten, einer der Hauptfaktoren sein kann.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, sollte aber nicht auf diese beschränkt werden.
Beispiel 1
1.1 Herstellung einer aktivierten Protein C-Präparation mit einer hohen spezifischen Aktivität
Eine Lösung einer aus Plasma abgeleiteten Protein-C-Präparation (8,7 mg/ml Protein C, pH 7,5, 34,3 ms/cm Leitfähigkeit) wurde gegen 20 mM Zitrat/0,1 M Natriumchloridpuffer (pH 6,0) dialysiert und dann auf eine Konzentration von 4 mg/ml Protein C verdünnt. Dieser Lösung wurde humanes Thrombin in einer Endkonzentration von 60 Einheiten/ml zugegeben und das Gemisch wurde für 5 Stunden auf 37°C erhitzt, um Protein C zu aktivieren.
Nach der Aktivierung wurde die Lösung nach Aktivierung zweifach mit 20 mmol Zitratpuffer (pH 6,0) verdünnt und auf eine Säule eines Kationenaustauschers (SP-Toyopearl) zur Entfernung von Thrombin aufgetragen. Der Austauscher wurde mit 20 mM Zitratpuffer (pH 6,0), der 60 mM Natriumchlorid enthielt, gut gewaschen und dann wurde aktiviertes Protein C mit 20 mM Zitratpuffer (pH 6,0), der 0,3 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Unter diesen Bedingungen wurde aktiviertes Protein C alleine ohne Elution von Thrombin eluiert. Eine Konzentration des verbleibenden Thrombin betrug 0,001 Einheiten/ml oder weniger. Die erhaltene APC-Präparation zeigte eine spezifische Aktivität von 4750,9 Einheiten/mg.
1.2 Untersuchung zu Bedingungen der APC-Adsorption und der Elution bei einer Kationenchromatografie nach Aktivierung
(1) Adsorptionsbedingung
Unter Verwendung von 20 mM Zitratpuffer wurden die Adsorptionsbedingungen von APC in einem Bereich von pH 6,0 bis 7,0 und einer Salzkonzentration von 0,0 bis 0,15 M untersucht, die angesichts der Stabilität von APC anwendbar sein können. Bei einem pH von 7,0 und einer Salzkonzentration von 0,1 M trat kaum Adsorption von APC auf. Bei pH 6,5 und einer Salzkonzentration von 0,1 M wurde das meiste APC eluiert, obwohl es teilweise adsorbiert war. Bei pH 6,0 und einer Salzkonzentration von 0,1 M war das meiste APC auf dem chromatografischen Träger adsorbiert.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Ausmaß von APC-Adsorption bei einem festen pH von 6,0 und verschiedenen Salzkonzentrationen untersucht. Bei einer Salzkonzentration von 0,15 M wurden nicht nur APC aber auch ein Teil des für die Aktivierung verwendeten Thrombins eluiert, wobei bei einer Salzkonzentration von 0,1 M APC hauptsächlich adsorbiert, aber die Adsorption nicht ausreichend war, und ein Teil des APCs, wie vorstehend genannt, eluiert wurde. Somit wurde eine Salzkonzentration auf 80 mM eingestellt und dabei eine geeignete Adsorption von APC an den chromatografischen Träger beobachtet.
(2) Elutionsbedingung
Nachdem der chromatographische Träger mit 20 mM Zitratpuffer (pH 6,0), der 60 mM NaCl enthielt, equilibriert wurde, wurde eine Gradientenelution bei einer Konzertration von 60 mM bis 0,5 M NaCl durchgeführt. Die Elution von APC begann schrittweise bei einer Konzentration von etwa 0,1 M NaCl und bei 0,35 M oder mehr wurde Thrombin ebenfalls partiell eluiert. Demgemäß ist eine bevorzugte Elutionsbedingung eine Konzentration von weniger als 0,35 M NaCl.
Referenzbeispiel 1
Herstellung einer aktivierten Protein-C-Präparation durch das herkömmliche Verfahren
Die vorstehend genannte Lösung der Protein-C-Präparation (8,7 mg/ml Protein C, pH 7,5, 34,3 ms/cm Leitfähigkeit) wurde gegen 50 mM Tris-HCl/0,1 M Natriumchloridpuffer (pH 8,0) dialysiert und dann auf eine Konzentration von 0,7 mg/ml Protein C verdünnt. Dieser Lösung wurde Thrombin in einer Endkonzentration von 10 Einheiten/ml zugegeben und dieses Gemisch wurde auf 37°C für 5 Stunden erhitzt, um Protein C zu aktivieren. Nach der Aktivierung wurde die Reaktionslösung auf eine Säule eines Kationenaustauschers (SP-Toyopearl) aufgetragen, der davor gewaschen und mit 50 mM Tris-HCl/0,15 M Natriumchloridpuffer (pH 8,0) equilibriert wurde und dadurch wurde Thrombin adsorbiert und aktiviertes Protein C in einer Elutionsfraktion gewonnen. Eine spezifische Aktivität von aktiviertem Protein C in dieser Lösung betrug 3259,6 Einheiten/mg.
Beispiel 2
Vergleich der Präparation der vorliegenden Erfindung mit den herkömmlichen Präparationen
Die Präparationen von Beispiel 1 und Referenzbeispiel 1 wurden hinsichtlich ihrer spezifischen Aktivität und der Reinheit mit Elektrophorese, etc. verglichen.
2.1 Messung der Aktivität von aktiviertem Protein C
Die Aktivität von APC wurde wie folgt gemessen.
Eine Einheit von APC-Aktivität ist definiert als Menge von APC, die eine aktivierte Thromboplastin-Zeit (APTT; Sekunde) zweifach verlängert, um die von normalem humanem Plasma zu verdoppeln. Demgemäß wird die Aktivität von APC gemessen, wobei APTT (Sekunde) für normales humanes Plasma gemessen wird, zu dem eine verdünnte Probe zugegeben wird und die Verdünnung, bei der der gemessene APTT-Wert zweifach so hoch ist wie der der Kontrolle (Puffer), wird bestimmt, und als die Aktivität von APC für Proben bezeichnet.
Verfahren
Eine Probe wurde mit einem Veronalpuffer verdünnt, der 1% HSA enthielt, auf z. B. eine 400fache, 500fache, 800fache oder 1000fache Verdünnung. Zu jeweils 100 μl entweder der Kontrolle (Puffer) oder Proben jeder Verdünnung wurden 100 μl normalen humanen Plasmas (z. B. Citrol I: Baxter Diagnostics Inc.) und 100 μl APTT-Reagens (z. B. Actin: Baxter Diagnostics Inc.) bei 37°C aufeinanderfolgend mit einem Intervall von 15 Sekunden zugegeben, das Gemisch wird verrührt und nach 2 Minuten werden 100 μl 0,025 M CaCl₂ zugegeben und eine Koagulationszeit wird gemessen.
Berechnung der Aktivität
Eine lineare Regressionsformel und ein Korrelations-Koeffizient von 10³/X und Y werden aus den Werten von APTT (Y) bei jeder Verdünnung (X) von Kontrollen und Proben wie folgt erhalten: Y = A(103/X) + B
Ein Wert von X₁, erhalten nach der folgenden Formel: X1 = 103{(Y1 – B)/A}wobei Y₁ der doppelte Wert von APTT (Sekunde) der Kontrolle ist, und als Aktivität von APC (Einheiten/ml) für die Proben betrachtet wird.
Messung des Proteins
Eine Konzentration von aktiviertem Protein C wurde gemessen, basierend auf der Messung der Adsorption A₂₈₀, d. h. basierend auf der Abschätzung, dass A₂₈₀ von APC bei einer Konzentration von 1% (W/V) (10 mg/ml) 14,5 beträgt, wie abgeschätzt aus der Aminosäurezusammensetzung von APC (J. Clin. Invest., 64, 761–769 (1979)). Demgemäß wird die Konzentration von aktiviertem Protein C durch die folgende Formel berechnet: Konzentration von aktiviertem Protein C (mg/ml) = A280 wie gemessen/1,45
Basierend auf der Aktivität und der vorstehend gemessenen Konzentration von APC wurde eine spezifische Aktivität von APC (Einheiten/mg) wie hier verwendet, berechnet.
2.2 Auswirkung der Aktivierungsbedingungen auf die spezifische Aktivität von APC
Durch Verwendung von Proben kurz nach der Aktivierung wurden Effekte von Unterschieden der Aktivierungsbedingungen auf eine spezifische Aktivität untersucht. Die Messung der APC-Aktivität nach der Aktivierung wurde durchgeführt, wobei jeweils 1 Einheit und 10 Einheiten von Anti-Thrombin und Heparin zu 1 ml einer Probe vor der Messung zugegeben wurden und das Gemisch wurde auf 37°C für 30 Minuten erhitzt, um Thrombin zu inaktivieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Für die Aktivierungsbedingungen der vorliegenden Erfindung (pH 6,0, NaCl-Konzentration 0,1 M) wurde kein Effekt auf die spezifische Aktivität beobachtet, verglichen mit den Aktivierungsbedingungen des herkömmlichen Verfahrens (pH 8,0, NaCl-Konzentration 0,15 M).
Tabelle 1
2.3 Vergleich der spezifischen Aktivität vor und nach der Behandlung mit Kationenchromatographie
Unter Verwendung verschiedener Proben wurde die spezifische Aktivität von APC vor und nach Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Kationchromatografie verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. In der herkömmlichen Zubereitung wurde eine Zunahme der spezifischen Aktivität kaum beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten die Präparationen der vorliegenden Erfindung eine spezifische Aktivität von APC (Einheiten/mg) von mehr als 4500, wobei die spezifische Aktivität von APC nach der Chromatografiebehandlung um etwa 1,5fach erhöht wurde. Die Hauptursache, warum ein solcher Anstieg der spezifischen Aktivität beobachtet wurde, ist noch unklar, aber es wird angenommen, dass die Entfernung kontaminierender Proteine (Degradationsprodukte von APC, Protein C, das nicht aktiviert wurde, koagulierte Proteine, etc.), die durch die herkömmlichen Verfahren nicht entfernt werden können, einer der Hauptfaktoren sein kann.
Tabelle 2
2.4 Vergleich mit Elektrophorese vor und nach Behandlung mit Kationchromatografie
APC wurde im herkömmlichen Verfahren bei pH 8,0 durch Kationchromatografie eluiert, während im erfindungsgemäßen Verfahren APC zuerst bei pH 6,0 adsorbiert und dann eluiert wird. 1 zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE des herkömmlichen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei APC bei pH 6,0 adsorbiert und Protein C, das keiner Aktivierung unterzogen wurde, eluiert wird, werden Fraktionsbanden dieser Bereiche mit einem höheren oder niedrigeren molekularen Gewicht, als das von APC, entfernt. Zusätzlich zeigte im Vergleich mit der bei pH 8,0 eluierten Fraktion, die Fraktion die durch Adsorption bei pH 6,0 und eine nachfolgende Elution erhalten wurde, eine schärfere Bande des entsprechenden APCs, und somit wird das Protein C, das keiner Aktivierung unterzogen wurde, wahrscheinlich entfernt. Andererseits wurden, obwohl die durch das herkömmliche Verfahren eluierte Fraktion eine quantitative Abnahme der Fraktionsbanden mit höherem oder niedrigerem Molekulargewicht als APC zeigte, diese Banden nicht vollständig entfernt.
2.5 Gehalt von Protein C in einer APC-Zubereitung, das keiner Aktivierung unterzogen wurde
Ein verminderter Gehalt von Protein C, das nicht aktiviert wurde, wurde als ein Faktor angesehen, der zur Zunahme der spezifischen Aktivität der erfindungsgemäßen APC-Präparationen mit einer hohen spezifischen Aktivität führte. Somit wurde der Gehalt an Protein C, das nicht aktiviert wurde, sowohl für die APC-Präparationen des herkömmlichen Verfahrens als auch des erfindungsgemäßen Verfahrens gemessen. Die Messung wurde unter Verwendung eines ELISA-Systems mit einem monoklonalen Antikörper durchgeführt, der für Protein C spezifisch ist, in Übereinstimmung mit dem gewöhnlichen Protokoll.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Die herkömmlichen Präparationen mit einer niedrigen spezifischen Aktivität hatten einen Gehalt von 4–6% Protein C, das nicht aktiviert wurde, wobei die erfindungsgemäßen Präparationen eine hohe spezifische Aktivität mit einem Gehalt in Höhe von 0,4–1,2% aufwiesen. Obwohl die herkömmlichen Präparationen einen höheren Gehalt an Protein C aufwiesen, das nicht aktiviert wurde, verglichen mit den erfindungsgemäßen Präparationen, ist der Gehalt sehr gering und somit wahrscheinlich nicht aussagekräftig, um einen direkten Effekt auf die spezifische Aktivität der Präparationen auszuüben. Um dies zu bestätigen wurde die Präparation 3 der vorliegenden Erfindung, die den geringsten Gehalt an Protein C enthielt, der nicht aktiviert wurde, zu Protein C in einer Endkonzentration von 5% zugegeben und die APC-Aktivität (APTT) wurde gemessen. Als Ergebnis wurde keine Veränderung der APTT-Werte beobachtet, verglichen mit dem Fall ohne Zugabe von Protein C (siehe Tabelle 4). Demgemäß wird angenommen, dass eine Verminderung des Gehaltes an Protein C, das nicht aktiviert wurde, kein Hauptfaktor bei der Zunahme der spezifischen Aktivität von APC ist, wie in den Präparationen der vorliegenden Erfindung beobachtet.
Tabelle 4
Beispiel 3
Erzeugung einer aktivierten Protein C-Präparation
Eine Menge an frisch eingefrorenem humanen Plasma (100 l) im industriellen Maßstab wurde ohne Erhitzen geschmolzen und gebildete Prezipitate wurden durch Zentrifugation abgetrennt. Der erhaltene Überstand wurde auf einen Anionenaustauscher (DEAE-Sephadex A-50) zugegeben. Der Austauscher wurde mit 20 mmol Zitratpuffer (pH 7,0) gut gewaschen, der 0,1 M Natriumchlorid enthielt und Elution erfolgte mit 20 mM Zitratpuffer (pH 7,0), der 0,5 M Natriumchlorid enthielt, um eine Fraktion mit humanem Protein C mit einer Gla-Domäne zu eluieren.
Zu dieser Lösung wurden 30 mmol Kalziumchlorid zugegeben und dann wurde das Gemisch auf eine Affinitätschromatografiesäule unter Verwendung eines Anti-Protein-C-Antikörpers aufgetragen. Die Säule wurde mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,15 M Natriumchlorid und 2 mM Kalziumchlorid enthielt, gut gewaschen und danach wurde Protein C mit 20 mM Zitratpuffer (pH 6,0), der 0,15 M Natrumchlorid enthielt, eluiert.
Die Lösung wurde mit 0,1 M Natriumhydroxid auf einen pH von 8,0 eingestellt und dann auf eine Anionenaustauschersäule (Q-Sepharose Fast Flow) aufgetragen. Der Austauscher wurde mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, gut gewaschen und die Elution wurde mit 0,3 M Glyzinpuffer (pH 7,0), der 0,4 M Natriumchlorid enthielt, durchgeführt. Protein C, das in diesem Schritt erhalten wurde, wurde als einzelne Bande in SDS-PAGE bestimmt.
Für die Aktivierung wurde die Lösung des aufgereinigten Proteins C, das durch das vorstehende Verfahren erhalten wurde, mit 20 mM Zitratpuffer verdünnt (pH 6,0) auf eine Konzentration von 4 mg/ml Protein C. Zu dieser Lösung wurde Thrombin in einer Endkonzentration von 60 Einheiten/ml zugegeben und das Gemisch wurde auf 37°C für 5 Stunden erhitzt, um Protein C zu aktivieren.
Nach der Aktivierung wurde zur Entfernung des Thrombins die Lösung nach der Aktivierung zweifach mit 20 mM Zitratpuffer (pH 6,0) verdünnt und auf eine Kationenaustauschersäule aufgetragen (SP-Toyopearl). Der Austauscher wurde mit 20 mM Zitratpuffer (pH 6,0), der 60 mM Natriumchlorid enthielt, gut gewaschen und aktiviertes Protein C wurde mit 20 mM Zitratpuffer (pH 6,0), der 0,35 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Unter dieser Bedingung wurde aktiviertes Protein C alleine ohne Elution von Thrombin eluiert und somit wird Thrombin entfernt. Die erhaltene Lösung von aktiviertem Protein C wurde einer Filtration mit einer Virus- entfernenden Membran (Planova 35N, hergestellt von Asahi Chemical Industries, K. K.) unterzogen. Die entstehende Lösung hatte eine spezifische Aktivität von 5392,7 Einheiten/mg aktiviertem Protein C und eine Konzentration von verbleibendem Thrombin von 0,001 Einheiten/ml oder weniger.
Das Filtrat wurde auf 0,7% (W/V) Natriumchlorid, 0,5% (W/V) Glyzin, 0,6% (W/V) Natriumzitrat, 2,5% (W/V) humanes Albumin und 600 Einheiten/ml der Aktivität von APC bei einer Endkonzentration angepasst. Die Lösung von aktiviertem Protein C, die so hergestellt wurde, wurde steril filtriert, gefriergetrocknet und dann bei 65°C für 96 Stunden trocken erhitzt, zur Inaktivierung von Viren, um schließlich eine aktivierte Protein-C-Präparation zu ergeben, die für die therapeutische Anwendung geeignet ist.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung einer humanen Aktivierten Protein C Präparation, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) In Kontakt bringen einer Lösung, die humanes Protein C mit einem Anionenaustauscher enthält, um die Adsorption des Protein C an den Austauscher zu ermöglichen und dann Eluieren des Protein C um eine Fraktion von humanem Protein C herzustellen, dass eine Gla Domäne besitzt; (2) In Kontakt bringen der Lösung, die humanes Protein C mit einem Adsorptionsmittel enthält, d. h. ein unlöslicher Träger an den Antikörper, der spezifisch von Protein C gebunden mit Kalziumion erkannt wird, angeheftet ist, in der Anwesenheit von Kalzium um die Adsorption des Proteins C an das Adsorptionsmittel zu ermöglichen, und dann Eluieren des Protein C davon unter Verwendung von Zitratpufferlösung; (3) In Kontakt bringen der Lösung, die Protein C enthält, mit einem Anionenaustauscher um die Adsorption von Protein C an den Austauscher zu ermöglichen, und dann Eluieren des Protein C davon, um den Antikörper gegen Protein C aus der vorstehenden Lösung, die Protein C enthält zu entfernen, (4) Aktivieren des humanen Protein C mit Thrombin, wobei Thrombin der Lösung, die Protein C enthält, in einem Verhältnis von Thrombin/Protein C 1 zu 20 U/mg zugefügt wird, unter pH Bedingungen von 6.0 bis 8.0; und (5) In Kontakt bringen der Lösung, die humanes Aktiviertes Protein C enthält, nach Aktivierung, mit einem Kationenaustauscher unter pH Bedingungen 5.0 bis 6.0, einer Salzkonzentration von 80 mM oder weniger, um die Adsorption von sowohl Thrombin, als auch Aktiviertem Protein C an den Austauscher zu ermöglichen, und dann Eluieren des humanen Aktivierten Protein C allein davon unter Bedingungen einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,35 M zur Rückgewinnung, wobei das gereinigte humane Aktivierte Protein C eine spezifische Aktivität von 3500 U/mg oder mehr besitzt, wobei die Einheit der spezifischen Aktivitätais die Menge APC definiert wird, die zweifach die Aktivierte Thromboplastinzeit (APTT) von normalem humanem Plasma verlängert, und eine Thrombinkonzentration in dem Eluat von 0,001 U/ml oder weniger und/oder Protein C der Aktivierung nicht unterworfen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend das Entfernen und Inaktivieren von Vieren von dem hergestellten Aktivierten Protein C, das in Schritt (5) erhalten wurde, durch Membranfiltration unter Verwendung einer Virus-entfernenden Membran in Kombination mit gefriertrocken-Erhitzung unter Verwendung eines stabilisierenden Agenz Albumin bei 0,5 bis 10% (w/v).
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das human Aktivierte Protein C eine spezifische Aktivität von 4000 U/ml oder mehr hat.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lösung, die humanes Protein C enthält aus humanem Plasma erhalten wird.