DE2912292C2

DE2912292C2 -

Info

Publication number: DE2912292C2
Application number: DE2912292A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Watanabe; Yoshiaki Satoh; Takayuki Yokohama Jp Takano
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1978-03-29
Filing date: 1979-03-28
Publication date: 1988-06-30
Also published as: US4248968A; IT1162484B; RO82577A; FR2421212B1; GB2018240A; NL7902453A; FR2421212A1; RO82577B; DE2912292A1; GB2018240B; SU1299501A3; DE2954531C2; IT7948496A0; RO77918A

Description

In der US-PS 40 01 081 wird ein Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid aus Acrylnitril (AN) oder Methacrylnitril (MAN) unter Anwendung einer enzymatischen Reaktion beschrieben, bei dem ein Bakterium verwendet wird, das zu den Gattungen Bacillus, Bacteridium im Sinne von Prevot, Micrococcus, Brevibacterium im Sinne von Bergey oder ähnlichen gehört. Dieses Verfahren basiert auf der Entdeckung, daß das oben genannte Bakterium verschiedene organische Nitrile unter Ausbildung der entsprechenden organischen Säureamide hydrolysiert. Im Falle der Umsetzung von Acrylnitril oder Methacrylnitril (Beispiele 6 bis 8 in der genannten US-PS) ist dort angegeben, daß Acrylamid oder Methacrylamid fast quantitativ erhalten wird, wenn die Reaktionsbedinungen 8 bis 12 Gew.-% Acrylnitril - oder Methacrylnitril-Konzentration, 2 bis 4 Gew.-% Bakteriumzellen- Konzentration, pH-Wert 7 bis 9, Temperatur 25°C und Reaktionszeit 20 bis 30 Minuten eingehalten werden. Es trifft zwar zu, daß Acrylamid oder Methacrylamid in der angegebenen hohen Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% hergestellt werden kann, jedoch verlieren die Bakteriumzellen ihre enzymatische Aktivität unter diesen Bedingungen schnell. Außerdem ist die Lösung, aus der die Bakteriumzellen abgetrennt werden, stark gelb gefärbt und enthält verschiedene Verunreinigungen, die aus den Zellen stammen, so daß ein schwieriger Reinigungsprozeß erforderlich ist. Das oben beschriebene Verfahren ist somit wirtschaftlich nicht vorteilhaft und deshalb für die industrielle Anwendung nicht geeignet.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid aus Acrylnitril oder Methacrylnitril in einem wäßrigen Medium unter Einwirkung eines Bakteriums zur Verfügung zu stellen, das Acrylamid- oder Methacrylamid-Konzentrationen von wenigstens 10 Gew.-% ermöglicht, und bei dem man keine besondere Reinigungsstufe vornehmen muß. Außerdem soll bei dem Verfahren die enzymatische Nitrilase-Aktivität des verwendeten Bakteriums auch bei niedrigen Temperaturen hoch sein und für lange Zeit erhalten bleiben.

Dies Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Patentansprüchen 2 bis 4 angegeben.

Es wurde festgestellt, daß die enzyatische Nitrilase-Aktivität der Stämme Corynebacterium N-771 und N-774 sowie von Nocardia N-775 bei niedrigen Temperaturen überraschend hoch ist, und daß diese Stämme bei der Hydrolyse von AN und MAN unter Bildung von Acrylamid bzw. Methacrylamid eine hohe enzymatische Aktivität während einer langen Zeit beibehalten, wobei man gleichzeitig auch Konzentrationen an Acrylamid bzw. Methacrylamid von 10 Gew.-% oder mehr erreicht.

Gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird kontinuierlich eine wäßrige Lösung von AN oder MAN durch eine oder mehrere oder gegebenenfalls in Reihe hintereinander geschaltete Kolonnen geleitet, die mit den immobilisierten Bakteriumzellen gefüllt sind, und AN oder MAN wird durch einen oder mehrere Einlässe zwischen dem Kolonneneinlaß und dem Kolonnenauslaß einer Kolonne derart zugeführt, daß es sich in der Reaktionsmischung auflösen kann.

Die Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind die bereits genannten Stämme N-771, N-774 und N-775.

Für die Kultivierung der Mikroorganismenstämme, die bei der vor liegenden Erfindung zu verwenden sind, dienen übliche Kulturmedien, die eine Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Maltose), eine Stickstoffquelle (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid), eine organische Nährstoffquelle (z. B. Hefeextrakt, Malz extrakt, Pepton, Fleischextrakt) und eine anorganische Nährstoffquelle (z. B. Phosphate, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen, Mangan) enthalten. Die Kultur wird aerobisch geführt, während der pH-Wert des Kulturmediums auf etwa 6 bis 9 bei einer Temperatur von etwa 20 bis 35°C gehalten wird, vorzugsweise etwa 25 bis 30°C, und zwar für etwa 1 bis 5 Tage.

Die Stämme N-771, N-774 und N-775, die bei der vorliegenden Er findung verwendet werden, wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan unter den Nummern FERM-P 4 445, 4 446 und 4 447 hinterlegt und am 10. Januar 1986 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags nochmals als FERM BP-959, BP-960 und BP-961 hinterlegt. Die bakteriologischen Eigenschaften jeder dieser Stämme werden nachfolgend angegeben.

A: Stamm N-771 (a) Morphologie

(1) Größe und Form der Zellen:
(0,5-0,8)µ×(2-5)µ
(2) Pleomorphis der Zellen:
Im Anfangsstadium der Kultur liegen die Bakterien zellen als lange stäbchenförmige Gebilde ohne Krümmung vor, wachsen unter Verzweigung und brechen und spalten danach zu Gebilden in kokoider oder kurzer Stäbchenform auf.
(3) Beweglichkeit: keine
(4) Sporen: keine
(5) Gramfärbung: positiv
(6) Säurefestigkeit: negativ
(7) Metachromatisches Granulat: positiv

(b) Wachstumszustand in unterschiedlichen Kulturmedien (bei 30°C)

(1) Nährstoff Agar Plattenkultur:
Rundscheiben (1 bis 3 mm Durchmesser) mit festen Kanten, glatt, halbsphärisch, opak mit Lüster, leicht pinkfarben.
(2) Nährstoff Agar Flächenkultur:
Mittleres Wachstum, filamentähnlich, oberflächenglatt, konvex, glänzend, leicht pinkfarben.
(3) Flüssige Bouillonkultur:
Kräftiges Wachstum unter Bildung von Membranen (Häutchen) mittelgradige Trübung mit Wachstum, Bildung eines Niederschlages.
(4) Gelatinierte Bouillon-Impfkultur:
Gutes Wachstum an der Oberfläche, trichterförmiges Wachstum entlang des Impfstabes bei nahezu keinem Wachstum im unteren Bereich, keine Verflüssigung der Gelatine.
(5) Lackmusmilch: keine Veränderung

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat: positiv
(2) Entnitrierung: negativ
(3) MR-Test: negativ
(4) VP-Test: negativ
(5) Indolbildung: negativ
(6) Hydrogensulfid-Bildung: negativ
(7) Stärkehydrolyse: negativ
(8) Verwendung von Zitronensäure:
Kosers Kulturmedium: negativ
Christiansens Kulturmedium: positiv
(9) Verwendung anorganischer Stickstoffquellen:
Nitrat: positiv
Ammoniumsalze: positiv
(10) Pigmentbildung: negativ
(11) Urease: positiv
(12) Oxidase: nagativ
(13) Katalase: positiv
(14) Hydrolyse von Zellulose: negativ
(15) Wachstumsbereich: pH-Wert 5 bis 10; Temperatur 5 bis 37°C
(16) Sauerstoffverhältnis: aerobisch
(17) O-F-Test: F
(18) Wärmebeständigkeit (in 10%iger Magermilch, bei 72°C für 15 Minuten): keine
(19) Säure- und Gas-Bildung aus Zucker

B: Stamm N-774 (a) Morphologie

(1) Größe und Form der Zellen:
(0,5-0,8)µ×(2-5)µ
(2) Pleomorphismus der Zellen:
Im Anfangsstadium der Kultur liegen die Bakterienzellen als lange stäbchenförmige Gebilde ohne Krümmung vor, wachsen unter Verzweigung und brechen und spalten danach zu Gebilden in kokoider oder kurzer Stäbchenform auf.
(3) Beweglichkeit: keine
(4) Sporen: keine
(5) Gramfärbung: positiv
(6) Säurefestigkeit: negativ
(7) Metachromatisches Granulat: positiv

(b) Wachstumszustand in unterschiedlichen Kulturmedien (bei 30°C)

(1) Nährstoff Agar Plattenkultur:
Rundscheiben (1 bis 3 mm Durchmesser), leicht irregulär, glatt mit Tendenz der Oberflächentrocknung, flach, opak, leicht pinkfarben.
(2) Nährstoff Agar Flächenkultur:
Mittleres Wachstum, filamentähnlich, oberflächenglatt, konvex mit der Tendenz zur Trocknung, leicht pinkfarben.
(3) Flüssige Bouillonkultur:
Kräftiges Wachstum unter Bildung von Membranen (Häutchen), leicht trüb, Bildung eines Niederschlages mit Wachstum.
(4) Gelatinierte Bouillon-Impfkultur:
Gutes Wachstum an der Oberfläche, trichterförmiges Wachstum entlang des Impfstabes bei nahezu keinem Wachstum im unteren Bereich, keine Verflüssigung der Gelatine.
(5) Lackmusmilch: keine Veränderung

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat: positiv
(2) Entnitrierung: negativ
(3) MR-Test: negativ
(4) VP-Test: negativ
(5) Indolbildung: negativ
(6) Hydrogensulfid-Bildung: negativ
(7) Stärkehydrolyse: negativ
(8) Verwendung von Zitronensäure:
Kosers Kulturmedium: negativ
Christiansens Kulturmedium: positiv
(9) Verwendung anorganischer Stickstoffquellen:
Nitrat: positiv
Ammoniumsalze: positiv
(10) Pigmentbildung: negativ
(11) Urease: positiv
(12) Oxidase: negativ
(13) Katalase: positiv
(14) Hydrolyse von Zellulose: negativ
(15) Wachstumsbereich: pH-Wert 5 bis 10; Temperatur 10 bis 40°C
(16) Sauerstoffverhältnis: aerobisch
(17) O-F-Test: F
(18) Wärmebeständigkeit (in 10%iger Magermilch, bei 72°C für 15 Minuten): keine
(19) Säure- und Gas-Bildung aus Zucker

C: Stamm N-775 (a) Morphologie

(1) Größe und Form der Zellen:
(0,6-1,0)µ×(5-15)µ
(2) Pleomorphismus der Zellen:
Im Anfangsstadium der Kultur liegen die Bakterienzellen vor als lange stäbchenförmige Gebilde mit strichähnlicher Erscheinungsform (hypha-like appearance), wachsen unter Verkettung und brechen und spalten später in kokoide oder kurzstäbchenartige Form auf.
(3) Beweglichkeit: keine
(4) Sporen: keine
(5) Gramfärbung: positiv
(6) Säurefestigkeit: schwach positiv
(7) Metachromatisches Granulat: positiv

(b) Wachstumszustand in verschiedenen Kulturmedien (bei 30°C)

(1) Nährstoff Agar Plattenkultur:
Rundscheiben (1 bis 3 mm Durchmesser), irregulär, glatt, mit Relief, opak, leicht glänzend, leicht rot.
(2) Nährstoff Agar Flächenkultur:
Mittleres Wachstum, filamentähnlich, oberflächenglatt, flachtrapezoider Querschnitt mit leichtem Glanz, leicht rot.
(3) Flüssige Bouillonkultur:
Kräftiges Wachstum unter Bildung von Membranen (Häutchen), transparente Lösung, bildet leicht einen Niederschlag mit Wachstum.
(4) Gelatinierte Bouillon-Impfkultur:
Gutes Wachstum an der Oberfläche, trichterförmiges Wachstum entlang des Impfstabes bei nahezu keinem Wachstum am unteren Stabteil, keine Verflüssigung der Gelatine.
(5) Lackmusmilch: keine Veränderung

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat: positiv
(2) Entnitrierung: negativ
(3) MR-Test: negativ
(4) VP-Test: negativ
(5) Indolbildung: negativ
(6) Hydrogensulfid-Bildung: negativ
(7) Stärkehydrolyse: negativ
(8) Verwendung von Zitronensäure:
Kosers Kulturmedium: positiv
Christiansens Kulturmedium: positiv
(9) Verwendung anorganischer Stickstoffquellen:
Ammoniumsalze: positiv
Nitrate: positiv
(10) Pigmentbildung: negativ
(11) Urease: positiv
(12) Oxidase: negativ
(13) Katalase: positiv
(14) Hydrolyse von Zellulose: negativ
(15) Wachstumsbereich: pH-Wert 6 bis 10; Temperatur 10 bis 40°C
(16) Sauerstoffverhältnis: aerobisch
(17) O-F-Test: O
(18) Wärmebeständigkeit (in 10%iger Magermilch, bei 72°C für 15 Minuten): keine
(19) Säure- und Gas-Bildung aus Zucker

Um die Zuordnungsposition der Bakterienstämme aufgrund der oben angegebenen bakteriologischen Eigenschaften entsprechend Bergy′s "Manual of Determinative Bacteriology, 7th ed. (1957) und 8th ed. (1974) zu bestimmen, fallen die Stämme N-771 und N-774 unter die aerobischen, Gram-positiven, nichtsäurefesten und katalysepositiven stäbchenförmigen Kategorien, die keine Endo- Sporen und keine Geißeln bilden. Aufgrund der Tatsache, daß die Bakterien als lange Stäbchenform im Anfangsstadium des Wachstums auftreten, keine faserförmige Art zeigen, jedoch ein verzweigendes Wachstum ohne Verkettung aufweisen und daß das Bakterium in kokoide oder kurze stabförmige Gebilde aufbricht und aufspaltet ist es klar, daß hier die Kategorie der Coryneform- Bakterien vorliegt. Darüberhinaus ergibt ein Vergleich mit den Coryneform-Bakterien, die in Bergy′s Manual beschrieben sind, daß für die Bakterien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Zugehörigkeit auszuschließen ist für:
(1) die Gattung Cellulomonas, weil sie keine Zellulose abbauenden Eigenschaften haben, (2) die Gattung Arthrobacter, weil die Gram-Färbung nicht variabel ist, (3) die Gattung Microbacterium, weil sie keine Hitzebeständigkeit in 10%-iger Magermilch bei 72°C für 15 Minuten haben, und (4) die Gattung Kurthia, weil sie keine Geißeln haben. Hieraus folgt somit, daß die bei der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Bakterienstämme zur Gattung Corynebacterium gehören.

Der Stamm N-775 fällt unter die aerobische, Gram-positive, schwach säurefeste und Katalyse-positive stäbchenförmige Kategorie und bildet keine Endosporen und keine Geißeln. Aufgrund der Tatsache, daß die Bakterienstämme in Form langer Stäbchen im Anfangsstadium des Wachstums vorliegen, strichähnliche Er scheinungsform zeigen und unter Verzweigung wachsen, um danach zu kokoiden oder kurzstäbchenförmigen Gebilden zu brechen und zu spalten, ist dieser Stamm als zur Gattung Nocardia gehörig anzusehen.

Zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung genügt es, einen der oben angegebenen Mikroorganismen zu verwenden, zu kul tivieren für 2 bis 3 Tage in der oben angegebenen Weise, die Bakteriumzellen von der Kulturlösung durch Zentrifugieren abzu trennen, in Wasser oder in physiologischer Salzlösung zu sus pendieren und Acrylnitril oder Methacrylnitril der Einwirkung der Zellen zu unterwerfen.

D. h., daß die Reaktion üblicherweise in einer wäßrigen Suspension durchgeführt werden soll, die etwa 1 bis 10 Gewichts.-% (berechnet als Trockensubstanz) der Bakteriumzellen und 0,5 bis 10 Gew.-% Acrylnitril oder Methacrylnitril enthält, und zwar bei einer Temperatur im Bereich etwa vom Gefrierpunkt des Mediums bis 30°C, vorzugsweise etwa vom Gefrierpunkt bis 15°C, bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 10, vorzugsweise etwa 7 bis 9, für etwa 0,5 bis 10 Stunden. Zusätzlich zu dieser Reaktion ist es vorteilhaft, stets Acrylnitril oder Methacrylnitril in kon zentrierter Form als solche in das System einzuführen, wobei die Konzentration von Acrylnitril oder Methacrylnitril im System auf ein Maß von nicht mehr als 2 Gew.-% zu begrenzen ist, weil sie eine starke Toxizität besitzen und die enzymatische Reaktion verzögern würden. Im allgemeinen sind geringfügig höhere Konzentrationen von Acrylnitril und Methacrylnitril im Standverfahren eher möglich als im kontinuierlich durchgeführten Verfahren, das nachfolgend beschrieben wird, weil es möglich ist, das Reaktionssystem zu rühren, so daß ein homogenes System erhalten werden kann.

Während der Reaktion soll der pH-Wert vorzugsweise so gesteuert werden, daß er im Bereich von 7 bis 9 verbleibt, indem im Be darfsfalle laufend Ätzalkali, Ammoniak oder ähnliches hinzu gefügt wird oder indem von vornherein eine Pufferlösung in das Reaktionssystem eingeleitet wird. PH-Werte außerhalb des oben genannten Bereiches würden zu einer weiteren Hydrolyse des erzeugten und abgetrennten Acrylamids oder Methacrylamids unter Bildung von Nebenprodukten führen oder es würde zu einer Verminderung der Stabilität der Zellenzyme kommen. Unter Berücksichtigung obiger Bedingungen können Acrylamid oder Methacrylamid mit fast hundertprozentiger Ausbeute hergestellt und abgetrennt werden.

Besonders vorteilhaft ist es die Gesamtkonzentration des herzustellenden Acrylamids oder Methacrylamids und die Dauerhaftigkeit der Enzym-Aktivität der Zellen dadurch merklich zu verbessern, daß man die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich vom Gefrierpunkt des Reaktionsmediums bis 15°C durchführt.

Diese Mikroorganismenstämme können als intakte Zellen verwendet werden, jedoch ist es vom Standpunkt der wiederholten Verwendbarkeit, der kontinuierlichen Durchführung und Reinigung vorteilhaft, immobilisierte Zellen, insbesondere durch Einbettung in ein Polyacrylamid und verwandte polymere Gele immobilisierte Zellen zu verwenden.

Die Immobilisierung der Zellen kann erreicht werden, indem die oben genannten Mikroorganismenstämme in einem geeigneten wäßrigen Medium suspendiert werden (z. B. Wasser, physiologische Salzlösung, Pufferlösung), das ein Acrylamid- und ein Vernetzungsmittel enthält, indem ein geeigneter Polymerisationsinitiator und ein Polymerisations beschleuniger zu der Suspension hinzugefügt und die Polymerisation und Gelierung bei einer Temperatur von 0 bis 30°C, vorzugsweise 0 bis 15°C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 10, vorzugsweise etwa 6 bis 8 durchgeführt wird. Der Gehalt der Mikroorganismen in der Polymerisationsreaktionslösung hängt von der Art und der Form der verwendeten Mikroorganismen ab, jedoch sind 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1 bis 20 Gew.-% gerechnet als trockene Substanz, üblich.

Das Acrylamidmonomere, das für die Immobilisierung der Zellen bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, schließt beispielsweise Acrylamid, Methacrylamid und - falls erforderlich - äthylenisch ungesättigte Monomere, die damit copolymerisierbar sind und die deshalb in Kombination verwendet werden können, ein. Die Konzentration des Monomeren in der Reaktion soll wenigstens so hoch sein, daß im Ergebnis der Polymerisation ein Gel gebildet wird; gewöhnlich werden 2 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die Reaktions lösung, verwendet.

Als Vernetzungsmittel kommen N,N′-Methylen-bis- Acrylamid, 1,3-Di-(acrylamidmethyl)-2-imidazolidon und ähnliche in Frage. Als Polymerisationsinitiator und als Polymerisationsbe schleuniger werden solche gewählt, die die Aktivität der Mikroorganismen möglichst wenig beeinträchtigen. Gewöhnlich werden Kaliumpersulfat oder Ammoniumpersulfat als Polymerisations initiator und Dimethylaminpropionitril, Triäthanolamin u. ä. als Polymerisationsbeschleuniger verwendet, jeweils in Mengen von etwa 0,01 bis 10 Gew.-%.

Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Reaktion entweder diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden; die Verwendung der immobilisierten Zellen in kontinuierlicher Weise im Kolonnenprozeß, der nachfolgend beschrieben wird, ermöglicht es jedoch, eine wäßrige hochkonzentrierte Lösung von Acrylamid oder Methacrylamid in verhältnismäßig einfacher Weise und unter Bedingungen, unter denen die Aktivität der Zellenzyme für eine lange Zeit aufrechterhalten bleibt, zu erhalten.

Der kontinuierliche Kolonnenprozeß gemäß der vorliegenden Erfindung wird demzufolge unter Verwendung einer oder mehrerer, miteinander in Reihe geschalteter Kolonnen durchgeführt, die mit nach oben beschriebener Methode festgelegten Zellen in einer Dichte von 0,3 bis 0,5 g immobilisierter Zellen pro cm³ gefüllt sind, welche zu einer geeigneten Größe zer teilt sind (etwa 0,5 bis 5 mm, vorzugsweise etwa 1 bis 3 mm), wobei dann eine wäßrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch den Kolonneneinlaß eingeleitet wird und zur gleichen Zeit kontinuierlich Acrylnitril oder Methacrynitril an einem Zwischenstück, das örtlich vor der vollständig abgeschlossenen Reaktion sich befindet, kontinuierlich in einer Menge eingeleitet wird, die in der Reaktionslösung löslich ist. Genauer gesagt heißt das, daß bei Verwendung einer Kolonne ein sog. Kolonnenteil vorteilhaft ist, der üblicherweise einige Sektionen aufweist und eine oder mehrere Zuführungsleitungen zwischen dem Kolonneneinlaß und dem Kolonnenauslaß aufweist, wobei je Sektion eine Zuführungsleitung vorgesehen ist. Eine wäßrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril wird kontinuierlich durch den Kolonneneinlaß eingeleitet und zur gleichen Zeit wird Acrylnitril oder Methacrylnitril kontinuierlich durch alle diese Zuführungsleitungen eingeführt. Eine vorteilhafte Zuführungsmenge beträgt etwa 0,1 bis 1,5 g AN oder MAN pro Gramm Bakteriumzellen und pro Stunde, wobei 0,3 bis 0,8 g AN oder MAN pro Gramm Bakteriumzellen und pro Stunde besonders vorzuziehen sind. Die Menge an AN oder MAN, die durch jede der Zuführungsleitungen eingeleitet wird, ist derartig, daß AN beziehungsweise MAN sich in der Reaktionsmischung auflösen. Es ist vorteilhaft, die Konzentration von AN oder MAN im Reaktionssystem auf ein Niveau zu begrenzen, das nicht höher als 2 Gew.-% beträgt, weil - wie oben erläutert - bei höheren Konzentrationen der toxische Effekt von AN und MAN sich auszuwirken beginnt und die enzymatische Reaktion verzögert. Besondere Zuführungsmengen je Zuführungsleitung sind nicht erforderlich wegen des Unterschiedes in der Verbrauchsmenge von AN oder MAN während des Ablaufs der Reaktion, d. h. die Zuführungs mengen variieren in Abhängigkeit davon, ob das AN oder das MAN bei dem jeweiligen Niveau löslich ist.

Werden zwei oder mehrere Kolonnen verwendet, so sind sie miteinander in Reihe geschaltet; die wäßrige Lösung von AN oder MAN wird durch den Kolonneneinlaß der ersten Kolonne eingeleitet, während AN oder MAN durch die nachfolgend und successive längs der Kolonne angeordneten Zuführungsleitungen in der gleichen Weise eingeleitet werden, wie es oben beschrieben ist. Es kann somit eine hochkonzentrierte Lösung von Acrylamid oder Methacrylamid als Eluat der zweiten oder der letzten Kolonne erhalten werden.

Die in den Beispielen angegebenen Teile und Prozente sind jeweils auf das Gewicht bezogen. Die Reaktionsprodukte wie Acrylamid und Methacrylamid, und die nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien sowie Nebenprodukte, wie Methacrylsäure und Acrylsäure, wurden gaschromatographisch bestimmt.

Beispiel 1

12,5 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 80%), der durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums (pH-Wert 7,2) bereitet wurde, das 1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt enthielt, 6 Teile Acrylnitril und 81,5 Teile eines 0,05 molaren Phosphat puffers (pH-Wert 8,8) wurden miteinander vermischt und für eine Stunde bei 30°C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Diese Lösung enthielt 8% Acrylamid, enthielt jedoch kein unumgesetztes Acrylnitril und keine Nebenprodukte, wie beispielsweise Acrylsäure. Hieraus folgt, daß die Reaktion praktisch quantitativ abgelaufen ist.

Beispiel 2

12,5 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 80%), der in gleicher Weise bereitet wurde, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist, wurden mit 87,5 Teilen Wasser gemischt, und es wurde Acrylnitril kontinuierlich tropfenweise dieser Mischung in einer Menge von 4 Teilen pro Stunde hinzugefügt, wobei der pH-Wert auf 8,0 unter Verwendung von KOH gehalten wurde; unter Rühren erfolgte der Reaktion bei 30°C. Nach einer Reaktionszeit von 2,5 Stunden wurde die tropfenweise Zuführung von Acrylnitril gestoppt, wonach für weitere 30 Minuten gerührt wurde. Die entstandene Reaktionslösung hat noch weitere 30 Minuten reagiert und wurde dann zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen und eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung enthielt 12,0% Acrylamid, unumgesetztes Acrylnitril war nicht feststellbar. Die Reaktion war somit vollständig abgelaufen.

Beispiel 3

15 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 80%), der in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben erzeugt war, 8 Teile Methacrylnitril und 77 Teile eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH-Wert 8,8) wurden gemischt und für eine Stunde bei 30°C zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Diese Lösung enthielt 10,2% Methacrylamid. Obwohl eine Spur von Methacrylsäure festellbar war, war unumgesetztes Methacrylnitril überhaupt nicht feststellbar. Die Reaktion lief somit praktisch quantitativ ab.

Beispiel 4

12 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-774 (Wassergehalt: 75%), der in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet war, wurden mit 88 Teilen Wasser gemischt, und es wurde Methacrylnitril kontinuierlich tropfenweise in einer Menge von 3 Teilen pro Stunde hinzugefügt, während der pH-Wert der Lösung unter Verwendung von Kaliumhydroxid auf 8,5 gehalten wurde; unter Rühren reagierte die Mischung bei 30°C. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden wurde die tropfenweise Zuführung von Methacrylnitril unterbrochen, anschließend wurde für weitere 30 Minuten gerührt, um das Methacrylnitril in dem System vollständig reagieren zu lassen. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. In dieser Lösung wurden 13,0% Methacrylamid bestimmt.

Beispiel 5

25 Teile gewaschener Zellen (Wassergehalt: 78%) des Stammes N-775, erzeugt durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums (pH-Wert 7,2), das 1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 0,1% Acetonitril, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O enthält, wurden mit 5 Teilen AN und 70 Teilen eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH-Wert 8,8) gemischt und während einer Stunde bei 30°C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung enthielt 6,7% Acrylamid, unumgesetztes AN und Nebenprodukte wie Acrylsäure konnten über haupt nicht festgestellt werden. Hieraus folgt, daß die Reaktion praktisch vollständig bis zum Abschluß abgelaufen ist.

Beispiel 6

8 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 75%), erzeugt durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums )pH-Wert 7,2), das 1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt enthielt, wurden mit 92 Teilen Wasser gemischt, und es wurde AN mit Unterbrechungen tropfenweise in einer Menge von 2 Teilen pro Stunde hinzugefügt, wobei der pH-Wert der Lösung durch entsprechende Beigabe einer wäßrigen, 0,5 N KOH-Lösung unter Rühren auf 8,0 eingestellt wurde; die Reaktion wurde bei verschiedenen Reaktionstemperaturen im Bereich von etwa 0°C bis 30°C wie in Tabelle 1 angegeben durchgeführt. Der Ablauf der Reaktion erfolgte, bis unumgesetztes AN feststellbar war, in diesem Stadium wurde die Reaktion gestoppt und die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine klare Lösung zu erhalten. Der Gehalt an Acrylamid wurde jeweils für jede Lösung bestimmt, um die Konzentration des an gesammelten Acrylamids bei den jeweiligen Reaktionstemperaturen vergleichen zu können. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Aus diesen Ergebnissen folgt, daß die enzymatische Aktivität der Zellen stabil wurde und daß die Konzentration des erzeugten und angesammelten Acrylamids be trächtlich erhöht war, wenn die Reaktion bei Temperaturen von nicht höher als 15° durchgeführt wurde.

Tabelle 1

Beispiel 7

13 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-775 (Wassergehalt: 78%), erhalten durch Kultivierung in der im Beispiel 6 beschriebenen Weise, wurden mit 86,5 Teilen Wasser gemischt, AN wurde mit Unterbrechungen tropfenweise in einer Menge von 2 Teilen pro Stunde zugefügt, wobei der pH-Wert der Lösung durch entsprechende Zufügung einer wäßrigen, 0,5 n KOH-Lösung unter Rühren auf 8,0 eingestellt wurde; die Reaktion wurde bei verschiedenen Reaktionstemperaturen im Bereich von 0°C bis etwa 30°C - wie in Tabelle 2 gezeigt - durchgeführt. Die Reaktion wurde danach in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise fortgesetzt, bis unreagiertes AN feststellbar war. Die Konzentration an Acrylamid wurde jeweils für jede Lösung bestimmt, um die in der Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zu erhalten. Aus diesem Beispiel geht ebenfalls hervor, daß die Konzentration des hergestellten und angesammelten Acrylamid bei diesen Untersuchungen ebenfalls beträchtlich erhöht war, wenn die Reaktion bei Temperaturen von nicht höher als 15°C durchgeführt wurde.

Tabelle 2

Beispiel 8

4 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771, erhalten in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise, 0,45 Teile Acrylamid, 0,05 Teile von N,N′-Methylen-bis-acrylamid und 4 Teile physiologischer Salzlösung wurden miteinander vermischt, um eine homogene Suspension zu erzeugen. Dieser Suspension wurden 0,5 Teile einer wäßrigen, 5%-igen Dimethylaminopropionitril-Lösung und 1 Teil einer wäßrigen, 2,5%-igen Kaliumpersulfat-Lösung zugefügt, danach wurde das System bei 10°C für 30 Minuten für den Ablauf der Polymerisation gehalten. Das auf diese Weise erhaltene massive, Bakteriumzellen enthaltende Gel wurde in kleine Teile zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gewaschen, um 10 Teile immobilisierter Zellen zu erhalten. Zu 20 Teilen der immobilisierten Zellen wurden 72 Teile eines 0,05 molaren Phosphatpuffers (pH-Wert 8,0, also eine wäßrige Lösung), und es wurde AN tropfenweise in einer Menge von 2 Teilen pro Stunde hinzugefügt, wobei unter Rühren die Reaktion während 4 Stunden abgelaufen ist. Eine klare Lösung wurde durch Abtrennen und Entfernen der Bakteriumzellen vom Reaktionsprodukt erhalten, Nebenprodukte wie Acrylsäure und unumgesetztes AN waren praktisch nicht feststellbar. Die Reaktion ist somit praktisch quantitativ abgelaufen.

Die abgetrennten immobilisierten Zellen wurden erneut für den Ablauf der gleichen Reaktion benutzt. Andererseits wurden ent sprechende Untersuchungen bei 30°C durchgeführt, um einen Vergleich zu ermöglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Beispiel 9

40 g immobilisierter Zellen des Stammes N-771, erhalten in der in Beispiel 9 angegebenen Weise, wurden in eine ummantelte Kolonne (Innendurchmesser: 3 cm, Länge: 25 cm) eingefüllt, eine wäßrige, 4%-ige AN-Lösung bzw. eine wäßrige 2,6%-ige MAN-Lösung wurde kontinuierlich durch den oberen Einlaß der Kolonne mit einer Menge von 100 ml/h bei 10°C und bei 25°C (für den Vergleich) eingeleitet; die jeweiligen Reaktionszeiten sind in Tabelle 5 aufgeführt. Die Mengen an erzeugten Acrylamid oder Methacrylamid bei den jeweiligen Reaktionsstufen wurden bestimmt, wobei die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle 4

Beispiel 10

Die nachfolgende Tabelle 5 zeigt die Aktivität einerseits be weglicher, unbehandelter Bakteriumzellen und andererseits immobilisierter Bakteriumzellen im Hinblick auf unterschiedliche Mikroorganismen, die fähig sind, Acrylamid zu produzieren.

Herstellung der immobilisierten Zellen

4 Teile intakter Zellen (Wassergehalt: 75%), 0,45 Teile Acrylamid, 0,05 Teile N,N′-Methylen-bis-acrylamid und 4 Teile physiologischer Salzlösung wurden miteinander gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Dieser Suspension wurden 0,5 Teile einer wäßrigen, 5%-igen Dimethylaminopropionitril- Lösung und 1 Teil einer wäßrigen, 2,5%-igen Kaliumpersulfat- Lösung hinzugefügt, wonach das System bei 10 bis 15°C und 30 Minuten für den Ablauf der Polymerisation gehalten wurde. Nachfolgend wurden die so erhaltenen, zellenthaltenden Gele zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gewaschen, um 10 Teile immobilisierter Zellen zu erhalten.

Messung der Fähigkeit, Acrylamid zu produzieren

0,8 Teile intakter Zellen oder 2 Teile immobilisierter Zellen wurden mit 0,05 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH: 8,0) vermischt um 100 Teile zu bilden. Danach wurde 1 Teil jeder der so erhaltenen Lösung mit je einem Teil einer 0,05 molaren Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) vermischt, die 2% AN enthielt. Nach der Reaktion bei 10°C während 30 Minuten unter Rühren wurde das in der Reaktionslösung entstandene Acrylamid bestimmt, um die Fähigkeit, Acrylamid zu erzeugen, für jede Art der unbehandelten und der immobilisierten Zellen zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

Beispiel 11

40 Teile gewaschener Zellen des Stammes N-771 (Wassergehalt: 75%), erhalten durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums (pH-Wert 7,2), das 1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt enthielt, wurden mit 4,5 Teilen Acrylamid, 0,5 Teilen N,N ′-Methylen-bis-acrylamid und 40 Teilen physiologischer Salzlösung gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Dieser Suspension wurden 5 Teile einer wäßrigen, 5%-igen Dimethylaminopropionitril-Lösung und 10 Teile einer wäßrigen, 2,5%-igen Kaliumpersulfat-Lösung hinzu gefügt, wonach die Mischung bei 10°C 30 Minuten für den Ablauf der Polymerisation gehalten wurde. Das auf diese Weise erhaltene massive, zellenthaltende Gel wurde in kleine Teilchen zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gut gewaschen, um 100 Teile immobilisierter Zellen zu erhalten.

In 5 ummantelte Kolonnen (Innendurchmesser 3 cm, Länge 25 cm), je mit 40 g der immobilisierten Zellen gefüllt, die jeweils miteinander in Serie verbunden waren, wurde eine wäßrige, 4,5%-ige AN-Lösung unter Verwendung einer 0,05 m Phosphat-Pufferlösung mit pH-Wert 8,0 durch den oberen Einlaß der Kolonne Nr. 1 bei 10°C mit einer Ablaufmenge von 50 ml/h eingeleitet. Danach wurden 100 Teile des Eluates mit 4,5 Teilen AN vermischt und durch den Einlaß der Kolonne Nr. 2 einfließen gelassen, und zwar mit einer Ablaufmenge von 52,3 ml/h. Das Eluat wurde dann nachfolgend durch die Kolonne Nr. 3 fließen gelassen, wobei die Abflußmenge auf 54,5 ml/h eingestellt wurde, dann durch die Kolonne Nr. 4 mit 56,8 ml/h und durch die Kolonne Nr. 5 mit 59 ml/h während einer Zeit von 48 Stunden geleitet. Auf diese Weise wurde kontinuierlich ein Eluat bei einer Reaktionsmenge von 100% erhalten. Die Acrylamid-Konzentration in diesem Eluat betrug 25,5%.

Beispiel 12

7 ummantelte Kolonnen (Innendurchmesser 3 cm, Länge 25 cm) wurden mit 40 g immobilisierter Zellen, erhalten auf die in Beispiel 11 angegebenen Weise, gefüllt; die 7 Kolonnen waren miteinander in Serie verbunden; eine wäßrige, 2,5%-ige MAN- Lösung, gelöst in 0,05 m Phosphatpuffer (pH: 8,0), wurde durch die Kolonne Nr. 1 von oben nach unten geleitet, und zwar mit einer Durchflußmenge von 100 ml/h. 100 Teile des Eluates, d. h. der aus der Kolonnen Nr. 1 ausfließenden Reaktionslösung, wurden mit 2,5 Teilen MAN vermischt und von oben nach unten durch die Kolonne Nr. 2 mit einer Durchflußmenge von 103 ml/h geleitet.

Das Eluat wurde danach der Reihe nach durch die Kolonne Nr. 3 mit auf 105 ml/h gesteuerter Durchflußmenge geleitet, danach durch Kolonne Nr. 4 mit 108 ml/h , dann durch Kolonne Nr. 5 mit 110 ml/h, dann durch Kolonne Nr. 6 mit 113 ml/h und schließlich durch Kolonne Nr. 7 mit 115 ml/h geleitet, und zwar für 48 Stunden. Die Reaktionsmenge im letztlich austretenden Eluat betrug 100%, und die Konzentration von Methacrylamid im Eluat betrug 19,3%.

Beispiel 13

45 Teile gewaschener Zellen des Stammes Nr.-775 (Wassergehalt: 78%), erhalten durch aerobische Kultivierung unter Verwendung eines Kulturmediums mit 1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt, 0,1% Acetonitril, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, wurden mit 4,5 Teilen Acrylamid 0,5 Teilen N,N′-Methylen-bis-acrylamid und 40 Teilen physiologischer Salzlösung gemischt, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Zu dieser Suspension wurden 5 Teile einer wäßrigen, 5%-igen Dimethylaminopropionitril-Lösung und 10 Teile einer wäßrigen, 2,5%-igen Kaliumpersulfatlösung zugefügt und die gesamte Mischung bei 10°C für 30 Minuten gehalten. Das auf diese Weise erhaltene massive, Bakteriumzellen enthaltende Gel wurde in kleine Partikel zerteilt und mit physiologischer Salzlösung gut gewaschen, um 100 Teile immobilisierter Bakteriumzellen zu erhalten.

Die immobilisierten Zellen wurden in eine Teilkolonne eingefüllt, die einige Teile enthielt, von denen jeder ein Volumen von 100 ml hatte und 40 g immobilisierter Zellen enthielt. Eine 2,5%-ige MAN-Lösung (unter Verwendung eines 0,05 m Phosphat puffers, pH-Wert 8,0) wurde kontinuierlich in einer Menge von 100 ml/h durch den oberen Einlaß der obersten Sektion der Kolonne eingeleitet, während die Temperatur innerhalb der Kolonne auf 15°C gehalten wurde; MAN wurde in einer Menge von 3 ml/h im oberen Teil einer jeden Sektion der Nummern 2 bis 7 zugefügt, und zwar für eine Zeit von 48 Stunden, um die Reaktion durchzuführen. In diesem Falle war kein MAN im Eluat feststellbar, das aus dem Boden der siebenten Sektion der Kolonne austrat. Hieraus folgt, daß eine 100%-ige Reaktion erfolgt war. Der Anteil an Methacrylamid im Eluat betrug 19,3%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Acrylamid oder Methacrylamid aus Acrylnitril oder Methacrylnitril in wäßrigem Medium unter Einwirkung eines Bakteriums, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur im Bereich vom Gefrierpunkt des Mediums bis 30°C und bei einem pH-Wert von 6 bis 10 die Hydrolyse von Acrylnitril oder Methacrylnitril in Gegenwart der Stämme Coryne bacterium N-771 oder N-774 oder Nocardia N-775 durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium einsetzt, das in einem polymeren Gel immobilisiert vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium einsetzt, das in Polyacrylamid immobilisiert vorliegt.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man kontinuierlich eine wäßrige Lösung von Acrylnitril oder Methacrylnitril durch eine oder mehrere, ggf. in Reihe hintereinandergeschaltete Kolonnen leitet, die mit den immobilisierten Bakteriumzellen gefüllt sind, und Acrylnitril oder Methacrylnitril durch einen oder mehrere Einlässe zwischen dem Kolonneneinlaß und dem Kolonnenauslaß einer Kolonne derart zuführt, daß es sich in der Reaktionsmischung auflösen kann.