JPH05268970A - 部分的合成遺伝子を用いる成長ホルモンの発現 - Google Patents
部分的合成遺伝子を用いる成長ホルモンの発現Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 リーダー配列あるいは他の外来蛋白質を伴っ
ていないヒト成長ホルモンを発現するプラスミドを提供
する。 【構成】 ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子の実質
的な部分がcDNAで構成されている遺伝子を含有する
プラスミドを構築することによりヒト成長ホルモンを発
現させることができる。
ていないヒト成長ホルモンを発現するプラスミドを提供
する。 【構成】 ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子の実質
的な部分がcDNAで構成されている遺伝子を含有する
プラスミドを構築することによりヒト成長ホルモンを発
現させることができる。
Description
【0001】本発明は、目的とする蛋白質生成物の観点
からは不完全なメッセンジャーRNA(以下mRNAと略
す)配列からの酵素による逆転写と有機合成を組み合わ
せることにより、部分的合成遺伝子を作製する方法及び
これを微生物により発現させる方法に関する。発現され
た好ましい生成物には、「微生物を開裂させて生物活性
物質を生産する際に問題となる、真核性の発現生成物に
共通して存在する、生物活性を不活性化するリーダー配
列が含まれていない。本明細書では、好ましい例とし
て、ヒトの生長ホルモン(例えば下垂体機能減退矮小発
育症の治療に有用である)をコードする(略号化する)遺
伝子の作製およびその発現について例示する。
からは不完全なメッセンジャーRNA(以下mRNAと略
す)配列からの酵素による逆転写と有機合成を組み合わ
せることにより、部分的合成遺伝子を作製する方法及び
これを微生物により発現させる方法に関する。発現され
た好ましい生成物には、「微生物を開裂させて生物活性
物質を生産する際に問題となる、真核性の発現生成物に
共通して存在する、生物活性を不活性化するリーダー配
列が含まれていない。本明細書では、好ましい例とし
て、ヒトの生長ホルモン(例えば下垂体機能減退矮小発
育症の治療に有用である)をコードする(略号化する)遺
伝子の作製およびその発現について例示する。
【0002】遺伝子を構成しているDNA(デオキシリ
ボ核酸)は、蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構造
遺伝子と、RNAポリメラーゼの結合部位、リボゾーム
結合のための情報部位などを提供することによって構造
遺伝子の情報の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の両
者を含んでいる。暗号づけされた蛋白質は、その対応す
るDNAから、微生物内で、複数の過程を経て発現され
る。即ち、 1.調節領域(以下プロモーターという)内で酵素RNA
ポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿って
移動し、その暗号づけされた情報をメッセンジャーリボ
核酸(mRNA)に転写する。この転写は1個またはそれ
以上の終止コドンの位置で終了する。
ボ核酸)は、蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構造
遺伝子と、RNAポリメラーゼの結合部位、リボゾーム
結合のための情報部位などを提供することによって構造
遺伝子の情報の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の両
者を含んでいる。暗号づけされた蛋白質は、その対応す
るDNAから、微生物内で、複数の過程を経て発現され
る。即ち、 1.調節領域(以下プロモーターという)内で酵素RNA
ポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿って
移動し、その暗号づけされた情報をメッセンジャーリボ
核酸(mRNA)に転写する。この転写は1個またはそれ
以上の終止コドンの位置で終了する。
【0003】2.mRNAの「伝言」は、リボゾームにお
いて、そのmRNAが暗号づけているアミノ酸配列を持
った蛋白質に翻訳される。翻訳は開始信号、大抵はAT
G(これはf−メチオニンと翻訳される)から始まる。D
NAは遺伝暗号に従い、トリプレット、即ち、アデノシ
ン、チミジン、シチジンおよびグアニン(以下各々A,
T,CおよびGと表わす)から個々別々に選ばれる隣接す
る3個のヌクレオチドの「コドン」によって個々のアミノ
酸を指定する。これらはコードストランド(暗号鎖)、即
ち2本鎖(duplex)DNAの暗号配列中にある。2本鎖の
残りの鎖、即ち「相補ストランド」は、コードストランド
中の相補体と水素結合するヌクレオチド(塩基)で形成さ
れている。AとT、およびCとGが相補関係にある。本
発明の背景となる上記の事実およびその他の関連事項は
Gene Expressionに詳しく述べられている(Benjamin
Lewin,Gene Expression 1,2(1974年)およ
び3(1977年),Jone Wiley and Sons,N.
Y.)。本明細書で言及するこの文献およびその他の文
献については、参考までにその都度言及することとす
る。
いて、そのmRNAが暗号づけているアミノ酸配列を持
った蛋白質に翻訳される。翻訳は開始信号、大抵はAT
G(これはf−メチオニンと翻訳される)から始まる。D
NAは遺伝暗号に従い、トリプレット、即ち、アデノシ
ン、チミジン、シチジンおよびグアニン(以下各々A,
T,CおよびGと表わす)から個々別々に選ばれる隣接す
る3個のヌクレオチドの「コドン」によって個々のアミノ
酸を指定する。これらはコードストランド(暗号鎖)、即
ち2本鎖(duplex)DNAの暗号配列中にある。2本鎖の
残りの鎖、即ち「相補ストランド」は、コードストランド
中の相補体と水素結合するヌクレオチド(塩基)で形成さ
れている。AとT、およびCとGが相補関係にある。本
発明の背景となる上記の事実およびその他の関連事項は
Gene Expressionに詳しく述べられている(Benjamin
Lewin,Gene Expression 1,2(1974年)およ
び3(1977年),Jone Wiley and Sons,N.
Y.)。本明細書で言及するこの文献およびその他の文
献については、参考までにその都度言及することとす
る。
【0004】DNAの組み換えには、別々のDNA断片
の結合を促進するために、その隣接末端を色々の態様に
修復する種々の方法を利用することができる。ここでい
う「結合」とは、隣接するヌクレオチド間にホスホジエス
テル結合が形成することであり、これは大抵の場合、酵
素T4DNAリガーゼにより達成される。例えば平滑末
端(鈍感末端)(ブラントエンド、blunt end)も直接結合
することができる。あるいはまた、隣接末端に相補性の
1本鎖を含んでいる断片は、水素結合によって、「結合」
のためのそれぞれの位置に配置されるので好都合であ
る。このような接着末端と呼ばれる1本鎖は、ターミナ
ルトランスフェラーゼを用いて鈍感末端にヌクレオチド
を付加することにより生成させることができる。またこ
れは、鈍感末端の1本の鎖をλ−エキソヌクレアーゼの
如き酵素で切り取ることにより生成させることもでき
る。しかしこれは、制限エンドヌクレアーゼ(以下制限
酵素という)によるのが最も普通である。この制限酵素
は、塩基対が4ないし6個の長さのヌクレオチドの特異
な配列(制限部位という)内またはその隣接部位のホスホ
ジエステル結合を切断するものであり、多くの制限酵素
およびその認識部位が知られている(例えばR.J.Ro
berts, CRC Critical Reviews in Biochemis
try,123,(1976年11月)参照)。多くのものは互
い違いに切断し、2本鎖断片の端に短い相補性の1本鎖
配列ができる。相補性配列であるので、はみでた末端、
即ち接着末端は塩基対によって再結合することができ
る。2個の異なった分子をこの酵素で切断すると、相補
性1本鎖が交叉した対をつくり、新しいDNA分子がで
きる。この新しいDNA分子は、アニーリングした位置
にある1本鎖の切断点を結合するリガーゼを用いて、共
有結合した完全なDNA分子とすることができる。開裂
した2本鎖DNAに「コターミナル」、即ち鈍感末端を残
す様な制限酵素の場合は、この鈍感末端を他の鈍感末端
配列のものと、例えばT4リガーゼにより再結合して組
換えすることができる。
の結合を促進するために、その隣接末端を色々の態様に
修復する種々の方法を利用することができる。ここでい
う「結合」とは、隣接するヌクレオチド間にホスホジエス
テル結合が形成することであり、これは大抵の場合、酵
素T4DNAリガーゼにより達成される。例えば平滑末
端(鈍感末端)(ブラントエンド、blunt end)も直接結合
することができる。あるいはまた、隣接末端に相補性の
1本鎖を含んでいる断片は、水素結合によって、「結合」
のためのそれぞれの位置に配置されるので好都合であ
る。このような接着末端と呼ばれる1本鎖は、ターミナ
ルトランスフェラーゼを用いて鈍感末端にヌクレオチド
を付加することにより生成させることができる。またこ
れは、鈍感末端の1本の鎖をλ−エキソヌクレアーゼの
如き酵素で切り取ることにより生成させることもでき
る。しかしこれは、制限エンドヌクレアーゼ(以下制限
酵素という)によるのが最も普通である。この制限酵素
は、塩基対が4ないし6個の長さのヌクレオチドの特異
な配列(制限部位という)内またはその隣接部位のホスホ
ジエステル結合を切断するものであり、多くの制限酵素
およびその認識部位が知られている(例えばR.J.Ro
berts, CRC Critical Reviews in Biochemis
try,123,(1976年11月)参照)。多くのものは互
い違いに切断し、2本鎖断片の端に短い相補性の1本鎖
配列ができる。相補性配列であるので、はみでた末端、
即ち接着末端は塩基対によって再結合することができ
る。2個の異なった分子をこの酵素で切断すると、相補
性1本鎖が交叉した対をつくり、新しいDNA分子がで
きる。この新しいDNA分子は、アニーリングした位置
にある1本鎖の切断点を結合するリガーゼを用いて、共
有結合した完全なDNA分子とすることができる。開裂
した2本鎖DNAに「コターミナル」、即ち鈍感末端を残
す様な制限酵素の場合は、この鈍感末端を他の鈍感末端
配列のものと、例えばT4リガーゼにより再結合して組
換えすることができる。
【0005】本発明の目的に使用される「クローニング
媒体」は完全な「レプリコン」を含有する非染色体性の1
つの2本鎖DNAであり、この媒体は形質転換により単
細胞生物(微生物)に入れられた時、複製され得るもので
ある。この様に形質転換された微生物は形質転換体と呼
ばれている。現在クローニング媒体として一般に使用さ
れているのはビールスまたは細菌から得られるものであ
り、最も普通にはプラスミッドと呼ばれる環状の細菌D
NAである。
媒体」は完全な「レプリコン」を含有する非染色体性の1
つの2本鎖DNAであり、この媒体は形質転換により単
細胞生物(微生物)に入れられた時、複製され得るもので
ある。この様に形質転換された微生物は形質転換体と呼
ばれている。現在クローニング媒体として一般に使用さ
れているのはビールスまたは細菌から得られるものであ
り、最も普通にはプラスミッドと呼ばれる環状の細菌D
NAである。
【0006】最近の生化学の進歩により、例えばプラス
ミッドが外来性のDNAを含む様な、「組換型」クローニ
ング媒体が作製される様になった。特殊な例では、この
組み換え体はヘテロローガスDNAを含有することがで
きる。ここでいうヘテロローガスDNAとは、この組換
型媒体により形質転換することのできる微生物によって
通常は産生されないポリペプチドをコードするDNAを
意味する。例えば、プラスミッドを制限酵素で切断して
結合可能な末端を有する直鎖状DNAを得る。これを結
合可能な末端を持った外来性遺伝子と結合させると、生
物学的機能部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択
するのに有用な表現型の性質が付与されることになる。
この組み換え体を微生物に挿入して形質転換し、この形
質転換体を単離してクローン化する。この目的は外来性
遺伝子のコピーを含有している多数の転換体を得ること
であり、また特殊な場合には、さらにその遺伝子がコー
ドしている蛋白質を発現することにある。これに関連す
る技術およびその応用についてはRecombinant Molec
ules に詳しく記載されている(Miles Internationa
l Symposium Series 10; Recombinant Mole
cules :Impact on Science and Society,Beer
s and Bosseff,eds.,Raven Press,N.Y.19
77年)。
ミッドが外来性のDNAを含む様な、「組換型」クローニ
ング媒体が作製される様になった。特殊な例では、この
組み換え体はヘテロローガスDNAを含有することがで
きる。ここでいうヘテロローガスDNAとは、この組換
型媒体により形質転換することのできる微生物によって
通常は産生されないポリペプチドをコードするDNAを
意味する。例えば、プラスミッドを制限酵素で切断して
結合可能な末端を有する直鎖状DNAを得る。これを結
合可能な末端を持った外来性遺伝子と結合させると、生
物学的機能部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択
するのに有用な表現型の性質が付与されることになる。
この組み換え体を微生物に挿入して形質転換し、この形
質転換体を単離してクローン化する。この目的は外来性
遺伝子のコピーを含有している多数の転換体を得ること
であり、また特殊な場合には、さらにその遺伝子がコー
ドしている蛋白質を発現することにある。これに関連す
る技術およびその応用についてはRecombinant Molec
ules に詳しく記載されている(Miles Internationa
l Symposium Series 10; Recombinant Mole
cules :Impact on Science and Society,Beer
s and Bosseff,eds.,Raven Press,N.Y.19
77年)。
【0007】複製により遺伝子の数を増やすためにクロ
ーニング媒体を使用することとは別に、遺伝子がコード
している蛋白質を実際に発現しようという試みがなさ
れ、そのいくつかは成功している。その最初の例とし
て、脳ホルモン、ソマトスタチンがlacプロモーターの
コントロールの下に大腸菌中で発現された(K.Itakur
aet al.Science 198 1056.1977年)。
極く最近、ヒトインシュリンのA鎖およびB鎖が同じ方
法で発現され、結合されてこのホルモンを生成した
(D.V.Goeddel et al.Proc.Nat'l.Acad.
Sci.,USA76 106、1979年)。この両者で
は、遺伝子はその全てを合成により作製したものであっ
た。いづれの場合も、細胞内で蛋白質分解酵素が目的と
する生成物を分解するのは明らかであるので、その生成
物を複合体の形で、即ち、「隔離」(compartmentalizatio
n)により目的物を保護し、そして細胞外で切り離される
ことができて所望の生成物を与え得る別の蛋白質と結合
した複合体の形で生成させる必要があった。この研究は
本出願人の出願に係る英国特許GB2007675A
号、GB2007670A号、GB2007676A号
およびGB2008123A号明細書に記載されてい
る。
ーニング媒体を使用することとは別に、遺伝子がコード
している蛋白質を実際に発現しようという試みがなさ
れ、そのいくつかは成功している。その最初の例とし
て、脳ホルモン、ソマトスタチンがlacプロモーターの
コントロールの下に大腸菌中で発現された(K.Itakur
aet al.Science 198 1056.1977年)。
極く最近、ヒトインシュリンのA鎖およびB鎖が同じ方
法で発現され、結合されてこのホルモンを生成した
(D.V.Goeddel et al.Proc.Nat'l.Acad.
Sci.,USA76 106、1979年)。この両者で
は、遺伝子はその全てを合成により作製したものであっ
た。いづれの場合も、細胞内で蛋白質分解酵素が目的と
する生成物を分解するのは明らかであるので、その生成
物を複合体の形で、即ち、「隔離」(compartmentalizatio
n)により目的物を保護し、そして細胞外で切り離される
ことができて所望の生成物を与え得る別の蛋白質と結合
した複合体の形で生成させる必要があった。この研究は
本出願人の出願に係る英国特許GB2007675A
号、GB2007670A号、GB2007676A号
およびGB2008123A号明細書に記載されてい
る。
【0008】以上述べたいくつかの例で合成遺伝子によ
る方法が有用であることがわかったが、生成物がもっと
大きい蛋白質である場合、例えば成長ホルモン、インタ
ーフェロンなどである場合には、それらの遺伝子はそれ
に応じてさらに複雑であり、手軽に合成することができ
ないという現実的な問題がある。同時に、複合蛋白質を
伴なっていない生成物を発現することが望ましいであろ
うが、この様な発現の必要性から、使用する微生物を、
目的とする生成物を製造するのにもっとも好適な微生物
に変更しなければならない。
る方法が有用であることがわかったが、生成物がもっと
大きい蛋白質である場合、例えば成長ホルモン、インタ
ーフェロンなどである場合には、それらの遺伝子はそれ
に応じてさらに複雑であり、手軽に合成することができ
ないという現実的な問題がある。同時に、複合蛋白質を
伴なっていない生成物を発現することが望ましいであろ
うが、この様な発現の必要性から、使用する微生物を、
目的とする生成物を製造するのにもっとも好適な微生物
に変更しなければならない。
【0009】ある研究者たちは、有機合成からではな
く、組織から精製した相当するmRNAからの逆転写に
より得られた遺伝子を発現しようと試みた。この試みに
は2つの問題があった。まず第1は、逆転写酵素は所望
の全アミノ酸配列のためのcDNA(相補DNA)を完成
しない前に、mRNAからの転写を停止することがあ
る、ということである。従って、例えばVilla−Komar
offらはラットのプロインシュリンのためのcDNAを得
たが、それにはそのインシュリンプリカーサー(前駆体)
の最初の3個のアミノ酸のためのコドンが欠落していた
(Proc.Nat'l.Acad.Sci.,USA、75 372
7、1978年)。次に、プリカーサーの形で発現され
るポリペプチドのためのmRNAを逆転写したところ、
生物活性蛋白質ではなくそのプリカーサーのためのcD
NAが生成した。ところでこの生物活性蛋白質は、真核
細胞内においてはリーダー配列が酵素的に切断除去され
た結果として生成するものである。現在まで、この様な
機能を発揮する細菌は知られていない。従って、mRN
A転写体は、生物活性蛋白質自体ではなくプリカーサー
の形の、リーダー配列を含んだ発現生成物を製造してし
まうのである(Villa−Komaroff、前記(ラットプロイ
ンシュリン)、P.H.Seeburg et al.Nature 2
76、795 1978年(ラットのプレ生長ホルモ
ン))。最後に、ヒトのホルモン類(またはそれらのプリ
カーサー)をmRNA転写体から細菌により発現しようと
いう試みでは、明らかに細胞外で開裂され得ない複合蛋
白質が製造されただけであった(例えば、Villa−Koma
roff、前記(ペニシリナーゼ・プロインシュリン)、See
burg、前記(ベータ−ラクタマーゼ−プレ生長ホルモ
ン))。
く、組織から精製した相当するmRNAからの逆転写に
より得られた遺伝子を発現しようと試みた。この試みに
は2つの問題があった。まず第1は、逆転写酵素は所望
の全アミノ酸配列のためのcDNA(相補DNA)を完成
しない前に、mRNAからの転写を停止することがあ
る、ということである。従って、例えばVilla−Komar
offらはラットのプロインシュリンのためのcDNAを得
たが、それにはそのインシュリンプリカーサー(前駆体)
の最初の3個のアミノ酸のためのコドンが欠落していた
(Proc.Nat'l.Acad.Sci.,USA、75 372
7、1978年)。次に、プリカーサーの形で発現され
るポリペプチドのためのmRNAを逆転写したところ、
生物活性蛋白質ではなくそのプリカーサーのためのcD
NAが生成した。ところでこの生物活性蛋白質は、真核
細胞内においてはリーダー配列が酵素的に切断除去され
た結果として生成するものである。現在まで、この様な
機能を発揮する細菌は知られていない。従って、mRN
A転写体は、生物活性蛋白質自体ではなくプリカーサー
の形の、リーダー配列を含んだ発現生成物を製造してし
まうのである(Villa−Komaroff、前記(ラットプロイ
ンシュリン)、P.H.Seeburg et al.Nature 2
76、795 1978年(ラットのプレ生長ホルモ
ン))。最後に、ヒトのホルモン類(またはそれらのプリ
カーサー)をmRNA転写体から細菌により発現しようと
いう試みでは、明らかに細胞外で開裂され得ない複合蛋
白質が製造されただけであった(例えば、Villa−Koma
roff、前記(ペニシリナーゼ・プロインシュリン)、See
burg、前記(ベータ−ラクタマーゼ−プレ生長ホルモ
ン))。
【0010】ヒト生長ホルモン(HGH)はヒトの脳下垂
体で分泌される。191個のアミノ酸からなり、分子量
が約21,500であるこのHGHはインシュリンの3
倍以上大きい。これまで、HGHは限られた供給源、即
ちヒトの死体の下垂体から面倒な抽出によって得られる
だけであった。この物質は絶えず不足しており、その適
用は下垂体機能減退矮小発育症の治療に制限されてお
り、またそれですら、信頼できる計算によると、ヒト由
来のHGHは約50%の患者に供給するのがやっとであ
る。
体で分泌される。191個のアミノ酸からなり、分子量
が約21,500であるこのHGHはインシュリンの3
倍以上大きい。これまで、HGHは限られた供給源、即
ちヒトの死体の下垂体から面倒な抽出によって得られる
だけであった。この物質は絶えず不足しており、その適
用は下垂体機能減退矮小発育症の治療に制限されてお
り、またそれですら、信頼できる計算によると、ヒト由
来のHGHは約50%の患者に供給するのがやっとであ
る。
【0011】従って、HGHおよびその他のポリペプチ
ド生成物を多量に製造し得る新規な方法を開発する必要
があり、この要求は、有機合成で製造するには大きすぎ
るか、従ってまた、全合成遺伝子を用いて微生物に発現
させることが困難なポリペプチド類において特に火急を
要するものである。哺乳類のホルモンをmRNA転写体
から発現する方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得
ることを約束するものではあるが、現在のところ、所望
のホルモンを実際に切り離すことのできない、生物活性
のない複合体を微生物により製造することができるに過
ぎない。
ド生成物を多量に製造し得る新規な方法を開発する必要
があり、この要求は、有機合成で製造するには大きすぎ
るか、従ってまた、全合成遺伝子を用いて微生物に発現
させることが困難なポリペプチド類において特に火急を
要するものである。哺乳類のホルモンをmRNA転写体
から発現する方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得
ることを約束するものではあるが、現在のところ、所望
のホルモンを実際に切り離すことのできない、生物活性
のない複合体を微生物により製造することができるに過
ぎない。
【0012】本発明は、面倒な全合成による作製に頼ら
ず、暗号配列の実質的な部分、好ましくは大部分を逆転
写により得、一方その暗号配列の残りを合成することに
より、生物活性を不活性化するリーダー配列またはその
他の異質蛋白質を伴なっていない所望のポリペプチドを
発現することのできる完全な遺伝子を得、この部分的合
成遺伝子を発現する方法を提供するものである。あるい
は、この合成による残りの部分は、外来性蛋白質が細胞
外で開裂されて生物活性体が得られる様に設計された、
蛋白質分解に抵抗する複合体を生成させるものであって
もよい。従って、本発明は、従来、組織から多額の費用
をかけて抽出することにより、限られた量だけ生産され
ていた種々の物質、およびこれまで工業的に生産するこ
との出来なかったその他の物質を、微生物学的に生産す
る方法を可能にするものである。本明細書では、その最
も好ましい実施形式として、細胞内での蛋白質分解を避
け、かつ細胞外での開裂の間生物活性体を異質蛋白質中
に隔離しておく必要性を避けながら、医学的に重要なポ
リペプチドホルモン(HGH)を細菌により発現する最初
の例を提供する。本発明によって利用できる様になった
HGHのための微生物資源により、下垂体機能減退矮小
発育症の治療、並びにこれまで組織から得ていたホルモ
ンではまかないきれなかったその他の症状、例えば汎発
性胃内出血、仮関節、火傷治療、傷治療、ジストロフィ
ーおよび骨結合用として、このホルモンを多量に提供す
ることが初めて可能となった。
ず、暗号配列の実質的な部分、好ましくは大部分を逆転
写により得、一方その暗号配列の残りを合成することに
より、生物活性を不活性化するリーダー配列またはその
他の異質蛋白質を伴なっていない所望のポリペプチドを
発現することのできる完全な遺伝子を得、この部分的合
成遺伝子を発現する方法を提供するものである。あるい
は、この合成による残りの部分は、外来性蛋白質が細胞
外で開裂されて生物活性体が得られる様に設計された、
蛋白質分解に抵抗する複合体を生成させるものであって
もよい。従って、本発明は、従来、組織から多額の費用
をかけて抽出することにより、限られた量だけ生産され
ていた種々の物質、およびこれまで工業的に生産するこ
との出来なかったその他の物質を、微生物学的に生産す
る方法を可能にするものである。本明細書では、その最
も好ましい実施形式として、細胞内での蛋白質分解を避
け、かつ細胞外での開裂の間生物活性体を異質蛋白質中
に隔離しておく必要性を避けながら、医学的に重要なポ
リペプチドホルモン(HGH)を細菌により発現する最初
の例を提供する。本発明によって利用できる様になった
HGHのための微生物資源により、下垂体機能減退矮小
発育症の治療、並びにこれまで組織から得ていたホルモ
ンではまかないきれなかったその他の症状、例えば汎発
性胃内出血、仮関節、火傷治療、傷治療、ジストロフィ
ーおよび骨結合用として、このホルモンを多量に提供す
ることが初めて可能となった。
【0013】本発明の以上述べた、およびその他の目的
や特徴は以下の記載および好ましい実施形式を例示した
添付の図面から、より明らかになるであろう。図1は、
クローニングに使用するリンカー、開始信号ATGおよ
びHGHの最初の24個のアミノ酸をコードする遺伝子
断片を作製するための合成機構を示す。コードストラン
ド、即ち上側の鎖(U)および相補性ストランド、即ち下
側の鎖(L)の矢印は、描かれた断片の形式に使用される
オリゴヌクレオチドを表わしている。図2は、Uおよび
Lオリゴヌクレオチドを結合させて図1の遺伝子断片を
形成させる結合媒体および該遺伝子断片のプラスミッド
クローニング媒体への挿入を示している。図3には、下
垂体mRNA転写体のHaeIII制限酵素断片のDNA
配列(コードストランドのみ)が描かれており、それらが
コードしているヒト生長ホルモンのアミノ酸も番号付け
して記入してある。ここには非翻訳mRNAに相当する
DNA(ストップ以下)および主要な制限部位も示されて
いる。図4には、合成に由来しないHGHのアミノ酸を
コードする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製
およびヒト下垂体から単離されたmRNAからの逆転写
による相補DNAの形の該遺伝子断片の作製が示されて
いる。図5は、図2および図4のプラスミッドを用い
て、細菌内でHGHを発現し得るプラスミッドを作製す
る方法を示す。
や特徴は以下の記載および好ましい実施形式を例示した
添付の図面から、より明らかになるであろう。図1は、
クローニングに使用するリンカー、開始信号ATGおよ
びHGHの最初の24個のアミノ酸をコードする遺伝子
断片を作製するための合成機構を示す。コードストラン
ド、即ち上側の鎖(U)および相補性ストランド、即ち下
側の鎖(L)の矢印は、描かれた断片の形式に使用される
オリゴヌクレオチドを表わしている。図2は、Uおよび
Lオリゴヌクレオチドを結合させて図1の遺伝子断片を
形成させる結合媒体および該遺伝子断片のプラスミッド
クローニング媒体への挿入を示している。図3には、下
垂体mRNA転写体のHaeIII制限酵素断片のDNA
配列(コードストランドのみ)が描かれており、それらが
コードしているヒト生長ホルモンのアミノ酸も番号付け
して記入してある。ここには非翻訳mRNAに相当する
DNA(ストップ以下)および主要な制限部位も示されて
いる。図4には、合成に由来しないHGHのアミノ酸を
コードする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製
およびヒト下垂体から単離されたmRNAからの逆転写
による相補DNAの形の該遺伝子断片の作製が示されて
いる。図5は、図2および図4のプラスミッドを用い
て、細菌内でHGHを発現し得るプラスミッドを作製す
る方法を示す。
【0014】本発明の一般的手法は、一緒になって所望
の生成物の発現をコードする複数個の遺伝子断片を、1
つのクローニング媒体中に組み合わせることにある。こ
れらの内少なくとも1個は、Ullrichらの方法(A.Ul
lrich et al,Science 196 1313、1977
年)などにより組織から単離されたmRNAの逆転写によ
って得られるcDNA断片である。このcDNAは目的生
成物のためのコドンの実質的な部分、好ましくは少なく
とも大部分を提供し、一方遺伝子の残りの部分は合成に
より供給される。この合成による断片およびmRNA転
写による断片は別々にクローンし、最後の組合わせ段階
での使用のために量産する。
の生成物の発現をコードする複数個の遺伝子断片を、1
つのクローニング媒体中に組み合わせることにある。こ
れらの内少なくとも1個は、Ullrichらの方法(A.Ul
lrich et al,Science 196 1313、1977
年)などにより組織から単離されたmRNAの逆転写によ
って得られるcDNA断片である。このcDNAは目的生
成物のためのコドンの実質的な部分、好ましくは少なく
とも大部分を提供し、一方遺伝子の残りの部分は合成に
より供給される。この合成による断片およびmRNA転
写による断片は別々にクローンし、最後の組合わせ段階
での使用のために量産する。
【0015】合成遺伝子と、MaxamおよびGilbert(Pr
oc.Nat'l Acad.Sci.USA74 560、19
77年)の方法で決定された相補DNAの間に、目的産
物のためのコドンをどの様に分配するかは、種々の考え
方によって影響を受ける。逆転写によって得られる相補
DNAは必ず、少なくとも目的生成物のカルボキシル末
端部のためのコドンを含有しており、そのカルボキシル
末端に隣接する翻訳終止信号の下流に非翻訳mRNAの
ためのその他のコドンを合せて含有している。非翻訳R
NAのためのDNAの存在はほとんど無関係である。こ
の種の不当に長い配列は、所望の生成物のためのDNA
を複製し、発現するのに使用され細胞源を確保しつつ、
制限酵素による開裂等によって除去してもよい。特殊な
場合には、このcDNAは所望の全てのアミノ酸配列と
共に、目的産物のアミノ末端の上流に異質のコドンを含
んでいる。例えば、全部ではないが、多くのポリペプチ
ドホルモンは、リーダー配列や例えば細胞膜移送に関連
する蛋白質の信号配列を含んだプリカーサーの形で発現
される。真核細胞内で発現される場合には、これらの配
列は酵素により除去され、ホルモンはその遊離した形、
即ち生物活性な形でペリプラズム域に入る。しかし微生
物細胞がこの様な機能を営むことは期待し得ないので、
mRNA転写体からこの様な信号配列やリーダー配列を
除去しておくことが望ましい。この様な除去操作中に、
翻訳開始信号も失なわれ、またほとんどの場合、目的産
物のためのコドンの一部も失なわれる。本発明の部分的
合成遺伝子の合成による成分は、これらの後者のコドン
を回復するものであり、さらに、このハイブリッド(雑
種)遺伝子を最終的に挿入しようとしている媒体が適切
に配置された開始信号を欠いている場合には、新たに翻
訳開始信号を供給するものである。
oc.Nat'l Acad.Sci.USA74 560、19
77年)の方法で決定された相補DNAの間に、目的産
物のためのコドンをどの様に分配するかは、種々の考え
方によって影響を受ける。逆転写によって得られる相補
DNAは必ず、少なくとも目的生成物のカルボキシル末
端部のためのコドンを含有しており、そのカルボキシル
末端に隣接する翻訳終止信号の下流に非翻訳mRNAの
ためのその他のコドンを合せて含有している。非翻訳R
NAのためのDNAの存在はほとんど無関係である。こ
の種の不当に長い配列は、所望の生成物のためのDNA
を複製し、発現するのに使用され細胞源を確保しつつ、
制限酵素による開裂等によって除去してもよい。特殊な
場合には、このcDNAは所望の全てのアミノ酸配列と
共に、目的産物のアミノ末端の上流に異質のコドンを含
んでいる。例えば、全部ではないが、多くのポリペプチ
ドホルモンは、リーダー配列や例えば細胞膜移送に関連
する蛋白質の信号配列を含んだプリカーサーの形で発現
される。真核細胞内で発現される場合には、これらの配
列は酵素により除去され、ホルモンはその遊離した形、
即ち生物活性な形でペリプラズム域に入る。しかし微生
物細胞がこの様な機能を営むことは期待し得ないので、
mRNA転写体からこの様な信号配列やリーダー配列を
除去しておくことが望ましい。この様な除去操作中に、
翻訳開始信号も失なわれ、またほとんどの場合、目的産
物のためのコドンの一部も失なわれる。本発明の部分的
合成遺伝子の合成による成分は、これらの後者のコドン
を回復するものであり、さらに、このハイブリッド(雑
種)遺伝子を最終的に挿入しようとしている媒体が適切
に配置された開始信号を欠いている場合には、新たに翻
訳開始信号を供給するものである。
【0016】前駆体生長ホルモンcDNAからのリーダ
ー配列の除去は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけてい
る部分の内部にある制限部位を利用することによって好
適に行なうことができる。しかし本発明はこの様な部位
を利用できるかどうかに無関係に実施することもでき
る。即ち、mRNAに由来しない遺伝子を広範囲に合成
する必要性を避けるための、所望のポリペプチドのアミ
ノ末端に十分近い場所の制限部位を利用できるかどうか
に無関係に実施することができる。所望のポリペプチド
およびリーダー配列または他の生物活性を不活性化する
配列をコードしているcDNAにおいて、後者のコドン
と完全な(成熟)ポリペプチドのためのコドンとの境界
は、その完全なポリペプチドのアミノ酸配列からわか
る。単に選択したそのペプチドをコードしている遺伝子
内へ消化していき、望ましくないリーダー配列またはそ
の他の配列を除去すればよい。従って、例えば次の様な
cDNAであるとすると、
ー配列の除去は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけてい
る部分の内部にある制限部位を利用することによって好
適に行なうことができる。しかし本発明はこの様な部位
を利用できるかどうかに無関係に実施することもでき
る。即ち、mRNAに由来しない遺伝子を広範囲に合成
する必要性を避けるための、所望のポリペプチドのアミ
ノ末端に十分近い場所の制限部位を利用できるかどうか
に無関係に実施することができる。所望のポリペプチド
およびリーダー配列または他の生物活性を不活性化する
配列をコードしているcDNAにおいて、後者のコドン
と完全な(成熟)ポリペプチドのためのコドンとの境界
は、その完全なポリペプチドのアミノ酸配列からわか
る。単に選択したそのペプチドをコードしている遺伝子
内へ消化していき、望ましくないリーダー配列またはそ
の他の配列を除去すればよい。従って、例えば次の様な
cDNAであるとすると、
【0017】
【化1】 [ここで矢印は消化の終止を表わす]
【0018】上側の配列aおよびbを除去する様にエキソ
ヌクレアーゼ消化の反応条件を選ぶと、その後S1ヌク
レアーゼ消化により下側の配列cおよびdが自動的に除去
される。あるいは、より正確には、デオキシヌクレオチ
ドトリホスフェート(d(A,T,C,G)TP)の存在下でD
NAポリメラーゼ消化を行なうこともできる。例えば、
上の例では、dGTPの存在下でDNAポリメラーゼを
作用させて配列Cを除去し(Gで停止する)、次いでS1
ヌクレアーゼでaを消化する。dTTPの存在下でDNA
ポリメラーゼを作用させてdを除去し(Tで停止する)、
次いでS1ヌクレアーゼでbを切断する、等々(A.Kor
nberg,DNA Synthesis,P87−88、W.H.Fr
eeman and Co.,San Francisco、1974年参
照)。
ヌクレアーゼ消化の反応条件を選ぶと、その後S1ヌク
レアーゼ消化により下側の配列cおよびdが自動的に除去
される。あるいは、より正確には、デオキシヌクレオチ
ドトリホスフェート(d(A,T,C,G)TP)の存在下でD
NAポリメラーゼ消化を行なうこともできる。例えば、
上の例では、dGTPの存在下でDNAポリメラーゼを
作用させて配列Cを除去し(Gで停止する)、次いでS1
ヌクレアーゼでaを消化する。dTTPの存在下でDNA
ポリメラーゼを作用させてdを除去し(Tで停止する)、
次いでS1ヌクレアーゼでbを切断する、等々(A.Kor
nberg,DNA Synthesis,P87−88、W.H.Fr
eeman and Co.,San Francisco、1974年参
照)。
【0019】より好ましくは、Razinらのミスマッチ
(不適切な組み合せ)修復合成法(A.Razin et al,P
roc.Nat'l Acad.Sci.USA75,4268、1
978年)を利用して、目的産物をコードしているcDN
Aの部分内の好都合な位置に制限部位を作製してもよ
い。この方法によって、ミスマッチ置換分を含んでいる
プライマーを用いて存在しているDNA配列中の1個ま
たはそれ以上の塩基を置換することができる。少なくと
も7種の回文的4−塩基対配列が、既知の制限酵素によ
って特異的に認識される。それらは、AGCT(Alu
I)、CCGG(HpaII)、CGCG(Tha I)、GA
TC(Sau 3A)、GCGC(Hha)、GGCC(Hae
III)およびTCGA(Taq I)である。確率的には
非常にしばしばあり得ることであるが、cDNA配列
が、上記の様な認識部位と1個の塩基だけが異なってい
る配列を含んでいる場合は、修復合成によって、適切な
置換塩基を含んでる、従って所望の制限部位を含有して
いる複製cDNAが得られる。開裂によって望ましくな
いリーダー配列のDNAが除去され、その後、完全なポ
リペプチドの発現に必要なコドンが合成により回復され
る(下式参照)。
(不適切な組み合せ)修復合成法(A.Razin et al,P
roc.Nat'l Acad.Sci.USA75,4268、1
978年)を利用して、目的産物をコードしているcDN
Aの部分内の好都合な位置に制限部位を作製してもよ
い。この方法によって、ミスマッチ置換分を含んでいる
プライマーを用いて存在しているDNA配列中の1個ま
たはそれ以上の塩基を置換することができる。少なくと
も7種の回文的4−塩基対配列が、既知の制限酵素によ
って特異的に認識される。それらは、AGCT(Alu
I)、CCGG(HpaII)、CGCG(Tha I)、GA
TC(Sau 3A)、GCGC(Hha)、GGCC(Hae
III)およびTCGA(Taq I)である。確率的には
非常にしばしばあり得ることであるが、cDNA配列
が、上記の様な認識部位と1個の塩基だけが異なってい
る配列を含んでいる場合は、修復合成によって、適切な
置換塩基を含んでる、従って所望の制限部位を含有して
いる複製cDNAが得られる。開裂によって望ましくな
いリーダー配列のDNAが除去され、その後、完全なポ
リペプチドの発現に必要なコドンが合成により回復され
る(下式参照)。
【0020】
【化2】 勿論、所望によりもっと長い制限部位を同様にして挿入
することができるし、また、希望する位置に、その制限
部位に共通している塩基が2個しか存在しない場合で
も、連続修復によって4−塩基制限部位を作製すること
ができることは容易に理解されるはずである。
することができるし、また、希望する位置に、その制限
部位に共通している塩基が2個しか存在しない場合で
も、連続修復によって4−塩基制限部位を作製すること
ができることは容易に理解されるはずである。
【0021】この技術は、目的生成物のアミノ酸配列だ
けでなく、外来性ではあるが特別に設計したある大きさ
の蛋白質を発現するのが望ましい場合にも応用される。
この様な応用例として次の4種類のものを挙げることが
できる。まず第1に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋
白と結合することによって免疫原性が付与されるハプテ
ンまたはその他の免疫決定因子を発現してもよく、この
様にしてワクチンが製造され得る(英国特許第2008
123A号明細書参照)。また、生物学的安全性の見地
から、目的とする生成物を、細胞外で開裂して活性体に
変換し得る様に設計したその他の生物活性不活性化蛋白
質との複合体の形で発現してもよい。第3の応用は、細
胞膜を通って***された生成物の輸送信号ポリペプチド
を開裂することが出来るならば、所望の生成物の前に輸
送信号ポリペプチドをつけて、細胞膜を通して***させ
ることにより目的産物を製造することができる。最後
に、細胞外で特異的に開裂され得る様に設計された外来
性蛋白質との複合体は、そうしなければ微生物宿主にと
って内因性の蛋白質分解酵素で容易に分解されてしまう
目的産物を隔離するのに使用し得る。これらの内、少な
くとも最後の3つの応用例では、mRNA転写体の暗号
配列を完全にする為に使用される合成によるこの「アダ
プター分子」は、例えば酵素の作用によって特異的に開
裂され得るアミノ酸配列のためのコドンをさらに持って
いてもよい。例えば、トリプシンまたはキモトリプシン
はアルギニン−アルギニン(arg−arg)またはリジン−リ
ジン(lys−lys)などで特異的に開裂する(英国特許第2
008123A号、前記)。
けでなく、外来性ではあるが特別に設計したある大きさ
の蛋白質を発現するのが望ましい場合にも応用される。
この様な応用例として次の4種類のものを挙げることが
できる。まず第1に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋
白と結合することによって免疫原性が付与されるハプテ
ンまたはその他の免疫決定因子を発現してもよく、この
様にしてワクチンが製造され得る(英国特許第2008
123A号明細書参照)。また、生物学的安全性の見地
から、目的とする生成物を、細胞外で開裂して活性体に
変換し得る様に設計したその他の生物活性不活性化蛋白
質との複合体の形で発現してもよい。第3の応用は、細
胞膜を通って***された生成物の輸送信号ポリペプチド
を開裂することが出来るならば、所望の生成物の前に輸
送信号ポリペプチドをつけて、細胞膜を通して***させ
ることにより目的産物を製造することができる。最後
に、細胞外で特異的に開裂され得る様に設計された外来
性蛋白質との複合体は、そうしなければ微生物宿主にと
って内因性の蛋白質分解酵素で容易に分解されてしまう
目的産物を隔離するのに使用し得る。これらの内、少な
くとも最後の3つの応用例では、mRNA転写体の暗号
配列を完全にする為に使用される合成によるこの「アダ
プター分子」は、例えば酵素の作用によって特異的に開
裂され得るアミノ酸配列のためのコドンをさらに持って
いてもよい。例えば、トリプシンまたはキモトリプシン
はアルギニン−アルギニン(arg−arg)またはリジン−リ
ジン(lys−lys)などで特異的に開裂する(英国特許第2
008123A号、前記)。
【0022】以上記載したことから明らかな様に、本発
明は非常に多方面の応用性を持っており、それらはいづ
れも以下に述べる共通した特質を持っている。 1.目的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な
部分をコードしているmRNA転写体であるが、それ自
体を発現した場合、目的産物より大きいかあるいは小さ
い、異なったポリペプチドが産生されるであろうmRN
A転写体を使用する。 2.目的産物に含まれているアミノ酸配列以外のアミノ
酸配列のための蛋白質暗号化コドンが存在する場合は、
これを除去する。 3.有機合成により、所望の配列の残りの部分をコード
する断片を製造する。 4.mRNA転写体および合成断片を結合し、プロモー
ターを含有しているクローニング媒体に入れ、これを複
製し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、また
は異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切断
し得る目的産物を発現する。
明は非常に多方面の応用性を持っており、それらはいづ
れも以下に述べる共通した特質を持っている。 1.目的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な
部分をコードしているmRNA転写体であるが、それ自
体を発現した場合、目的産物より大きいかあるいは小さ
い、異なったポリペプチドが産生されるであろうmRN
A転写体を使用する。 2.目的産物に含まれているアミノ酸配列以外のアミノ
酸配列のための蛋白質暗号化コドンが存在する場合は、
これを除去する。 3.有機合成により、所望の配列の残りの部分をコード
する断片を製造する。 4.mRNA転写体および合成断片を結合し、プロモー
ターを含有しているクローニング媒体に入れ、これを複
製し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、また
は異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切断
し得る目的産物を発現する。
【0023】勿論、発現生成物はいづれの場合も、翻訳
開始信号によって暗号化されているアミノ酸から始まる
(ATGの場合はf−メチオニン)。これは細胞内で除去
されると期待し得るし、またいづれにせよ、最終生成物
の生物活性には本質的な影響を与えないと期待し得る。
本発明は抗体、酵素などの有用な蛋白質の製造に一般に
利用し得るものであるが、特に哺乳動物のポリペプチド
ホルモン類およびその他の医療に使用し得る物質、例え
ばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、すい臓性ポリペ
プチド、アドレノコルチコトロピン、ベータ−エンドル
フィン、インターフェロン、ウロキナーゼ、凝血因子、
ヒトアルブミンなどを発現するのに特に適している。以
下に本発明の好ましい実施形式を記載するが、これは、
ヒト生長ホルモンをコードする部分的合成遺伝子を作製
し、クローンし、そして微生物により発現するものであ
る。
開始信号によって暗号化されているアミノ酸から始まる
(ATGの場合はf−メチオニン)。これは細胞内で除去
されると期待し得るし、またいづれにせよ、最終生成物
の生物活性には本質的な影響を与えないと期待し得る。
本発明は抗体、酵素などの有用な蛋白質の製造に一般に
利用し得るものであるが、特に哺乳動物のポリペプチド
ホルモン類およびその他の医療に使用し得る物質、例え
ばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、すい臓性ポリペ
プチド、アドレノコルチコトロピン、ベータ−エンドル
フィン、インターフェロン、ウロキナーゼ、凝血因子、
ヒトアルブミンなどを発現するのに特に適している。以
下に本発明の好ましい実施形式を記載するが、これは、
ヒト生長ホルモンをコードする部分的合成遺伝子を作製
し、クローンし、そして微生物により発現するものであ
る。
【0024】ヒト生長ホルモンのためのクローニング媒
体の作製および発現 1.mRNA転写体のHae III断片のクローニング Ullrichらの方法により、HGHのためのポリアデニル
化mRNAを、下垂体生長ホルモン産生腫瘍から作製し
た(A.Ullrich et al.Science196.131
3、1977年)。Wickensらの方法に従い、このRN
A5μgから2本線(dsと略す)cDNA1.5μgを作製し
た(Wickens et al.J.Biol.Chem.253 2
483、1978年)。ただし、2番目の鎖の合成に
は、DNAポリメラーゼIの代りにRNAポリメラーゼ
「Klenow fragment」を使用した(H.Klenow Proc.
Nat'l.Acad.Sci.USA.65 168,1970
年)。HGHの制限パターンについては図3に示す様
に、Hae III制限部位が3'非暗号領域内およびH
GHの23および24番目のアミノ酸をコードする配列
内に存在する。このds HGH cDNAをHae II
Iで処理するとHGHの24から191番目のアミノ酸
をコードする551の塩基対(bpと略す)からなるDNA
断片が得られる。例えばcDNA90ngをHae III
で処理し、8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、
550bpの領域を溶離すると、約1ngのcDNAが得ら
れる。
体の作製および発現 1.mRNA転写体のHae III断片のクローニング Ullrichらの方法により、HGHのためのポリアデニル
化mRNAを、下垂体生長ホルモン産生腫瘍から作製し
た(A.Ullrich et al.Science196.131
3、1977年)。Wickensらの方法に従い、このRN
A5μgから2本線(dsと略す)cDNA1.5μgを作製し
た(Wickens et al.J.Biol.Chem.253 2
483、1978年)。ただし、2番目の鎖の合成に
は、DNAポリメラーゼIの代りにRNAポリメラーゼ
「Klenow fragment」を使用した(H.Klenow Proc.
Nat'l.Acad.Sci.USA.65 168,1970
年)。HGHの制限パターンについては図3に示す様
に、Hae III制限部位が3'非暗号領域内およびH
GHの23および24番目のアミノ酸をコードする配列
内に存在する。このds HGH cDNAをHae II
Iで処理するとHGHの24から191番目のアミノ酸
をコードする551の塩基対(bpと略す)からなるDNA
断片が得られる。例えばcDNA90ngをHae III
で処理し、8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、
550bpの領域を溶離すると、約1ngのcDNAが得ら
れる。
【0025】Bolivarらの方法によって調製したpB3
22を、このcDNAのためのクローニング媒体として
選択した(F.Bolivar et al.Gene 2 95−1
13、1977年)。pBR322の特徴は十分に解明さ
れており(J.G.Sutcliffe,Cold Spring Harbor
Symposium 43 70、1978年参照)、これは
多数のコピーを複製するプラスミッドである。また、こ
のプラスミッドはアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性遺伝子(それぞれApR、TcRと表わす。図4参照)を
含んでいるのでアンピシリンおよびテトラサイクリンの
両者に対して耐性を有し、また、制限酵素Pst I、E
co RIおよびHind IIIの認識部位を含んでい
る。
22を、このcDNAのためのクローニング媒体として
選択した(F.Bolivar et al.Gene 2 95−1
13、1977年)。pBR322の特徴は十分に解明さ
れており(J.G.Sutcliffe,Cold Spring Harbor
Symposium 43 70、1978年参照)、これは
多数のコピーを複製するプラスミッドである。また、こ
のプラスミッドはアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性遺伝子(それぞれApR、TcRと表わす。図4参照)を
含んでいるのでアンピシリンおよびテトラサイクリンの
両者に対して耐性を有し、また、制限酵素Pst I、E
co RIおよびHind IIIの認識部位を含んでい
る。
【0026】Hae IIIおよびPst Iの両者とも、
それによる開裂生成物は鈍感末端を有する。従ってCha
ngらの「GCテイリング法」(Chang.A.C.Y.et a
l.Nature275 617、1978年)を用いて、pB
R322をPst Iで開裂した鈍感末端生成物とmRN
A転写体をHae IIIで消化したものを結合すること
ができ、cDNA断片をpBR322のPst I部位に挿
入してcDNA上にHae III制限部位(GG↓CC)
を復元する一方、その挿入体のそれぞれの末端にPst
I制限部位(CTGCA↓G)を復元することができる。
それによる開裂生成物は鈍感末端を有する。従ってCha
ngらの「GCテイリング法」(Chang.A.C.Y.et a
l.Nature275 617、1978年)を用いて、pB
R322をPst Iで開裂した鈍感末端生成物とmRN
A転写体をHae IIIで消化したものを結合すること
ができ、cDNA断片をpBR322のPst I部位に挿
入してcDNA上にHae III制限部位(GG↓CC)
を復元する一方、その挿入体のそれぞれの末端にPst
I制限部位(CTGCA↓G)を復元することができる。
【0027】前記した様に、ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ(TdT)を用いて、3'末端
に約20dCを付加した(Chang,A.Y.C.,前記)。
同様にして、60ngのPst Iで処理したpBR322
の3'末端に約10個のdGを付加した。このdC付加ds
cDNAとdG付加ベクター(媒体)DNAを、10mM
トリス−Hcl(pH7.5)、100mM NaCl、0.25
mM EDTAの130μl中でアニーリングした。この
混合物をE.Coli×1776の形質転換に使用する前
に、70℃に加熱し、徐々に37℃まで冷却し(12時
間)、次いで20℃に冷却した(6時間)。×1776で
クローンしたこのプラスミッドpHGH31につき、Ma
xamおよびGilbertの方法(Proc.Nat'l.Acad.Sc
i.USA74 560、1977年)を用いてDNA配
列を分析した結果、図3に示す様にHGHの24から1
91のアミノ酸のためのコドンが確認された。
オチジルトランスフェラーゼ(TdT)を用いて、3'末端
に約20dCを付加した(Chang,A.Y.C.,前記)。
同様にして、60ngのPst Iで処理したpBR322
の3'末端に約10個のdGを付加した。このdC付加ds
cDNAとdG付加ベクター(媒体)DNAを、10mM
トリス−Hcl(pH7.5)、100mM NaCl、0.25
mM EDTAの130μl中でアニーリングした。この
混合物をE.Coli×1776の形質転換に使用する前
に、70℃に加熱し、徐々に37℃まで冷却し(12時
間)、次いで20℃に冷却した(6時間)。×1776で
クローンしたこのプラスミッドpHGH31につき、Ma
xamおよびGilbertの方法(Proc.Nat'l.Acad.Sc
i.USA74 560、1977年)を用いてDNA配
列を分析した結果、図3に示す様にHGHの24から1
91のアミノ酸のためのコドンが確認された。
【0028】E.Coli K−12株×1776はF-to
nA53dapD8min A1 supE42△40[gal−uvr
B]λ-minB2 rfb−2 nalA25oms−2 thyA5
7*metC65oms−1△29[bioH−asd] cycB2 c
ycA1 hsdR2の遺伝子型を有する。×1776はア
メリカ予防衛生研究所(NIH)により、EK2宿主ベク
ター系として公認されている。
nA53dapD8min A1 supE42△40[gal−uvr
B]λ-minB2 rfb−2 nalA25oms−2 thyA5
7*metC65oms−1△29[bioH−asd] cycB2 c
ycA1 hsdR2の遺伝子型を有する。×1776はア
メリカ予防衛生研究所(NIH)により、EK2宿主ベク
ター系として公認されている。
【0029】×1776はジアミノピメリン酸(DAP)
偏性要求性菌であり、ムコ多糖類コラン酸(colanic ac
id)を合成することができない。従って、細胞の代謝お
よび生長を支えるに十分な栄養は存在しているが、DA
Pが欠乏している環境ではDAP欠乏で死亡する。これ
はチミンまたはチミジンを要求し、代謝活性を維持する
に十分な栄養はあるがチミンおよびチミジンがない環境
では、DNAの崩壊を伴なってチミン欠乏で死滅する。
×1776は胆汁に対する感受性が極めて強く生存する
ことができない。従ってラットの胃腸管を生きて通過す
ることができない。また、×1776は洗剤、抗生物
質、薬物および化学薬品に対して感受性が非常に強い。
さらに×1776は紫外線による損傷を暗回復または光
回復することができず、従って野生型のE.Coli(大腸
菌)により太陽光に対する感受性が数オーダー強い。×
1776は多くの形質導入ファージに対して抵抗し、種
々の突然変異がために、異なったタイプの複合プラスミ
ッド(conjugative plasmids)の遺伝には複合が不十分
である(conjugation deficient)。×1776は、ナリ
ジクシックアシッド(nalidixic acid)、サイクロセリ
ンおよびトリメトプリムに対して抵抗性がある。従っ
て、これらの薬物を培地に加えることにより、この株を
モニターし、形質転換中、汚染菌の形質転換を不可能に
することができる。
偏性要求性菌であり、ムコ多糖類コラン酸(colanic ac
id)を合成することができない。従って、細胞の代謝お
よび生長を支えるに十分な栄養は存在しているが、DA
Pが欠乏している環境ではDAP欠乏で死亡する。これ
はチミンまたはチミジンを要求し、代謝活性を維持する
に十分な栄養はあるがチミンおよびチミジンがない環境
では、DNAの崩壊を伴なってチミン欠乏で死滅する。
×1776は胆汁に対する感受性が極めて強く生存する
ことができない。従ってラットの胃腸管を生きて通過す
ることができない。また、×1776は洗剤、抗生物
質、薬物および化学薬品に対して感受性が非常に強い。
さらに×1776は紫外線による損傷を暗回復または光
回復することができず、従って野生型のE.Coli(大腸
菌)により太陽光に対する感受性が数オーダー強い。×
1776は多くの形質導入ファージに対して抵抗し、種
々の突然変異がために、異なったタイプの複合プラスミ
ッド(conjugative plasmids)の遺伝には複合が不十分
である(conjugation deficient)。×1776は、ナリ
ジクシックアシッド(nalidixic acid)、サイクロセリ
ンおよびトリメトプリムに対して抵抗性がある。従っ
て、これらの薬物を培地に加えることにより、この株を
モニターし、形質転換中、汚染菌の形質転換を不可能に
することができる。
【0030】×1776は、100μg DAP/mlお
よび4μgチミジン/mlを追加したLブロスまたはペナ
セイ(penassay)ブロス中、約50分の世代時間で生長
し、定常期には8〜10×108細胞/mlの密度に達す
る。1〜2分渦巻き状にそして前後にゆっくり振盪して
細胞を100%生存可能の状態に保って懸濁する。×1
776についてのさらに詳しいことはCurtisらの文献
を参照のこと(R.Curtiset al.,Mol enular Cl
oning of Recombinant DNA、99−177、Sc
ott and Werner eds.,Academic Press、N.
Y.1977年)。×1776は1979年7月3日、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(AT
CC)に寄託された(ATCC番号31537、無制限寄
託)。
よび4μgチミジン/mlを追加したLブロスまたはペナ
セイ(penassay)ブロス中、約50分の世代時間で生長
し、定常期には8〜10×108細胞/mlの密度に達す
る。1〜2分渦巻き状にそして前後にゆっくり振盪して
細胞を100%生存可能の状態に保って懸濁する。×1
776についてのさらに詳しいことはCurtisらの文献
を参照のこと(R.Curtiset al.,Mol enular Cl
oning of Recombinant DNA、99−177、Sc
ott and Werner eds.,Academic Press、N.
Y.1977年)。×1776は1979年7月3日、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(AT
CC)に寄託された(ATCC番号31537、無制限寄
託)。
【0031】2.合成遺伝子断片の作製およびクローニ
ング(図1および図2参照) HGH部分的合成遺伝子の作製計画は、mRNA転写体
と結合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂部
位を有する合成遺伝子を作成することであった。従っ
て、図1に示す様に、このHGHの最初の24個のアミ
ノ酸のための合成遺伝子は、23番目のアミノ酸に続い
てHae III開裂部位を含んでいる。この合成断片の
遠位末端にはリンカーが設けられている。このリンカー
により、合成断片は、mRNA転写体および合成断片が
最終的に結合するプラスミッドの、制限開裂によって生
じる1本鎖末端とアニーリングすることができる。
ング(図1および図2参照) HGH部分的合成遺伝子の作製計画は、mRNA転写体
と結合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂部
位を有する合成遺伝子を作成することであった。従っ
て、図1に示す様に、このHGHの最初の24個のアミ
ノ酸のための合成遺伝子は、23番目のアミノ酸に続い
てHae III開裂部位を含んでいる。この合成断片の
遠位末端にはリンカーが設けられている。このリンカー
により、合成断片は、mRNA転写体および合成断片が
最終的に結合するプラスミッドの、制限開裂によって生
じる1本鎖末端とアニーリングすることができる。
【0032】図1に示す様に、2本鎖断片の5'末端に
は、Eco RIおよびHind III制限エンドヌクレ
アーゼのための一本鎖接着末端が含まれており、これに
よりプラスミッドの作製が容易に促進される。左末端の
メチオニンコドンは翻訳開始部位を提供している。11
量体から16量体の種々の大きさの12本の異なったオ
リゴヌクレオチドをCreaの改良ホスホトリエステル法
により合成した(Crea,R.Proc.Nat'l.Acad.Sc
i.USA75 5765、1978年)。U1からU6、
およびL1からL6のこれらのオリゴヌクレオチドは矢印
で示してある。
は、Eco RIおよびHind III制限エンドヌクレ
アーゼのための一本鎖接着末端が含まれており、これに
よりプラスミッドの作製が容易に促進される。左末端の
メチオニンコドンは翻訳開始部位を提供している。11
量体から16量体の種々の大きさの12本の異なったオ
リゴヌクレオチドをCreaの改良ホスホトリエステル法
により合成した(Crea,R.Proc.Nat'l.Acad.Sc
i.USA75 5765、1978年)。U1からU6、
およびL1からL6のこれらのオリゴヌクレオチドは矢印
で示してある。
【0033】10μgのU2からU6およびL2からL
6を、公知の方法に従い、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼおよび(γ32−P)ATPを用いて加燐酸化(phosphory
late)した(Goeddel,D.V.ら、Proc.Nat'l Aca
d.Sci.USA76 106、1979年)。T4リガ
ーゼを触媒として用いた3つの別々の反応を行なった:
即ち、10μgの5'−OH断片U1を加燐酸化したU2,
L5およびL6と結合し;加燐酸化したU3,U4,L3および
L4を結合し;そして10μgの5'−OH断片L1を加燐
酸化したL2,U5およびU6と結合した。これらの結合反
応は300μlの20mMトリス−塩酸(pH7.5)、1m
M MgCl2、10mMジチオトレイット、0.5mM A
TP中、T4リガーゼ100単位を用い、4℃で6時間
行なった。次いで、これらの3種の結合混合物を合わ
せ、T4リガーゼ100単位を加え、20℃で12時間
反応させた。この混合物をエタノールで沈殿させ、10
%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。84塩基
対移動帯をゲルから切取り、溶離した。pBR322(1
μg)をEco RIおよびHind IIIで処理し、大き
い断片をゲル電気泳動法で単離し、合成DNAと結合し
た。この混合体を用いてE.Coli.K−12株294(e
ndA.thi-hsr-、hsmk+を形質転換した。294株は1
978年10月30日、ATCCに寄託された(ATC
C番号31446、無制限寄託)。1個の形質転換体の
プラスミッドpHGH3からのEco RI−HindIII
挿入体の配列をMaxamおよびGilbertの方法(前記)によ
り分析した結果、図1に示した通りであることを確認し
た。
6を、公知の方法に従い、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼおよび(γ32−P)ATPを用いて加燐酸化(phosphory
late)した(Goeddel,D.V.ら、Proc.Nat'l Aca
d.Sci.USA76 106、1979年)。T4リガ
ーゼを触媒として用いた3つの別々の反応を行なった:
即ち、10μgの5'−OH断片U1を加燐酸化したU2,
L5およびL6と結合し;加燐酸化したU3,U4,L3および
L4を結合し;そして10μgの5'−OH断片L1を加燐
酸化したL2,U5およびU6と結合した。これらの結合反
応は300μlの20mMトリス−塩酸(pH7.5)、1m
M MgCl2、10mMジチオトレイット、0.5mM A
TP中、T4リガーゼ100単位を用い、4℃で6時間
行なった。次いで、これらの3種の結合混合物を合わ
せ、T4リガーゼ100単位を加え、20℃で12時間
反応させた。この混合物をエタノールで沈殿させ、10
%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。84塩基
対移動帯をゲルから切取り、溶離した。pBR322(1
μg)をEco RIおよびHind IIIで処理し、大き
い断片をゲル電気泳動法で単離し、合成DNAと結合し
た。この混合体を用いてE.Coli.K−12株294(e
ndA.thi-hsr-、hsmk+を形質転換した。294株は1
978年10月30日、ATCCに寄託された(ATC
C番号31446、無制限寄託)。1個の形質転換体の
プラスミッドpHGH3からのEco RI−HindIII
挿入体の配列をMaxamおよびGilbertの方法(前記)によ
り分析した結果、図1に示した通りであることを確認し
た。
【0034】3.細菌によるHGHの発現のためのプラ
スミッドの作製(図5) pHGH3中の合成断片およびpHGH31中のmRNA
転写体を用い、発現用プラスミッドpGH6を使用し
て、図5に示す様に、両方の断片を含有する複製可能な
プラスミッドを作製した。まず、縦列lacプロモーター
を含有するこの発現用プラスミッドを次の様にして作製
した。Backmanらの方法に従い、95塩基対の非相同(h
eterologous)DNA断片で分離されている2個の95塩
基対UV5lacプロモーター断片を含有する285塩基
対Eco RI断片をプラスミッドpKB268から単離
した(K.Backman,et al.,Cell 13巻 65−7
1、1978年)。この285塩基対断片をpBR322
のEco RI部位に挿入し、テトラサイクリン耐性遺伝
子を持った適切な解読相内に向って配置しているプロモ
ーター群を有するクローンpGH1を単離した。このテ
トラサイクリン耐性遺伝子から遠位のEco RI部位を
Eco RIによる部分消化で破壊し、その結果得られる
1本鎖Eco RI末端をDNAポリメラーゼIで修復
し、鈍感末端結合によりプラスミッドを再環化した。作
成されたプラスミッドpGH6は、完成したHGH用遺
伝子を挿入することができるプロモーター系について適
切に配置された単一のEco RI部位を含有している。
スミッドの作製(図5) pHGH3中の合成断片およびpHGH31中のmRNA
転写体を用い、発現用プラスミッドpGH6を使用し
て、図5に示す様に、両方の断片を含有する複製可能な
プラスミッドを作製した。まず、縦列lacプロモーター
を含有するこの発現用プラスミッドを次の様にして作製
した。Backmanらの方法に従い、95塩基対の非相同(h
eterologous)DNA断片で分離されている2個の95塩
基対UV5lacプロモーター断片を含有する285塩基
対Eco RI断片をプラスミッドpKB268から単離
した(K.Backman,et al.,Cell 13巻 65−7
1、1978年)。この285塩基対断片をpBR322
のEco RI部位に挿入し、テトラサイクリン耐性遺伝
子を持った適切な解読相内に向って配置しているプロモ
ーター群を有するクローンpGH1を単離した。このテ
トラサイクリン耐性遺伝子から遠位のEco RI部位を
Eco RIによる部分消化で破壊し、その結果得られる
1本鎖Eco RI末端をDNAポリメラーゼIで修復
し、鈍感末端結合によりプラスミッドを再環化した。作
成されたプラスミッドpGH6は、完成したHGH用遺
伝子を挿入することができるプロモーター系について適
切に配置された単一のEco RI部位を含有している。
【0035】RNA転写体と結合させるための合成断片
を得るために、10μgのpHGH3をEco RIおよび
Hae III制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、HG
Hアミノ酸1〜23の暗号配列を含有している77塩基
対断片を8%ポリアクリルアミドゲルで分離した。
を得るために、10μgのpHGH3をEco RIおよび
Hae III制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、HG
Hアミノ酸1〜23の暗号配列を含有している77塩基
対断片を8%ポリアクリルアミドゲルで分離した。
【0036】次いで5μgのプラスミッドpHGH31を
Hae IIIで切断した。551塩基対HGH配列およ
び一緒に移動したpBR322の540塩基対をゲル電
気泳動法により精製した。次いでXma Iで処理してH
GH配列のみを切断し、3'非コード領域から39塩基
対を除去した。得られた512塩基対断片を、540塩
基対のpBR322Hae III切片から、6%ポリア
クリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離した。
0.3μgの77塩基対Eco RI−Hae III断片を
16μlの反応液中、T4リガーゼを用いて4℃で14
時間ポリメリ化した。リガーゼを不活性化するために、
この混合物を70℃で5分間加熱し、次いでEco RI
(Eco RI部位によってダイマー化(二量化)した断片
を開裂するため)およびSma I(Xma Iダイマーを開
裂するため)で処理し、Eco RI接着末端およびSma
I鈍感末端を有する591塩基対断片を得た。6%の
ポリアクリルアミドゲルを用いて精製し、この断片約3
0ngを得た。ところで、発現用プラスミッドpGH6は
Xma I認識部位を含んでいないことを留意すべきであ
る。しかしながら、Sma IはXma Iと同じ部位を認
識し、しかしその中間部を切断し、鈍感末端を生成する
のである。従ってpHGH31から導かれたこの断片の
Sma−切断末端は、鈍感末端でpGH6に結合していく
ことができる。
Hae IIIで切断した。551塩基対HGH配列およ
び一緒に移動したpBR322の540塩基対をゲル電
気泳動法により精製した。次いでXma Iで処理してH
GH配列のみを切断し、3'非コード領域から39塩基
対を除去した。得られた512塩基対断片を、540塩
基対のpBR322Hae III切片から、6%ポリア
クリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離した。
0.3μgの77塩基対Eco RI−Hae III断片を
16μlの反応液中、T4リガーゼを用いて4℃で14
時間ポリメリ化した。リガーゼを不活性化するために、
この混合物を70℃で5分間加熱し、次いでEco RI
(Eco RI部位によってダイマー化(二量化)した断片
を開裂するため)およびSma I(Xma Iダイマーを開
裂するため)で処理し、Eco RI接着末端およびSma
I鈍感末端を有する591塩基対断片を得た。6%の
ポリアクリルアミドゲルを用いて精製し、この断片約3
0ngを得た。ところで、発現用プラスミッドpGH6は
Xma I認識部位を含んでいないことを留意すべきであ
る。しかしながら、Sma IはXma Iと同じ部位を認
識し、しかしその中間部を切断し、鈍感末端を生成する
のである。従ってpHGH31から導かれたこの断片の
Sma−切断末端は、鈍感末端でpGH6に結合していく
ことができる。
【0037】縦列lacUV5プロモーターを含む発現用
プラスミッドpGH6を、順次HindIII、ヌクレアー
ゼS1およびEco RIで処理し、ゲル電気泳動法によ
り精製した。この様にして得た1個のEco RI接着末
端および1個の鈍感末端を有するベクター50ngを、1
0ngの591塩基対HGH DNAと結合させた。この
結合混合物を用いてE.Coli×1776を形質転換し
た。テトラサイクリン(12.5μg/ml)に抵抗して生長
するコロリーを選択した。ハイブリッド(雑種)HGH遺
伝子をpGH6に挿入することによってテトラサイクリ
ン耐性遺伝子のためのプロモーターが破壊されるが、縦
列lacプロモーターによってテトラサイクリン耐性のた
めの構造遺伝子が通読され、この選択特性が保持される
ことに注目すべきである。この様にして約400の形質
転換体を得た。Grunstein−Hognessの方法によるフィ
ルターハイブリダイゼーションによってHGH配列を含
む12のコロニーを確認した(Proc.Nat'l Acad.
Sci.USA,72 3961、1975年)。これらの
コロニーの内、3種のコロニーから分離したプラスミッ
ドがHae III、Pvu IIおよびPst Iで開裂し
た時、期待する制限パターンを示した。1個のクロー
ン、pHGH107のDNA配列を測定した。
プラスミッドpGH6を、順次HindIII、ヌクレアー
ゼS1およびEco RIで処理し、ゲル電気泳動法によ
り精製した。この様にして得た1個のEco RI接着末
端および1個の鈍感末端を有するベクター50ngを、1
0ngの591塩基対HGH DNAと結合させた。この
結合混合物を用いてE.Coli×1776を形質転換し
た。テトラサイクリン(12.5μg/ml)に抵抗して生長
するコロリーを選択した。ハイブリッド(雑種)HGH遺
伝子をpGH6に挿入することによってテトラサイクリ
ン耐性遺伝子のためのプロモーターが破壊されるが、縦
列lacプロモーターによってテトラサイクリン耐性のた
めの構造遺伝子が通読され、この選択特性が保持される
ことに注目すべきである。この様にして約400の形質
転換体を得た。Grunstein−Hognessの方法によるフィ
ルターハイブリダイゼーションによってHGH配列を含
む12のコロニーを確認した(Proc.Nat'l Acad.
Sci.USA,72 3961、1975年)。これらの
コロニーの内、3種のコロニーから分離したプラスミッ
ドがHae III、Pvu IIおよびPst Iで開裂し
た時、期待する制限パターンを示した。1個のクロー
ン、pHGH107のDNA配列を測定した。
【0038】この形質転換体によって発現されたヒト生
長ホルモンは、ファデバスHGHプライストキット(Ph
adebas HGH PRIST Kit、Farmacia)を用
い、溶菌上澄液を順次希釈したものを直接放射免疫分析
することにより簡単に検出された。HGHの発現がlac
プロモーターのコントロール下(支配下)で行なわれたこ
とを示すために、pHGH107をlacレプレッサーを過
剰生産するE.Coli株D1210 lac+(iQo+Zty
+)に入れた。インデューサー、IPTG(イソプロピル
チオガラクトシド)を添加するまで、有意な量のHGH
発現生成物は検出されなかった。
長ホルモンは、ファデバスHGHプライストキット(Ph
adebas HGH PRIST Kit、Farmacia)を用
い、溶菌上澄液を順次希釈したものを直接放射免疫分析
することにより簡単に検出された。HGHの発現がlac
プロモーターのコントロール下(支配下)で行なわれたこ
とを示すために、pHGH107をlacレプレッサーを過
剰生産するE.Coli株D1210 lac+(iQo+Zty
+)に入れた。インデューサー、IPTG(イソプロピル
チオガラクトシド)を添加するまで、有意な量のHGH
発現生成物は検出されなかった。
【0039】pHGH107のEco RI部位を除去す
ることにより、lacプロモーターのリボゾーム結合部位
コドンとATG開始信号との距離は、天然におけるその
リボゾーム結合部位コドンとβ−ガラクトシダーゼのた
めの開始信号との間の距離と同じになるであろう。この
天然の距離を模倣することによって発現が増加するかど
うかを調べる為に、pHGH107をEco RIで開裂
し、得られた1本鎖末端をS1エンドヌクレアーゼで消
化し、次いでT4リガーゼを用いて鈍感末端結合して再
環化することにより、pHGH107をpHGH107−
1に変換した。この様にして得たプラスミッドは同様に
HGHを発現することができるけれども、驚くべきこと
に、発現の程度はpGH107より低いことが直接放射
免疫分析によってわかった。
ることにより、lacプロモーターのリボゾーム結合部位
コドンとATG開始信号との距離は、天然におけるその
リボゾーム結合部位コドンとβ−ガラクトシダーゼのた
めの開始信号との間の距離と同じになるであろう。この
天然の距離を模倣することによって発現が増加するかど
うかを調べる為に、pHGH107をEco RIで開裂
し、得られた1本鎖末端をS1エンドヌクレアーゼで消
化し、次いでT4リガーゼを用いて鈍感末端結合して再
環化することにより、pHGH107をpHGH107−
1に変換した。この様にして得たプラスミッドは同様に
HGHを発現することができるけれども、驚くべきこと
に、発現の程度はpGH107より低いことが直接放射
免疫分析によってわかった。
【0040】本発明は上に述べた好ましい実施形式に限
定されるのではなく、特許請求の範囲の記載によっての
み限定されるものであることは、当業者には容易に理解
されるだろう。プロモーター系、親プラスミッド、目的
とするポリペプチド生成物またはその他の因子を種々選
択し直すことにより、これまで述べたものに種々の変更
を加えることは勿論可能である。例えば、他のプロモー
ター系を本発明において使用することができる。この様
なプロモーター系としてはラムダープロモーター、アル
ビノースオペロン(Phi80dara)、またはコリシンE
1、ガラクトース、アルカリホスファターゼあるいはト
リプトファンプロモーター系などを挙げることができ
る。細菌による発現のために使用する宿主生物として
は、例えばエンテロバクテリアケア(Enterobacteriace
ae)、例えば大腸菌株、サルモネラ(Salmonella);バシ
ラーケア(Bacillaceae)、例えば枯草菌(bacillussubti
lis);肺炎球菌(Pneumococcus);連鎖球菌(Streptococc
us);およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenza
e)などが挙げられる。勿論、どの微生物を選ぶかによっ
て、アメリカ予防衛生研究所の組み換えDNAのための
ガイドライン(43Fed.Reg.60,080、1978
年)に従って行なわれなければならないクローニングお
よび発現操作において、物理的封じ込めの程度を調節し
なければならない。
定されるのではなく、特許請求の範囲の記載によっての
み限定されるものであることは、当業者には容易に理解
されるだろう。プロモーター系、親プラスミッド、目的
とするポリペプチド生成物またはその他の因子を種々選
択し直すことにより、これまで述べたものに種々の変更
を加えることは勿論可能である。例えば、他のプロモー
ター系を本発明において使用することができる。この様
なプロモーター系としてはラムダープロモーター、アル
ビノースオペロン(Phi80dara)、またはコリシンE
1、ガラクトース、アルカリホスファターゼあるいはト
リプトファンプロモーター系などを挙げることができ
る。細菌による発現のために使用する宿主生物として
は、例えばエンテロバクテリアケア(Enterobacteriace
ae)、例えば大腸菌株、サルモネラ(Salmonella);バシ
ラーケア(Bacillaceae)、例えば枯草菌(bacillussubti
lis);肺炎球菌(Pneumococcus);連鎖球菌(Streptococc
us);およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenza
e)などが挙げられる。勿論、どの微生物を選ぶかによっ
て、アメリカ予防衛生研究所の組み換えDNAのための
ガイドライン(43Fed.Reg.60,080、1978
年)に従って行なわれなければならないクローニングお
よび発現操作において、物理的封じ込めの程度を調節し
なければならない。
【0041】本発明は実験室規模で実施するのは好まし
いけれども、E.Coli×1776は、生物学的安全性
の為に故意に虚弱性が導入されているので、大規模に工
業生産するには限界があることがわかった。生物学的封
じ込めよりも、むしろ適当な物理学的封じ込めを行え
ば、E.Coli.K−12株294(前記)およびE.Co
li.株RRI、遺伝子型:Pro-Leu-Thi-RB -recA+
Strr Lacy-の様な微生物を大規模操作に使用するこ
とができる。E.Coli.RRIは、Hfrドナー(高頻度
組換型供与菌)としてのE.Coli.K12株KL16と
かけあわせることにより、E.Coli HB101(H.
W.Boyerら、J.Mol.Bio.41 459−47
2、1969年参照)から得ることができる(J.H.M
iller,Experiments in Molecular Genetics;Col
d Spring Harbor,New York,1972年参照)。
E.Coli.RRIは、1978年10月30日、AT
CCに寄託された(無制限寄託、ATCC番号3134
3)。×1776株も同様に1979年7月3日、AT
CCに寄託された(ATCC番号31537)。その他、
プラスミッドpHGH107(ATCC番号4001
1)、プラスミッドpGH6(ATCC番号40012)、
pHGH107で形質転換した×1776株(ATCC番
号31538)およびpGH6で形質転換したE.Coli
K12株294(ATCC番号31539)も1979年
7月3日、ATCCに寄託された。
いけれども、E.Coli×1776は、生物学的安全性
の為に故意に虚弱性が導入されているので、大規模に工
業生産するには限界があることがわかった。生物学的封
じ込めよりも、むしろ適当な物理学的封じ込めを行え
ば、E.Coli.K−12株294(前記)およびE.Co
li.株RRI、遺伝子型:Pro-Leu-Thi-RB -recA+
Strr Lacy-の様な微生物を大規模操作に使用するこ
とができる。E.Coli.RRIは、Hfrドナー(高頻度
組換型供与菌)としてのE.Coli.K12株KL16と
かけあわせることにより、E.Coli HB101(H.
W.Boyerら、J.Mol.Bio.41 459−47
2、1969年参照)から得ることができる(J.H.M
iller,Experiments in Molecular Genetics;Col
d Spring Harbor,New York,1972年参照)。
E.Coli.RRIは、1978年10月30日、AT
CCに寄託された(無制限寄託、ATCC番号3134
3)。×1776株も同様に1979年7月3日、AT
CCに寄託された(ATCC番号31537)。その他、
プラスミッドpHGH107(ATCC番号4001
1)、プラスミッドpGH6(ATCC番号40012)、
pHGH107で形質転換した×1776株(ATCC番
号31538)およびpGH6で形質転換したE.Coli
K12株294(ATCC番号31539)も1979年
7月3日、ATCCに寄託された。
【0042】本発明によって製造される微生物は、ヒト
生長ホルモンを工業的スケールで発酵により製造する方
法に使用することができ、多量の生成物を得ることがで
き、従来不可能であった分野に使用することができる。
例えば形質転換E.Coli株は、常法により通気し、攪
拌している鋼鉄製またはその他の発酵容器中の水性培
地、例えば、適当な栄養物(例えば炭水化物またはグリ
セロール)、硫酸アンモニウムの様な窒素源、燐酸カル
シウムの如きカリウム源、微量元素、硫酸マグチシウム
などを含んだ、ほぼ中性pHの(例えばpH7±0.3)、
約37℃の水性培地中で増殖させることができる。形質
転換微生物は、抗生物質耐性の如き1またはそれ以上の
選択特性を示すことが好ましく、それによって選択圧が
かかって野生型E.Coliの競合増殖が抑制される。例
えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性微生物
の場合、その抗生物質を発酵培地に加え、それに対する
耐性を持っていない野生型生物を選別することができ
る。
生長ホルモンを工業的スケールで発酵により製造する方
法に使用することができ、多量の生成物を得ることがで
き、従来不可能であった分野に使用することができる。
例えば形質転換E.Coli株は、常法により通気し、攪
拌している鋼鉄製またはその他の発酵容器中の水性培
地、例えば、適当な栄養物(例えば炭水化物またはグリ
セロール)、硫酸アンモニウムの様な窒素源、燐酸カル
シウムの如きカリウム源、微量元素、硫酸マグチシウム
などを含んだ、ほぼ中性pHの(例えばpH7±0.3)、
約37℃の水性培地中で増殖させることができる。形質
転換微生物は、抗生物質耐性の如き1またはそれ以上の
選択特性を示すことが好ましく、それによって選択圧が
かかって野生型E.Coliの競合増殖が抑制される。例
えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性微生物
の場合、その抗生物質を発酵培地に加え、それに対する
耐性を持っていない野生型生物を選別することができ
る。
【0043】発酵が完了したら細菌懸濁液を遠心分離す
るかあるいはブロスから細菌固形物を集め、次いで物理
的または化学的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残
骸を除去し、可溶性生長ホルモンを単離精製する。ヒト
生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれかの方
法により、またはそれらを組み合わせることによって精
製することができる。(1)ポリエチレンイミン分別法、
(2)セフアクリル(Sephacryl)S−200によるゲル濾
過クロマトグラフィー、(3)ビオレックス(Biorex)−
70レジンまたはCMセファデックスによるイオン交換
クロマトグラフィー、(4)硫酸アンモニウムおよび/ま
たはpH分別法、および(5)ハイブリードマス(hybridom
as)または免疫感作動物から単離した抗−HGH IgG
から調製した抗体レジンを用いたアフィニィティークロ
マトグラフィー;このホルモンは酸性条件または僅かに
変性させた条件下で脱着させる。
るかあるいはブロスから細菌固形物を集め、次いで物理
的または化学的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残
骸を除去し、可溶性生長ホルモンを単離精製する。ヒト
生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれかの方
法により、またはそれらを組み合わせることによって精
製することができる。(1)ポリエチレンイミン分別法、
(2)セフアクリル(Sephacryl)S−200によるゲル濾
過クロマトグラフィー、(3)ビオレックス(Biorex)−
70レジンまたはCMセファデックスによるイオン交換
クロマトグラフィー、(4)硫酸アンモニウムおよび/ま
たはpH分別法、および(5)ハイブリードマス(hybridom
as)または免疫感作動物から単離した抗−HGH IgG
から調製した抗体レジンを用いたアフィニィティークロ
マトグラフィー;このホルモンは酸性条件または僅かに
変性させた条件下で脱着させる。
【図1】 HGHの最初の24個のアミノ酸をコードす
る遺伝子を含有する合成遺伝子断片の模式図である。
る遺伝子を含有する合成遺伝子断片の模式図である。
【図2】 合成遺伝子のプラスミッドへの挿入を示す模
式図である。
式図である。
【図3】 HGHをコードしているmRNA転写体のD
NA配列を示す模式図である。
NA配列を示す模式図である。
【図4】 mRNA転写体のプラスミッドへの挿入を示
す模式図である。
す模式図である。
【図5】 HGHを発現し得るプラスミッドの作製を示
す模式図である。
す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // A61K 37/36 8314−4C (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19)
Claims (7)
- 【請求項1】 形質転換細菌中でヒト成長ホルモンリー
ダー配列、あるいは結合した他の外来蛋白質を伴ってい
ないヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細
菌プラスミド。 - 【請求項2】 ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子の
実質的な部分がcDNAあるいはその複製物である請求
項1記載のプラスミド。 - 【請求項3】 少なくとも1つの抗生物質に対する耐性
を示す請求項1記載のプラスミド。 - 【請求項4】 tetプロモーターを欠失しているがテト
ラサイクリン耐性を示す請求項3記載のプラスミド。 - 【請求項5】 縦列lacプロモーターの制御下にヒト成
長ホルモンをコードする遺伝子が存在する請求項4記載
のプラスミド。 - 【請求項6】 プラスミドpHGH107。
- 【請求項7】 プラスミドpHGH107−1。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/055,126 US4342832A (en) | 1979-07-05 | 1979-07-05 | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
US55126 | 1979-07-05 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP55092161A Division JPH0612996B2 (ja) | 1979-07-05 | 1980-07-04 | 部分的合成遺伝子の微生物学的発現法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05268970A true JPH05268970A (ja) | 1993-10-19 |
JP2622479B2 JP2622479B2 (ja) | 1997-06-18 |
Family
ID=26733870
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP55092161A Expired - Lifetime JPH0612996B2 (ja) | 1979-07-05 | 1980-07-04 | 部分的合成遺伝子の微生物学的発現法 |
JP1099888A Expired - Lifetime JPH0648987B2 (ja) | 1979-07-05 | 1989-04-18 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
JP4256344A Expired - Lifetime JP2622479B2 (ja) | 1979-07-05 | 1992-09-25 | ヒト成長ホルモンの遺伝子を発現する複製可能な細菌プラスミド |
JP7310696A Pending JPH08242881A (ja) | 1979-07-05 | 1995-11-29 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP55092161A Expired - Lifetime JPH0612996B2 (ja) | 1979-07-05 | 1980-07-04 | 部分的合成遺伝子の微生物学的発現法 |
JP1099888A Expired - Lifetime JPH0648987B2 (ja) | 1979-07-05 | 1989-04-18 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7310696A Pending JPH08242881A (ja) | 1979-07-05 | 1995-11-29 | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 |
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Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0022242B1 (ja) |
JP (4) | JPH0612996B2 (ja) |
KR (2) | KR830003574A (ja) |
AR (1) | AR244341A1 (ja) |
AT (1) | ATE82324T1 (ja) |
AU (2) | AU533697B2 (ja) |
BE (1) | BE884012A (ja) |
BG (1) | BG41135A3 (ja) |
BR (1) | BR8008736A (ja) |
CA (2) | CA1164375A (ja) |
CH (1) | CH661939A5 (ja) |
CS (3) | CS250652B2 (ja) |
DD (3) | DD210071A5 (ja) |
DE (3) | DE3050722C2 (ja) |
DK (2) | DK173503B1 (ja) |
EG (1) | EG14819A (ja) |
ES (2) | ES493149A0 (ja) |
FI (2) | FI802030A (ja) |
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GB (2) | GB2121047B (ja) |
GR (1) | GR69320B (ja) |
HK (3) | HK87484A (ja) |
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IT (1) | IT1131393B (ja) |
KE (3) | KE3450A (ja) |
MX (1) | MX172674B (ja) |
MY (3) | MY8500763A (ja) |
NL (1) | NL930114I2 (ja) |
NO (2) | NO167673C (ja) |
NZ (2) | NZ201312A (ja) |
OA (1) | OA06562A (ja) |
PH (1) | PH19814A (ja) |
PL (1) | PL149278B1 (ja) |
PT (1) | PT71487A (ja) |
RO (1) | RO93374B (ja) |
SG (1) | SG56984G (ja) |
WO (1) | WO1981000114A1 (ja) |
YU (3) | YU163580A (ja) |
ZA (1) | ZA803600B (ja) |
ZW (1) | ZW14180A1 (ja) |
Families Citing this family (186)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
US4898830A (en) * | 1979-07-05 | 1990-02-06 | Genentech, Inc. | Human growth hormone DNA |
US6455275B1 (en) | 1980-02-25 | 2002-09-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells |
CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
US4711843A (en) * | 1980-12-31 | 1987-12-08 | Cetus Corporation | Method and vector organism for controlled accumulation of cloned heterologous gene products in Bacillus subtilis |
IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
US4370417A (en) * | 1980-04-03 | 1983-01-25 | Abbott Laboratories | Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator |
US6610830B1 (en) | 1980-07-01 | 2003-08-26 | Hoffman-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferons |
IE53166B1 (en) * | 1980-08-05 | 1988-08-03 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression |
US7101981B1 (en) | 1980-08-26 | 2006-09-05 | Regents Of The University Of California | Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli |
US4725549A (en) * | 1980-09-22 | 1988-02-16 | The Regents Of The University Of California | Human and rat prolactin and preprolactin cloned genes |
NZ198445A (en) * | 1980-09-25 | 1984-05-31 | Genentech Inc | Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology |
NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
JPS57181098A (en) * | 1981-04-30 | 1982-11-08 | Japan Found Cancer | Novel recombinant dna |
US4801685A (en) * | 1981-08-14 | 1989-01-31 | Hoffmann-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L |
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