CH638053A5

CH638053A5 - Process for the determination of vitamin B12 in a liquid

Info

Publication number: CH638053A5
Application number: CH1274878A
Authority: CH
Inventors: Adrienne Raie Mcgregor; James Andrew Carney
Original assignee: Technicon Instr
Priority date: 1977-12-14
Filing date: 1978-12-14
Publication date: 1983-08-31
Also published as: AU4239678A; JPS6342231B2; FR2412074B1; FR2412074A1; JPS54116293A; DE2853500A1; AU519485B2; NL7812106A; CA1104911A; DE2853500C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts von Vitamin B12 in Flüssigkeiten. Das Verfahren eignet sich insbesondere, wenngleich nicht ausschliesslich, zur Bestimmung dieses Gehaltes in biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise menschlichem Serum. The invention relates to a method for determining the content of vitamin B12 in liquids. The method is particularly, if not exclusively, suitable for determining this content in biological liquids, such as human serum.

Für medizinische Zwecke ist es von grosser Bedeutung, dass der Vitamin Bi2-Gehalt im menschlichen Serum genau bestimmt werden kann. Beispielsweise kann der Vitamin Bi2-Gehalt von normalem Serum von etwa 150 bis 1000 pg/ml variieren. Bei Werten unter 150 pg/ml ist eine Anämie aufgrund von Vitamin Bu-Mangel zu diagnostizieren. In der Vergangenheit sind microbiologische Bestimmungsmethoden angewandt worden, wobei der Organismus Euglena gracilis eingesetzt wurde. Vor kurzem sind auch Radioassays entwickelt worden, bei denen als bindendes Protein der Intrinsic Factor (im folgenden mit IF abgekürzt) verwendet wurde (siehe beispielsweise Clin. Chim. Acta, 32 (1971), 339. Bei diesen Radioassays ist es von Bedeutung, dass man zunächst das zu analysierende Serum einer Behandlung unterzieht, um das Vitamin B12 von seinem Serumbindeprotein Transcobalamin (im folgenden TC genannt) abzutrennen. Dies wird dadurch bewirkt, dass man das Serum in einem Puffer von niedrigem pH-Wert verdünnt und anschliessend etwa 15 min lang kocht. Das TC wird dadurch denaturiert, während das Vitamin B12 nicht beeinträchtigt wird. Danach wird der Radioassay mit dem gekochten Serum durchgeführt. For medical purposes, it is very important that the vitamin Bi2 content in human serum can be precisely determined. For example, the vitamin Bi2 content of normal serum can vary from about 150 to 1000 pg / ml. Anemia due to vitamin Bu deficiency can be diagnosed at values below 150 pg / ml. Microbiological methods of determination have been used in the past using the organism Euglena gracilis. Radioassays have also recently been developed in which the intrinsic factor (hereinafter abbreviated to IF) was used as the binding protein (see, for example, Clin. Chim. Acta, 32 (1971), 339). With these radioassays it is important that the serum to be analyzed is first treated to separate vitamin B12 from its serum binding protein, transcobalamin (hereinafter called TC), by diluting the serum in a low pH buffer and then for about 15 minutes The TC is denatured while the vitamin B12 is not affected, and the radioassay is then carried out on the cooked serum.

Bei der Verwendung des IF als Bindeprotein in derartigen Radioassays haben sich jedoch verschiedene Nachteile bemerkbar gemacht, so dass vorgeschlagen wurde (British Journal of Haematology, 25 (1973), 359), Kükenserum als besseres Bindeprotein für derartige Zwecke einzusetzen. Insbesondere in der genannten Literaturstelle wird gezeigt, dass bei verhältnismässig hohen pH-Werten (9 bis 12) die Bindung des IF mit Vitamin B12 sehr scharf abfällt, während die Bindung von Kükenserum mit Vitamin B12 konstant bleibt. Deshalb wird empfohlen, den Radioassay mit Kükenserum bei einem pH-Wert von etwa 9,2 durchzuführen. Ausserdem wird gezeigt, dass die Bindung von Vitamin B12 an Kükenserum durch die Anwesenheit von denaturiertem menschlichen Serum, wie es bei dem wesentlichen Vorbereitungsschritt für den Radioassay, nämlich dem Kochen des Serums zur Denaturierung des endogenen Vitamin Bi2-Bin-deproteins erzeugt wird, nicht beeinträchtigt wird. However, various disadvantages have become apparent when using the IF as a binding protein in such radio assays, so that it has been proposed (British Journal of Haematology, 25 (1973), 359) to use chick serum as a better binding protein for such purposes. In particular, in the cited literature reference it is shown that at relatively high pH values (9 to 12) the binding of the IF with vitamin B12 drops very sharply, while the binding of chick serum with vitamin B12 remains constant. It is therefore recommended that the radioassay with chick serum be carried out at a pH of around 9.2. It is also shown that the binding of vitamin B12 to chick serum is not impaired by the presence of denatured human serum, as is produced in the essential preparation step for the radioassay, namely the boiling of the serum for denaturing the endogenous vitamin Bi2-bin deprotein becomes.

Während das bekannte Radioassayverfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 unter Verwendung des IF dadurch verbessert werden kann, dass man Kükenserum als Bindeprotein einsetzt, besitzt es selbst bei Verwendung von Kükenserum trotzdem eine Reihe von Nachteilen, die sich hauptsächlich aus While the known radio assay method for the determination of vitamin B12 using the IF can be improved by using chick serum as a binding protein, it still has a number of disadvantages, even when using chick serum, which mainly result from

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der Notwendigkeit ergeben, einen Verdiinnungs- und Kochvorgang durchzuführen. Auf diese Weise sind die für die Vitamin Bi2-Konzentration erhaltenen Werte normalerweise höher (wenn die freie Fraktion gezählt wird) als diejenigen Werte, die bei demselben Serum mit Hilfe der Mikrobiologischen Methode erhalten werden. Dies kann auf unspezifische Adsorption von Vitamin B12 an das durch das Kochen denaturierte Serumprotein zurückzuführen sein. Der Kochvorgang selbst ist ausserdem unerwünscht, da er zeitraubend und schwierig auf kontinuierliche Weise durchzuführen ist. Ausserdem ist zur Verhütung von Ausfällungen während des Kochens eine Verdünnung des Serums im Verhältnis 1:5 erforderlich. Ausserdem ist die anzuwendende Konzentration an radioaktiver Markierungssubstanz verhältnismässig hoch (häufig höher als einige der Standardlösungen mit niedriger Konzentration), was zusammen mit dem Erfordernis, einen Verdünnungsschritt vorzusehen, zu einer geringen Empfindlichkeit und dem Fehlen von Genauigkeit am unteren Ende des Bereichs für die zu ermittelnden Konzentrationen führt. Dies ist von besonderer Bedeutung, da gerade am unteren Ende des Konzentrationsbereichs, beispielsweise um und unterhalb 150 pg/ml, die grösste Genauigkeit erforderlich ist. the need to do a thinning and cooking process. In this way, the values obtained for the vitamin Bi2 concentration are normally higher (when counting the free fraction) than those obtained with the same serum using the microbiological method. This may be due to non-specific adsorption of vitamin B12 onto the serum protein that has been denatured by cooking. The cooking process itself is also undesirable because it is time consuming and difficult to perform in a continuous manner. It is also necessary to dilute the serum in a ratio of 1: 5 to prevent precipitation during cooking. In addition, the concentration of radioactive label to be used is relatively high (often higher than some of the standard low concentration solutions) which, together with the need to provide a dilution step, results in low sensitivity and lack of accuracy at the lower end of the range for those to be determined Concentrations. This is of particular importance since the greatest accuracy is required at the lower end of the concentration range, for example around and below 150 pg / ml.

Es wurde nun ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 in Flüssigkeiten, insbesondere in menschlichem Serum, gefunden, durch das bestimmte Nachteile der oben beschriebenen Radioassayverfahren vermindert oder ganz überwunden werden. Insbesondere wurde gefunden, dass in dem Fall, in dem die Bestimmung unter Verwendung von Kükenserum als Bindeprotein bei einem pH-Wert von etwa 12,8 bis 13,2 durchgeführt wird, ein vorheriges Kochen sowie eine Verdünnung der Probe aus menschlichem Serum nicht erforderlich sind. Der Fortfall des Verdünnungs- und Kochschrittes vereinfacht das Verfahren nicht nur beträchtlich und macht es für eine kontinuierliche Durchführung nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses geeignet, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Bestimmung. An improved method for the determination of vitamin B12 in liquids, in particular in human serum, has now been found, by means of which certain disadvantages of the radioassay methods described above are reduced or completely overcome. In particular, it was found that in the case where the determination using chick serum as the binding protein is carried out at a pH of about 12.8 to 13.2, prior boiling and dilution of the sample from human serum are not necessary . The elimination of the dilution and boiling step not only simplifies the method considerably and makes it suitable for continuous operation according to the principle of continuous flow, but also increases the accuracy of the determination.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Gemisch aus einer Probe der Flüssigkeit, Vitamin Bubindenden Proteinen aus Kükenserum und einem Puffer zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes im Bereich von 12,8 bis 13,2 herstellt, wobei das Vitamin B12 in dem Gemisch an die Bindeproteine gebunden wird, und anschliessend die Menge an in der Probe vorhandenem Vitamin B12 durch Analyse einer Komponente des Gemisches bestimmt. The invention relates to a method for determining vitamin B12 in a liquid, which is characterized in that a mixture of a sample of the liquid, vitamin-binding proteins from chick serum and a buffer for maintaining a pH in the range of 12.8 to 13.2, whereby the vitamin B12 in the mixture is bound to the binding proteins, and then the amount of vitamin B12 present in the sample is determined by analyzing a component of the mixture.

In einer bevorzugten Durchführungsform besteht das erfin-dungsgemässe Verfahren aus der Bestimmung von Vitamin B12 in einer Flüssigkeit durch kompetitive Bindung und ist durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet: In a preferred embodiment, the method according to the invention consists of the determination of vitamin B12 in a liquid by competitive binding and is characterized by the following method steps:

a) Bildung eines Gemisches aus einer Probe der Flüssigkeit, Vitamin B12 bindenden Proteinen aus Kükenserum, markiertem Vitamin B12 und einem Puffer zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 12,8 bis 13,2, wobei die Menge der Bindeproteine aus Kükenserum nicht ausreicht, sämtliches Vitamin B12 und markiertes Vitamin B12, die in dem Gemisch vorhanden sind, zu binden; a) Forming a mixture of a sample of the liquid, vitamin B12 binding proteins from chick serum, labeled vitamin B12 and a buffer to maintain a pH of 12.8 to 13.2, the amount of binding proteins from chick serum not being sufficient, all of them Bind vitamin B12 and labeled vitamin B12 present in the mixture;

b) Abtrennen der freien, ungebundenen Fraktion aus Vitamin B12 und markiertem Vitamin B12 von der gebundenen Fraktion aus Vitamin B12 und markiertem Vitamin B12 in dem Gemisch und c) Bestimmung des Gehaltes an markiertem Vitamin B12 in der freien oder der gebundenen Fraktion aus Vitamin B12 und markiertem Vitamin B12 sowie, davon ausgehend, Bestimmung der Menge an Vitamin B12 in der Probe mit Hilfe von Standardergebnissen. b) separating the free, unbound fraction from vitamin B12 and labeled vitamin B12 from the bound fraction from vitamin B12 and labeled vitamin B12 in the mixture and c) determining the content of labeled vitamin B12 in the free or the bound fraction from vitamin B12 and labeled vitamin B12 and, based on this, determination of the amount of vitamin B12 in the sample using standard results.

Wird das erfindungsgemässe Verfahren dazu verwendet, Vitamin B12 in menschlichem Serum zu bestimmen, muss der If the method according to the invention is used to determine vitamin B12 in human serum, the

Puffer eine Menge an Cyanidionen enthalten, die ausreicht, sämtliches im menschlichen Serum vorhandene Vitamin B12 in die Cyanoform zu überführen. Normalerweise wird Kalium-cyanid verwendet, wenngleich auch andere Cyanidionen enthaltende Substanzen, wie beispielsweise Natriumcyanid, verwendet werden können. Die Cyanoform des Vitamin B12 lässt sich von dem Bindeprotein im menschlichen Serum bei den hohen pH-Werten, wie sie bei dem erfindungsgemässen Verfahren angewandt werden, abtrennen. In dem Masse, wie die Konzentration an Kaliumcyanid in dem für die Bestimmung verwendeten Puffer von Null aus ansteigt, steigt auch die Dissoziation des Vitamin B12 von dem Bindeprotein im menschlichen Serum. Bei einer Konzentration von Kaliumcyanid von etwa 20 Hg/ml ist die Dissoziation grösser als 92%. Oberhalb dieser Konzentration erhöht sich die Dissoziation nur geringfügig, jedoch wird dann die Bindung des Vitamins B12 an das Kükenserum ernstlich beeinträchtigt. Daher ist es bei dem erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt, in dem für die Bestimmung verwendeten Puffer beispielsweise Kaliumcyanid mit einer Konzentration von etwa 20 |ig/ml zu verwenden. Buffers contain an amount of cyanide ions sufficient to convert all vitamin B12 present in human serum into the cyanoform. Potassium cyanide is normally used, although other substances containing cyanide ions such as sodium cyanide can also be used. The cyanoform of vitamin B12 can be separated from the binding protein in human serum at the high pH values used in the process according to the invention. As the concentration of potassium cyanide in the buffer used for the determination increases from zero, the dissociation of vitamin B12 from the binding protein in human serum also increases. At a concentration of potassium cyanide of about 20 Hg / ml, the dissociation is greater than 92%. Above this concentration, the dissociation increases only slightly, but then the binding of vitamin B12 to the chick serum is seriously impaired. It is therefore preferred in the method according to the invention to use, for example, potassium cyanide with a concentration of about 20 μg / ml in the buffer used for the determination.

Bei pH-Werten von etwa 12,9 und darüber wird das Vitamin B12 von den im menschlichen Serum vorhandenen Bindeproteinen (TC) vollständig abgetrennt. Bei derartigen pH-Werten wurde jedoch gefunden, dass Vitamin B12 trotzdem noch an Kükenserum gebunden bleibt. Durch die Verwendung von Kükenserum als Bindeprotein bei pH-Werten von etwa 12,9 und darüber gibt es daher keine Störung durch das TC des menschlichen Serums, und das Kükenserum bleibt an das Vitamin B12 gebunden und führt zu einer hohen Genauigkeit bei der Bestimmung. At pH values of around 12.9 and above, vitamin B12 is completely separated from the binding proteins (TC) present in human serum. At such pH values, however, it was found that vitamin B12 still remains bound to chick serum. By using chick serum as a binding protein at pH values of about 12.9 and above, there is therefore no interference from the TC of human serum, and the chick serum remains bound to the vitamin B12 and leads to a high accuracy in the determination.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren liegt der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 12,9 bis 13,1. Es kann aber auch bei niedrigeren oder höheren pH-Werten gearbeitet werden (beispielsweise bei 12,8 oder 13,2), jedoch wurde gefunden, dass bei einem pH-Wert von etwa 12,7 das Vitamin B12 nicht vollständig von den das Vitamin B12 bindenden Proteinen im menschlichen Serum dissoziiert. Bei pH-Werten oberhalb von etwa 13,1 nimmt das Ausmass der Bindung zwischen dem Kükenserum und dem Vitamin B12 ab. In the method according to the invention, the pH is preferably in the range from 12.9 to 13.1. However, it is also possible to work at lower or higher pH values (for example at 12.8 or 13.2), but it has been found that at a pH of about 12.7 the vitamin B12 is not completely different from that of the vitamin B12 binding proteins dissociated in human serum. At pH values above about 13.1, the extent of the bond between the chick serum and the vitamin B12 decreases.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren werden die im Kükenserum vorhandenen das Vitamin B12 bindenden Proteine ausgenutzt. Es kann Vollkükenserum verwendet werden, oder gewünschtenfalls können die das Vitamin B12 bindenden Proteine des Kükenserums (die vermutlich Kükenserum-Transco-balamine sind), von dem Serum abgetrennt und als solche verwendet werden. Wenn Vollkükenserum verwendet wird, stört natives Vitamin B12, das in ihm enthalten sein kann, nicht, weil, wie dem Fachmann bekannt ist, das Kükenserum in starker Verdünnung (von der Grössenordnung von 10 000) eingesetzt wird. In the method according to the invention, the proteins which bind the vitamin B12 and are present in the chick serum are used. Whole chick serum can be used or, if desired, the chick serum vitamin B12 binding proteins (which are believed to be chick serum transco-balamines) can be separated from the serum and used as such. When whole chick serum is used, native vitamin B12, which may be contained in it, does not interfere because, as is known to the person skilled in the art, the chick serum is used in a strong dilution (of the order of magnitude of 10,000).

Bei dem bekannten Verfahren sind zur Bestimmung von Vitamin B12 auf competitiver Bindung beruhende Radioassays angewandt worden. Bei einem Verfahren zur competitiven Bindung gemäss der Erfindung wird eine radioaktive Markierung, wie beispielsweise "Co oder l25I, bevorzugt, wenngleich andere Markierungen, wie Fluoreszenz- oder Enzymmarkierungen, ebenfalls verwendet werden können. Die Bestimmung kann auch ohne Verwendung irgendeiner Markierung durchgeführt werden, jedoch ist dies im allgemeinen nicht bevorzugt, weil damit normalerweise weit mehr Arbeit verbunden ist und Möglichkeiten zu grösseren Fehlern geschaffen werden. Im folgenden wird das erfindungsgemässe Verfahren im Hinblick auf die Verwendung einer radioaktiven Markierung (57Co) erläutert. In the known method, radioassays based on competitive binding have been used to determine vitamin B12. In a method for competitive binding according to the invention, a radioactive label such as "Co or I25I" is preferred, although other labels such as fluorescent or enzyme labels can also be used. The determination can also be carried out without using any label, however this is generally not preferred because it usually involves much more work and creates opportunities for larger errors. The method according to the invention is explained below with regard to the use of radioactive labeling (57Co).

Bei einem Verfahren mit competitiver Bindung gemäss der Erfindung ist es erforderlich, in Stufe b) die freie Fraktion von Vitamin B12 (markiert und nicht markiert) von der gebundenen Fraktion von Vitamin B12 (dem markierten und nicht markierten Vitamin B12, das an die Kükenserumproteine gebunden In a competitive binding method according to the invention it is necessary in step b) to free the free fraction of vitamin B12 (labeled and unlabelled) from the bound fraction of vitamin B12 (the labeled and unlabelled vitamin B12 bound to the chick serum proteins)

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worden ist) zu trennen. Um diese Abtrennung zu erleichtern, werden vorzugsweise zwei alternative Techniken eingesetzt. Bei der ersten wird das Gemisch mit einem festen Material in Berührung gebracht, zweckmässig einem teilchenförmigen Material, das sich selektiv entweder an die freie Vitamin Bi2-Fraktion oder die gebundene Vitamin Bi2-Fraktion, jedoch nicht an beide adsorbieren oder binden kann. Es wurde gefunden, dass zu diesem Zweck mit Albumin beschichtete Aktivkohleteilchen geeignet sind, da sie selektiv die freie Fraktion adsorbieren. Selbstverständlich können auch andere Teilchen verwendet werden, wie dem Fachmann ersichtlich. Das feste Material wird anschliessend aus dem Gemisch abgetrennt und kann selbst auf seinen Gehalt an markiertem Vitamin B12 analysiert werden, oder die Analyse kann bei dem restlichen Gemisch durchgeführt werden. has been separated). To facilitate this separation, two alternative techniques are preferably used. In the first, the mixture is brought into contact with a solid material, suitably a particulate material that can selectively adsorb or bind to either the free vitamin Bi2 fraction or the bound vitamin Bi2 fraction, but not both. It has been found that activated carbon particles coated with albumin are suitable for this purpose since they selectively adsorb the free fraction. Of course, other particles can also be used, as will be apparent to those skilled in the art. The solid material is then separated from the mixture and can itself be analyzed for its content of labeled vitamin B12, or the analysis can be carried out on the rest of the mixture.

Die zweite, alternative Technik besteht in der Verwendung eines teilchenförmigen Materials in Schritt a), wobei auf diesem Material die Bindeproteine aus dem Kükenserum immobilisiert worden sind. Auf diese Weise wird die gebundene Vitamin Bn-Fraktion selbst immobilisiert, nachdem sie an die Proteine aus dem Kükenserum gebunden worden ist. Die festen Teilchen können dann aus dem Gemisch abgetrennt werden, wobei sie die gebundene, jedoch nicht die freie Vitamin Bi2-Fraktion mit sich führen. Vorzugsweise enthalten die Teilchen ein magnetisch anziehbares Material, so dass sie leicht aus dem Gemisch abgetrennt werden können. Einzelheiten über die Anwendung derartiger Teilchen sind der DE-OS 27 10 438 zu entnehmen. The second, alternative technique is to use a particulate material in step a), in which the binding proteins from the chick serum have been immobilized on this material. In this way, the bound vitamin Bn fraction itself is immobilized after being bound to the proteins from the chick serum. The solid particles can then be separated from the mixture, carrying with them the bound but not the free vitamin Bi2 fraction. The particles preferably contain a magnetically attractable material so that they can be easily separated from the mixture. Details of the use of such particles can be found in DE-OS 27 10 438.

Beispiele für diese beiden Techniken werden im folgenden in allgemeinen Ausführungen in bezug auf Bestimmungen in menschlichem Serum angegeben. Examples of these two techniques are given below in general terms with respect to determinations in human serum.

Bei der ersten Technik wird das zu untersuchende menschliche Serum mit einer Lösung aus markiertem Vitamin B12, beispielsweise 57Co-markierten Vitamin B12, und einem Kükenserumextrakt, der Vitamin B12 bindende Proteine enthält, in einem Puffer von einem pH-Wert von etwa 13 vermischt. Das Gemisch wird bebrütet und anschliessend mit Albumin beschichteter Aktivkohle versetzt. Die beschichtete Aktivkohle adsorbiert das freie Vitamin B12, jedoch nicht die zwischen dem Vitamin B12 und den bindenden Proteinen des Kükenserums gebildeten Komplexe. Danach wird die Aktivkohle abgetrennt und entweder die verbleibende Flüssigkeit oder - in stärkerem Masse bevorzugt - die abgetrennte Aktivkohle auf "Co analysiert. Aus Ergebnissen, die bei der Analyse von Lösungen mit bekannter Vitamin Bi2-Konzentration erhalten worden sind, kann die Menge an Vitamin B12 in dem zu untersuchenden menschlichen Serum an Hand des "Co-Gehaltes, beispielsweise unter Verwendung von Standardkurven, ermittelt werden. In the first technique, the human serum to be examined is mixed with a solution of labeled vitamin B12, for example 57Co-labeled vitamin B12, and a chick serum extract containing protein B12 binding proteins in a buffer of a pH of about 13. The mixture is incubated and then albumin-coated activated carbon is added. The coated activated carbon adsorbs the free vitamin B12, but not the complexes formed between the vitamin B12 and the binding proteins of the chick serum. The activated carbon is then separated off and either the remaining liquid or - to a greater extent - the separated activated carbon is analyzed for "Co. The results of analysis of solutions with a known vitamin Bi2 concentration can be used to determine the amount of vitamin B12 in the human serum to be examined on the basis of the "Co content, for example using standard curves.

Bei der zweiten Technik werden die das Vitamin B12 bindenden Proteine aus dem Kükenserum auf festem, teilchenförmi-gem Material immobilisiert. Beispielsweise können sie an Cel-luloseteilchen oder mit Cellulose beschichteten Teilchen, die mit Bromcyan aktiviert sind, gekuppelt werden. Verfahren zur Immobilisierung von Reaktionsteilnehmern auf kleinen Teilchen sind bekannt. Es wird bevorzugt, Teilchen zu verwenden, die ein magnetisch anziehbares Material, wie beispielsweise Fe3C>4, enthalten, da dadurch die anschliessende Abtrennung erleichtert wird. Die Teilchen werden mit dem zu untersuchenden menschlichen Serum und mit markiertem Vitamin B12, wie beispielsweise "Co-Vitamin B12, vermischt, und das Gemisch wird geschüttelt und bebrütet. Anschliessend werden die Teilchen abgetrennt und entweder die restliche Flüssigkeit oder die abgetrennten Teilchen auf "Co analysiert. In the second technique, the proteins binding the vitamin B12 from the chick serum are immobilized on solid, particulate material. For example, they can be coupled to cellulose particles or particles coated with cellulose which are activated with cyanogen bromide. Methods for immobilizing reactants on small particles are known. It is preferred to use particles that contain a magnetically attractable material, such as Fe3C> 4, since this facilitates the subsequent separation. The particles are mixed with the human serum to be examined and with labeled vitamin B12, such as "Co-Vitamin B12," and the mixture is shaken and incubated. The particles are then separated off and either the remaining liquid or the separated particles are deposited on "Co analyzed.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist natürlich besonders für die Untersuchung von menschlichem Serum geeignet, jedoch kann es auch zur Bestimmung des Vitamin Bi2-Gehaltes anderer Flüssigkeiten angewandt werden. Ausserdem kann es zur Bestimmung chemischer Analoga von Vitamin B12, die sich an Kükenserum binden, angewandt werden. Selbstverständlich gilt die Bezugnahme auf Vitamin B12 im vorliegenden Falle auch für chemisch nahe verwandte Analoga davon-, die ebenfalls nach dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmt werden können. The method according to the invention is of course particularly suitable for the examination of human serum, but it can also be used to determine the vitamin Bi2 content of other liquids. It can also be used to determine chemical analogues of vitamin B12 that bind to chick serum. Of course, the reference to vitamin B12 in the present case also applies to chemically closely related analogues thereof, which can also be determined by the method according to the invention.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann nach dem kontinuierlichen Durchflussprinzip durchgeführt werden, dessen allgemeine Merkmale bekannt sind. The method according to the invention can be carried out according to the continuous flow principle, the general characteristics of which are known.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen und Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen bedeuten The invention is explained in more detail below with the aid of examples and drawings. Mean in the drawings

Fig. 1 eine Standardkurve für die Bestimmung gemäss Beispiel 1, 1 shows a standard curve for the determination according to Example 1,

Fig. 2 eine Standardkurve für die Bestimmung gemäss Beispiel 2 und 2 shows a standard curve for the determination according to Example 2 and

Fig. 3 eine grafische Darstellung der Korrelation zwischen den in Beispiel 2 erhaltenen sowie microbiologisch erhaltenen Ergebnissen. 3 shows a graphical representation of the correlation between the results obtained in Example 2 and those obtained microbiologically.

Beispiel 1 (Bestimmung in fester Phase) Example 1 (determination in solid phase)

Die Vitamin B12 bindenden Anteile von Kükenserum wurden mit Teilchen aus Cellulose/Fe304 von einer mittleren Grösse von 2 bis 3 jj. gekuppelt, indem man zunächst die Teilchen nach dem bekannten Verfahren der Aktivierung der Cel-lulosekomponente mit Bromcyan aktivierte und anschliessend das Kükenserum mit den aktivierten Teilchen 72 h bei etwa 4 °C bebrütete. The vitamin B12-binding portions of chick serum were treated with particles of cellulose / Fe304 with an average size of 2 to 3 years. coupled by first activating the particles using the known method of activating the celulose component with cyanogen bromide and then incubating the chick serum with the activated particles at about 4 ° C. for 72 h.

Das bei den Bestimmungen und zur Verdünnung der zu untersuchenden Komponenten vor der Bestimmung verwendete Puffer bestand aus 50 mM Kaliumchlorid, 0,002% Kaliumcyanid und 0,1% Natriumazid, mit 2-n Natronlauge auf pH 13,0 eingestellt. The buffer used in the determinations and for the dilution of the components to be examined before the determination consisted of 50 mM potassium chloride, 0.002% potassium cyanide and 0.1% sodium azide, adjusted to pH 13.0 with 2N sodium hydroxide solution.

Das mit "Co aktivierte Vitamin B12 war im Handel erhältlich und besass eine spezifische Aktivität von 100 bis 300 liCi/p-g. Vitamin B12 activated with "Co" was commercially available and had a specific activity of 100 to 300 liCi / p-g.

Die Bestimmung verlief unter Zugabe der Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge wie folgt: The determination with the addition of the reagents proceeded as follows:

Standard oder Serum 50 jxl Standard or serum 50 jxl

"Co-Vitamin B12 (4,4 pg) 150 jxl "Co-vitamin B12 (4.4 pg) 150 jxl

Festphasenkükenserum 100 jxl Solid phase chick serum 100 jxl

Das Festphasenkükenserum wird mit einer Verdünnung von 1 g/640 ml verwendet, bestimmt mit Hilfe einer dosisabhängigen Standardkurve als optimale Verdünnung für den Versuch. Die incubierten Gemische wurden 3 h bei Raumtemperatur durch Überkopfdrehung kontinuierlich gemischt. Die Abtrennung erfolgte durch Zentrifugieren, wonach die Teilchen mit Pufferlösung gewaschen wurden und die feste Phase (gebundene Fraktion) 5 min in einem Gammazähler ausgezählt wurde. The solid phase chick serum is used with a dilution of 1 g / 640 ml, determined with the help of a dose-dependent standard curve as the optimal dilution for the experiment. The incubated mixtures were continuously mixed for 3 hours at room temperature by overhead rotation. The separation was carried out by centrifugation, the particles were washed with buffer solution and the solid phase (bound fraction) was counted for 5 minutes in a gamma counter.

Unter Verwendung von Standardlösungen von Vitamin B12 wurde die in Fig. 1 dargestellte Standardkurve erhalten. Unter Verwendung dieser Kurve wurden zehn Seren untersucht und in bezug auf die microbiologische Bestimmung mit E. gracilis korreliert, wobei eine Regressionslinie von y = 0,9 x + 31 und ein Korrelationskoeffizient von 0,93 erhalten wurden. The standard curve shown in FIG. 1 was obtained using standard solutions of vitamin B12. Using this curve, ten sera were examined and correlated for microbiological determination with E. gracilis, whereby a regression line of y = 0.9 x + 31 and a correlation coefficient of 0.93 were obtained.

Beispiel 2 (Flüssigphasenbestimmung) Example 2 (liquid phase determination)

Ein Extrakt aus dem Vitamin Bi2-bindenden Protein wurde nach folgender Methode aus Kükenserum erhalten: Ausfällung mit Ammoniumsulfat, wobei die gewünschte Proteinfraktion bei einem Sättigungsgrad zwischen 35 und 80% ausfiel. Diese Fraktion wurde in einer 10 mM-Lösung von Ammoniumhydro-gencarbonat wieder gelöst, der Säulenchromatografie mit DE-52-Cellulose unterworfen und mit einem Gradienten von Ammoniumhydrogencarbonat eluiert. Aliquote Teile dieses An extract from the vitamin Bi2-binding protein was obtained from chick serum by the following method: precipitation with ammonium sulfate, the desired protein fraction being found to be between 35 and 80% saturated. This fraction was redissolved in a 10 mM solution of ammonium hydrogen carbonate, subjected to column chromatography with DE-52 cellulose and eluted with a gradient of ammonium hydrogen carbonate. Aliquot parts of this

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Extraktes wurden bei allen folgenden Flüssigphasenbestim-mungen verwendet. Extracts were used in all of the following liquid phase determinations.

Der Puffer, der für die Bestimmung sowie für die Verdünnung der für die Bestimmung verwendeten Komponenten vor der Bestimmung selbst verwendet wurde, bestand aus 50 mM Kaliumchlorid, 0,0002% Kaliumcyanid und 0,1% Natriumazid, mit 2n Natronlauge auf pH 13,0 eingestellt. The buffer, which was used for the determination and for the dilution of the components used for the determination before the determination itself, consisted of 50 mM potassium chloride, 0.0002% potassium cyanide and 0.1% sodium azide, with 2N sodium hydroxide solution to pH 13.0 set.

Die Bestimmung wurde mit den in der angegebenen Reihenfolge zugesetzten Bestandteilen wie folgt durchgeführt: The determination was carried out with the components added in the order given as follows:

Standard oder Serum 50 |il Standard or Serum 50 | il

57Co-Vitamin B12 (4,4 pg) 100 jxl 57Co-vitamin B12 (4.4 pg) 100 jxl

Puffer 1250 (j.1 Buffer 1250 (j.1

Kükenserumextrakt 100 [il Chick serum extract 100 [il

Der Kükenserumextrakt wurde mit einer Verdünnung von VÌ2800 verwendet, bestimmt mit Hilfe einer dosisabhängigen Standardkurve ais optimale Verdünnung für den Ansatz. Nach Vermischen der Komponenten wurden die bebrüteten Gemische 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Trennung von gebundenen und freien Fraktionen wurde durch Zugabe von 0,3 ml einer wie folgt hergestellten Aktivkohlesuspension bewirkt: The chick serum extract was used with a dilution of VÌ2800, determined with the aid of a dose-dependent standard curve as the optimal dilution for the mixture. After the components had been mixed, the incubated mixtures were left to stand at room temperature for 2 hours. Separation of bound and free fractions was effected by adding 0.3 ml of an activated carbon suspension prepared as follows:

Aktivkohle Norit-OL 5 g/100 ml dest. Wasser Activated carbon Norit-OL 5 g / 100 ml dest. water

Rinderserumalbumin (BSA) 0,5 g/100 ml dest. Wasser Bovine serum albumin (BSA) 0.5 g / 100 ml dist. water

Die beiden Bestandteile wurden miteinander vermischt, und die mit Rinderserumalbumin beschichtete Aktivkohle wurde zentrifugiert, um überschüssiges Rinderserumalbumin und Feinteile abzutrennen, worauf die Aktivkohle in dem 5 ursprünglichen Volumen (200 ml) erneut suspendiert wurde. Danach wurde das Natriumazid bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugesetzt. The two ingredients were mixed together, and the activated carbon coated with bovine serum albumin was centrifuged to remove excess bovine serum albumin and fines, and the activated carbon was resuspended in the original volume (200 ml). The sodium azide was then added to a final concentration of 0.1%.

Nach der Zugabe der Aktivkohle wurde der Inhalt der Versuchsgläser vermischt und 10 min bei etwa 3000 UpM zentrifu-10 giert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und das Aktivkohlepellet (freie Fraktion) 5 min in einem Gammazäh-ler gezählt. After the addition of the activated carbon, the contents of the test glasses were mixed and centrifuged at about 3000 rpm for 10 min. The supernatant liquid was suctioned off and the activated carbon pellet (free fraction) was counted for 5 minutes in a gamma counter.

Unter Verwendung von Standardlösungen von Vitamin B12 wurde die in Fig. 2 dargestellte Standardkurve erhalten. Unter 15 Verwendung dieser Kurve wurden zwanzig Proben aus Menschenserum analysiert und die Ergebnisse mit auf microbiologische Weise erhaltenen Ergebnissen verglichen. Man erhielt einen Korrelationskoeffizienten von 0,97 mit einer Regressionslinie von y = 1,15 x - 6,92 (Fig. 3). The standard curve shown in FIG. 2 was obtained using standard solutions of vitamin B12. Using this curve, twenty samples from human serum were analyzed and the results compared with results obtained in a microbiological manner. A correlation coefficient of 0.97 with a regression line of y = 1.15 x -6.92 was obtained (FIG. 3).

20 Gegenstand der Erfindung ist schliesslich eine Ausstattung für die Durchführung eines Radioassays von Vitamin B12 nach dem erfindungsgemässen Verfahren. Eine derartige Ausstattung kann beispielsweise einen Satz mit Standardlösungen von Vitamin B12, Kükenserumextrakt, Seren zur Qualiätskontrolle 25 und 57Co-Vitamin B12 enthalten. Diese Komponenten können sämtlich in gefriergetrockneter Form vorliegen. Die Ausstattung kann weiterhin eine Suspension mit beschichteter Aktivkohle enthalten. Finally, the subject matter of the invention is equipment for carrying out a radioassay of vitamin B12 according to the method according to the invention. Such equipment can include, for example, a set of standard solutions of vitamin B12, chick serum extract, sera for quality control 25 and 57Co-vitamin B12. These components can all be in freeze-dried form. The equipment can also contain a suspension with coated activated carbon.

G G

2 Blatt Zeichnungen 2 sheets of drawings

Claims

638 053 638 053

2 2nd

PATENTANSPRÜCHE PATENT CLAIMS

1. Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe der Flüssigkeit mit Vitamin B12 bindenden Proteinen aus Kükenserum und einem Puffer zur Herstellung eines pH-Wertes im s Bereich von 12,8 bis 13,2 vermischt, wodurch das Vitamin B12 in dem Gemisch an die bindenden Proteine gebunden wird, und anschliessend die Menge an in der Probe vorhandenem Vitamin B12 durch Analyse einer Komponente des Gemisches bestimmt. 10 1. A method for determining vitamin B12 in a liquid, characterized in that a sample of the liquid is mixed with proteins from vitamin B12 binding from chick serum and a buffer to produce a pH in the range from 12.8 to 13.2. whereby the vitamin B12 in the mixture is bound to the binding proteins, and then the amount of vitamin B12 present in the sample is determined by analyzing a component of the mixture. 10th

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Bereitstellung der Bindeproteine Vollkükenserum zusetzt. 2. The method according to claim 1, characterized in that whole chick serum is added to provide the binding proteins.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man 15 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that 15

a) ein Gemisch aus der Flüssigkeitsprobe, Vitamin B12 bindenden Proteinen aus Kükenserum, markiertem Vitamin B12 und einem Puffer zur Herstellung eines pH-Wertes von 12,8 bis 13,2 bildet, wobei man die Menge an bindenden Proteinen aus Kükenserum so wählt, dass sie nicht ausreicht, um sämtliches 20 vorhandenes Vitamin B12 und markiertes Vitamin B12 zu binden, a) forms a mixture of the liquid sample, vitamin B12-binding proteins from chick serum, labeled vitamin B12 and a buffer for producing a pH of 12.8 to 13.2, the amount of binding proteins from chick serum being chosen such that it is not sufficient to bind all 20 vitamin B12 and labeled vitamin B12 present,

b) die freie ungebundene Fraktion von Vitamin B12 und markiertem Vitamin B12 in dem Gemisch von der gebundenen Fraktion von Vitamin B12 und markiertem Vitamin B12 in dem 25 Gemisch trennt und c) die freie oder die gebundene Fraktion aus Vitamin B12 und markiertem Vitamin B12 auf ihren Gehalt an markiertem Vitamin B12 analysiert und auf diese Weise mit Hilfe von Standardergebnissen die Menge an in der Probe vorhandenem Vita- 30 min B12 bestimmt. b) separates the free unbound fraction of vitamin B12 and labeled vitamin B12 in the mixture from the bound fraction of vitamin B12 and labeled vitamin B12 in the mixture, and c) the free or bound fraction of vitamin B12 and labeled vitamin B12 on their The content of labeled vitamin B12 is analyzed and the amount of vitamin B12 present in the sample is determined using standard results.

4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe b) das Gemisch mit einem festen Material in Berührung bringt, das sich selektiv an entweder die freie oder die gebundene Fraktion adsorbiert oder bindet, und nach dieser 35 Adsorption oder Bindung das Material aus dem Gemisch abtrennt. 4. The method according to claim 3, characterized in that in step b) the mixture is brought into contact with a solid material which selectively adsorbs or binds to either the free or the bound fraction, and after this adsorption or binding the material separated from the mixture.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als festes Material ein Material aus Teilchen von mit Albumin beschichteter Aktivkohle verwendet, die die freie 40 Fraktion selektiv adsorbiert. 5. The method according to claim 4, characterized in that a material made of particles of activated carbon coated with albumin is used as the solid material, which selectively adsorbs the free fraction.

6. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe a) Vitamin Bi2-bindende Proteine aus Kükenserum verwendet, die auf einem festen, teilchenförmigen Material immobilisiert sind, und in Stufe b) das teilchenförmige 45 Material, das die Proteine und die gebundene Fraktion trägt, 6. The method according to claim 3, characterized in that in stage a) vitamin Bi2-binding proteins from chick serum are used, which are immobilized on a solid, particulate material, and in stage b) the particulate material containing the proteins and the bound fraction carries,

aus dem Gemisch abtrennt. separated from the mixture.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als teilchenförmiges Material, auf dem die Bindeproteine immobilisiert sind, ein Material verwendet, das aus einem so magnetisch anziehbaren Material besteht, und dass man in Stufe b) das teilchenförmige Material aus dem Gemisch mit Hilfe eines Magneten abtrennt. 7. The method according to claim 6, characterized in that one uses as the particulate material on which the binding proteins are immobilized, a material which consists of such a magnetically attractable material, and that in step b) the particulate material from the mixture with With the help of a magnet.

8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe a) Vollkükenserum zur 55 Bereitstellung der Vitamin Bn-bindenden Proteine in dem Gemisch verwendet. 8. The method according to any one of claims 3 to 5, characterized in that in step a) whole chick serum is used to provide the vitamin Bn-binding proteins in the mixture.

9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als markiertes Vitamin B12 ein radioaktiv markiertes Vitamin B12 verwendet. 60 9. The method according to any one of claims 3 to 8, characterized in that a radiolabeled vitamin B12 is used as the labeled vitamin B12. 60

10. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu untersuchende Flüssigkeit menschliches Serum und als Puffer einen solchen verwendet, der Cyanidionen in einer Menge enthält, 10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that human serum is used as the liquid to be investigated and one which contains cyanide ions in an amount as the buffer,

die ausreicht, um sämtliches Vitamin B12 in dem menschlichen 65 Serum in die Cyanoform zu überführen. sufficient to convert all of the vitamin B12 in human serum to cyanoform.

11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung durchführt, ohne dass das menschliche Serum einem Kochvorgang unterzogen wird. 11. The method according to claim 10, characterized in that one carries out the determination without the human serum being subjected to a cooking process.

12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Puffer einen solchen verwendet, der einen pH-Wert in dem Gemisch von 12,9 bis 13,1 herstellt. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the buffer used is one which produces a pH in the mixture of 12.9 to 13.1.

13. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung nach dem automatisierten kontinuierlichen Durchflussprinzip durchführt. 13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that one carries out the determination according to the automated continuous flow principle.

14. Ausstattung zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 3, gekennzeichnet durch die folgenden Bestandteile : eine Reihe von Lösungen von Vitamin B12 von bekannter Konzentration, Vitamin Bn-bindende Proteine aus Kükenserum, ein oder mehrere Standardsera und 57Cobalt-Vitamin-Bi2, wobei die Bestandteile innerhalb der Ausstattung einzeln abgepackt sind. 14. Equipment for carrying out the method according to claim 3, characterized by the following constituents: a series of solutions of vitamin B12 of known concentration, vitamin Bn-binding proteins from chick serum, one or more standard sera and 57 cobalt vitamin Bi2, the constituents are individually packaged within the equipment.