DE2853500C2

DE2853500C2 -

Info

Publication number: DE2853500C2
Application number: DE19782853500
Authority: DE
Inventors: Adrienne Raie Mcgregor; James Andrew London Gb Carney
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-12-14
Filing date: 1978-12-12
Publication date: 1988-04-14
Also published as: AU4239678A; JPS6342231B2; FR2412074B1; FR2412074A1; JPS54116293A; CH638053A5; DE2853500A1; AU519485B2; NL7812106A; CA1104911A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B₁₂ in einer Flüssigkeit gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Für medizinische Zwecke ist es von großer Bedeutung, daß der Vitamin B₁₂-Gehalt im menschlichen Serum genau bestimmt werden kann. Beispielsweise kann der Vitamin B₁₂- Gehalt von normalem Serum von etwa 150 bis 1000 pg/ml variieren. Bei Werten unter 150 pg/ml ist eine Anämie aufgrund von Vitamin B₁₂-Mangel zu diagnostizieren. In der Vergangenheit sind mikrobiologische Bestimmungsmethoden angewandt worden, wobei der Organismus Euglena gracilis eingesetzt wurde. Vor kurzem sind auch Radioassays entwickelt worden, bei denen als bindendes Protein der Intrinsic Factor (im folgenden mit IF abgekürzt) verwendet wurde (siehe beispielsweise Clin. Chim. Acta, 32 (1971), 339. Bei diesen Radioassays ist es von Bedeutung, daß man zunächst das zu analysierende Serum einer Behandlung unterzieht, um das Vitamin B₁₂ von seinem Serumbindeprotein Transcobalamin (im folgenden TC genannt) abzutrennen. Dies wird dadurch bewirkt, daß man das Serum in einem Puffer von niedrigem pH- Wert verdünnt und anschließend etwa 15 min lang kocht. Das TC wird dadurch denaturiert, während das Vitamin B₁₂ nicht beeinträchtigt wird. Danach wird der Radioassay mit dem gekochten Serum durchgeführt.

Bei der Verwendung des IF als Bindeprotein in derartigen Radioassays haben sich jedoch verschiedene Nachteile bemerkbar gemacht, so daß vorgeschlagen wurde (British Journal of Haematology, 25 (1973), 359), Kükenserum als besseres Bindeprotein für derartige Zwecke einzusetzen. In der genannten Literaturstelle wird gezeigt, daß bei verhältnismäßig hohen pH-Werten (9 bis 12) die Bindung des IF mit Vitamin B₁₂ sehr scharf abfällt, während die Bindung von Kükenserum mit Vitamin B₁₂ konstant bleibt. Deshalb wird empfohlen, den Radioassay mit Kükenserum bei einem pH-Wert von etwa 9,2 durchzuführen. Außerdem wird gezeigt, daß die Bindung von Vitamin B₁₂ an Kükenserum durch die Anwesenheit von denaturiertem menschlichen Serum, wie es bei dem wesentlichen Vorbereitungsschritt für den Radioassay, nämlich dem Kochen des Serums zur Denaturierung des endogenen Vitamin B₁₂-Bindeproteins erzeugt wird, nicht beeinträchtigt wird.

Während also das bekannte Radioassayverfahren zur Bestimmung von Vitamin B₁₂ unter Verwendung des IF dadurch verbessert werden kann, daß man Kükenserum als Bindeprotein einsetzt, besitzt es selbst bei Verwendung von Kükenserum trotzdem eine Reihe von Nachteilen, die sich hauptsächlich aus der Notwendigkeit ergeben, einen Verdünnungs- und Kochvorgang durchzuführen. Auf diese Weise sind die für die Vitamin B₁₂-Konzentration erhaltenen Werte normalerweise höher (wenn die freie Fraktion gezählt wird) als diejenigen Werte, die bei demselben Serum mit Hilfe der mikrobiologischen Methode erhalten werden. Dies kann auf unspezifische Adsorption von Vitamin B₁₂ an das durch das Kochen denaturierte Serumprotein zurückzuführen sein. Der Kochvorgang selbst ist außerdem unerwünscht, da er zeitraubend und schwierig auf kontinuierliche Weise durchzuführen ist. Außerdem ist zur Verhütung von Ausfällungen während des Kochens eine Verdünnung des Serums im Verhältnis 1 : 5 erforderlich. Außerdem ist die anzuwendende Konzentration an radioaktiver Markierungssubstanz verhältnismäßig hoch (häufig höher als einige der Standardlösungen mit niedriger Konzentration), was zusammen mit dem Erfordernis, einen Verdünnungsschritt vorzusehen, zu einer geringen Empfindlichkeit und dem Fehlen von Genauigkeit am unteren Ende des Bereichs für die zu ermittelnden Konzentrationen führt. Dies ist von besonderer Bedeutung, da gerade am unteren Ende des Konzentrationsbereichs, beispielsweise um und unterhalb 150 pg/ml, die größte Genauigkeit erforderlich ist.

Es stellte sich daher die Aufgabe, ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B₁₂ in Flüssigkeiten, insbesondere in menschlichem Serum, zu entwickeln, durch das bestimmte Nachteile der oben beschriebenen Radioassayverfahren vermindert oder ganz überwunden werden. Es wurde gefunden, daß in dem Fall, in dem die Bestimmung unter Verwendung von Kükenserum als Bindeprotein bei einem pH-Wert von etwa 12,8 bis 13,2 durchgeführt wird, ein vorheriges Kochen sowie eine Verdünnung der Probe aus menschlichem Serum nicht erforderlich sind. Der Fortfall des Verdünnungs- und Kochschrittes vereinfacht das Verfahren nicht nur beträchtlich und macht es für eine kontinuierliche Durchführung nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses geeignet, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Bestimmung.

Gegenstand der Erfindung ist somit, daß man bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 in Stufe a) einen Puffer zur Herstellung eines pH-Wertes von 12,8 bis 13,2 verwendet.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren dazu verwendet, Vitamin B₁₂ in menschlichem Serum zu bestimmen, muß der Puffer eine Menge an Cyanidionen enthalten, die ausreicht, sämtliches im menschlichen Serum vorhandenes Vitamin B₁₂ in die Cyanoform zu überführen. Normalerweise wird Kaliumcyanid verwendet, wenngleich auch andere Cyanidionen enthaltende Substanzen, wie beispielsweise Natriumcyanid, verwendet werden können. Die Cyanoform des Vitamin B₁₂ läßt sich von dem Bindeprotein im menschlichen Serum bei den hohen pH-Werten, wie sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, abtrennen. In dem Maße, wie die Konzentration an Kaliumcyanid in dem für die Bestimmung verwendeten Puffer von Null aus ansteigt, steigt auch die Dissoziation des Vitamin B₁₂ von dem Bindeprotein im menschlichen Serum. Bei einer Konzentration von Kaliumcyanid von etwa 20 µg/ml ist die Dissoziation größer als 92%. Oberhalb dieser Konzentration erhöht sich die Dissoziation nur geringfügig, jedoch wird dann die Bindung des Vitamin B₁₂ an das Kükenserum ernstlich beeinträchtigt. Daher ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, in dem für die Bestimmung verwendeten Puffer beispielsweise Kaliumcyanid mit einer Konzentration von etwa 20 µg/ml zu verwenden.

Bei pH-Werten von etwa 12,9 und darüber wird das Vitamin B₁₂ von den im menschlichen Serum vorhandenen Bindeproteinen (TC) vollständig abgetrennt. Bei derartigen pH-Werten wurde jedoch gefunden, daß Vitamin B₁₂ trotzdem noch an Kükenserum gebunden bleibt. Durch die Verwendung von Kükenserum als Bindeprotein bei pH-Werten von etwa 12,9 und darüber gibt es daher keine Störung durch das TC des menschlichen Serums, und das Kükenserum bleibt an das Vitamin B₁₂ gebunden und führt zu einer hohen Genauigkeit bei der Bestimmung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 12,9 bis 13,1. Es kann aber auch bei niedrigeren oder höheren pH-Werten gearbeitet werden, und zwar im Bereich von 12,8 oder 13,2. Bei einem pH-Wert von etwa 12,7 und darunter dissoziiert das Vitamin B₁₂ dagegen nicht vollständig von den das Vitamin B₁₂ bindenden Proteinen im menschlichen Serum. Bei pH-Werten oberhalb von etwa 13,1 nimmt das Ausmaß der Bindung zwischen dem Kükenserum und dem Vitamin B₁₂ ab.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die im Kükenserum vorhandenen, das Vitamin B₁₂ bindende, Proteine ausgenutzt. Es kann Vollkükenserum verwendet werden, oder gewünschtenfalls können die das Vitamin B₁₂ bindenden Proteine des Kükenserums (die vermutlich Kükenserum-Transcobalamine sind), von dem Serum abgetrennt und als solche verwendet werden. Wenn Vollkükenserum verwendet wird, stört natives Vitamin B₁₂, das in ihm enthalten sein kann, nicht, weil, wie dem Fachmann bekannt ist, das Kükenserum in starker Verdünnung (von der Größenordnung von 10 000) eingesetzt wird.

Bei dem bekannten Verfahren sind zur Bestimmung von Vitamin B₁₂ auf competitiver Bindung beruhende Radioassays angewandt worden. Bei einem Verfahren zur competitiven Bindung gemäß der Erfindung wird eine radioaktive Markierung, wie beispielsweise ⁵⁷Co oder ¹²⁵I, bevorzugt, wenngleich andere Markierungen, wie Fluoreszenz- oder Enzymmarkierungen, ebenfalls verwendet werden können. Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf die Verwendung einer radioaktiven Markierung (⁵⁷Co) erläutert.

Bei einem Verfahren mit competitiver Bindung gemäß der Erfindung ist es erforderlich, in Stufe b) die freie Fraktion von Vitamin B₁₂ (markiert und nicht markiert) von der gebundenen Fraktion von Vitamin B₁₂ (dem markierten und nicht markierten Vitamin B₁₂, das an die Kükenserumproteine gebunden worden ist) zu trennen. Um diese Abtrennung zu erleichtern, werden vorzugsweise zwei alternative Techniken eingesetzt. Bei der ersten wird das Gemisch mit einem festen Material in Berührung gebracht, zweckmäßig einem teilchenförmigen Material, das sich selektiv entweder an die freie Vitamin B₁₂-Fraktion oder die gebundene Vitamin B₁₂-Fraktion, jedoch nicht an beide adsorbieren oder binden kann. Es wurde gefunden, daß zu diesem Zweck mit Albumin beschichtete Aktivkohleteilchen geeignet sind, da sie selektiv die freie Fraktion adsorbieren. Selbstverständlich können auch andere Teilchen verwendet werden, wie dem Fachmann ersichtlich. Das feste Material wird anschließend aus dem Gemisch abgetrennt und kann selbst auf seinen Gehalt an markiertem Vitamin B₁₂ analysiert werden, oder die Analyse kann bei dem restlichen Gemisch durchgeführt werden.

Die zweite, alternative Technik besteht in der Verwendung eines teilchenförmigen Materials in Schritt a), wobei auf diesem Material die Bindeproteine aus dem Kükenserum immobilisiert worden sind. Auf diese Weise wird die gebundene Vitamin B₁₂-Fraktion selbst immobilisiert, nachdem sie an die Proteine aus dem Kükenserum gebunden worden ist. Die festen Teilchen können aus dem Gemisch abgetrennt werden, wobei sie die gebundene, jedoch nicht die freie Vitamin B₁₂-Fraktion mit sich führen. Vorzugsweise enthalten die Teilchen ein magnetisch anziehbares Material, so daß sie leicht aus dem Gemisch abgetrennt werden können. Einzelheiten über die Anwendung derartiger Teilchen sind der DE-OS 27 10 438 zu entnehmen.

Beispiele für diese beiden Techniken werden im folgenden in allgemeinen Ausführungen in bezug auf Bestimmungen in menschlichem Serum angegeben.

Bei der ersten Technik wird das zu untersuchende menschliche Serum mit einer Lösung aus markiertem Vitamin B₁₂, beispielsweise ⁵⁷Co-markierten Vitamin B₁₂, und einem Kükenserumextrakt, der Vitamin B₁₂ bindende Proteine enthält, in einem Puffer von einem pH-Wert von etwa 13 vermischt. Das Gemisch wird bebrütet und anschließend mit mit Albumin beschichteter Aktivkohle versetzt. Die beschichtete Aktivkohle adsorbiert das freie Vitamin B₁₂, jedoch nicht die zwischen dem Vitamin B₁₂ und den bindenden Proteinen des Kükenserums gebildeten Komplexe. Danach wird die Aktivkohle abgetrennt und entweder die verbleibende Flüssigkeit oder - in stärkerem Maße bevorzugt - die abgetrennte Aktivkohle auf ⁵⁷Co analysiert. Aus Ergebnissen, die bei der Analyse von Lösungen mit bekannter Vitamin B₁₂-Konzentration erhalten worden sind, kann die Menge an Vitamin B₁₂ in dem zu untersuchenden menschlichen Serum an Hand des ⁵⁷Co-Gehaltes, beispielsweise unter Verwendung von Standardkurven, ermittelt werden.

Bei der zweiten Technik werden die das Vitamin B₁₂ bindenden Proteine aus dem Kükenserum auf festem, teilchenförmigen Material immobilisiert. Beispielsweise können sie an Celluloseteilchen oder mit Cellulose beschichteten Teilchen, die mit Bromcyan aktiviert sind, gekuppelt werden. Verfahren zur Immobilisierung von Reaktionsteilnehmern auf kleinen Teilchen sind bekannt. Es wird bevorzugt, Teilchen zu verwenden, die ein magnetisch anziehbares Material, wie beispielsweise Fe₃O₄, enthalten, da dadurch die anschließende Abtrennung erleichtert wird. Die Teilchen werden mit dem zu untersuchenden menschlichen Serum und mit markiertem Vitamin B₁₂, wie beispielsweise⁵⁷Co-Vitamin B₁₂, vermischt, und das Gemisch wird geschüttelt und bebrütet. Anschließend werden die Teilchen abgetrennt und entweder die restliche Flüssigkeit oder die abgetrennten Teilchen auf ⁵⁷Co analysiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist natürlich besonders für die Untersuchung von menschlichem Serum geeignet, jedoch kann es auch zur Bestimmung des Vitamin B₁₂- Gehaltes anderer Flüssigkeiten angewandt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip durchgeführt werden, dessen allgemeine Merkmale bekannt sind.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen und Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen bedeutet

Fig. 1 eine Standardkurve für die Bestimmung gemäß Beispiel 1,

Fig. 2 eine Standardkurve für die Bestimmung gemäß Beispiel 2 und

Fig. 3 eine grafische Darstellung der Korrelation zwischen den in Beispiel 2 erhaltenen sowie mikrobiologisch erhaltenen Ergebnissen.

Beispiel 1 (Bestimmung in fester Phase)

Die Vitamin B₁₂ bindenden Anteile von Kükenserum wurden mit Teilchen aus Cellulose/Fe₃O₄ von einer mittleren Größe von 2 bis 3 µ gekuppelt, indem man zunächst die Teilchen nach dem bekannten Verfahren der Aktivierung der Cellulosekomponente mit Bromcyan aktivierte und anschließend das Kükenserum mit den aktivierten Teilchen 72 h bei etwa 4°C bebrütete.

Der bei den Bestimmungen und zur Verdünnung der zu untersuchenden Komponenten vor der Bestimmung verwendete Puffer bestand aus 50 mM Kaliumchlorid, 0,002% Kaliumcyanid und 0,1% Natriumazid, mit 2-n Natronlauge auf pH 13,0 eingestellt.

Das mit ⁵⁷Co aktivierte Vitamin B₁₂ war im Handel erhältlich und besaß eine spezifische Aktivität von 100 bis 300 µCi/µg.

Die Bestimmung verlief unter Zugabe der Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge wie folgt:

Standard oder Serum 50 µl ⁵⁷Co-Vitamin B₁₂ (4,4 pg)150 µl Festphasenkükenserum100 µl

Das Festphasenkükenserum wird mit einer Verdünnung von 1 g/640 ml verwendet, bestimmt mit Hilfe einer dosisabhängigen Standardkurve als optimale Verdünnung für den Versuch. Die incubierten Gemisch wurden 3 h bei Raumtemperatur durch Überkopfdrehung kontinuierlich gemischt. Die Abtrennung erfolgte durch Zentrifugieren, wonach die Teilchen mit Pufferlösung gewaschen wurden und die feste Phase (gebundene Fraktion) 5 min in einem Gammazähler ausgezählt wurde.

Unter Verwendung von Standardlösungen von Vitamin B₁₂ wurde die in Fig. 1 dargestellte Standardkurve erhalten. Unter Verwendung dieser Kurve wurden zehn Sera untersucht und in bezug auf die mikrobiologische Bestimmung mit E. gracilis korreliert, wobei eine Regressionslinie von y=0,9x+31 und ein Korrelationskoeffizient von 0,93 erhalten wurden.

Beispiel 2 (Flüssigkeitsphasenbestimmung)

Ein Extrakt aus dem Vitamin B₁₂-bindenden Protein wurde nach folgender Methode aus Kükenserum erhalten:
Ausfällung mit Ammoniumsulfat, wobei die gewünschte Proteinfraktion bei einem Sättigungsgrad zwischen 35 und 80% ausfiel. Diese Fraktion wurde in einer 10 mM-Lösung von Ammoniumhydrogencarbonat wieder gelöst, der Säulenchromatografie mit DE-52-Cellulose unterworfen und mit einem Gradienten von Ammoniumhydrogencarbonat eluiert. Aliquote Teile dieses Extraktes wurden bei allen folgenden Flüssigphasenbestimmungen verwendet.

Der Puffer, der für die Bestimmung sowie für die Verdünnung der für die Bestimmung verwendeten Komponenten vor der Bestimmung selbst verwendet wurde, bestand aus 50 mM Kaliumchlorid, 0,0002% Kaliumcyanid und 0,1% Natriumazid, mit 2n Natronlauge auf pH 13,0 eingestellt.

Die Bestimmung wurde mit den in der angegebenen Reihenfolge zugesetzten Bestandteilen wie folgt durchgeführt:

Standard oder Serum 50 µl ⁵⁷Co-Vitamin B₁₂ (4,4 pg)100 µl Puffer1250 µl Kükenserumextrakt 100 µl

Der Kükenserumextrakt wurde mit einer Verdünnung von 1/12800 verwendet, bestimmt mit Hilfe einer dosisabhängigen Standardkurve als optimale Verdünnung für den Ansatz. Nach Vermischen der Komponenten wurden die bebrüteten Gemische 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Trennung von gebundenen und freien Fraktionen wurde durch Zugabe von 0,3 ml einer wie folgt hergestellten Aktivkohlesuspension bewirkt:

Aktivkohle Norit-OL5 g/100 ml destilliertes Wasser Rinderserumalbumin (BSA)0,5 g/100 ml destilliertes Wasser

Die beiden Bestandteile wurden miteinander vermischt, und die mit Rinderserumalbumin beschichtete Aktivkohle wurde zentrifugiert, um überschüssiges Rinderserumalbumin und Feinteile abzutrennen, worauf die Aktivkohle in dem ursprünglichen Volumen (200 ml) erneut suspendiert wurde. Danach wurde das Natriumazid bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugesetzt.

Nach der Zugabe der Aktivkohle wurde der Inhalt der Versuchsgläser vermischt und 10 min bei ewa 3000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und das Aktivkohlepellet (freie Fraktion) 5 min in einem Gammazähler gezählt.

Unter Verwendung von Standardlösungen von Vitamin B₁₂ wurde die in Fig. 2 dargestellte Standardkurve erhalten. Unter Verwendung dieser Kurve wurden zwanzig Proben aus Menschenserum analysiert und die Ergebnisse mit auf mikrobiologische Weise erhaltenen Ergebnissen verglichen. Man erhielt einen Korrelationskoeffizienten von 0,97 mit einer Regressionslinie von y = 1,15x-6,92 (Fig. 3).

Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung eines in einer Verpackungseinheit konfektionierten Satzes aus Einzelreagenzien, bestehend aus einer Reihe von Lösungen von Vitamin B₁₂ von bekannter Konzentration, Vitamin B₁₂-bindenden Proteinen aus Kükenserum, einem oder mehreren Standardsera und ⁵⁷Cobalt-Vitamin-B₁₂ zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die einzelnen Komponenten können sämtlich in gefriergetrockneter Form vorliegen. Der Reagenziensatz kann weiterhin eine Suspension mit beschichteter Aktivkohle enthalten.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B₁₂ in einer Flüssigkeit durch kompetitive Bindung, wobei man

a) ein Gemisch aus der Flüssigkeitsprobe, Vitamin B₁₂- bindenden Proteinen aus Kükenserum, markiertem Vitamin B₁₂ und einem Puffer zur Herstellung eines bestimmten pH-Wertes bildet, wobei man die Menge an bindenden Proteinen aus Kükenserum so wählt, daß sie nicht ausreicht, um sämtliches vorhandenes Vitamin B₁₂ und markiertes Vitamin B₁₂ zu binden,
b) die freie ungebundene Fraktion von Vitamin B₁₂ und markiertem Vitamin B₁₂ in dem Gemisch von der gebundenen Fraktion von Vitamin B₁₂ und markiertem Vitamin B₁₂ in dem Gemisch trennt, und
c) die freie oder die gebundene Fraktion aus Vitamin B₁₂ und markiertem Vitamin B₁₂ auf ihren Gehalt an markiertem Vitamin B₁₂ analysiert und auf diese Weise mit Hilfe von Standardergebnissen die Menge an in der Probe vorhandenem Vitamin B₁₂ bestimmt

dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) einen Puffer zur Herstellung eines pH-Wertes von 12,8 bis 13,2 verwendet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) das Gemisch mit einem festen Material in Berührung bringt, das sich selektiv an entweder die freie oder die gebundene Fraktion adsorbiert oder bindet, und nach dieser Adsorption oder Bindung das Material aus dem Gemisch abtrennt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Material ein Material aus Teilchen von mit Albumin beschichteter Aktivkohle verwendet, die die freie Fraktion selektiv adsorbiert.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) Vitamin B₁₂-bindende Proteine aus Kükenserum verwendet, die auf einem festen, teilchenförmigen Material immobilisiert sind, und in Stufe b) das teilchenförmige Material, das die Proteine und die gebundene Fraktion trägt, aus dem Gemisch abtrennt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als teilchenförmiges Material, auf dem die Bindeproteine immobilisiert sind, ein Material verwendet, das aus einem magnetisch anziehbaren Material besteht, und daß man in Stufe b) das teilchenförmige Material aus dem Gemisch mit Hilfe eines Magneten abtrennt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) Vollkükenserum zur Bereitstellung der Vitamin B₁₂-bindenden Proteine in dem Gemisch verwendet.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als markiertes Vitamin B₁₂ ein radioaktiv markiertes Vitamin B₁₂ verwendet.

8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu untersuchende Flüssigkeit menschliches Serum und als Puffer einen solchen verwendet, der Cyanidionen in einer Menge enthält, die ausreicht, um sämtliches Vitamin B₁₂ in dem menschlichen Serum in die Cyanoform zu überführen.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer einen solchen verwendet, der einen pH-Wert in dem Gemisch von 12,9 bis 13,1 herstellt.

10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung nach dem automatisierten kontinuierlichen Durchflußprinzip durchführt.

11. Verwendung eines in einer Verpackungseinheit konfektionierten Satzes aus Einzelreagenzien zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bestehend aus folgenden Bestandteilen:
einer Reihe von Lösungen von Vitamin B₁₂ von bekannter Konzentration, Vitamin B₁₂-bindenden Proteinen aus Kükenserum, einem oder mehreren Standardsera, 57 Cobalt-Vitamin-B₁₂ und gegebenenfalls einer Suspension aus beschichteter Aktivkohle.