DE2723463B2 - Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephem-Verbindungen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephem-VerbindungenInfo
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Description
211
R1 R2
in der
Ri ein Wasserstoffatom, eine niedrigmolekulare Alkanoylgruppe, eine Aryl-alkanoylgruppe, eine
Alkoxycarbonylgruppe, eine niedrigmolekulare Halogenalkoxycarbonylgruppe, eine Aroylgruppe,
eine N-Arylcarbamoylgruppe oder eine Arylgruppe,
R2 entweder ein Wasserstoffatom oder gemeinsam
mit der Gruppe der Formel
Ri—N —
eine Phthalimidogruppe und
X eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder
X eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder
einen Thioschwefelsäurerest
bedeuten,
bedeuten,
oder auf deren Metallsalze oder Salze mit organischen Basen eine Kultur des Mikroorganismus
Aspergillus sp. MA-13 (ATCC Nr. 20 491) und/oder des Mikroorganismus Alternaria sp.
MA-133 (ATCC Nr. 20 492) oder ein aus der Kultur gewonnenes Sekundärpräparat in Gegenwart eines
wäßrigen Mediums einwirken läßt
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen
Formel I
H2N
CH2X
(D
in der X für eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest steht.
Nützliche Antibiotika der Cephalosporinreihe, wie beispielsweise Cefalotin, Cefaloridin oder Cefaloglycin,
erhält man im allgemeinen durch Umwandlung des durch Fermentationsverfahren gebildeten Cephalosporins
C in 7-Aminocephalosporansäure (die im folgenden auch als »7-ACA« bezeichnet wird), welche Säure man
chem'sch in geeigneter Weise modifiziert. Daher ist die
7-Aminocephalosporansäure das wichtigste Ausgangsmaterial zur Herstellung dieser Cephalosporin-Antibiotika.
Weiterhin tragen sowohl Cefoxitin, das als neues synthetisches Cephalosporin-Antibiotikum entwickelt
wird und das aufgrund seiner bei Bewertungsuntersuchungen festgestellten ausgezeichneten Eigenschaften
(siehe Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 5 [1974], 25) erhebliches Interesse findet, als auch
Cefuroxim, das sich ebenfalls im Entwicklungszustand befindet und ausgezeichnete Eigenschaften aufweist
(siehe The Journal of Antibiotics, Vol.29 [1976], 29) in der 3-Stellung Carbamoyloxymethylgruppen. Für die
Synthesen dieser Verbindungen stellt die 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
(im folgenden auch als »D-7-ACA« bezeichnet) ein besseres Ausgangsmaterial
dar. Die 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure ist auch als Ausgangsmaterial für die Synthese von in der
3-Stellung substituierten Vinyl-cephalosporinen geeignet,
die aufgrund ihrer starken antibakteriellen Wirkung auf gramnegative Bakterien (vgl. Journal of Medical
Chemistry, Vol. 18 [1975], 986) allgemeines Interesse finden.
Es sind bereits eine Reihe von Verfahren vorgeschlagen worden, mit denen die Desacylierung von Cephalosporin C in der 7-StelIung, die im folgenden der Einfachheit halber als »Desacylierung« bezeichnet wird, auf chemischem Wege erreicht wird, wobei diese Desacylierung tatsächlich mit Hilfe chemischer Verfah-
Es sind bereits eine Reihe von Verfahren vorgeschlagen worden, mit denen die Desacylierung von Cephalosporin C in der 7-StelIung, die im folgenden der Einfachheit halber als »Desacylierung« bezeichnet wird, auf chemischem Wege erreicht wird, wobei diese Desacylierung tatsächlich mit Hilfe chemischer Verfah-
•Γ) rensweisen in technischem Maßstab durchgeführt wird.
Ein bekanntes Verfahren zur chemischen Desacylierung von Cephalosporin C ist beispielsweise das Iminohalogenid-Verfahren
(siehe die veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. Sho-41-13 862). Dieses Desacylie-
>o rungsverfahren umfaßt die folgenden Schritte: Schutz
der Aminogruppe des Cephalosporin C, Schutz der Carboxylgruppe, Umwandlung in das Iminochlorid,
Umwandlung in den Iminoäther, Desacylierung und Abspaltung der Schulzgruppe der Carboxylgruppe. Da
■ν- dieses Verfahren eine Reihe von Schritten umfaßt, ist
die Durchführung der aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte sehr aufwendig und zeitraubend. Weiterhin
wurde als Verbesserung des Iminohalogenid-Verfahrens das sogenannte Silylchlorid-Verfahren vorgeschla-
M gen (vgl. die veröffentlichte japanische Patentanmeldung
Nr. Sho-45-40 899). Dieses Verfahren ist im Vergleich zu dem Irr.inonalogenid-Verfahren dadurch
vorteilhaft, daß es eine geringere Anzahl von Verfahrensschritten benötigt; es wirft jedoch weitere Probler'
me auf, wie das Abkühlen auf Temperaturen von unterhalb —60nC und die Anwendung kostspieliger
Reaktionsvorrichtungen. Neben diesen Problemen leiden die chemischen Desacylierungsverfahren an dem
weiteren Nachteil, daß es zur Erzielung hoher Ausbeuten erforderlich ist, hochreines Cephalosporin C
als Ausgangsmaterial einzusetzen.
Die theoretische Möglichkeit der direkten Desacylierung von Cephalosporin C durch die Anwendung von
Mikroorganismen oder Enzymen scheint aufgrund von Erfahrungen bei der Herstellung von 6-Amino-penicillansäure
(6-APA) aus Penicillin gegeben zu sein. Es sind bislang jedoch noch keine Berichte über die Herstellung
von 7-Amino-cephalosporansäure oder von 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
ausgehend von Cephalosporin C in technischem Maßstab veröffentlicht worden. Es wird angenommen, daß dies eine Folge der
Tatsache ist, daß in der 7-Stellung des Cephalosporins C
eine spezifische Gruppe (das heißt die D-5-Amino-5-carboxy-pentanoylgruppe)
vorhanden ist, was erwarten läßt, daß die enzymatisch bewirkte direkte Desacylierung
schwierig oder nicht durchzuführen ist
In der US-PS 32 39 394 ist ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäure aus Cephalosporin
C unter Verwendung von Mikrobenzellen beschrieben. Dieses Verfahren besteht darin, daß man
Cephalosporine mit den gezüchteten Zellen eines bestimmten Bakterienstammes aus der Gruppe der
Genera ßrevibanterium, Achromobacterium und Flavobacterium,
behandelt, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die 7-Amino-cephalosporansäure und 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
enthält. Bei einem solchen Verfahren ist jedoch keine Verbesserung der Reaktionsausbeute aufgrund der Tatsache zu erwarten, j<
> daß die verwendeten Mikrobenstämme eine extrem geringe Desacylierungsaktivität besitzen und daß das
eine Desacylierungsaktivität aufweisende Enzym auch eine ß- Lactamase-Wirkung entfaltet, was zur Folge hat,
daß die ß-Lactamringe von sowohl Cephalosporin C als Ji
auch dem daraus gebildeten Produkt, nämlich 7-Aminocephalosporansäure, gespalten werden.
Es wurde nun von der Anmelderin überraschenderweise gefunden, daß gewisse Mikroorganismeristämme,
die zu den Genera Aspergillus oder Alternaria gehören, w
eine starke Desacylierungswirkung entfalten und dafür geeignet sind, aus Cephalosporin C oder seinen
Derivaten 7-Amino-cephalosporansäure oder 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
zu bilden. Die Erfindung beruht nun auf dieser überraschenden Erkennt- 4r>
nis. Das erfindungsgemäße mikrobiologische Desacylierungsverfahren besitzt gegenüber den herkömmlichen
Verfahren eine Reihe von Vorteilen, beispielsweise den, daß lediglich eine einzige Verfahrensstufe erforderlich
ist, daß das Verfahren einfacher und wirksamer r><
> durchgeführt werden kann, daß insbesondere keine Ausgangsmaterialien mit hoher Reinheit erforderlich
sind, und daß nur geringe Vorrichtungskosten aufgewandt werden müssen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf Verbindungen der allgemeinen
Formel II
HOOCCH(CH2),CONH
/ \
R1 R2
R1 R2
in der
(H)
CH,X
COOH
carbonylgruppe, eine niedrigmolekulare Halcgenalkoxycarbonylgruppe,
eine Aroylgruppe, eine N-Arylcarbamoylgruppe oder eine Arylgruppe,
R2 entweder ein Wasserstoffatom oder gemeinsam mit der Gruppe der Formel
R2 entweder ein Wasserstoffatom oder gemeinsam mit der Gruppe der Formel
R1-N-
eine Phthalimidogruppe und
X eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest
bedeuten,
oder auf deren Metallsalze oder Salze mit organischen Basen eine Kultur des Mikroorganismus Aspergillus sp.
MA-13 (ATCC Nr. 20491) und/oder des Mikroorganismus Alternaria sp. MA-133 (ATCC Nr. 20 492) oder ein
aus der Kultur gewonnenes Sekundärpräparat in Gegenwart eines wäßrigen Mediums einwirken läßt.
Der Einfachheit halber werden die 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel 1 im folgenden
als »7-Amino-cephem- Verbindungen 1« bezeichnet, während die Homologen des Cephalosporins C der
allgemeinen Formel II als »Verbindungen II« bezeichnet werden.
Im folgenden sei zunächst ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der 7-Amino-cephem-Verbindungen
1 angegeben, die durch Behandlung von Cephalosporin C oder seinen Derivaten mit den
gezüchteten Myzelen der oben beschriebenen Mikroorganismenstämme erhalten wurden; weiterhin sind
einige experimentelle Ergebnisse angegeben, die mit den folgenden Methoden ermittelt wurden:
M)
Ri ein Wasserstoffatom, eine niedrigmolekulare Alkanoylgruppe,
eine Aryl-alkanoyigruppe, eine Aikoxy-
A) Methode zur quantitativen Bestimmung der
7-Amino-cephem-Verbindungen I
7-Amino-cephem-Verbindungen I
1. Für in organischen Lösungsmitteln lösliche Substrate
Reagentien:
Lösung A: 2°/oige Lösung von Phenylacetylchlorid
in Aceton,
Lösung B: 5%ige wäßrige Natriumbicarbonatlö-
Lösung B: 5%ige wäßrige Natriumbicarbonatlö-
sung.
Man stellt 1 ml der Reaktiorsmischung, die man durch das Behandeln der Substratlösung mit dem gezüchteten
Myzel erhält, mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure auf einer, pH-Wert von 2,5 und extrahiert (das heißt wäscht)
zweimal mit gleichen Mengen Äthylacetat. Den Extrakt stellt man mit 1 n-Natriumhydroxidlösung auf einen
pH-Wert von 7, gibt bei 0°C 0,6 m! der Lösung B zu und
versetzt unmittelbar danach mit 2 ml der Lösung A. Die erhaltene Mischung wird während 60 Minuten bei 00C
aufbewahrt. Anschließend untersucht man die antimikrobielle Wirkung der Reaktionsmischung mit Hilfe
einer mikrobiologischen Untersuchungsmethode. Zu diesem Zweck führt man die Papierscheibenmethode
bei 37°C während 16 Stunden auf einer Analysenplatte durch, wobei man als Test-Mikroorganismus Bacillus
subtilis ATCC 6633 verwendet. Getrennt davon bereitet man mit der authentischen 7-Amino-cephem-Verbindung
eine geeignete Anzahl von wäßrigen Lösungen
unterschiedlicher Konzentrationen, die man in der oben beschriebenen Weise mit Phenylacetylchlorid umsetzt,
worauf man das gebildete Reaktionsprodukt in der oben beschriebenen Weise auf seine antimikrobieHe Wirkung
untersucht. So kann man die Menge der in der Probe der Reaktionsmischung vorhandenen 7-Amino-cephem-Verbindung
mit Hilfe einer Eichkurve ablesen, die mit Hilfe der authentischen 7-Amino-cephem-Verbindung
ermittelt wurde.
2. Für in organischen Lösungsmitteln unlösliche Substrate:
Reagenrien etc.:
Papierchromatographie:
Papierchromatographie:
Filterpapier (Toyo Nr. 50 Filterpapier) der Größe 2 cm χ 40 cm,
Lösungsmittelsystem:
Acetonitril/Wasser-Mischung (4/1).
Hochspannungspapierelektrophorese:
Hochspannungspapierelektrophorese:
Pufferlösung:
Ameisensäure/Essigsäure-Mischung (1 /4)
(der pH-Wert der Mischung beträgt 1,9),
Filterpapier: Toyo Nr. 51 Filterpapier
Spannung: 160 V/cm
Zeit: 30 Minuten
Filterpapier: Toyo Nr. 51 Filterpapier
Spannung: 160 V/cm
Zeit: 30 Minuten
Man trägt einen aliquoten Anteil der Rea ktionslösung
des Substrats und des Myzelins oder des Konzentrats davon auf das Filterpapier (Toyo Nr. 50) auf und
entwickelt das Filterpapier bei Raumtemperatur nach der absteigenden Methode während 4 Stunden mii dem
oben beschriebenen Lösungsmittelsystem. Anschließend wird das Filterpapier an der Luft getrocknet,
worauf zwei 3 cm breite Streifen aus dem Filterpapier herausgeschnitten werden, und zwar von Stellen, die
7,5 cm bzw. 13,5 cm von dem Startpunkt des Filterpapiers entfernt sind, wobei diese Bereiche die Mitten der
Streifen betreffen. Jeder der Ausschnitte wird gut mit 2 ml einer 0,05 m-Phosphatpufferlösung (mit einem
pH-Wert von 7) extrahiert, worauf man 1 ml des Extrakts mit Phenylacetylchlorid umsetzt und dann die
antimikrobieHe Wirkung des Materials in der unter Ziffer 1 beschriebenen Weise bestimmt. In dieser Weise
kann getrennt die quantitative Bestimmung von Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure (D-7-ACA), die
7,5 cm vom Startpunkt entfernt vorliegt, und von 7-Amino-cephalosporansäure (7-ACA), die 13,5 cm vom
Startpunkt entfernt vorliegt, durchgeführt werden, woraus die Ausbeuten der entsprechenden Produkte
errechnet werden können.
Wenn das Substrat ein Buntesalz des Cephalosporins C ist, das heißt eine Verbindung der allgemeinen
Formel I, in der X für eine Gruppo der Formel -S-SO3M steht, in der M den Rest einer anorganischen
oder organischen Base darstellt (siehe E. H. Flynn, Cephalosporins and Penicillins, Academic Press, New
York and London [1972], 20), wird ein aliquoter Anteil
der bei der Umsetzung der Verbindung mit den Zellen oder ihrem Konzentrat erhaltenen Lösung mit Phenylessigsäure
in der oben beschriebenen Weise umgesetzt. Man trägt einen aliquoten Anteil der gebildeten
Reaktionslösung auf das Filterpapier (Toyo Nr. 51) auf und führt eine Hochspannungs-Papierelektrophorese
durch. Anschließend trocknet man das Filterpapier und schneidet einen 3 cm breiten Filterpapierstreifen in
einer Entfernung von 6 cm von dem Startpunkt an der Anodenseite des Filterpapiers heraus, wobei dieser
Bereich die Mitte des Streifens darstellt. Dann wird der Ausschnitt extrahiert und es wird die anlimikrobielle
Wirkung des Extraktes in der oben beschriebenen Weise ermittelt. In dieser Weise kann man quantitativ
das Buntesalz der 7-Amino-cephalosporansäure quantitativ über die antimikrobieHe Wirkung des phenylacety-Iierten
Derivates ermitteln.
B) Einige experimentelle Ergebnisse
Wie aus der folgenden Tabelle I hervorgeht, bilden sich durch die Desacyliening von Cephalosporin C mit
dem Myzel-Enzym 7-Amino-cephalosporansäure (7-ACA) und Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
(D-7-ACA). Weiterhin zeigt sich, daß die letztere Verbindung, das heißt die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure,
das überwiegende Produkt darstellt. Dies beruht auf der Tatsache, daß in dem eine Desacylierungswirkung
aufweisenden kultivierten Myzel neben dem desacylierenden Enzym ein Enzym enthalten ist,
das die Esterbindung der 3-Acetoxygruppe des Cephalosporins hydrolysiert, das heißt eine Acetyl-esterase.
Die Stärke der enzymatischen Wirkung dieser Acetylesterase variiert mit dem eingesetzten Mikroorganismenstamm.
Aspergillus sp. MA-13 zeigt eine starke enzymatische Wirkung dieses Enzyms, mit dem
Ergebnis, daß vorzugsweise Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure gebildet wird. Demgegenüber weist
Alternaria sp. MA-133 nur eine relativ schwache Aktivität dieses Enzyms auf, so daß 7-Amino-cephalosporansäure
bevorzugt gegenüber der Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
gebildet wird.
Weiterhin hat sich gezeigt, wie aus der folgenden Tabelle II hervorgeht, daß die gezüchteten Myzele der
oben beschriebenen Mikroorganismenstämme nicht nur eine desacylierende Wirkung auf die verschiedenen
N-Derivate von Cephalosporin unter Bildung der entsprechenden 7-Amino-cephem-Verbindungen, sondern
auch auf die Buntesalze des Cephalosporins C (das heißt die Derivate des Cephalosporins C, die einen
Thioschwefelsäurerest in der 3-Stellung aufweisen) ausüben, wodurch die entsprechenden Buntesalze der
7-Amino-cephalosporansäure gebildet werden.
1. Man beschickt ein Reagenzglas mit 0,5 g (Naßgewicht) der Mikroorganismenkultur, die man durch
Züchten der unten angegebenen Schimmeipilzstämme in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise
unter Verwendung des Mediums 1 oder des Mediums 2, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind,
erhält und mit einer aliquoten Menge von 10 ml einer 0,5%igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes
von Cephalosporin C (die einen pH-Wert von 7 aufweist) und versetzt die Lösung mit einer solchen
Menge Natriumazid, daß sich eine Konzentration von 100 mg/ml ergibt. Man setzt den Inhalt des
Reagenzglases um, indem man das Reagenzglas während 16 Stunden bei 28° C in einer Schüttelvorrichtung
schüttelt. Anschließend filtriert man die Reaktionsmischung und unterzieht das Filtrat der
quantitativen Bestimmung bezüglich 7-Amino-cephalosporansäure und Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
unter Anwendung der oben beschriebenen Methode 2. Die Ausbeuten der entsprechenden
Produkte sind in der folgenden Tabelle I als Prozentsatz, bezogen auf die Menge des eingesetzten
Substrates, angegeben.
Mikroorganismenstamm
Medium Ausbeule der 7-Amino-cephem-Verbindungen
7-ACA D-7-ACA Insgesamt
Aspergillus sp. MA-13
(FERM-P3490 oder ATCC Nr. 20491)
(FERM-P3490 oder ATCC Nr. 20491)
Alternaria sp. MA-133
(FERM-P3492 oder ATCC Nr. 20492)
(FERM-P3492 oder ATCC Nr. 20492)
4,5
18,5
3
3
18,5
7,5
7,5
2. Man züchtet Aspergiüus sp. MA !3 (FERM-P 3490)
(ATCC Nr. 20 491) in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise unter Anwendung des Mediums 2, das
ebenfalls in Beispiel 1 erläutert ist. Die erhaltene Kultur des Schimmelpilzstamms setzt man mit
verschiedenen Substraten während 16 Stunden bei 3O0C in der unter Ziffer 1 beschriebenen Weise um.
Man filtriert die Reaktionsmischung und führt eine quantitative Bestimmung des Filtrats hinsichtlich
der gebildeten 7-Amino-cephem-Verbindung unter Anwendung der oben beschriebenen Methoden 1
und 2 durch. Die Ausbeuten der als Produkt erhaltenen Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
(D-7-ACA) sind in der folgenden Tabelle II als Prozentsatz, bezogen auf die Menge des eingesetzten
Substrats, angegeben.
30
Substrat | Ausbeute an |
D-7-ACA | |
N-Formyl-cephalosporin C | 12 |
N-(2-Ch!orätho.\ycarbonyl !-cephalo | 11.5 |
sporin C | |
N-(p-Ch!orbenzoyl)-cephalo- | 8 |
sporin-C-Tetraäthylen-diaminsalz | |
N-Phenyicarbamoyl-cephalo- | 8 |
sporin C | |
N-Phthaloyl-cephalosporin C | 11 |
Desacetyl-cephalosporin-C- | 18,5 |
Natriumsalz | |
Cephalosporin-C-Buntesalz | 5*) |
*) Als Produkt erhält man das entsprechende Buntesalz.
Es ist festzuhalten, daß der wesentlichste Vorteil des erfindungsgemäßen Desacylierungsverfahrens unter
Anwendung von Kulturen von Schimmelpilzen der oben beschriebenen Art oder den daraus bereiteten Sekundärpräparaten
darin zu sehen ist, daß sich in dem Reaktionssystem nur wenig /?-Lactamase findet, die zu
einer Spaltung des Lactamrings der als Substrat verwendeten Verbindungen II oder der daraus gebildeten
7-Amino-cephem-Verbindungen I führen würde, was zur Folge hat, daß erfindungsgemäß in wirksamer
Weise und mit hohen Ausbeuten die als Produkt erwünschten 7-Amino-cephem-Verbindungen I gebildet
werden. In dieser Hinsicht ist das erfindungsgemäße Verfahren den herkömmlichen Verfahren, beispielsweise
den unter Anwendung von Bakterien durchgeführten Verfahren überlegen, bei denen der Nachteil der
jS-Lactamaseaktivität besteht.
Aspergillus sp. MA-13
1. Wachstum auf Agar
1. Wachstum auf Agar
Der Stamm bildet, wenn er auf Kartoffel-Glucose-Agarplatten bei 26° C während 7 Tagen gezüchtet wird,
eine Kolonie mit einem Durchmesser von 56 mm, dessen weißes Myzel sich radial ausbreitet. Die Kolonie
zeigt ein samtiges Aussehen, wobei sich um das Zentrum des Myzels herum vereinzelt schwarze Sporen finden.
Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplatte nach Czapeck, so bildet der
Stamm eine Kolonie mit einem Durchmesser von 42 mm, die ein samtiges Aussehen zeigt. Um die Zentren
des Myzels herum finden sich braungefärbte Sporen.
Die mikroskopische Untersuchung zeigt die folgenden morphologischen Eigenschaften: zusammen mit den
ausgereiften Konidienköpfen tritt eine Vielzahl von dicht gepackten, braungefärbten Konidien mit einem
Durchmesser von 30 bis 50 μπι auf. Die Konidiophoren besitzen eine Länge von 200 bis 300 μΐη, die fast
senkrecht stehen und an ihren Spitzen sphärische Vesikel mit einem Durchmesser von 3 bis 4 μπι
aufweisen. Die Sterigmen umfassen zwei Bereiche und die Konidien sind kugelförmig ohne Fortsätze und
weisen einen Durchmesser von 3 bis 4 μπι auf.
2. Physiologische Eigenschaften
Optimale Wachstumstemperatur:
Der Stamm wächst bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 42° C, wobei die optimale Temperatur bei
etwa 35° C liegt.
Optimaler pH-Wert für das Wachstum:
Optimaler pH-Wert für das Wachstum:
Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 2 bis 8 wachsen, wobei der optimale pH-Wert im
Bereich von 3 bis 6 liegt.
Nitrat-Anabolismustest:
Nitrat-Anabolismustest:
Negativ
Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wurde der Stamm als zu dem Genus
Aspergillus sp. gehörig identifiziert
Alternaria sp. MA-133
1. Wachstum auf Agar
1. Wachstum auf Agar
Züchtet man den Stamm bei 26° C während 7 Tagen auf einer Kartoffel-Glucose-Agarplatte, so bildet er eine
Kolonie mit einem Durchmesser von 40 mm, die an der Peripherie eine grünlich-schwarze Färbung aufweist
Die Kolonie besitzt ein flauschiges baumwollartiges Aussehen und zeigt nur geringe Sporenbildung.
Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplatte nach Czapeck, so bildet er
eine Kolonie mit einem Durchmesser von 22 mm, die an der Peripherie grau-schwarz gefärbt ist und im
Uhrzeigersinn gekräuselt ist. Um die Mitte der Kolonie herum findet sich eine dichte Ansammlung von
hellbraun gefärbtem Myzel, das eine Sporenbildung zeigt.
Züchtet man den Stamm auf einem Medium, das aus Blättern von breitblättrigen Bäumen besteht, die auf
Agar fixiert sind, so zeigt das Wachstum eine sehr aktive Sporenbildung. Die mikroskopische Untersuchung
zeigt, daß vielzellige Konidien ziegelartigen Aufbaus einzeln oder in Ketten vorliegen.
Die Sporen besitzen Abmessungen von 8 bis 1Ox 15
bis 20 μπι und sind oval oder rotationselliptisch bzw.
eiförmig geformt. In ausgereiftem Zustand zeigen sie deutliche geringfügige Vorsprünge an ihren Oberflächen
und sehen so aus, als ob sie von eins bis drei Wänden kreuzweise geteilt wären. Einige Sporen
besitzen vertikale Scheidewände. Neben diesen Sporen zeigt sich auch die Bildung von ovalen Chlamydosporen,
die rötlich-braun gefärbt sind.
2. Physiologische Eigenschaften
Optimale Wachstumstemperatur:
Der Stamm kann bei Temperaturen im Bereich von 5 bis 3O0C wachsen, wobei die optimale Temperatur
bei etwa 25° C liegt.
Für das Wachstum optimaler pH-Wert:
Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 3,5
bis 10 wachsen, wobei der optimale pH-Wert bei etwa 6 liegt.
Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wird der Stamm als dem Genus
Alternaria sp. zugehörig identifiziert.
Die zwei Schimmelpilzstämme, deren mikrobiologische Eigenschaften oben angegeben sind, das heißt
Aspergillus sp. MA-13 und Alternaria sp. MA-133 sind
die ersten Mikroorganismen, von denen gefunden wurde, daß sie Cephalosporin C-Acylase bilden. Sie
wurden bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan,
hinterlegt und haben die Hinterlegungsnummern FERM-P 3490 und 3492 erhalten. Die Stämme wurden
auch bei der American Type Culture Collection, USA, unter den Hinterlegungsnummern ATCC 20 941 bzw.
20 942 hinterlegt
Wie ganz allgemein bei anderen Mikroorganismen auch, unterliegen die oben beschriebenen Schimmelpilzstämme
Veränderungen hinsichtlich ihrer Eigenschaften. Beispielsweise können künstliche Mutanten oder
Varianten aus den Stämmen gebildet werden, beispielsweise durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht, mit
hochfrequenten Wellen, mit radioaktiver Strahlung oder unter Verwendung von chemischen Mutagenen.
Diese Mutanten und Varianten können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenso verwendet werden,
vorausgesetzt, daß sie zu der angestrebten Desacylierung fähig sind.
Bei der Herstellung der erwünschten 7-Amino-cephem-Verbindungen
I unter Anwendung der oben erwähnten Schimmelpilzstämme läßt man vorzugsweise die durch Züchten dieser Mikroorganismen erhaltenen
Kulturen oder die daraus bereiteten Sekundärpräparate unter Anwendung geeigneter Bedingungen auf die
Verbindungen II einwirken.
Zur Gewinnung der Kulturen kann man übliche Züchtungsmethoden anwenden, bei denen Kulturmedien
verwendet werden, die Nährstoffe enthalten, die normalerweise von Mikroorganismen angenommen
werden. Als Nährstoffquellen kann man irgendwelche Materialien einsetzen, die ganz allgemein zur Züchtung
von Mikroorganismen verwendet werden. Beispielsweise kann man als Kohlenstoffquelle Glucose, Saccharose,
Stärke, Glycerin, Maissirup, Melassen und Sojaöl
ίο verwenden. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen
sind: Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Fleischextrakte, Pepton, Maiswasser, Trockenhefe, Ammoniumsulfat
und Natriumnitrat. Zusätzlich zu diesen Nährstoffen kann man in geeigneter Kombination jene Additive
η verwenden, die das Wachstum der Mikroorganismen
fördern und die für die Steigerung der Desacylierungswirkung, das heißt für die Beschleunigung der
Ausbildung der Cephalosporin C-Acylase-Aktivität erforderlich sind. Beispiele für solche Additive sind
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Phosphate und ähnliche anorganische Salze. Als Züchtungsverfahren
kann man irgendein übliches Verfahren anwenden, das für das Züchten von Mikroorganismen
auf festen oder flüssigen Medien geeignet ist. Für die Herstellung in industriellem Maßstab ist die Anwendung
von submersen Kulturen besonders geeignet.
Das Züchten erfolgt unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 37° C,
vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 280C. Die
Züchtungszeit hängt von anderen Züchtungsbedingungen ab, insbesondere der Züchtungsvorrichtung und der
Zusammensetzung und der Temperatur des Mediums, wobei man die Bedingungen vorzugsweise derart
auswählt, daß der Züchtungsvorgang zu dem Zeitpunkt unterbrochen wird, bei dem die Desacylierungswirkung
der Kultur ihr Maximum erreicht. Beispielsweise beginnt im Falle von Aspcrgillus sp. MA-13 die
Acylase-Aktivität am 3. Tag aufzutreten und erreicht ihr Maximum am 4. bis 5. ZUchtungstag, wonach sie wieder
abnimmt, bis sie völlig verschwunden ist, obwohl dies in gewissem Maß von der Art und der Konzentration des
Mediums abhängt. Im allgemeinen arbeitet man bei einer Züchtungszeit im Bereich von vorzugsweise 3 bis
7 Tagen.
Wie bereits erwähnt, verwendet man die Kultur oder das daraus bereitete Sekundärpräparat zur Desacylierung
der Verbindungen II. Der Ausdruck »aus der Kultur gewonnenes Sekundärpräparat« oder die dafür
verwendeten äuqivalenten Ausdrücke stehen für irgendein Produkt, das man dadurch erhält, daß man die Kultur
in der Weise behandelt, daß man ein Produkt erhält, dessen Wirkungsgrad bezüglich der Bildung der
gewünschten 7-Amino-cephem-Verbindungen 1 erhöht ist, mit anderen Worten, ein Produkt, das für die Bildung
der gewünschten Verbindungen vorteilhaft ist Somit kann man, da für die Desacylierung nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren das Enzym von wesentlicher Bedeutung ist, das als »Cephalosporin C-Acylase«
bezeichnet wird, eine Vielzahl von Sekundärpräparaten
bo verwenden, die eine Cephalosporin C-Acylase-Aktivität
aufweisen. Beispiele für solche Sekundärpräparate sind:
das aus der Kulturbrühe gewonnene und gewaschene Myzel; zellfreie Extrakte, die man durch physikalische
oder chemische Behandlung des Myzels erhält (bei-
ί>5 spielsweise die Zerkleinerungsprodukte, die man durch
Vermählen oder durch Ultraschallbehandlung des Myzels erhält, und Myzellysate, die man durch
Behändem mit oberflächenaktiven Mitteln oder Enzy-
men bildet); teilweise oder vollständig gereinigte Präparate des gewünschten Enzyms, die man durch
Reinigen der zellfreien Extrakte mit Hilfe üblicher Enzymreinigungsmethoden erhält, beispielsweise durch
Aussalzen, durch fraktionierte Ausfällung, durch Dialyse, durch Gelfiltration und durch Ionenaustausch- oder
Adsorptions-Chromatographie; Produkte mit desacylierender
Wirkung, die man dadurch erhält, daß man das Enzym entweder physikalisch oder chemisch an
wasserlösliche, hochmolekulare Substanzen bindet; und Produkte mit einer Fähigkeit zur Bildung der 7-Aminocephem-Verbindungen
I, die man dadurch erhält, daß man das gewaschene Myzel an Kieselgur oder wasserunlöslichen hochmolekularen Substanzen adsorbiert.
Die Herstellung der Verbindungen i aus den Verbindungen II durch Desacylierung unter Anwendung
der beschriebenen Kulturen oder ihrer Sekundärpräparate erfolgt im allgemeinen in einem wäßrigen
Medium. Bevor genauer auf die Reaktionsbedingungen eingegangen wird, seien im folgenden einige der
Eigenschaften des intrazellularen Enzyms angegeben, das man in der Kultur findet, das heißt des Enzyms
»Cephalosporin C-Acylase«. Das Enzym übt seine Desacylierungswirkung bei pH-Werten im Bereich von
6 bis 8 aus, wobei nur eine verminderte oder keine Wirkung bei pH-Werten von weniger als 5 oder höher
als 9 zu beobachten ist Das Enzym arbeitet bei Temperaturen im Bereich von 28 bis 400C und verliert
seine Aktivität bei Temperaturen von mehr als 500C.
Daher wird die enzymatische Reaktion vorzugsweise bei pH-Werten im Bereich von 6,5 bis 7,5 und bei
Temperaturen im Bereich von 28 bis 40° C durchgeführt Weiterhin kann die Aktivität des Enzyms durch
Enzyminhibitoren, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) inaktiviert werden.
Wenn die Kultur oder das daraus bereitete Sekundärpräparat in Wasser unlöslich ist, wird die Reaktion in
einem System, das die Form einer Suspension hat, durchgeführt, wobei es von Vorteil ist, die Suspension in
geeigneter Weise zu schütteln oder zu rühren. Alternativ kann man die Kultur oder das Sekundärpräparat
in eine Säule einführen, so daß man die angestrebte Desacylierungsreaktion kontinuierlich
durchführen kann, währenddem man eine wäßrige Lösung der Verbindung II durch die Säule führt Die
Reaktionszeit hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise der Substratkonzentration, der Aktivität
des desacylierenden Enzyms und der Reaktionstemperatur, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von 6 bis
60 Stunden. Es ist ratsam, mit Hilfe einer Voruntersuchung die Zeit zu bestimmen, die für die maximale
Bildung der 7-Amino-cephem-Verbindung I erforderlich ist, und die Reaktionszeit auf der Grundlage des
Ergebnisses dieser Voruntersuchung zu bestimmea Die Substratkonzentration hängt überwiegend von der
Stärke der Desacylierungswirkung ab, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 10%. Weiterhin ist es
auch möglich, um eine Verunreinigung des Reaktionssystems während der Reaktion mit fremden Mikroorganismen
zu verhindern, irgendein geeignetes Antikontaminationsmittel
zu verwenden.
Die 7-Amino-cephem-Verbindungen I, die man durch Einwirkung der Kulturen der oben erwähnten Mikroorganismenstämme
oder der daraus bereiteten Sekundär Präparate auf die Verbindungen II in Gegenwart eines
wäßrigen Mediums erhält, kann man mit Hilfe irgendwelcher bekannter Verfahren reinigen. Somit
kann man das Endprodukt beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, durch Säulenchromatographie
oder durch isoelektrische Ausfällung reinigen.
ίο Man kann das Produkt auch in der Weise reinigen, daß
man die letztendlich erhaltene Reaktionsmischung, gegebenenfalls im Verlaufe einer weiteren Reinigungsstufe,
mit einer geeigneten organischen Säure umsetzt, so daß man ein Derivat des Endproduktes erhält, das
man dann in ein wasserunlösliches Salz überführt, welches man mit einem organischen Lösungsmittel
extrahiert, oder das darin besteht, daß man das Endprodukt in eine für die anschließende Isolierung aus
der Reaktionsmischung geeignete Form umwandelt.
Diese Reinigungsmethoden können natürlich in irgendeiner geeigneten Kombination angewandt werden.
Wenn nicht anders angegeben, sind die in den folgenden Beispielen angegebenen Teile und Prozentteile
auf das Gewicht bezogen, während das Verhältnis von Gewichtsteilen zu Volumenteilen sich so verhält
wie Gramm zu Kubikzentimeter.
Man beschickt eine Säule mit einem Durchmesser von 4,2 cm und einer Höhe von 28 cm mit 8,7 g (Naßgewicht)
der Myzelmasse, die man durch Züchten von Aspergillus sp. MA-13 (FERM-P 3490, ATCC Nr. 20 491) erhält
Man verbindet die untere und die obere Öffnung der Säule miteinander unter Bildung eines geschlossenen
Reaktionssystems. Dann führt man von oben 200 ml einer 0,5%igen wäßrigen Lösung (mit einem pH-Wert
von 7) des Natriumsalzes von Cephalosporin C mit einer Reinheit von 85% von oben nach unten durch die Säule
und zirkuliert das Material mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml pro Minute mit Hilfe einer
Pumpe durch das geschlossene Reaktionssystem, wobei man sicherstellt daß ein guter Kontakt der Substratlösung
mit der Myzelmasse erfolgt Man beläßt das Reaktionssystem während 17 Stunden in einem
Wasserbehälter, der bei einer konstanten Temperatur von 300C gehalten wird. Anschließend trennt man die
Myzelmasse von der Reaktionsmischung ab und wäscht sie mit Wasser. Man vereinigt die Reaktionslösung mit
den Waschwässern, wobei sich ein Gesamtvolumen von
so 220 ml ergibt Die gebildete Lösung führt man durch eine mit 60 ml vernetztem Dextran (DEAE-Sephadex®A-25
in der Chloridform) beschickte Säule. Die Säule wird zunächst mit Wasser gewaschen und dann
unter Anwendung eines ansteigenden Natriumchloridgradienten eluiert, dessen Konzentration von 0 bis 0,1
Mol pro Liter ansteigt wobei man die D-7-ACA-Fraktionen auffängt Die vereinigten D-7-ACA-Fraktionen
engt man ein und reinigt das Material durch isoelektrische Ausfällung, wobei man 90 mg 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure
mit einer Reinheit von 90% erhält Die Ausbeute an dieser Verbindung beträgt 18,1 %, bezogen auf das eingesetzte Substrat
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel IH2NCH2X(DCOOHin der X für eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest steht, dadurch gekennzeichnet, daß man auf Verbindungen der allgemeinen Formel IIHOOCCH(CHj)3CONH
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