DE4480132C2

DE4480132C2 - Verfahren und Rhodococcus rhodochrous-Stamm zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen

Info

Publication number: DE4480132C2
Application number: DE4480132A
Authority: DE
Inventors: Aleksandr Stepanovic Janenko; Olga Borisovna Astaurova; Sergej Petrovic Voronin; Tatjana Vasilievna Gerasimova; Nikolaj Borisovic Kirsanov; Vladimir Nikolaevic Paukov; Inga Nikolaevna Poljakova; Vladimir Georgievic Debabov
Original assignee: GNI SKIJ I GENETIKI I SELEKCII
Current assignee: GNI SKIJ I GENETIKI I SELEKCII
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-15
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2014-12-16
Also published as: GB2290295B; CA2155635C; RU2053300C1; FI953865A0; FI953865A; GB9516901D0; CA2155635A1; GB2290295A; DE4480132T1; AU1428195A; KR950018447A; FI111738B; WO1995017505A1; US5827699A; KR0131276B1; AU675379B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Biotechnolo gie und betrifft einen neuen Bakterienstamm mit einer hohen Nitrilhydratase-Aktivität, der in Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen eingesetzt wird.

Das Enzym Nitrilhydratase, das die Umwandlung von Nitrilen in Amide katalysiert, wurde bei vielen Arten von Bakterien festgestellt. Zur Erzeugung der Nitrilhydratase ist es bei der Züchtung von Bakterien notwendig, dem Nährmedium einen Induktor zuzugeben, z. B. Nitrile und Amide von organischen Säuren (US-A-4 555 487, EP-A-0 109 083, EP-A-0 204 555), Harnstoff oder dessen Derivate (EP-A-0 362 829). Bekannt sind ferner die Stämme Corynebacterium N774 (US-A-4 248 968) und Rhodococcus sp. S-6 (US-A-5 179 014), für die ein Induktor nicht erforderlich ist. Nachteile des Stammes N774 sind eine niedrige Nitrilhydratase-Aktivität (die spezifi sche Aktivität beträgt nur 50 bis 60 Einheiten/mg, wobei die Einheit hier und im folgenden in Mikrogramm Acrylamid pro Minute und Milligramm Zellen, bezogen auf die Trocken masse, angegeben ist), ein nur kleiner Bereich von Nitri len, die umgewandelt werden können (nur aliphatische Nitri le), sowie eine nur geringe Wärmebeständigkeit der Enzyme (Temperaturoptimum für N774 35°C). Ein Nachteil des Stam mes S-6 ist seine Fähigkeit, die gebildeten Amide zu den Säuren weiterzuhydrolysieren, was zu einer erheblichen Verringerung der Qualität der Amide führt. Darüber hinaus besitzt dieser Stamm S-6 eine geringe Wärmebeständigkeit der Nitrilhydratase (Temperatur nicht höher als 30°C) und eine niedrige Produktivität (Akkumulation von maximal 20% Acrylamid in der Lösung). Für die Kultivierung der beiden Stämme N774 und S-6 müssen ferner teure Komponenten in den Nährmedien eingesetzt werden (Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt).

Der nach dem technischen Wesen und dem erreichten Ergebnis der vorliegenden Erfindung am nächsten kommende Stamm ist der Stamm Rhodococcus rhodochrous J1 (EP-A-0 362 829), der eine Nitrilhydratase-Aktivität in Bezug auf aliphatische und aromatische Nitrile aufweist.

Ein Nachteil dieses Stammes besteht in der Notwendigkeit, im Nährmedium zur Kultivierung des Stammes Vitamine, Hefe extrakt und Pepton einzusetzen. Ein weiterer Nachteil be steht ferner darin, daß der Stamm J1 zur Erzeugung der Nitrilhydratase eines Induktors, nämlich Harnstoff, in hoher Konzentration (7,5-12 g/l) bedarf. Die spezifische Aktivität der Nitrilhydratase erreicht bei Züchtung dieses Stamms auf einem Nährmedium ohne Harnstoff nur 3,35 Einhei ten/mg. Die Gesamtaktivität beträgt 17,7 Einheiten/ml. Die Gesamtaktivität wird hier und im folgenden in Mikromol Acrylamid pro Minute und Milliliter Kulturflüssigkeit (µmol Acrylamid/min·ml) ausgedrückt. Bei einer Konzentration an Harnstoff von 7,5 g/l erreicht die spezifische Aktivität im Medium 497 Einheiten/mg, während die Gesamtaktivität 2480 Einheiten/ml beträgt. Dabei ist festzustellen, daß der Harnstoff eine doppelte Rolle spielt, nämlich als Stick stoffquelle und als Induktor für die Nitrilhydratase. Zum Wachstum dieses Stammes ist eine Harnstoffkonzentration von maximal 2 g/l ausreichend; hierbei erreicht die spezifische Nitrilhydratase-Aktivität des Stamms J1 36,5 Einheiten/mg, während die Gesamtaktivität 189 Einheiten/ml beträgt. Die hohen Harnstoffkonzentrationen sind nur für die Induktion notwendig. Deshalb verbleiben nach der Kultivierung des Stamms J1 erhebliche Mengen an Harnstoff im Medium.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Stamm von Rhodococcus rhodochrous anzugeben, der eine hohe Nitrilhydratase-Aktivität besitzt und auf einfachen synthe tischen Medien kultivierbar ist, die keine Vitamine und Aminosäuren sowie keine Verbindungen enthalten, die als Induktoren der Synthese der Nitrilhydratase dienen (wie z. B. Nitrile, Amide oder Harnstoff); ferner soll ein Ver fahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen unter Verwendung dieses Mikroorganismus angegeben werden.

Die Aufgabe wird gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Die abhängigen Ansprüche betreffen vorteilhafte Ausfüh rungsformen der Erfindungskonzeption.

Der erfindungsgemäße, Nitrilhydratase produzierende Stamm von Rhodococcus rhodochrous ist unter der Hinterlegungs bezeichnung VKM Ac-1515 D bei der Allrussischen Sammlung von Mikroorganismen, Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen, Puschkino, Moskau, Russische Födera tion, hinterlegt (russisch-sprachige Hinterlegungsbezeich nung BKM Ac-1515 D, als VKM Ac-1515 D transkribiert). Der erfindungsgemäße Stamm Rhodococcus rhodochrous VKM Ac-1515 D wird im folgenden kurz als M33 bezeichnet. Der erfindungsgemäße Stamm M33 besitzt die Fähigkeit, auch ohne Induktor zur Enzyminduktion eine Nitrilhydratase kon stitutiv zu bilden, welche die Hydrolyse aliphatischer Nitrile, z. B. von Acrylnitril, wie auch aromatischer Ni trile, z. B. von 3-Cyanopyridin, zu den entsprechenden Ami den, z. B. zu Acrylamid bzw. Nicotinsäureamid, zu katalysie ren. Der erfindungsgemäße Stamm produziert Nitrilhydratase in Abwesenheit von Harnstoff mit einer spezifischen Aktivi tät von 200 bis 457 bzw. 500 Einheiten/mg und einer Gesamt aktivität von 350 bis 360 Einheiten/ml (in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle) sowie in Anwesenheit von Harnstoff im Medium in einer Konzentration von 2 g/l mit einer spezi fischen Aktivität von 180 Einheiten/mg und einer Gesamt aktivität von 1368 Einheiten/ml.

Eine weitere Eigenschaft, durch die sich der erfindungsge mäße Stamm M33 von Stämmen gemäß dem Stand der Technik un terscheidet, ist das praktisch vollständige Fehlen einer Amidaseaktivität. Die Amidase stellt ein Enzym dar, das die Hydrolyse der aus Nitrilen gebildeten Amide zu den entspre chenden Carbonsäuren katalysiert, beispielsweise die Hydro lyse von Acrylamid zu Acrylsäure, was zu einer erheblichen Verschlechterung der Qualität der gebildeten Amide führt. Dieses Problem tritt im Gegensatz zum Stand der Technik bei dem erfindungsgemäßen Stamm nicht auf.

Der erfindungsgemäße Stamm M33 ist auf einfachen syntheti schen Medien kultivierbar, die eine Kohlenstoffquelle in Form von Pyruvat, Acetat oder Glucose in Konzentrationen von 0,1 bis 4 Masse-% und eine Stickstoffquelle in Form von Ammoniumsalzen, Nitraten oder Harnstoff in einer Konzentra tion von 0,4 bis 2 Masse-% enthalten. Ferner ist von Bedeu tung, daß zum Wachstum des Stammes M33 keine Vitamine, kei ne Aminosäuren und kein Hefe- oder Fleischextrakt erforder lich sind.

Der Stamm Rhodococcus rhodochrous M33 wurde aus dem Stamm Rhodococcus rhodochrous M8 (vgl. SU 1731814) durch orien tierte Selektion in zwei Schritten unter Verwendung von se lektiven Medien, die im ersten Schritt Chloracetamid und im zweiten Schritt Acetamid enthielten, erhalten.

Der erfindungsgemäße neue Stamm besitzt die wichtige Fähig keit, Nitrilhydratase in Abwesenheit von Induktoren im Me dium, wie etwa Nitrile, Amide oder Harnstoff, konstitutiv zu bilden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen unter Verwendung eines Nitrilhydratase produ zierenden Stamms von Rhodococcus rhodochrous ist entspre chend dadurch gekennzeichnet, daß der unter der Hinterle gungsbezeichnung VKM Ac-1515 D hinterlegte Stamm (kurz als M33 bezeichnet) verwendet wird.

Die Umsetzung wird vorteilhaft in einem wässerigen Medium durchgeführt, das einen pH-Wert im Bereich von 3 bis 10 aufweist. Die Temperatur bei der Umsetzung liegt im Bereich von 0 bis 50°C und vorzugsweise im Bereich von 4 bis 30°C.

Der erfindungsgemäße Stamm wird vor der Verwendung zur Hydrolyse von Nitrilen in einem Nährmedium kultiviert, vor teilhaft bei einer Temperatur von 25 bis 30°C, und dann vorzugsweise in Form einer Zellsuspension eingesetzt.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, trägerfixierte bzw. immobilisierte Zellen einzusetzen.

Die Umsetzung kann kontinuierlich, quasikontinuierlich oder diskontinuierlich vorgenommen werden. Sie wird vorteilhaft so geführt, daß die Konzentration des Nitrils höchstens 8 Masse-% und vorzugsweise höchstens 2 Masse-%, bezogen auf die Masse des Reaktionssystems, beträgt. Hierfür kann das Nitril dem Reaktionsmedium durch periodische oder konti nuierliche Zugabe vorzugsweise so zugegeben werden, daß die vorgegebene Maximalkonzentration an Nitril nicht über schritten wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders gün stig zur Hydrolyse von Nitrilen wie 2-Cyanopyridin, 3-Cyanopyridin, 4-Cyanopyridin, Acrylnitril und Acetonitril zu den entsprechenden Amiden.

Aus der nachstehenden Tabelle 1 ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Stamm zur konstitutiven Bildung von Nitrilhydratase befähigt ist.

Tabelle 1

*Die Stämme wurden in Erlenmeyerkolben (750 ml), die je weils 150 ml Nährmedium mit Pyruvat (5 g/l) und NH₄Cl (2 g/l) enthielten, unter intensiver Belüftung 24 h bei 30°C kultiviert. Nach 24 h wurden die erhaltenen Kul turen in zwei Teile aufgeteilt; zu dem einen Teil wurde Harnstoff als Induktor (10 g/l) zugegeben, wonach noch 48 h weiter kultiviert wurde. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren abgetrennt und zur Bestimmung der Aktivität an Nitrilhydratase und Amidase verwendet. Die Nitrilhydratase-Aktivität der erhaltenen Kulturen wurde jeweils unter Verwendung von Acrylnitril als Substrat unter standardisierten Bedingungen bestimmt. Die Amidaseaktivität wurde anhand der Bildung von Ammonium aus Acrylamid als Substrat bestimmt. Die Bestimmung der Ammoniumkonzentration wurde nach Neßler vorgenommen.

**Mikromol Acrylamid pro Minute und Milligramm Zellen, bezogen auf die Trockensubstanz (µmol Acryl amid/min·mg).

***Mikromol Ammonium pro Minute und Milligramm Zellen, bezogen auf die Trockensubstanz (µmol Ammonium/min·mg).

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, erreicht die spezifische Aktivität der Nitrilhydratase 457 Einheiten/mg bei Kulti vierung des Stamms M33 auf dem Nährmedium in Abwesenheit von Harnstoff. Unter diesen Bedingungen beträgt die Nitril hydratase-Aktivität des Ausgangsstamms M8 nur 8 Einhei ten/mg. Es ist bekannt, daß die spezifische Aktivität der Nitrilhydratase des Stamms J1 bei Kultivierung auf Nährme dien, die keinen Harnstoff enthalten, nur 3,4 Einheiten/mg erreicht (vgl. EP-A-0 362 829; US-A-5 089 411).

Der erfindungsgemäße Stamm M33 ist folglich im Unterschied zum Ausgangsstamm M8 und zu dem Stamm J1 befähigt, die Nitrilhydratase sogar in Abwesenheit eines Induktors im Medium konstitutiv zu bilden, und weist zugleich eine Amidaseaktivität auf, die um etwa den Faktor 20 verringert ist.

Der unter der Hinterlegungsbezeichnung VKM Ac-1515 hinter legte Stamm M33 wird durch die nachstehend angegebenen Kul turbedingungen sowie morphologischen und physiologisch-bio chemischen Eigenschaften charakterisiert.

Morphologische Eigenschaften

Die Zellen des Stamms M33 sind nicht beweglich und werden nach Gram gefärbt (Gram-positiv). Sie bilden keine Sporen und sind nicht säurebeständig. Im Alter von 18 bis 20 h bilden die Zellen lange, schwach verzweigte Fäden von bis zu 20 µm Länge, die nach 48 bis 72 h in stäbchenförmige und coccusförmige Elemente zerfallen.

Kultivierungseigenschaften

Auf dichten Nährmiedien (MPA, Hottinger) bildet der Stamm M33 nach 48 h Wachstum runde, glatte Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm, die rosa-strohgelb bis rosa-orange gefärbt sind. Bei Kultivierung auf Fleischpeptonbrühe wer den ein Film und ein Sediment gebildet. Mit Lackmusmilch tritt keine Farbänderung auf.

Physiologische Eigenschaften.

Der Stamm ist obligat aerob und reduziert Nitrat. Der Test mit Methylrot sowie die Voges-Proskauer-Reaktion sind nega tiv. Der Stamm erzeugt Hydrogensulfid bzw. Schwefelwasser stoff, ist oxidasenegativ und katalase- sowie phosphatase positiv. Er hydrolysiert Stärke und Cellulose nicht, jedoch werden Tween® 60 und 80 hydrolysiert. Der Stamm verwertet kein Adenin. Die Zellen halten eine Erwärmung in Magermilch auf 72°C während 15 min nicht aus. Der Stamm wächst bei pH-Werten von 6 bis 9 und Temperaturen von 5 bis 45°C. Aus folgenden Zuckern und Alkoholen werden Säuren gebildet: Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Sorbit, Mannit und Glycerin. Bei keinem der Zucker wurde eine Gasbildung fest gestellt. Der Stamm verwendet als einzige Stickstoffquelle Verbindungen von Ammonium, Nitrate und Harnstoff. Als ein zige Kohlenstoffquelle werden Maltose, Mannit, Sorbit, Glucose, Glycerin, Lactat, Pyruvat, Benzoat, p- und m- Hydroxybenzoat und Tyrosin verwertet. Der Stamm verwertet Rhamnose, Galactose, Inosit und α-Ketoglutarat nicht.

Die biochemische Analyse zeigte, daß in der Zellwand des Stamms M33 meso-Diaminopimelinsäure, Arabinose und Galactose enthalten sind, was für coryneforme Bakterien charakteristisch ist, die eine Zellwand vom Typ IV aufwei sen. Die Zellen enthalten ferner Lipid A (LCH), das für Rhodococci charakteristisch ist.

Der Stamm M33 besitzt also Eigenschaften, die für coryne forme Bakterien typisch sind. Aufgrund der oben angeführten Eigenschaften sowie in Übereinstimmung mit Bergy′s Manual of Systematic Bacteriology sowie dem Klassifizierungshand buch von Nesterenko wurde der Stamm M33 der Gattung Rhodo coccus und der Art R. rhodochrous zugeordnet.

Zur Erzeugung von Zellen des Stamms M33 mit hoher Nitril hydratase-Aktivität wird die Impfkultur in ein Nährmedium eingebracht und vorzugsweise bei 25 bis 30°C 24 bis 72 h inkubiert.

Zur Umwandlung von Nitrilen in Amide werden vorzugsweise Zellsuspensionen eingesetzt, die durch Zentrifugieren ent sprechender Kulturen und anschließendes Resuspendieren der Zellen in 10 mM Phosphatpuffer erhalten wurden.

Die in dieser Weise erhaltenen Zellen besitzen eine hohe Nitrilhydratase-Aktivität und sind befähigt, die Hydrolyse von aliphatischen und aromatischen Nitrilen zu den entspre chenden Amiden in einem breiten Temperaturbereich von 0 bis 50°C und vorzugsweise 4 bis 30°C und bei pH-Werten von 3 bis 10 zu katalysieren.

Der Standardtest zur Messung der Nitrilhydratase-Aktivität wird wie folgt durchgeführt. 1 ml einer 2%igen Nitrillösung in 10 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,6 wird mit 1 ml der Zellsuspension vermischt, die 0,04 mg Zellen, be zogen auf die Trockensubstanz, enthält. Die Reaktion wird bei 20°C 5 min durchgeführt. Anschließend wird die Reak tion durch Zugabe von 20 µl konzentrierter HCl gestoppt. Die Konzentration der gebildeten Amide wird gaschromato graphisch bestimmt.

Die Aktivität der Nitrilhydratase wird in folgenden Ein heiten ausgedrückt:
1 Einheit wird definiert als diejenige Enzymmenge, die zur Bildung des Amids aus dem Nitril unter den oben beschriebe nen Bedingungen in einer Rate von 1 mmol/min erforderlich ist.

Die spezifische Aktivität wird in Mikromol Amid pro Minute und Milligramm Zellen, bezogen auf die Trockensubstanz (µmol Amid/min·mg), oder in Einheiten/mg ausgedrückt.

Die Gesamtaktivität wird in Mikromol Amid pro Minute und Milliliter Kultur (µmol Amid/min·ml) oder in Einheiten/ml ausgedrückt.

Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zellen des Stamms M33 werden in Abwesenheit von Harnstoff auf einem Nährmedium gezüchtet, das als Stickstoffquelle Natriumnitrat enthält. In Erlenmeyerkolben (750 ml), die 150 ml Nährmedium mit folgender Zusammensetzung (g/l)

K₂HPO₄
0,5
KH₂PO₄	0,6
MgSO₄	0,5
FeSO₄	0,005
CoCl₂	0,01
Glucose	5
NaNO₃	1

enthalten, werden 5 ml einer Kultur des Stamms M33 gegeben, die zuvor auf einem Medium mit gleicher Zusammensetzung 2 d bei 30°C gezüchtet worden war. Die Kolben werden auf einer Schütteleinrichtung bei 30°C 48 h inkubiert. Die Nitril hydratase-Aktivität der Zellen wird unter Verwendung von Acrylnitril als Substrat bestimmt. Die spezifische Aktivi tät der Nitrilhydratase des Stamms M33 erreicht 200 Einhei ten/mg, die Gesamtaktivität 360 Einheiten/ml.

Die spezifische Aktivität des Stamms M33, der auf einem Me dium ohne Gehalt an Harnstoff kultiviert worden war, ist somit etwa 60fach höher als die spezifische Aktivität des Stamms J1. Hinzu kommt, daß zur Kultivierung leicht im Han del erhältliche und preiswerte Komponenten, nämlich Glucose und Natriumnitrat, verwendet werden.

Beispiel 2

Die Kultivierung wird in Erlenmeyerkolben (750 ml) durchge führt, die 150 ml Nährmedium wie in Beispiel 1 enthalten, mit dem Unterschied, daß die Glucosekonzentration 20 g/l beträgt und anstelle von Natriumnitrat Harnstoff in einer Menge von 2 g/l eingesetzt wird. In die Kolben werden 5 ml einer Kultur des Stamms M33 gegeben, die zuvor auf einem Medium mit gleicher Zusammensetzung 2 d bei 30°C gezüchtet wurde. Die Kolben werden auf einer Schütteleinrichtung bei 30°C 48 h inkubiert. Dann werden die Zellernte sowie die Nitrilhydratase-Aktivität unter Verwendung von Acrylnitril als Substrat bestimmt. Die Zellernte beträgt 7,6 g/l. Die spezifische Aktivität beträgt 180 Einheiten/mg, die Gesamt aktivität 1386 Einheiten/ml.

Beispiel 3

Der Stamm M33 wird wie in Beispiel 1 kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 10 mM Phosphat puffer gewaschen und in 10 mM Phosphatpuffer resuspendiert.

Unter Verwendung verschiedener Nitrile als Substrate wird die Nitrilhydrolyse unter standardisierten Bedingungen durchgeführt. Die Reaktion wird jeweils durch Zugabe von konzentrierter HCl gestoppt. Die Konzentration der gebilde ten Amide wird gaschromatographisch bestimmt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 folgt, daß der Stamm M33 die Hydrolyse sowohl aliphatischer als auch aromatischer Nitrile zu katalysieren befähigt ist.

Beispiel 4

Der Stamm M33 wird wie in Beispiel 1 kultiviert. In Kolben von 100 ml Fassungsvermögen, die 40 ml destilliertes Wasser (pH 7,6) enthalten, werden eine Biomasse aus Zellen M33 bis zur einer Konzentration von 0,5 mg/ml sowie 3-Cyanopyridin bis zu einer Konzentration von 8 Masse-% eingebracht. Die Kolben werden dann bei 30°C unter Rühren inkubiert. Nach 60 min wird eine 10%ige Lösung von Nicotinsäureamid erhal ten. Im Reaktionsgemisch fehlen 3-Cyanopyridin und Nicotin säure.

Beispiel 5

In einen Stahlreaktor mit einem Fassungsvermögen von 1,5 l, der mit einem mechanischen Rührwerk versehen ist und im Temperaturbereich von 12 bis 20°C thermostatisierbar ist, werden 400 ml destilliertes Wasser (pH 7,6) eingebracht.

Darin werden 272 mg Biomasse (bezogen auf die Trockensub stanz) des Stamms M33 resuspendiert, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde. Danach wird zu dem Reaktionsge misch reines Acrylnitril in einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, daß seine Konzentration in der Lösung 2 Masse-% nicht übersteigt. Die qualitative und quantitative Zusam mensetzung der Lösung wird durch Gas-Flüssig-Chromatogra phie bestimmt. Insgesamt werden in den Reaktor 173 g Acryl nitril eingebracht. Im Laufe von 8 h wird eine Lösung von Acrylamid einer Konzentration von 46% (Masse/Volumen) er halten. Die Ausbeute an Acrylamid beträgt nahezu 99%. Acrylnitril und Acrylsäure als Nebenprodukte wurden nicht festgestellt.

Der anmeldungsgemäße Stamm M33 besitzt folglich eine hohe Nitrilhydratase-Aktivität und ist befähigt, sowohl alipha tische als auch aromatische Nitrile zu den entsprechenden Amiden zu hydrolysieren. Im Unterschied zu den bekannten Mikroorganismenstämmen ist der Mutantenstamm M33 imstande, bei Kultivierung in Medien, die keinen Induktor der Syn these von Nitrilhydratase enthalten, Nitrilhydratase kon stitutiv zu bilden. Dies erlaubt, zur Züchtung der Zellen Medien ohne Zusatz von Vitaminen mit Glucose als Kohlen stoffquelle und Natrium- oder Kaliumnitrat als Stickstoff quelle zu verwenden, die keine speziellen Verbindungen wie etwa Induktoren der Bildung der Nitrilhydratase (Amide, Nitrile oder Harnstoff in hohen Konzentrationen) enthalten. Ein weiterer Vorteil des Stamms M33 ist in dem praktisch völligen Fehlen der Amidaseaktivität zu sehen, wodurch die Bildung der Säuren aus den Amiden während der katalytischen Hydrolyse der Nitrile blockiert ist.

Der Nitrilhydratase produzierende Stamm Rhodococcus rhodochrous M33 empfiehlt sich daher in ganz besonderer Weise für den Einsatz bei Verfahren zur Herstellung von aliphatischen und aromatischen Amiden aus Nitrilen.

Claims

1. Nitrilhydratase produzierender Stamm von Rhodococcus rhodochrous, der unter der Hinterlegungsbezeichnung VKM Ac-1515 D bei der Allrussischen Sammlung von Mikroorga nismen, Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen, Puschkino, Moskau, Russische Födera tion, hinterlegt ist.

2. Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen unter Verwendung eines Nitrilhydratase produzierenden Stamms der Mikroorganismenart Rhodococcus rhodochrous, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Rhodococcus rhodochrous verwendet wird, der unter der Hinterle gungsbezeichnung VKM Ac-1515 D bei der Allrussischen Sammlung von Mikroorganismen, Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen, Puschkino, Moskau, Russische Föderation, hinterlegt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in einem wässerigen Medium durchgeführt wird, das einen pH-Wert im Bereich von 3 bis 10 auf weist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und/oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Umsetzung bei einer Temperatur im Be reich von 0 bis 50°C und vorzugsweise im Bereich von 4 bis 30°C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Rhodococcus rhodochrous-Stamm VKM Ac-1515 D zuvor bei bis 45°C und vorzugsweise 25 bis 30°C in einem Nährmedium kulti viert wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Rhodococcus rhodochrous-Stamm VKM Ac-1515 D in Form einer Zellsus pension verwendet wird.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Nitrils höchstens 8 Masse-% und vorzugsweise höchstens 2 Masse-%, bezogen auf die Masse des Reaktionssystems, beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitril dem Reaktionsmedium durch periodische oder kontinuierliche Zugabe so zugegeben wird, daß die vor gegebene Maximalkonzentration nicht überschritten wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch ge kennzeichnet, daß als Nitril 2-Cyanopyridin, 3-Cyano pyridin, 4-Cyanopyridin, Acrylnitril oder Acetonitril eingesetzt werden.