DE3023627A1 - Mikrobielle expression von quasi- synthetischen genen - Google Patents

Mikrobielle expression von quasi- synthetischen genen

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Genentech Inc
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Description

Beschreibung
Genetische Expression .
Die DNA (Desoxyribonucleinsäure), aus der Gene bestehen, enthält sowohl Protein codierende oder nßtrukturM-Gene als auch Kontrollregionen, welche die Expression ihrer Information dadurch vermitteln, daß sie Bereiche (sites) fur die BNA-Polymerase-Bindung, Information für ribosomale Bindestellen usw. bereitstellen. Codiertes Protein wird von der korrespondierenden DNA innerhalb eines Organismus durch einen vielstufigen Prozeß exprimiert, wobeit
1. das Enzym.SNA-Polymerase in der Kontrollregion (im folgenden "Promoter" genannt) aktiviert wird. und sich an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information in Boten-(Messenger)-Ribonucleinsäure (mßNA) transkribiert wird, bis die Transkription bei einem oder mehreren "Stop"-Oodons beendet wird;
2. die mRNA-Bo tschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Aminosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei einem "Start"-Signal für die Translation, überwiegend einem ATG (das in "f-Methionin" translatiert wird).
In Übereinstimmung mit dem genetischen Code, spezifiziert die DNA jede Aminosäure durch ein Triplet oder "Codon" von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt werden aus Adenosih, Thymidin, Cytidin und Guanin, die im folgenden A, T, C oder G genannt werden. Diese treten in dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer Doppelstrang-("Duplex")-DNA auf, dessen bleibender oder
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"komplementärer" Streng aus Nucleotiden ("Basen") gebildet wird, die mit den ihnen komplementären Easen im codierenden Strang V/asserstoffbrückenbindungen eingehen. A ist komplementär zu T und C komplementär zu G. Die bisher beschriebenen und weitere Erkenntnisse, die sich auf den Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich diskutiert in Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974·) und 3 (1977)» John Wiley und Sons, N.Y. Diese und andere Veröffentlichungen, die hier angesprochen sind, sind durch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen.
Schneiden und Verbinden von
Es stehen eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekombination zur Verfügung, nach denen aneinander angrenzende Enden separater DNA-Fragmente auf die eine oder andere Weise geschnitten werden, um das Verbinden zu erleichtern. Das Verbinden geschieht durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen aneinandergrenzenden Nucleotiden, meistens durch die Wirkung eines Enzyms, einer T4- DNA-Ligase. Auf diese Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft, da durch die Wasserstoffbrückenbindungen die geweiligen Enden in die Position für die anschließende Verbindung gebracht werden. Solche Einzelstränge, als cohäsive Enden bezeichnet, können dadurch gebildet werden, daß man an stumpfe Enden unter Verwendung einer terminalen Transferase Nucleotide anhängt, und manchmal einfach dadurch, daß ein Strang eines stumpfen Endes mit einem Enzym wie λ-Exonuclease abgeknabbert wird. Meistens jedoch verwendet man Restriktionsendonucleasen (im folgenden "Restriktionsenzyme"), die Phosphodiesterbindungen in und im Bereich von spezifischen Nucleotidsequenzen, die eine Länge von etwa 4 bis
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6 Basenpaaren haben ("Restriktionserkennungsstelle"), schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre Erkennungsstellen bekannt. Siehe z.B. R. J. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Viele davon machen versetzte Schnitte, wodurch kurze komplementäre Einzelstrangsequenzen an den Enden eines an sich doppelsträngigen Fragments entstehen. Als komplementäre Sequenzen können die überstehenden oder "cohäsiven" Enden durch Basenpaarung rekombinieren. Wenn zwei unterschiedliche Moleküle mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht durch kreuzweise Paarung der komplementären Einzelstränge ein neues DNA-Molekül. Durch die Verwendung von Ligase, das die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche heilt, erhalten die neuen DNA-Moleküle eine feste kovalente Bindung. Restriktionsenzyme, die an geschnittener doppelsträngiger DNA "stumpfe" Enden hinterlassen, erlauben eine Rekombination mit anderen stumpfendigen Sequenzen durch beispielsweise T4~Ligase.
Cionierende Vektoren und rekombinante DNA
Für den vorliegenden Zweck wird folgendes "clonierender Vektor" genannt: ein nichtchromsomales Stück einer doppelsträngigen DNA, das ein intaktes Replikon enthält, so daß der Vektor repliziert werden kann, wenn er in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") durch Transformation gebracht wird. Ein auf diese Weise transformierter Organismus wird "Transformante" genannt. Derzeit sind die clonierenden Vektoren, die üblicherweise verwendet werden, von Viren und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von bakterieller DNA, genannt "Plasmide".
Die Fortschritte in der Biochemie haben in den letzten Jahren zur Konstruktion von "rekombinanten" clonierenden Vektoren geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das
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exogene DEfA enthält, bestehen. In besonderen Beispielen kann die Rekombinante "heterologe" DITA einschließen, wobei damit eine DNA gemeint ist, die für Polypeptide codiert, die normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt werden, welcher empfindlich ist für die Transformation durch den rekombinanten Vektor. Es werden somit Plasmide mit Hestriktionsenzymen geschnitten, um lineare DUA zur Verfügung zu stellen, die verbindbare Enden hat. Diese werden an ein exogenes Gen gebunden, das ebenfalls verbindbare Enden aufweist, um ein biologisch funktionierendes Teil zur Verfügung zu stellen, das ein intaktes Replikon und eine phänotypische Eigenschaft aufweist, die benützt werden kann, um Transformanten zu selektieren. Das rekombinante Teil wird durch Transformation in einen Mikroorganismus überführt, und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel ist5 große Populationen zu erhalten, die Kopien des exogenen Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die Expression des Proteins, für welches das Gen codiert. Über die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung ist in extenso berichtet in Miles International Symposium Series 10: Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers und Bosseff, eds., Raven Press, N.Y. (1977).
Expression von rekombinanter DFA
Heben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrößern, hat es Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene codieren. In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen für das Hirnhormon Somatostatin unter dem Einfluß des lac-Promoters in einem E. coli Bakterium exprimiert (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)). Kürzlich
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gelang auf die gleiche Weise die Expression der A- und B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das Hormon bilden (D.V. Goeddel et al., Proc. Nat 1I. Acad. Sei., USA 76, 106 (1979)). In jedem Pail wurden die Gene vollständig durch Synthese konstruiert. In jedem Fall wurden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, wodurch dessen Herstellung in konjugierter Form nötig ist, d.h. als Tandem mit einem anderen Protein, das das gewünschte Produkt durch Kompartimentierung schützt und das außerhalb der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden, veröffentlichten englischen Patentschriften des Anmelders der vorliegenden Anmeldung beschrieben: GB 2 007 675 A; GB 2 007 670 A; GB 2 007 676 A; GB 2 008 123 A,
Während sich der Weg über synthetische Gene in den bisher diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmäßig erwiesen hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den lall von sehr viel größeren Proteinprodukten, z.B. Wachstumshormonen, Interferon usw., deren Gene in korrespondierender Weise komplexer und weniger geeignet für eine leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es wünschenswert, derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes Protein zu exprimieren, da die Notwendigkeit von deren Expression die Verwertung von Material erfordert, das innerhalb des Organismus besser für die Konstruktion des angestrebten Produkts verwendet werden könnte.
In anderen Arbeiten ist die Expression von Genen versucht worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden, sondern durch reverse !Transkription von korrespondierender Messenger-ENA, die aus Gewebe gereinigt wurde. Dieser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet. Erstens
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kann die reverse Transkriptase die Transkription von der mRNA kurz vor der Fertigstellung der cfflA für die komplette, gewünschte Aminosäuresequenz beenden. So haben beispielsweise Villa-Komaroff et al. eine cBÜTA für Ratten-Proinsulin erhalten, dem die ersten drei Aminosäuren des Insulinvorläufers fehlten (Proc. Nat 1I. Acad. Sei., USA 75, 3727 (1978)). Weiterhin hat die reverse Transkription von mRNA für Polypeptide, die in Vorlauferform exprimiert werden, eine cMA für den Vorläufer ergeben, statt des bioaktiven Proteins, das man erhält, wenn in einer eukaryotischen Zelle FührerSequenzen (im folgenden Leader-Sequenzen) enzymatisch abgetrennt1 werden. Bisher ist keine Bakterienzelle aufgezeigt worden, die diese Fähigkeit hätte, so daß das mRNA-Transkript eher die Expression von Produkten ergeben hat, die die leader-Sequenz der Vorläuferform enthalten, als das bioaktive Protein selbst (Villa-Komaroff, a.a.O. (Ratten-Proinsulin); P.H. Seeburg et al., Nature 276, (1978) (Rattenwachstumshormon)).
Schließlich haben vergangene Versuche durch andere zur bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offensichtlich nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich ist, z.B. Villa-Komaroff, a.a.O. (Penicillinase-Proinsulin); Seeburg, a.a.O. (yS-Lactamase-Wachstumshormon).
Menschliches Wachstumshormon
Menschliches Wachstumshormon ("HGH") wird abgesondert in der menschlichen Hypophyse. Es besteht aus 191 Aminosäuren und ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 21.500, mehr als dreimal so groß wie Insulin. Bis zur vorliegenden Er-
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findung konnte menschliches Wachstumshormon nur arbeitsaufwendig aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen werden — der Hypophyse aus menschlichen Leichen. Die daraus folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei der Behandlung von durch Funktionsstörung der Hypophyse verursachtem hypophysären Zwergem-mchs begrenzt, und sogar hier wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen vermutet, daß vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge erhalten werden kann, daß nicht mehr als 50 % der Betroffenen damit behandelt xirerden können.
Zusammengefaßt besteht daher eine Notwendigkeit für neue Methoden, um HGH und andere Polypeptidprodukte in großen Mengen herzustellen«, Diese Notwendigkeit ist besonders akut in dem FaIl3 wenn Polypeptide zu groß sind, um organische Synthese zuzulassen oder9 aus diesem Grund, mikrobiologische Expression von vollständigen synthetischen Genen. Die Expression von Säugetierhormonen von mRWA-Trans-= Skripten hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeiten,* die dem synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits jedoch bis heute lediglich die mikrobielle Produktion von bioinaktiven Konjugaten erlaubt, von denen die gewünschten Hormone nicht brauchbar getrennt werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt Methoden und Mittel zur Expression quasi-synthetischer Gene zur Verfügung, wobei durch reverse Tr ans skr ip tion ein ire sent Ii eher Bestandteil,. vorzugsweise die Mehrheit der codierenden Sequenz zra? Verfügung gestellt xtfirds ohne den arbeitsaufwendigen Uiiweg der vollständiges synthetischen Konstruktion, während die Synthese des Rests der codierenden Sequenz sin komplettes Gen liefert, das fähig ist zur Expression des gewünschten
Polypeptids, ohne die Begleitung von bioinaktivierenden Leader-Sequenzen oder anderem Eremdprotein. Alternativ dazu kann der synthetische Rest ein gegen Proteolyse resistentes Konjugat ergeben, so gebaut,daß das Schneiden des Iremdproteins außerhalb der Zelle ermöglicht ist, wodurch die bioaktive lorm erhalten wird. Die Erfindung stellt folglich Methoden und Mittel für die mikroMeile Produktion von zahlreichen Materialien zur Verfügung, die bisher lediglich in sehr begrenzter Menge durch kostenaufwendige Extraktion aus Geitfebe hergestellt werden konnten und weitere, die früher zur industriellen Herstellung ungeeignet waren. In ihrer- am meisten bevorzugten Form stellt die Erfindung die erste Möglichkeit dars mit der ein medizinisch signifikantes Polypeptidhormon (menschliches Wachstumshormon) bakteriell exprimiert wird, wobei sowohl die intrazelluläre Proteolyse als auch die Notwendigkeit der Korapartimentierung der bioaktiven Form mit Eremdprotein bis zum extrazellulären Schneiden vermieden wird. Der mikrobielle Ursprung für menschliches Wachstumshormon, ermöglicht durch die Erfindung, bietet vorerst einen reichen Vorrat des Hormons für die Behandlung von Zwergenwuchs 2 zusammen mit anderen Anwendungsmöglichkeiten, die bisher jenseits der Kapazität der Hormone lagen, die aus Geweben zu erhalten waren, einschließlich diffusem Kagenbluten, Pseudoarthrose, der Therapie von Brandwunden, Wundheilung, Dystrophy und der Heilung von Knochenbrüchen.
Die Art, auf welehe diese und andere Ziele und Vorteile der Erfindung erreicht werden können, wird aus der folgenden Spesialbeschreitong uaratändlich sowie aus den "beigefügten Zeichnungen5 die sich auf ein "bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung beziehen. Es seigern:
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Fig. Λ das Syntheseschema für die Konstruktion eines Genfragments, das für die ersten 24· Aminosättren des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern, die beim Olonen verwendet werden« Die Pfeile im codierenden oder oberen Strang ("U") und in dem komplementären oder unteren Strang ("L") bezeichnen die Oligonucleotide, die miteinander verbunden wurden, um das gezeigte Fragment zu bilden;
Fig. 2 die Verbindungen der "U"- und "L"-01igonucleotiden, für die Bildung des Genfragments aus Fig. 1, und dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendem Vektor;
Fig. 3 die MA-Sequenz (nur der codierende Strang) eines Haelll-Restriktionsenzymfragments eines HypophysenmRNA-Transkripts, mit den numerierten Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons, für das sie codieren. Schlüsselrestriktionserkennungsstellen sind bezeichnet, ebenso MTA (auf "Stop" folgende) für nicht translatierte mRlTA;
Fig. 4 die Konstruktion eines clonierenden Vektors für ein Genfragment, das für die Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, welches nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion dieses Genfragments als komplmentäre BUA durch reverse Transkription von mRNA, die aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert wurde;
Fig. 5 die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien zur Expression des menschlichen Wachstumshormons
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fähig ist» beginnend Bit den Plasaiden der ügtarea 2 und 3.
geserella Weg der Erfiaeltisg ist di© Soabinatioa mehrerer 08sfragaeate Ib sines einzigen eloHierend.es tfetetor, wobei diese ßesfragsest© in Kombination für die Expression des gewünschtes Ero&ulsts codieren» Ton den Gasfragmenten ist rniad@stans eiaes ©in eMA-Eragsent» das dH^cli reverse Sranskription vom sRliA abgeleitet ist9 welche aus Gowebe isoliert wurde, wie äiarch die Methode aacsn A. tTlirieh et al., Science 196, 1313 (1977). Die ©DIA stellt ©inen wesentlichen Bestandteil, vorzugsweise Mindestens eise Mehrheit der Godons für das gewünschte Produkt sur ¥erfügting9 während restliche feile des Gens s^thetisch erhalten werden. Die sjBthetisehen und die ÄMA-Translcriptfragaente werden getresat geelont, um ausrsichende Mengen für den Einsatz in äem späteren !Combinationsschritt zur Verfügung zu stellen.
Eine Tielzahl von Überlegungen beeinflußt die Verteilung der Codons für das Endprodukt, a.B. zwischen synthetischer und cBE, ganz besonders die MA-Sequenz der komplementären MA9 wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxam und Gilbert, Proc, Nat«1. Acad. Sei. USA 7^» 560 (1977). Komplementäre MA, die durch reverse Transkription erhalten wird, wird auf unveränderliche Weise Codons für mindestens eine Carboxyl-Endgruppe des gewünschten Produkts enthalten, ebenso wie andere, stromabwärts von einem oder mehreren Translations-Stopsignalen, benachbart zum Carboxylende liegende Codons für nicht translatierte mRÜTA. Di© Anwesenheit von DNA für nicht translatierte HNA ist weitgehend unerheblich, obwohl übermäßig verlängerte Sequenzen dieser Art z.B. durch Schneiden mit Hestriktionseazymen entfernt werden können, um
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zelluläres Material au erhalten,, das für die Beplikation und Expression der DlA für das angestrebte produkt "benötigt wir do In "besonderen lallen wird die cDSSTA Godons für die vollständige j gewünschte iminosäureseqnenz on thaitan, ©Tbeaso wie fremde Godons stromaufwärts vom Aminoende des angestrebten Produkts ο Zum Beispiel x-jerden viele, wenn nicht alle, Pol;ypeptidhormone in einer Vorlauf er form eicprimiert mit Leader= oder Signalsequenzen für ein Protein, das beispiels-= weise beim Transport zur Zellwand beteiligt isto Während der Expression von eukaryotischen Zellen werden diese Sequenzen enzymatisch beseitigt, so daß das Hormon in seiner freien, bioaktiven Form in den periplasmatisehen Raum eindringto Man kann sich jedoch nicht darauf verlassen, daß mikrobielle Zellen diese Funktion ausführen, und es ist folglich x^ünschens·= wert, Sequenzen, die für solche Signale oder Leader-Sequenzen codieren, vom mBETA-Transkript au entferneno Im Yerlauf dieses Entfernungsvorgangs geht auch das Translations= Startsignal verloren, und nahezu immer werden ebenso einige Godons für das angestrebte Produkt entfernte Bis synthe» tische Komponente des quasi-synthetisehen Gengrodukts des? Erfindung ersetzt diese lotatgsnannten Godonss ©Tbesso atollt si® ©i® asues SraBslations^Startsignal ^m* ¥®rfügmag, wobei des1 !faktor 9 in &<$m sich das Hgrtei&gstfi lotjztllelj ent=
fe Isoiaaa glfostig
iehkeit aiaer reichend nah® am Arainoend®
30064 f
BA.D
Polypeptids liegt 9 um die Ifatwendigkeit für eine mmfangreiche Synthese der Gsnkoiaponente zu vermeidens die aiclit iron TsMMA abgeleitet ist= In jeder cDMls die für das ge= i-nmaohtQ Polypeptid usd eina Leader= oder ander© teoinakti* liierende Sequenz codiert, wird sich daher die Grenze zwischen den Codons der letzteres und denen des reifen Poly= peptids an der Aminosäurensequenz des reifen Poljrpeptids zeigen,, Han kann einfach in die Gene verdauen, die für das Peptid der Wahl codieren, und so die ungewünschten Leader- oder andere Sequenzen entfernen«, Wenn daher beispielsweise eine cDFl folgender Struktur gegeben ists
TThh&CCCTGKTCGT
IhMSTCGGGkC1ShGCh
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wobei der Endpunkt der "Verdauung durch siaea Pfeil Tbe» seichaet ist, ksssn ®ine R®aktions"badiagiiag für ©ine IsrojaiJ-Qleass-YsrdsiiuHg gswählt [email protected] ^ um ö&q obeiiea
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Stole allgouQiia A0 l@3?a"fe©i?g9 K!/i S U.E. J'TQGBaa waä ©©o? Sas
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Vorzugsweise kann man gans einfach eine Eestriktionserkemmngsstelle en einem passenden Punkt innerhalb fies Bereichs der clli, die für das gewünschte Produkt codierts konstruieren5 durch Anwendung der "unpassenden" (mismateh) Beparatursynthes©t@chnik voa A0 Hasin et al., Proc. Hat0I0 lead» Sei. USA ?59 4268 (1978)o Sei dieser Technik können eine oder mehrere Basen in sin© foeetahead© DNA-Seqaenz substituiert werden9 wobei !Primer verwendet werden, die den unpassenden Substituenten enthaltene Mindestens sieben palindromartige 4-Basenpaarsequensen werden selektiv durch bekannte Restriktionsensyme erkannt, das siad AGGf (AIuI), GOGa (Spall), CGOG (Thal), GATG (SauJA), GCGG (Hha), GGOG (Haelll), und TGGA (£aql) o Wenn di® ©BlSTA-Sequenz @ia© Sequenz enthält 9 die sich von einer derartigen Erkennmagsstelle in nur einer einzigen Base unter !scheidet, was statistisch sehr wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatursynthese eine replizierte cMi au erhalten, die die geeignete, substituierte Base enthält wad damit die gewünschte Restriktionserkennungsstell©ο Durch ©inen Schnitt wird die DNA vom unerwünschten leader entfernt, tionaeh durch Synthese die Godons wieder angefügt werden, die für die Expression des kompletten Polypeptide benötigt werden. Zum Beispiels
-Leader
Godon für gewünschtes Produkt—*|
cDNA
CAGG
"mi smatchMRep8ratur synthese
CCGG'
quasisynthetische DNA
Codons für gewünschtes > Produkt »\
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Es ist natfelieiL ©ffeiagiehtlich, daß läEgsr© H@strxktions~ ©Efessmangsstalien auf asnliche ¥eis© <§±s,g®s©t&t werden "feon= sea5 uo dae ©rwunsett ist, oder daß eburelh, giikztssive Separate 4-Basenpaar-Restai^tionserk@ammgsst©lX@iä g@"b£ld@t werden !sonnas«, im lediglieli 2 Basen gtmsisgara alt &®τ ErkensungssteXXe am gex-jünsehtea. Punkt erscheinen nmso
Es -cjeraen aich inwendmigsiDoglichkeiten seigeng "bei denen es wünschenswert ist, nicht nur die AsinosHurssequenz des angestrebten Produkts, sondern auch eine bestimmte Henge fremdes, aber speziell hergestelltes Protein au essprimisren. Tier derartige Anwendungen werden durch Beispiele erwähnt werden. Erstens kann das quasi-synthetische Gen ein Hapten oder eine andere immunologische Determinante repräsentieren, auf welehe Immunogenität durch Konjugation au einem zusätzlichen Protein übertragen wird, so daß eine Yaccine produziert wird. Siehe allgemein GB-Patent 2 008 123 A. Es kann jedoch wieder aus Sicherheitsgründen wünschenswert sein, das angestrebte Produkt als eine Konjugate eines anderen, bioinaktiven Proteins zu exprimieren, die so gebaut sind, daß extrazelluläres Schneiden ermöglicht ist, um die aktive Torrn zu erhalten. Drittens werden Anwendungen vorgestellt, bei denen Polypeptide mit Transportsignalen dem gewünschten Produkt vorausgehen, um die Herstellung des Produkts durch Ausschleusen durch die Zellmembran zu ermöglichen, solange das Signal-Peptid danach geschnitten werden kann. Schließlich kann eine itemdverbindung verwendet werden, die so gebaut ist, daß ein spezifischer extrazellulärer Schnitt möglich ist, um das angestrebte Produkt abzuschirmen, das sonst empfindlich wäre für den Abbau durch endogene Proteasen des mikrobiellen Wirts, Zumindest in den letzten drei Anwendungsbereichen kann der synthetische molekulare Adapter, der verwendet wird, um die codierende Sequenz des mHHA-Transkripts zu vervollständigen, zusätzlich Godons eingebaut
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haben für Amino säure sequenasa,, die spezifisch geschnitten werden3 beispielsweise durch enzymatisch^ Wirkungo Beispielsweise schneidet Srjpsin oder Chymotrypsin bei Arg-Arg oder Ljs-Lys uaw. Siehe GB»Patent 2 008 123 A0
Aus dem bisher Geschilderten ist ersichtlich, daß die Erfindung in ihrem breitesten Bsreieh die mannigfaltigsten Anwendungen erlaubt „ von denen alle die folgenden Eigenschaften gemeinsam aufweisen?
— Es wird ein mRWA-Sranskript verwendet 9 das für einen wesentlichen Bestandteil der angestrebten Aminosäuresequenz des Polgrpeptids codierts das jedoch,, falls es alleine esqpri= misrt wirdj ein vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren t-nirdes entweder kleiner oder großer als das angestrebte Produkt ι
— Protein codierende Godons für andere als solche Aminosäuren^ die im angestrebten Produkt enthalten siad9 x-jardea, falls vorhanden.
Fragmente„ Si©.für d©a Seat der
öas iSifl^Trassteipt xm& übe (üe)
gfej daait @atu©cl©i? fias angast^s^t® ohae fr
das angestrebte Produkt konjugiert IuIt3 aber
spezifisch abtrennbar von Itoaisdproteia. repli
esprisder-t wirdo
Ba:s Produkt der Suppression wird satürlieh Is ,jede® lall sit der Aminosäure beginnen,, für dl© das translations-* Startsigaal eediert (für dea I'all non Αΐ§9 f-Methionin) Han kann sswarten9 daB dies® Asiaosäm?© Intrazellialäs?
entfernt ui2?d9 oder jedenfalls die Bloaktiirltät des re= Produkts im wesentlichen unbeeinflußt läßt
die ErflndBag ein Yerfahrsn allgenalner Anwendbar= Is@It "bei öer Produktion von nut fliehen !Proteinen 9 ein= schließlich Antikörpern9 lagyasn Bad ähnliehern zvs ¥er= fügnag stellt s Ist die lsfliadiaag Ia "bassadereii aiaf dl© ·ί?οη PolgrpoptifiliorEQSien fön Sängetierea und
SiifostanzeE. alt asdlslBisolieE' Anwondimg gerichtet,,
gg gastroiatastlnala InMbltorpolypsp^i^·® 9 P©l2?peptisLe der Bauchspeicheldrüse s Afiraaokortllsotropin9 s=Iaa.©X"pMne, Interferon 9 Oroldnass, Bliitgerlaaiaagsfak-Heaseiallehss Albuiaia umu Tm folgenden wird eine sfosag di© di© Irfiadimg erläutert, das? @ia qia,a@i=a3FEifel,©tiseh@i GeE9 fias
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^QbIOE1S für rao®s©M.£©fe©si
SuIBOE1SIa g©u©sis©ia iaaefe, &<sm
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Ao Ullrich .et al«,. Science 1962 1313 Doppelst3eang-( "ds")^eMA wird präpariert aus 5 ßJB RUA, im wesentlichen wie beschrieben "bei Hiekens et alO9 Jo Biolo enemo 253 2483 (1978), mit der Aosnahiae, SaS fii©
Acad. Sei«, USA 65, 168 (197O)) für di© BfA-Pölgnaerase I la der Zvjeit-Strangsynthese eingesetzt x-rardso Bas muster iron HGS ist derartig, daß Ha© nungsstellea in der 5" nicatcodierenden Hegion und ia Sequens, die für die Amino säur en 23 und 24 des HGH codieren, vorhanden sind9 wie geneigt in Fig» 3° Eine Behandlung der ds-HGH-cMA mit Haelll gibt ein DIA-Fragaent von 551 Basenpaaren (81IJp8Os äie f&r fii@ Aminosäuren 24 bis 91 des HGH codieren. 90 ng der eDHA wird mit Haelll "behandelt, in einem 8 %igen Polyaerylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und die Region "bei 550 bp eluiert. Man erhält annähernd 1 ng cDNAE .
pBR322, hergestellt nach F, Bolivar et al·, Gene 2 (1977) 95-113» wird als clonierender Vektor für die cDUA ausgewählt. püR322 ist vollständig charakterisiert,(J9 G. Sutcliffe, Cold Spring Earbor Symposium 43, 70 (1978)), ist ein mit zahlreichen Kopien (multicopy) replizierendes Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetracydin-Resistenz aufweist, die auf den Einschluß der korrespondierenden Gene ("ApR" bzw. "Tc11" in Fig. 4) zurückzuführen sind, wobei das Plasmid Erkennungsstellen für die Bestriktionsenzyme Pstl, EcoRI und Hindlll enthält, wie in der Figur gezeigt.
Die Schneideprodukte von Haelll und Pstl haben stumpfe Enden. Es kann folglich das GC-Anhängeverfahren nach Chang A.CY. et al., Nature 275,617 (1978) angewendet werden, um
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die stumpfendigen Produkte der Fstl-Schnitte von pBR322 mit der Haelli-Verdauung des mRNA-Transkripts zu verbinden, so daß das c!WA-Fragment in die Pstl-Erkennungsstelle von pBR322 eingefügt wird, und zwar in der Weise, daß die Haelll-HeBtriktionserkennungsstellen (GG^CC) auf der cMA und die Pstl-Hestriktionserkennungsstellen (OTGCA^G) an federn Ende des eingeschobenen Teils wieder hergestellt werden.
Es wird also terminale De soxynucleotid-Transferase (TdT) verwendet, um annähernd 20 dC-Eeste an das 3'-Ende anzufügen, wie "bereits früher beschrieben, Chang A.Y.C., a.a.O. Auf ähnliche Weise werden an das J'-Ende von 60 ng J?stl-behandeltem pBR322 etwa 10 dG-Reste angehängt. Das Verschmelzen der dC-ergänzten ds-cDHA mit der dG-ergänzten ?ektor-B!TA wird in 130 μΧ von 10 mti Tris-HCl (pH 7 »5) 100 mM UaCl und 0,25 mM EDTA durchgeführt. Die Mischung wird auf ?0° C erhitzt, langsam (12 Stunden) auf 37° C abgekühlt, und schließlich auf 20° C (6 Stunden) abgekühlt, ehe es zum Transformieren von E. coli x1776 verwendet wird. Eine DHA-Sequenzanalyse des Plasmids pHGH31 nach der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Hat'l. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977), nach dem Clonen des Plasmids in x1776, stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 bis 191 des HGH überein, wie in Pig. 3 gezeigt.
Der Stamm E. coli K-12 x1776 hat den Genotyp P"tonA53 % dapDB, minA1, BUpE42, Ä40(gal-uvrB) , ^J", minB2» rfb-2, nalA25, oms-2, thyA57* * metC65« oms-1,Δ29(bioH-aad), cycB2, cycA1, hsdR2. X1776 wurde vom National Institutes of Health als ein EK2 Wirts-Vektor-System bescheinigt.
X1776 hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelinsäure (DAP) und kann nicht die Mukopolysaccharidcolan-(colenic)-
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säure synthetisieren. Die Zelle -unterliegt daher dem DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in denen DAP "begrenzt ist, jedoeh genügend Jjährsuhstrat vorhanden igt, um den zellulären Stoffwechsel und das zelluläre Wachstum aufrechtzuerhalten. Der Sta» ist Thyrain- oder Thymidin-bedürftig und unterliegt dam Thymin-Mangeltod mit Abbau der DWA, wenn TbymiB und ÜJhyraidin in der Umgebung fehlent jedoch genügend Mtesubstrate vorhanden sind, um die Stoffwechse!aktivität aufrechtzuerhalten. X17?6 ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig zu überleben, d«^ unfähig, ain© Paasage durch den Intestinaltralct von Hatten zu überleben,. 2s1776 iat hochgradig empfindlich gegen Dete^geatie®, Antibiotika, Arzneimittel ttnö QhemiltalieB« si776 Icsnn weder die Dunkelreparatur aoch die PhotQ=Heaktivi®X"uag von W-= .induziertes Schäden durchführaa .vmä ist dahes» vm meferare Größenordnungen arapfte-dlioher g©gaa .Sonnenlicht als der Wildtypstamm von B* eoli. χ1?7δ ist resistsat g©g®B visle transduzierend© Phagen und läßt "bei der Konäugatioa nur mangelhaft die genet is ©he Ilbertrsgiiag von vialen varschi©- denen fypen voabai d@a? Kon^gati©^ beteiligten Plasraidsa au, was auf tie Jtewes@»heit ¥ob VQrschiedQnan Mutatioatm zurückzufüteeB ist. s177ö ist resiatent g©g©n Haliöixin« säure, Gycloaariii un4 teimet^Qp^iH« Biest SubstsBZ©a können daheE1 dais lfeSium SBg©g©b©a imvä®M? mm des StaroBs eu ®TUQ&li®k®n wi& ein©
sowohl ia li-lateraadiix® (L-brotfe) als (Penaaeay te©tfe)? weim dies©© ©it 100y?4g DilP/ol 5?hyiaidiB/iil üBppl®raentiert wisd Wiü erreicht eine dichte von 8°10 χ 10 Zellen/©! im der stationären Pfesae Vorsichtiges j Kreisförmiges Hin» raid Herschütteln
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©ine Zeitspanne tob 1 Ms 2 Hinuten suspendiert die Zeilen vollständig bei Erhalt der Ifabensfälligkeit von 100 %. Zusätzlich© Details bezüglich 3d776 sind su finden bei Ι« Gurtis et al., Molecular Cloning of BeeomMaant BRa, 99-177, Scott und Werner,. edaM Academic Press (ϊί.Υ. 1977) χ 1776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungastelle American Tjp® Culture Collection am 3. Juli 1979 imter der Nummer ISGG 31537 hinterlegt, '
2® KoHstruktioö und Olonie^en des
G@afeagja©sts (figo 1 ußi 2)
ist Teil der Strategie iSf die fsrnstruktioE des HGH-
©©sg5 daß eis s^ßtßetisalies Fragment wi2*ds äas isfeBHipfaseiie lestriktioESscaneide-
aufweist q its ass ä©ß Fußktes sitzen, an d©nen Bn #es fpagg!3©®t . äas mPHA-Trajsakripfc angeloilipft weräeii soll. Baa'systlietiaolie ©an Süv ii© o^st©B 24 Imino säuren des H§H entfeilt daiier^ uie in Figo 1 geaeigtj ©ine auf <äi© Aminosäure 23 folgosäe HsQlJI-SüliBeideerkennungsst;©Xl©, Das äiatals lade des sjötfeetigohen Iregiaents wird mit eiaeu TerfeiaduBggeleaent (im folgeadeB "iiinkss5" ^©^seaen, dsa di© Vs^sstael^iaBg sit eisern Eiasaistrang- ©sie erlaubt „ äas &rcii !©str-ifetioagselinitte te dem Plasrsid erlialteo wird, la üaa ias oliiA-TraBskript isnd synthetisöii© FrogEsst !©tstlloM ©iBgebaut werden
Wie in IPIg0 1 gezeigt, feaböB ü© 5J°Bß4en ü®a ä©ppelati?äsgigen F^agsenta eiasselsteäagig© coöäsii?© Enden für Sie ScoBXoimd Hindlll-BastrilstiQnaeBdoniicleasen, um äie Plasraiö-Koasteufetion ssu erleichtern, Bas C©don
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BAD ORIQlNAL
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für Methionin atn linken Ende stellt eine Erkennumgsstgll@ für die Initiation der !Translation sur Verfügung» Es werden zwölf verschiedene Oligontacleotide, die in ihrer G-roB© von undeksraer bis hexadekamer variieren, synthetisiert, und zwar nach dem "bewährten Pfoosptiotriester-Verfehren nach Crea, H. Eroc. Met1!,, Acad. Sei. USA 759 5765 (1978). Biese Oligonucleotide, U^ bis U6 und L^ bis L6 sind durch Pfeile bezeichnet·
10 JUE Substanz von Up einschließlich U^ und L2 einschließ» lieh Lg werden unter Verwendung der Τ4-Polgmucleotidkinas© und (y32_p)_4Qj!> phosphoryliert, und swar nach dem veröffentlichten Verfahren von Goeddel, B0If0 et al» Proc. Mat 1Io Aead. Sei. USA 76, 106 (1979).
Es werden drei getrennte ü}4~Ligase~katalysierte Heaktioasm durchgeführt: lOyt^g des 5'~0H»S1ragraents U^ werden mit phosphoryliertem ^5 Lc.und Lg vereint5 phosphoryliert©s ^3» U/}., Lx und L^ \ferden vereint 5 tfeiterhin werden 10yuiS des 5'-0H-Fragments L^ mit phosphoryliertem L2, Uc und Ug vereint. Diese Verknüpfungen werden bei 4° G für sechs Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300ul von 20 Tris-HGl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 tnM Bithiothreitol und 0,5 mM ATP enthält, wobei 100 Einheiten $4-Ligase verwendet werden. Die drei Verknüfpungsmischlingen werden dann vereint, Ί00 Einheiten T4~Ligase zugegeben, worauf man die Reaktion 12 Stunden lang bei 20° C ablaufen läßt. Die Mischung wird dann mit Äthanol ausgefällt und auf einem 10 %igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen. Die Bande, die bis zur 84- Basenpaar-Stelle gewandert ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert. pBR322 (1yitg) wird mit EcoRI und H'indlll behandelt, das große !Fragment durch Gel-Elektrophorese isoliert und mit der synthetischen DHA verknüpft. Diese Mischung wird ver-
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wendet, um den Stamm E. coli K-12 294 (end A1 thi~, hsr", hsmfe +) zu transformieren, tier Stamm 294 wurde am 30. Oktober 1978 "bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection unter der Kummer ATCC 31446 ohne Einschränkungen hinterlegt. Eine Sequenzanalyse nach der Maxam und Gilbert-Technik, a.a.O., bei der Ecoßl - Hindltl-Insertion von einem Plasmid pHGH3 einer Transformante bestätigte das in Mg. 1 Dargestellte.
3. Konstruktion eines Plasmids für die bakterielle Expression von HGH (Pig. 5)
Mit dem synthetischen Fragment in pHGH3 und dem mßlTA-Transkr'ipt in pHGH31 wird ein zur ßeplikation fähiges Plasmid konstruiert, das beide !Fragmente enthält, wobei das Expressionsplasmid pGH6 verwendet wird, wie in Fig. 5 gezeigt. Bas Expressionsplasmid, das einen lac-Fronoter als Tandem enthält, wurde zuerst folgendermaßen konstruiert. Ein 285 Basenpaare langes EcoBI-Fragment, das zwei 95 Basenpaare lange TTV^-lac-Promoter-Fragmente enthält, welche durch ein 95 Basenpaar langes,.heterologes DNA-Fragment abgetrennt wurden, wird aus dem Plasmid pKB268 isoliert, siehe E. Backman et al.,'Cell. Vol. 13, 65-71 (1978). Das 285 bp -Fragment wird in die Ecoßl-Erkennungsstelle von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGH1 isoliert, in dem die Promoter auf das Gen für Tetracyclin-ßesistenz hin und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind. Die distal zu dem letztgenannten Gen gelegene Ecoßl-Erkennungsstelle wird durch teilweise Ecoßl-Verdauung zerstört, die resultierenden einzelsträngigen Ecoßl-Enden mit DNA-Polymerase I repariert und das Plasmid durch stumpfendige Verbindung wieder in Bingform gebracht. Das resultierende Plasmid, pGH6, enthält eine einzige Ecoßl-Erken-
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nungastelle, die passend liegt im Hinblick au? das Promoter-System, in dag das komplette Gen für HGB eingebaut werden kann,
Um das synthetische fragment fur die Vereinigung mit dem RNA-3Jranskript fertigzustellen, werden 10/tg von pHGH3 mit UcoRI-und Eaelll-Bestriktionsendonuoleasen geschnitten und das 77 Basenpaare-Fragment, das die codierenden Sequenzen für die HGK-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird aus einem 8 %igen Polyacrylamid-Gel isoliert.
Als nächstes wird das Plasraid pHGH31 (5yoig) mit Haelll geschnitten. Die 551 bp HGH-Sequenz und ein mitgewandertes 540 bp Haelll-Fragment von pER322 werden durch Gel-Elektrophorese gereinigt. Sine anschließende Behandlung mit Xraal schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare von der 3'-nichtcodierenden Region entfernt werden· Das resultierende 512 bp-3?ragment wird von dem 54Q bp pBB322-Haelll-Stück durch Elektrophorese in einem 6 S^igen FdIyacrylamid-Gel getrennt. O,3μ% des 77 bp EcoBI-Haelll-Fragraents werden mit T4-Ligase in einer 16^1 Reaktion 14 Stunden lang bei 4° G polymerisiert. Die Mischung wird dann für 5 Minuten (51) auf 70° C erhitzt, um öie Idgase zu inaktivieren, anschließend mit EcoRI behandelt (um Fragmente zu schneiden, die aufgrund ihrer EcoRl-Erkennunga« stellen dimerisiert haben), weiterhin mit Smal behandelt (um X«4rBii}ere zu schneiden), wodurch tic 501 bp-fragaent mit eine^ EcoRI-Iade^ See cchäeiv ist, ur?4 einen gusel das stumpf ist, erhalte» τ4$$, looh de? Jttitt|jpil?$ mt 6 %igen FüIsacujIaBiä-Gel vsWXt rsati annühttp4 M »8 fragment a * Sa aollte benerfet wwdan t 4s® pXaeeid paK6 ls*ine ZmaX-I^keimwtgiitellf kennt jedqsli die gleich« Zrleenmmgasteile wie schneidet gar.su durch die mtt·, ao da3
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halten werden. Das Sma-geschnittene Ende dea yragmenta, das von gHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig an pGH6 gebunden werden.
Das Expressionsplasmid pGH6, das den lac~UV5-Promoter in Tandemform enthält, wird sukaessive mit HindlU, Nuclease und EcoRI behandelt und durch Gel-Elektrophorese gereinigt. 50 ng des resultierenden Vectors, der ein cohägives EcoBI-Ende und ein stumpfes Ende aufweist, wird mit 10 ng der 591 bp HGH-MTA verbunden. Diese Verbindungsmischung wird verwendet, um E. coli xi776 zu transformieren. Die Kolonie® werden durch Waohstum auf Tetracyclin (12,5/tg/el) selektiert. Es ist bemerkenswert, daß die Insertion des hybriden HGH-Gens in pGH6 den promoter für die Tetracyclin-Ilesiatenz zerstört, daß jedoch der Taudem-lac-Proraoter das Durchlesen der Strukturgene für Setrscyolin-Heaistens erlaubt und auf diese Weise die Selektionecharakteristik trhalten bleibt. Es wurden annähernd 400 Tran »formant en erhalten«. Mit der Grunstein-Hognesa-Kethode, Proo, Nat'l. Acsd. Sei. TISA 72, 3961 (1975), wurden durch Pilterhybridisierung 12 Kolonien identifiziert, die die HGH-Sequens enthalten. Die aus drei dieser Kolonien isolierten Plasmide ergaben das erwartete Hestriktionemuster, wenn sie mit HaellX, PvuJI und Pstl geschnitten wurden. Von einem Olon, pHGH107, wurde die MA-Sequenz bestimmt.
Menschliche« Wachstumshormon, da« von Trtssforauinten produsiept wird, fcsnn ohn® wtitfree dupoh
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D121O (lac+(i^O4-z+y+)) » einem Stamm, der den lac-Repressor überproduziert, transformiert. Bis zur Zugabe des Induktors IFTG (Isopropylthiogalactosidolipoid) kann keine nennenswerte Menge von ΗδΗ-ÄJtpression nachgewiesen werden.
Ein Entfernen der EcoRl-Erkennungsstelle in pHGH1O7 hätte zur Folge, daß das AiG-Starteignal Von den Codons der Anfcatzstelle für die Hibosomen dee lac-Promoters den gleichen Abstand hätte, den diese Codons natürlicherweise vom Startsignal für B-Galactosidase haben. Um festzustellen, ob die Expression durch Nachahmung dieses natürlichen Abstands zu steigern ist, wurde pHGH1O7 in pHGH1O7-4 überführt, indem das erstere Plasmid mit EcoRI geöffnet wurde, die entstehenden Einzelstrangenden mit SI-Endonuclease verdaut wurden land das Plasmid durch Verbinden der stumpfen Enden mit T4-Ligase wieder in Ringform überführt wurde. Obwohl sich zeigte, daß das erhaltene Plasmid in ähnlicher Weise zur Expression von HGH fähig war, produzierte es jedoch HGH überraschenderweise in geringerem Umfang als pHGH1O7» wie durch direkten Radioimmunoassay gezeigt werden konnte.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die bisher geschilderte, bevorzugte Ausführungsform beschränkt ist, sondern ausschließlich auf den Schutzbereich der Patentansprüche. Andere Abänderungen als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die Wahl des Promoter-Systems, des Elternplasmids, des angestrebten Polypeptidprodukts oder sonstigem. Andere, für die vorliegende Erfindung anwendbare Promoter-Systeme bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem Arabinose-Operon (phi80 dara) oder dem Colicin-ΕΊ-, Galactose-» alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Promoter. Wirtsorganismen für die bakterielle Expression können ausgewählt werden beispielsweise aus der Familie der Enterobacteriaceae,
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z.B. die Stämme Escherichia coli und Salmonella j aus der Familie der Bacillaceae, z.B. Bacillus subtilisj weiterhin Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae. Natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der Richtlinien für rekombinante MA des National Institutes of Health, 43 fed. Reg. 60,080 (1978) durchgeführt werden sollen.
Für die Arbeit der vorliegenden Erfindung im Labormaßstab eignet sich der Stamm E. coli χ 1776 besonders gut, es könnte sich jedoch zeigen, daß für die industrielle Herstellung im großen Maßstab der Stamm weniger geeignet ist, und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absichtlich aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden· ItLt einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherrschung, eher als biologischer, können für die Arbeit im großen Maßstab auch solche Organismen wie E. coli K-12 Stamm 294» a.a.O., und E. coli Stamm RRI1 Genotypt Pro'Leu*" Tfoi~Bg*-recA+Strr Lac y" verwendet werden. E. coli RR1 wurde durch Paarung aus dem Stamm E. coli HB101 (H.W. Boyer et al., J. Mol.Bio. (1969) 41 459-^72) mit dem Stamm E. coli K-12, Stamm KL16 als Hfr-Bonor erhalten. Siehe auch J.tt. Miller, Experiments in Molecular Senstics (Gold Spring Harbor, New York, 1972). Eine Kultur von E. coli BR1 wurde em 30. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung bezüglich der Sugänglichkeit unter der Nummer AUCG 31343 hinterlegte Auf-ähnliche Weise wurde eine Kultur von »1776 am 3·" ^mIi 1979 bei der American fype Culture Collection unter d©r Mummer ATCO 31537 hinterlegt. Am 3· Juli 1979 wurden bei der American Type Culture Collection weiterhin hinterlegt: Plaeoid pHGH1Q7 (ATCC 40011); Plasmia pGH6 (ATCG 40012)? der Stamm 2d776, der mit pHGH107 transformiert i^urde (ATCC 31538) und S. coil K12 Stamm 294, transformiert mit pGH6 (ATGC 31539).
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Nach der Erfindung hergestellte Organismen können für die in industriellem Maßstab durchgeführte fermentative Produktion von menschlichem Wachstumshormon eingesetzt werden, wodurch ein Produkt in solchen Mengen und für Anwendungsgebiete erhalten wird, wie es bisher unerreichbar war. Beispielsweise kö&nen transformierte E, coli-Kulturen gezüchtet werden in wäßrigem Medium in eine® Stahl- od.©?? einem anderen JFermentationsgefäß, auf übliche Weise belüftet und geschüttelt, in xräßrigem iledium bei beispielsweise 37° C und nahezu neutralem pH (beispielsweise pH 7+ O«3), ergänzt mit geeigneten ITährsubstraten, beispielsweisa Kohlenhydrat oder Glycerin, Stickstoffquellen, wie Aramoniuiasulfat, Kaliumquellen, wie Kaliumphosphat, Spur©©©laiaeBtQ®3 Hagneaiumsulfat und ähnlichem. Transforraante Organismen weisen vorzugsweise eine oder mehrere Selsktionscharakteristiken auf, beispielsweise Antibiotika-Beaiatenze», s© daß ein Selektionsdruck ausgeübt werden "kann, um konkurrierendes Wachstum. von Wildtyp-Ee coli zu · behindern. Mir den lall eiase gages Ampicillin oder Tetracyclin r©siate»tea Qrganiaaus kanö beispielsweise. das Antibiotikum zum ^armeQtationsmedium gegeben werden, so daß Wildtyp-Organieiaen ausselektiert werden, di© nicht gegsn dies© totibiotika resistent sind«,
Nachdem irallständig fenaantisit wur€®? wird die bakteriell©
©dap die Z©lliaass© auf andere
gegammelts daraufhin mit p&ysi- ©hemise&ess Mitteln l^©iayte Die Zelltrüimne? werden vqb Ifttsstand geteeaat imd das. lielishe horaos is®lt®^"fe und
kann &us Bakt©ri©iiextrafet gereinigt X'i®2?iQQ9 indem maß ©in® der folgesden Methoden oder eine lombiaation dieser anwendet: (1) Polyäthylimiö-Fralttio-
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BAD
nierung; (2) GeX-i^iltrierungs-QnroniatQgraphie auf Sephacryl §-2QQ$ (3) lonenaustausoa-Gnroraatograpkie auf Biorex-70 Harz oder CM Sephedex| (4) AwuantmtimXtat und/oder pli-
imd (5) Affinitäta-Gteoisftosrapiiie, wofeei verwesaet werde», diQ aua snti-H<M XgG hergestellt werden, vrelchta aus immimaeiuai ti vierten Tieren ©dar HybridgewelsQß (^ybridowas) isoliert wurde | das Hormoa wird unter sauren q&qv isilS denaturierenden Bedingungen herausgelöst·
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Claims (23)

PA"1" E N TA N W ι. LT E Λ GRÜNECKER D(PL-INa H. KINKELDEY DR-ING. W. STOCKMAIR Dn-INd-AeE(CAlTECH K. SCHUMANN Oft FER NAT.- DIPL-FHVS. P. H. JAKOB DIPL-INa G. BEZOLD OR FERNST.- DIFL-OEM 8 MÜNCHEN 22 MAXIMILIANSTRASSE 43 24. Juni 1980 P 15 179-602/ks GENENTECH, IFG. Point San Bruno Boulevard South San Francisco, California, USA Mikrobielle Expression von quasi-synthetischen Genen Patentansprüche
1. Verfahren zum Konstruieren eines sich replizierenden clonierenden Vektors, der in einem mikroMeilen Organismus zur Expression eines speziellen Polypeptids mit bekannter Aminosäuresequenz fähig ist, bei dem ein für das Polypeptid codierendes Gen in den clonierenden Vektor eingefügt und unter die Kontrolle eines Promoters für die Expression gebracht wird, dadurch gekennzeichnet , daß
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ORIGTNAL INSPECTED
a) ein erstes, durch reverse Transkription von Boten-RlTA erhaltenes Genfragment für ein Expressionsprodukt erhalten wird, das sich von dem Polypeptid unterscheidet, wobei das Fragment zumindest einen wesentlichen Bestandteil der für das Polypeptid codierenden Sequenz enthält,
"b) in den Fällen, in denen das erste Fragment Protein codierende Codons für Aminosäuresequenzen enthält, die sich von denen, die in dem Polypeptid enthalten sind, unterscheiden, diese Codons eliminiert werden, während zumindest ein wesentlicher Bestandteil der genannten codierenden Sequenz beibehalten wird und das erhaltene Fragment dennoch für ein Expressionsprodukt codiert, das sich von dem Polypeptid unterscheidet,
wobei das Produkt aus dem Schritt (a) oder, falls erforderlich, aus dem Schritt (b) ein Fragment darstellt, das für weniger als alle Aminosäuren des Polypeptids codiert, daß ferner
c) durch organische Synthese ein oder mehr Genfragmente, die für den Rest der Aminosäuresequenz des Polypeptids codieren, bereitgestellt werden, wobei mindestens eines dieser Fragmente für den Amino-Ende-Bestandteil des Polypeptids codiert, und
d) daß das (die) Genfragment(e) aus Schritt (c) und dasjenige, das in Schritt (a) oder (b), je nach Sachlage, hergestellt wurde, in einem sich replizierenden, clonierenden Vektor in richtiger Lesephase zueinander und unter der Kontrolle eines Promoters für die Expression angeordnet werden,
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wodurch, ein sich, replizierender, clonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der Aminosäuresequenz des Polypeptids fähig ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch. gekennzeichnet , daß der clonierende Vektor aus Schritt (d) ein "bakterielles Plasmid ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das für den Amino-Ende-Bestandteil des Polypeptids codierende, synthetische Fragment zusätzlich für die Expression einer spezifisch schneidbaren Aminosäuresequenz codiert, und daß die Fragmente stromabwärts von und in Lesephase mit exprimierten,Protein codierenden Codons angeordnet werden, wodurch das konjugierte Expressionsprodukt des Plasmids spezifisch geschnitten werden kann, um das Polypeptid zu erhalten.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Aminosäuresequenz des PoIypeptids ohne anhängendes Fremdprotein exprimierbar ist.
5· Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment aus Schritt (a) mindestens eine Mehrheit der codierenden Sequenz für das Polypeptid enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein synthetisches Fragment und ein mRNA-Transkript-Fragment vor ihrer Anordnung im clonierenden Vektor miteinander verknüpft v/erden, und wobei die entgegengesetzten Enden des Fragments und des Transkripts unterschiedlich entweder einzelsträngig
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oder stumpf sind, so daß sichergestellt ist, daß die Verknüpfung der beiden Fragmente in der richtigen Orientierung für die Expression des Polypeptids erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet , daß das Polypeptid das menschliche Wachstumshormon ist, und daß das erste Fragment Protein codierende Codons für AminosäureSequenzen enthält, die sich von denen im menschlichen Wachstumshormon unterscheiden, und wobei der Eliminierungsschritt (b) das Haelll-Restriktionsenzymfragment des ersten Fragments liefert.
8. Verfahren nach Anspruch 7i dadurch gekennzeichnet , daß Schritt (b) einschließt: das Verdauen des Haelll-Fragments mit einem anderen Restriktionsenzym, das Abschneiden von Codons für untranslatierte Boten-RFA und das gleichzeitige Bereitstellen eines Einzelstrangendes an einem Ende des entstehenden Fragments.
9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Restriktionsenzym Xmal ist.
10. Bakterielles, sich replizierendes Plasmid, das in einem transformierten Bakterium zur Expression von Wachstumshormonen fähig ist, welchem kein fremdes, konjugiertes Protein anhängt.
11. Plasmid nach Anspruch 10, dessen für menschliches Wachstumshormon codierendes Gen als wesentlichen Bestandteil cBNA oder Replikationsprodukte von dieser enthalten.
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ORIGINAL INSPECTED
12. Plasraid nach Anspruch 11, das eine Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum aufweist.
13. Plasmid nach Anspruch 12, dem der tet-Proraoter fehlt, und daa trotzdem letraeyclinresistenz aufweist.
14. Plasmid nach Anspruch 13, in dem das für das menschliche Wachstumshorraon codierende Gen unter der Kontrolle eines lac-Proraoters in Tandem-Struktur ist.
15. Plasmid pHGHIQ?.
16. Plasmid pHGH1O7-1.
17. Lebensfähige Kultur bakterieller Transformanten, die Plasmide nach Anspruch 10 enthalten.
18. Verfahren zum Herstellen von menschlichem Wachstumshormon, das folgende Schritte enthält:
a) Behandeln einer Kultur nach Anspruch 17 in einem Ifermentationsgefäß, daa »it Belüftungs- und Schüttel- (oder Rühr-)Mitteln ausgestattet ist in eintr wäßrigen, Nährsubstrate enthaltenden JPermentationshoullion,
b) Wachsenlassen der Kultur unter Belüften und Schütteln (oder Rühren), während zusätzliche Nährsubstrate zugegeben werden, die »rforderlieh sind, um verstärktes Wachstum zu erhalten,
c) Abtrennen der erhaltenen Zellmasse aus der
d) Lyaieren der Zellen, um deren Inhalt freizulegen,
β) Trennen der Zelltrümmer vom Überstand und
f) Isolieren und Heinigen des menschlichen Wachstumshormons, das im Überstand enthalten ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , daß die Bakterien Transforraanten von E. coli sind, die eine Selektionseigenschaft aufweisen, und daß ein Selektionsdruck angewendet» wird, ue konkurrierendes Wachstum von E. coli-Wildtyp au "behindern.
20. Ein Plasraid für die Expression, das funktionsgene für Ampicillin- und letracyclinresistenz enthält, sowie einen lae-Promoter in Tandem-Struktur, der »wischen den genannten Genen liegt und so orientiert ist, daß er die Expression in Richtung des Gens für fetrscycliaresistenz in Gang setzt, das ferner eine Mehrzahl von Xestriktionserkennungsstellen enthält, die stromabwärts Tom genannten Promoter-System liegen, die jeweils cobäaive und stumpfe Enden nach den Schneiden liefern, wodurch richtiges Einfügen von heterologer VSX «wischen den genannten Erkennungsstellen ermöglicht wird, so dai diese unter die Kontrolle des genannten Promoter-Systems gelangt.
21. Plasraid pGH6. .
22. Plasmid nach Anspruch 10, das in transformierten E. coli-Bakterien fähig ist zur Expression der Aminosäuresequenz, deren Abfolge in den Figuren 1 und 3 dirgestellt ist.
23. Verfahren nach Anspruch .4, dadurch g β k e » η ζ β t c fc.R.e. ΐ...*-.,Αββ die AwiflQBäyceeequen* des Polypeptide exprimiert wird.
ORlGlNAL INSPECTED
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