DE2806860C3 - Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der freien Fraktion eines Hormons in einer biologischen Flüssigkeit - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der freien Fraktion eines Hormons in einer biologischen Flüssigkeit

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Description

K1(M1-HP1),
V KJM1-HP1)
20
25
worin D für den Verdünnungsfaktor steht, um den die biologische Flüssigkeit vor dem Kontaktieren mit der festen Matrix verdünnt worden ist, Ks die Absorptionskonstante der festen Matrix gegenüber dem freien Hormon bedeutet, S> für die Gesamtzahl von Bindestellen in der festen Matrix steht und
35
die Summe der Produkte ist, die man erhält, wenn man die Assoziationskonstante der Bindungsstellen des Typs /gegenüber dem Hormon, d. h. ΑΓ» mit der Konzentration der ungebundenen Stellen des Typs i, w angegeben als Gesamtkonzentration der Stellen des Typs i, d.h. M» minus der Konzentration der gebundenen Stellen des Typs i, d. h. HPi, für alle η Spezies der Bindungsstelien in der biologischen Flüssigkeit multipliziert
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit Blutserum ist, und daß der Kontakt zwischen dem Blutserum und der festen Matrix bei einem stabilisierten pH-Bereich von 73 bis 7,8 und einer physiologisch annehmbaren Temperatur durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Hormon Thyroxin und/oder Trijodthyronin ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß der Wert für das Produkt KsS0 etwa 10 bis etwa 80 beträgt, und daß der Wert von D etwa 1 bis etwa 20 beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ω dadurch gekennzeichnet, daß man als Analysenme* thode zur Bestimmung des an die feste Matrix gebundenen Hormons eine radioimmunologische Methode anwendet
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste Matrix ein natürliches, synthetisches oder modifiziertes Harz verwendet
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste Matrix ein modifiziertes dreidimensionales Polysaccharid verwendet
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste Matrix Sephadex LH-20 verwendet
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste Matrix Sephadex G-25 verwendet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der freien Fraktion eines Hormons in einer biologischen Flüssigkeit, die gebundenes und ungebundenes Hormon in einem Gleichgewichtszustand enthält
Es ist bekannt, daß einige Hormone, die in Körperflüssigkeiten zirkulieren, in zwei Formen, nämlich an Trägerproteine gebunden und ungebunden, vorkommen. Die zwei Fraktionen liegen untereinander im Gleichgewichtszustand vor. Die freie Fraktion ist in vielen Fällen für die biologischen Effekte direkt verantwortlich. Thyroidhormone, Thyroxin (T4) und Trijodthyronin (T3), die in dem Blut zirkulieren, sind hauptsächlich an Trägerproteine durch eine nicht-kovalente Bindung gebunden. Trägerproteine sind z. B. ein «-Globulin (thyroxinbindendes Globulin, TBG), das etwa 75% der Hormone bindet, eine Präalbuminfraktion (TBPA) und eine Albuminfraktion (TBA), die etwa 15 bzw. 10% der Hormone binden. Die Assoziationskonstanten von T3 und T4 mit Bindeproteinen sind verschieden: Die TS-TBG-Assoziationskonstante ist niedriger als die T4-TBG-Assoziationskonstante. Die T3-TBPA-Assoziationskonstante ist vernachlässigbar. Selbst dann, wenn sehr kleine Fraktionen von T3 und T4 ungebunden im Plasma (FT3 und FT4) zirkulieren, dann werden nur die ungebundenen Fraktionen als biologisch aktiv angesehen. Es ist nachgewiesen worden, daß gebundene Hormonfraktionen durch Zellmembranen nicht hindurchgehen können.
Es ist daher wesentlich, die Hormonfunktionen mit ihrer freien Fraktion anstelle mit oer in dem Serum vorhandenen Gesamtmenge in Beziehung zu bringen. Variationen der freien Fraktionen, die bei hypo- und hyperthyroiden Personen beobachtet werden, stehen in einem engeren Zusammenhang mit klinischen Symptomen als die Gesamttliyroidhormone. Die Werte der freien Fraktionen von hypo- und hyperthyroiden Personen springen nicht 'iber die Werte von euthyroiden Personen hinaus, wie es bei den Gesamthormonwerten beobachtet wurde. Durch Messungen der freien Fraktion können daher zweifelhafte diagnostische Werte, die in den Grenzzonen auftreten, vermieden Werden.
Die Bestimmung von freiem T3 und T4 eröffnet neue interessante Untersuchungen von nicht-thyroiden Krankheiten, So wird &B< bei Patienten mit Angina pectoris eine Erhöhung des Gehalts von freiem T4 beobachtet Da weiterhin Spiegel von freien Thyroidhormonen und insbesondere der Spiegel von freiem T3 eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltutig der
Homeostase des Hypothahmus-Hypophyse-Schilddrüsen-Systems spielen, kann eine ausgedehntere Untersuchung dieser Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen durchgeführt werden.
Die Wechselwirkung zwischen Thyroidhormonen und Bindprotehien kann durch eine reversible Reaktion beschrieben werden, auf die das Massenwirkungsgesetz angewendet werden kann: das Gleichgewicht zwischen der ungebundenen (freien) und der gebundenen Hormonfraktion hängt von der Assoziationskonstante jedes Bindeproteins und von der Anzahl von Bindestellen ab. Zirkulierende Hormon-Protein-Komplexe können als Reservoirsysteme angesehen werden, um scharfe Variationen der Schilddrüsen-Sekretionsaktivität zu vermeiden. Etwa 0,01 bis 0,04% der Gesamtmenge von T4 und etwa 0,2 bis 0,4% der Gesamtmenge von T3 sind ungebunden. Was die Hormone betrifft, die dazu imstande sind, sich an Serumproteine zu binden, so wird für jede Art vor? Bindungsstelle die Situation durch das folgende Gleichgewicht:
H+ P,
angegeben, worin H die Konzentration des freien Hormons, Pi die Konzentration der freien Stellen des Typs i, HPi die Konzentration der gebundenen Stellen des Typs / und K1 die relative Assoziationskonstante bedeuten.
In diesem Falle ist die Konzentration des freien Hormons:
HP1
HP1
K-P, K1(M1-HP1)
Il
Σ HP,
ι I
Σ K1(M1-HP1)
ι I
!0
15
2(1
25
30
35
worin Mj die Gesamtkonzentration der gebundenen und nicht-gebundenen Stellen vom Typ / ist Da die Bindestellen eines einzelnen Proteins wie die in dem Gesamtsystem vorhandenen Proteine von unterschiedlichem Typ sein können, wird im Falle von π Arten von BindesteUen im Serum die Situation bei Gleichgewichtsbedingungen in allgemeinerer Weise durch folgende Beziehung:
50
angegeben, worin //die Konzentration des zirkulierenden freien Hormons bedeutet, M, und HP1 die obigen Bedeutungen haben und die Summen sich auf die Arten der Bindestellen / in dem Serum und die relativen Assoziationskonstanten gegenüber dem Hormon bezie* hen.
TBG und TBPA haben eine einzige Bindestelle pro Molekül, während Albumin zwei BindesteUen mit unterschiedlichen Assoziationskonstanten hat
Die Konzentration eines freien Hormons in einer biologischen Flüssigkeit wird gewöhnlich in der Weise bestimmt, daß man die Prozente der freien Fraktion mit
55
60
65 der Menge des in dem Medium vorhandenen Gesamthormons multipliziert Die Prozentmenge kann beispielsweise durch Dialyse des Serums im Gemisch mit einer bekannten Menge von markiertem freien Hormon bestimmt werden. Die Anwendung dieser Methode auf Thyroxin (T4) wird z. B. von S. H. Ingbar et al. in »J. Clin. Invest«, 44, 1679 (1965) beschrieben. Diese Methode liefert jedoch nicht besonders verläßliche Werte, da es mehrere Faktoren gibt, die das Ergebnis beeinträchtigen könaen, wie z. B. das Vorhandensein von J125-Ionen, die die Berechnung des Verhäknisses von gebundenem Hormon zu nicht-gebundenem Hormon negativ beeinflußt
Die direkte Methode von S. ElUs und R. Ekins (»Acta Endocrinologica Suppl.« 177, 106, 1973 — K Acta Endocrinolcgica Congress, Oslo, 17.—21.Junie 1973)zur Bestimmung von Thyroxin und Trijodthyronin erfordert eine ziemlich gute technische Erfahrung, die die Techniker, die diese Analysenarten durchführen, im allgemeinen nicht haben, da diese Methode ziemlich kompliziert ist. Auch diese Methode baut sich auf einer Dialyse auf.
Im speziellen Falle von T4 sind zwei weitere Möglichkeiten untersucht worden. Die erste Möglichkeit (Index von freiem T4) basiert auf der Bestimmung des Gesamt-T4-Seruinspiegels (beispielsweise gemäß der US-PS 36 59 104) und der T3-Aufnahme (beispielsweise gemäß der US-PS 37 10117). Die zweite Möglichkeit basiert auf der vollständigen Dissoziierung von T4 in Gegenwart von markiertem T4 und durch anschließende Absorption auf einem Harz und Eluierung des markierten T4 aus dem Harz mittels eines Teils des Testserums (US-PS 39 41 56.4).
Bei Anwendung der ersten Möglichkeit gibt das arithmetische Produkt des T4-Gesamtserumspiegels und der T3-Aufnahme eine indirekte Abschätzung des freien T4 (Index von freiem T4). Diese Abschätzung kann zwar besser mit der SchildtfTJsenfunktion in Beziehung gebracht werden, doch sind zwei getrennte Tests erforderlich, was eine Vergrößerung der Fehler mit sich bringt
Beide Methoden geben eim;n indirekten Wert von freiem T4. Mit diesen Methoden kann bezüglich freiem T3 keine Information erhalten werden.
Aus den obigen Gründen ge:ht hervor, daß nur eine direkte Messung von freiem T3 und T4 eine größere Verwendungsmöglichkeit für diagnostische Zwecke hat.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur direkten Bestimmung von freien Hormonfraktionen in biologischen Flüssigkeiten zu schaffen, das insbesondere eine einfache und rasche Elestimmung von freiem T3 und T4 in Serum (FT3 und FT4) ermöglicht
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der freien Fraktion eines Hormons in einer biologischen Flüssigkeit, die gebundenes und ungebundenes Hormon in einem Gleichgewichtszustand enthält, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Probe der biologischen Flüssigkeit mit einer festen Matrix kontaktiert, die dazu imstande ist, selektiv und reversibel das freie Hormon zu absorbieren, und daß man die Menge des an die feste Matrix gebundenen Hormons bestimmt und in Korrelat tion mit der Konzentration des freien Hormons, das in der biologischen Flüssigkeit vorhanden ist, setzt Die Konzentration der freien Fraktionen der Hormone kann darin leicht bestimmt werden, indem man den Wert der an die feste Matrix gebundenen Hormohmengen durch einen Faktor (φ) dividiert, der mit den
physikalischen Eigenschaften der festen Matrix in Beziehung steht
Es wird ersichtlich, daß die Bestimmung nur dann möglich ist, wenn die feste Matrix das das System bestimmende Gleichgewicht nur bis zu einem geringen Ausmaß stört. So muß beispielsweise in jedem Falle die Variation der freien Konnonfraktionen, die auf die Störung zurückzuführen ist, weniger als 10% sßin.
Es wurde gefunden, daß durch geeignete Auswahl des Typs der festen Matrix und deren Menge im Verhältnis ι ο zu dem Volumen der Serumprobe (nach Verdünnung mit dem Puffer) den oben beschriebenen Bedingungen genügt wird.
Geeignet ist eine feste Bindematrix, die eine sehr niedrige Absorptionskonstante Ks gegenüber den Hormonen hat und die eine Gesamtzahl von Bindestellen Sry hat, die im Vergleich zu der Anzahl von Bindestellen sehr hoch ist, welche tatsächlich an das adsorbierte Hormon gebunden sind (HS).
Besonders vorteilhaft ist es, wenn man die Bedingungen gemäß Patentanspruch 2 einhält
Wenn den im Anspruch 2 genannten Bedingungen Genüge getan wird, dann steht die Menge des Hormons, das an die feste Matrix gebunden ist in direktem proportionalen Zusammenhang mit der Konzentration 2-j des freien Hormons, das ursprünglich in der biologischen Flüssigkeit vorhanden ist
Feste Matrices, die zur selektiven und reversiblen Absorption von freien Hormonen aus biologischen Flüssigkeiten geeignet sind, können aus verschiedenen Substanzen ausgewählt werden, wie z. B. synthetischen Harzen, festen natürlichen Polymeren, z. B. Stärke, Dextran und den gleichen natürlichen Polymeren, die durch eine chemische oder physikalische Behandlung modifiziert worden sind. Vorzugsweise werden feste Matrices verwendet die eine leichte und vollständige Wiedergewinnung der adsorbierten Hormone, beispielsweise durch Eluierung mit einem Lösungsmittel, gestatten. Es wurde gefunden, daß handelsübliche synthetische oder modifzierte Harze mit Vorteil verwendet werden können, vorausgesetzt daß das Verhältnis der Harzmenge zu der Volumenmenge der Testprobe richtig eingestellt wird. Beispiele für handelsübliche synthetische oder modifizierte Harze sind solche, wie sie beispielsweise unt^r den Warenzeichen Sephadex, Sepharose, Amberlite und Dowex vertrieben werden.
Als Richtlinie zur Auswahl der festen Matrices kann der Wert der Summe
errechnet werdm, indem man die Werte für K1, M, und HP, einsetzt die von verschiedenen Autoren für das spezifische System, beispielsweise für Trägerproteine von T3 und T4 im Serum beschrieben worden sind.
Die Werte des Produkts KsSo können für jede in Betracht gezogene Matrix errechnet oder experimentell bestimmt werden, indem man die folgende Beziehung zwischen der bekannten Konzentration des freien Hormons in einer Slandardprobe und der Menge des Hormons HR, das an die Matrix nach Kontakt mit der Standardprobe gebunden ist, anwendet;
Darin ist ψ gleich dem Produkt K5Sa.
Im FpII der Bestimmung der freien Hormone T3 und T4 (FT3 und FT4) werden sehr zufriedenstellende Ergebnisse bei Verwendung von modifizierten Polysacchariden, z. B. von Sephadex G-25 (ein modifiziertes Dextran, bei dem die Makromoleküle vernetzt sindl oder Sephadex LH-20 (ein perlenförmiges hydroxypropyliertes Dextrangel, bei dem die Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk vernetzt worden sind), erhalten. In diesem Falle wird das Harz in einer solchen Menge eingesetzt, daß das Produkt KsSo etwa 10 bis etwa 80 ist Der Wert für den Faktor D kann im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis etwa 20 gehalten werden, wobei für jedes Hormon der angemessene Wert ausgewählt wird.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Probe der vorzugsweise frischen oder gut konservierten biologischen Flüssigkeit, die das zu bestimmende freie Hormon enthält mit einer Pufferlö sung versetzt damit ein End-pH- * ert im Bereich von 7,3 bis 7,8 erhalten wird Das Voiumer der zugesetzten Pufferlösung ist etwa demjenigen der Serumprobe gleich. Die so erhaltene Lösung wird mit einer vorgewählten Menge einer geeignet ausgewählten feste· ■ Matrix bei einer physiologisch annehmbaren Temperatur kontaktiert Wenn das durch das Vorhandensein der festen Matrix gestörte Gleichgewicht stabilisiert ist dann wird die restliche Flüssigkeit entfernt und die Matrix wird wiederholt mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 73 bis 7,8 gewaschen, um irgendwelche Spuren der Testlösung zu eliminieren. Das auf der Matrix adsorbierte Hormon wird mit einem Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, eluiert Hierauf wird das Methanoleluat eingedampft und das zurückgebliebene Hormon wird durch eine übliche Analysenmethode bestimmt
Im allgemeinen ist die geeignetste analytische Methode für diese Bestimmungen der Radioimrnunoassay. Im Falle der Thyroidhormone kann beispielsweise mit Vorteil die von F. Pennisi et al (»Quadernie Sclavo di Diagnostica«, 1975, Band 11, Seite 311) beschriebene Methode angewendet werden.
Die Menge des an die Matrix gebundenen Hormons (HR) steht mit dem in dem Serum vorhandenen freien Hormon (H)'m folgender Beziehung:
50
H
(φ A1Sn)
HR
Darin ist φ (Adsorptionsfaktor) ein Faktor, der von
dei. ,yhjsikulischen Eigenschaften der festen Matrix, die experimentell bestimmt oder in einigen Fällen auf der Basis von Literaturwerten theoretisch errechnet werden können, abhängig.
Durch das folgende Beispiel, das die Bestimmung von FT4 im Serum zeigt, wird die Erfindung näher erläutert.
Eine 0,5-ml-Probe des Serums wird durch die obese
Öffnung in eine chromatographische Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 70 mm eingebracht Die Säule ist in zwei Abschnitte
aufgeteilt und sie besitzt zwei Endöfirungen mit ihren
jeweiligen Abdeckungen. Die untere öffnung hat einen kleineren Durchmessen Der obere Abschnitt enthält 0,5 ml einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,3 (0,1 M-Phosphat).
Der untere Abschnitt enthält die feste Matrix, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt worden
ist Die Matrix wird zwischen zwei porösen Polyäthylenscheiben gehalten. Die feste Matrix besteht aus 150 mg Sephadex LH-20.
Die durch Vermischen des Serums mit dem Puffer erhaltene Lösung wird sorgfältig geschüttelt und sodann wird die überschüssige Flüssigkeit durch die untere Öffnung entfernt.
Nach der Entfernung der Flüssigkeit wird die Säule mit Abdeckungen zugestöpselt Die Säule, die die feste Matrix enthält,'welche restliche Flüssigkeit aufgesaugt hat, wird 1 h bei 37 ± 2° C inkubiert
Die Säule wird sodann 2 χ mit 2 ml Pufferlösung, pH-Wert 7,4 (0,1 M-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-salzsäure) bei 37±2°C und einmal mit 0,4 ml Methanol zur Entfernung der restlichen Pufferlösung gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Das auf der festen Matrix in der Säule adsorbierte Hormon wird sodann mit 2 ml Methanol eluiert Das Eluat wird in einem Reagensglas gesammelt und sodann in einem Thermostat bei 37° C im Vakuum zur Trockene eingedampft
Die erhaltene Probe wird hierauf einem radioimmunologischen Assay unterworfen. Die Bestimmung von freiem T4 wird wie folgt durchgeführt:
Neben der Testprobe werden weitere 6 Standardproben der radioimmunologischen Untersuchung unterworfen. Diese Proben werden im wesentlichen nach der gleichen Verfahrenweise, wie sie für die Testprobe beschrieben wurde, hergestellt, wobei vorgewählte Mengen des Hormons T4 verwendet werden. In diesen Standardproben werden 0, 60. 120, 240. 480 und 720 Picogramm des Hormons T4 verwendet
Standardproben werden auch für die T3-Bestimmung hergestellt, wenn begleitende radioimmunologische Assays mit einer einzigen Serumprobe durchgeführt Werden sollen. Der radioimmunologische Assay wird vorzugsweise mit Doppelproben durchgeführt, die in der Weise hergestellt worden sind, daß zu jeder Standardprobe und zu der Testprobe 4 ml Pufferlösung, pH Wert 7.4. gegeben werden und daß 0,5-ml- Portionen jeder der erhaltenen Lösungen in zwei Reagensgläser überführt werden. In jedes Reagensglas wird 0,1 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die eine vorgewählte Menge von T4-J125 enthält Mit dem markierten Produkt (0,1 ml) und mit dem Puffer (0,6 ml) werden weiterhin zwei Proben für die Zählung der Gesamtaktivität und der Blindprobe hergestellt
In alle Reagensgläser mit Ausnahme der beiden letztgenannten werden 0,1 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die eine vorgewählte Menge von T4-Antiserum enthält. Alle Reagensgläser, die jeweils 0,7 ml Flüssigkeit enthalten, werden sodann 4 h bei 4° C inkubiert Das an den Antikörper gebundene Hormon wird von dem ungebundenen Hormon abgetrennt, indem in jedes Reagensglas 0,5 ml einer Suspension von Holzkohle/Dextran in destilliertem Wasser (Holzkohle 20 mg/ml. Dextran 2 mg/ml, y-GlobuIin 3 mg/ml in Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4) gegeben wird und indem sodann 15 min bei 4000 Upm zentrifugiert wird. Die Holzkohle wird auch in die Reagensgläser gegeben, die kein Antiserum enthalten. Die überstehende Flüssigkeit jedes Reagensglases wird in eine neue Reihe v<m Reagensgläsern zur Zählung der Radioaktivität überführt Im Falle der Reagensgläser, die für die Zählung der Gesamtaktivität und für die Blindprobe (d. h. Proben, die kein T4-Antiserum enthalten) hergestellt worden sind, wird auch die durch Zentrifugiening ausgefällte Holzkohle der Zählung unterworfen.
Die Reagensgläser, die die überstehende Flüssigkeit
enthalten, werden einer radioaktiven Zählung unterworfen. wobei für jedes Paar der arithmetische Mittelwert errechnet wird. Die Radioaktivität der Reagensgläser, die kein Antiserum enthalten, entspricht der Radioaktivität, die in der überstehenden Flüssigkeit auch in Abwesenheit des Antikörpers (Blindprobe) vorhanden ist
Diese Zählungen sind auf kleine Mengen von immunologisch inaktiven Substanzen zurückzuführen und sie müssen von den mittleren Zählungen für jedes Reagensglaspaar abgezogen werden, um den korrigierten Mittelwert zu erhalten. Die Radioaktivität der ausgefällten Holzkohle entspricht der Gesamtradioaktivität die in die Reagensgläser gegeben worden ist (Gesamtaktivitätszählung). Diese Werte sind dazu geeignet, um die Qualität der Reagentien und der Verfahrensdurchführung zu kontrollieren.
Aufgrund der korrigierten mittleren Zählungen, die
ausgphend von den Paaren von Standard- und Testreagensgläschen erhalten worden sind, werden die Werte für das reziproke Konkurrenzverhältnis (R. C. R.) für alle Standard- und Testproben definiert Die
R. C R.- Werte entsprechen dem Verhältnis zwischen der korrigierten mittleren Zählung des Standardpaars von Reagensgläsern, die kein T4 enthalten (Standard 0) und der korrigierten mittleren Zählung von jedem der anderen Paare von Standard- und Testproben.
Auf diese Weise werden mehrere R. C. R.-Werte erhalten, die sich auf die verschiedenen Standard- und Testproben beziehen. Sie können mit den jeweiligen Originalgehalten von T4 anhand einer linearen Beziehung des Typs: y=a+bx in Beziehung gesetzt werden, worin y den R. C R.-Wert bedeutet _ und χ die in Picogramm ausgedrückte Hormonmenge bedeutet, die durch die Matrix absorbiert worden ist
Die Konzentration von FT4 in der ursprünglichen Testprobe wird daher in der Weise bestimmt daß man den Wert von χ für den entsprechenden Wert von y, der wie oben erhalten worden ist abliest und diesen durch den Faktor φ dividiert
Zur Bestimmung von FT3 im Serum wird im so wesentlichen die gleiche Verfahrensweise angewendet Es wurden Vergleichstest zwischen der Methode mit einer Dialyse (Ellis und Ekins) und der erfindungsgemäßen Methode durchgeführt, wobei die gleichen heterogenen Gruppen von Patienten verwendet wurden. Statistische Tests, die auf die Vergleichsuntersuchungen angewendet wurden (lineare Regressionsanalyse und der Paartest von Student), zeigen, daß die nach den zwei Methoden erhaltenen Ergebnisse sich nicht signifikant unterscheiden. In der folgenden Tabelle sind die ω erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt:
9 10
FT3- und FT4-Bestimmung: Vergleich der Ergebnisse, die unter Anwendung der Dialysemethode (.v) und der erfindungsgemäßen Methode (y) erhalten wurden
Bestim Nr. Lineare Regressionsanalyse Bestimmung Paar-t-Test Ό.05
mung
a b Sy r Bias (SD)1, 1
pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml
FT3 81 0,703 0,848 0,610 0,947 -0,038 0,684 0,503 1,9901
FT4 55 0,463 0,968 1,691 0,910 -0,151 1,700 0,658 2,0049
η = Anzahl der Bestimmungen.
χ = Ergebnisse, die bei Anwendung der Dialysemethode erhalten wurden; y = Ergebnisse, die bei Anwendung deä errindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurden.
Lineare Regressiöhsariälyse: y = a + bx, Sr = Ständardfehler des geschätzten Wertes; r = Bezügsköefnzierii der linearen Regression.
i-T'esl: (T= [χ- y); EUd = Ständäfdaöweicnung der Differenzen
Bias
Bias = ——; / =

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der freien Fraktion eines Hormons in einer biologischen Flüssigkeit, die gebundenes und ungebundenes Hormon in einem Gleichgewichtszustand enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der biologischen Flüssigkeit mit einer festen Matrix kontaktiert, die dazu imstande ist, selektiv und reversibel das freie Hormon zu absorbieren, und daß man die Menge des an die feste Matrix gebundenen Hormons bestimmt und in Korrelation mit der Konzentration des freien Hormons, das in der biologischen Flüssigkeit vorhanden ist, setzt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wert für das Produkt DK5S0 gleich oder niedriger ist als 10% des Wertes der Summe
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