DE2824742A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung klinischer fiagnose-tests in vitro unter verwendung eines festphasen- bestimmungs-systems - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung klinischer fiagnose-tests in vitro unter verwendung eines festphasen- bestimmungs-systemsInfo
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Description
Unsere Nr. 22 000 Pr/br
Roger Norman Piasio
Yarmouth, Maine, V.St.A. David Allan Perry
Portland, Maine, V.St.A. Pangal Narayan Nayak
Belmont, Mass., V.St.A.
Yarmouth, Maine, V.St.A. David Allan Perry
Portland, Maine, V.St.A. Pangal Narayan Nayak
Belmont, Mass., V.St.A.
Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung klinischer Diagnose-Tests in vitro unter Verwendung eines Pestphasen-Bestimmungs-Systems
.
In den letzten Jahren sind zahlreiche Techniken auf dem Gebiet der Laboratoriumsdiagnostik angewandt worden, um die Durchführung
bestehender Methoden zu vereinfachen und um neue Methoden mit verbesserter Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Genauigkeit
zu schaffen. Insbesondere waren Festphasen-Reaktionen besonders wertvoll, um die Handhabung bisheriger Methoden zu vereinfachen
und Methoden möglich zu machen, die mit üblichen Homogenphasen-Reaktianen
nicht durchgeführt werden konnten.
Die Festphasen-Reaktion wird im allgemeinen zwischen einem
Reaktionsteilnehmer, der stationären Komponente, der auf der
Oberfläche einer unlöslichen Trägermatrix immobilisiert ist,und
einem zweiten Reaktionstexlnehmer, der mobilen Komponente, in Lösung durchgeführt. Die Reaktion findet statt, wenn ein Molekül
oder eine molekulare Anordnung des mobilen Reaktionsteilneh-
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COPY
COPY
mers im Verlaufe der Diffusion mit einem Molekül des stationären auf der Oberfläche der festen Trägermatrix immobilisierten
Reaktionsteilnehmers kollidiert. Die Reaktion kann eine übliche chemische Reaktion, eine Bindung der mobilen Komponente durch
die stationäre Komponente wie in einer immunchemischen Reaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder sie kann eine
Bindung der mobilen Komponente durch die stationäre Komponente sein, begleitet durch chemische Transformierung der einen der
Komponenten, wie es in einer enzymkatalysierten Reaktion stattfindet. Quantitative Ergebnisse werden erzielt, indem man die
Bildung der Produkte oder das Verschwinden der Reaktionsteilnehmer mißt, wie im Falle von üblichen und enzymkatalysierten
Reaktionen, und indem man die Menge der gebundenen mobilen Komponente oder die Menge der ungebundenen mobilen Komponente
im Fall einer immunchemischen Reaktion mißt.
Jede übliche chemische Reaktion oder enzymkatalysierte Reaktion, die in einer direkt oder indirekt meßbaren Veränderung resultiert,
kann im Prinzip durch Festphasen-Techniken durchgeführt werden. Zu den direkt meßbaren Veränderungen gehören Änderung des pH-Wertes,
der Lichtabsorption im sichtbaren und Ultraviolettbereich
oder der Fluoreszenzintensität. Indirekte Messungen können durchgeführt werden, wenn die primären Reaktionsteilnehmer
oder Produktfselbst nicht ohne weiteres meßbar sind, indem man die Wirkung eines Reagens zwischenschaltet, um weitere Reaktionsstufen durchzuführen, die in einer meßbaren Veränderung resultiert
und indem man spezifische Trenntechniken einfügt. Derartige Strategien können alleine oder in Kombination, wie es in der
Technik üblich ist, angewandt werden. •
Wo die Reaktion alleine in der Bindung ohne chemische Veränderung besteht, können Techniken, die auf dem Gebiet der Immunchemie
entwickelt wurden, angewandt werden, um das Ausmaß der Reaktion
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zu messen. Pestphasen-Reaktionen .eignen sich besonders für
immunchemische Bestimmungen, weil die Reaktionsteilnehmer in gebundener Form leicht von der Lösung entfernt werden können
aufgrund ihrer Bindung an die feste Phase. Häufig lassen sich jedoch gebundene Verbindungen in einer immunchemischen Reaktion
nicht direkt messen wegen ihrer Nichtunterscheidbarkeit durch chemische Methoden von anderen Substanzen, die üblicherweise im
gleichen Reaktionsgemisch vorliegen, so daß das einfache Verschwinden einer reaktiven Komponente von der Lösung oder dessen
Ansammlung in der festen Phase nicht direkt gemessen werden kann. Deshalb müssen zusätzliche Schritte unternommen werden, um eine
meßbare Veränderung bezüglich des Ausmaßes an Bindung zu erzielen.
Die Vielzahl an Schritten, die durch bisherige Fachleute unternommen
wurden, lassen sich in zwei generelle Kategorien unterteilen. In der ersten Kategorie, die als konkurrierende oder
indirekte immunologische Bestimmung bezeichnet wird, liegt die immobilisierte Komponente in einer gesteuerten Mange vor und
die mobile Komponente in einer unbekannten Menge. Der unbekannten Menge der mobilen Komponente wird eine bekannte Menge der gleichen
Komponente zugesetzt, die durch Zugabe eines meßbaren Substituenten markiert worden war, dessen immunchemische reaktive Eigenschaften
nicht stören. Die Markierung kann aus einem Radioisotop, einem Chromophor, einem Fluorophor oder einem Enzym bestehen.
Die Menge an markiertem Material, das immunchemisch an die feste
Phase gebunden ist, hängt von der Menge der nicht markierten Komponente in der Lösung ab, die um die gleichen Bindungsstellen
konkurriert. Je weniger unbekannter Stoff vorliegt, desto weniger wird die Menge an gebundener markierter Komponente sein.
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_ Q —
282Λ742 C
In der zweiten generellen Methode, die als Sandwich-Methode oder direkte Methode bezeichnet wird, wird die feste Phase, die eine
Menge an immunchemisch gebundener mobiler Komponente aus der
ersten immunchemischen Reaktion enthält, der Wirkung eines Reagens unterworfen, das ebenfalls immunchemisch an die feste
Phase gebunden werden kann, jedoch nur an Stellen, die bereits durch die immunchemis ch gebundene mobile Komponente besetzt
sind. Das Reagens kann markiert sein, beispielsweise wie in der ersten Methode mit einem Radioisotop, einem Pluorophor, einem
Chromophor oder einem Enzym. Die Menge an gebundenem markiertem Reagens ist ein direktes Maß der Menge an mobiler gebundener
Komponente, die ihrerseits ein Maß für die Menge an mobiler Komponente, die ursprünglich im Reaktionsgemisch vorhanden war,
ist.
In den Fällen, in denen die Markierung ein Radioisotop ist, bezeichnet man die Technik,entweder die konkurrierende oder die
nicht konkurrierende ,als radioimmunologische Bestimmung. Wenn die Markierung ein Enzym ist, bezeichnet man die Bestimmung
als enzymgebundene immunologische Bestimmung. Die Menge an
enzyramarkiertem Reagens wird durch irgend eine bequeme Methode zum Messen der Aktivität des bei der Markierung verwendeten
Enzyms gemessen. Andere Arten von Pestphasen-Reaktionen des vorstehend beschriebenen allgemeinen Typs werden durch Beispiele
erläutert. Die immunradiometrische Bestimmung zur quantitativen
Bestimmung eines Antigens wird durchgeführt, indem man zuerst
einen bekannten Überschuß eines markierten Antikörpers mit der unbekannten Menge eines Antigens in einer Homogenphasen-Reaktion
umsetzt. Anschließend wird immobilisiertes Antigen in überschüssiger Menge zugesetzt, um den nxchtumgesetzten löslichen markierten
Antikörper zu binden. Die Menge an unbekanntem Antigen wird dadurch bestimmt, daß man den Unterschied zwischen den gesamten
markierten Antikörpern und der an die Pestphase gebundenen Menge
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bestimmt. Die Methode gibt direkte quantitative Ergebnisse nur mit einem einwertigen Antigen, d.h. einem Antigen, das nur ein
Molekül Antikörper binden kann.
Enzymkatalysierte Reaktionen werden zweckmäßigerweise in Festphasen-Systemen
durchgeführt. Ein an einer Pestphasen-Matrix immobilisiertes Enzym kann dazu verwendet werden, um das Substrat
für das Enzym in einer Probe eines biologischen Materials quantitativ zu bestimmen oder dessen Gegenwart qualitativ festzustellen.
Beispielsweise kann Milchsäure in Serum durch Verwendung einer Matrix gemessen werden, die mit Milehsäure-dehydrogenase
überzogen ist. Gleicherweise kann Harnstoff bestimmt werden unter Verwendung einer festen Zwischenphase, die immobilisierte
Urease trägt. Außer für klinische Anwendungen können Enzymbestimmungen zur überwachung der Qualität bei industriellen Verfahrensstufen
und außerdem zur Durchführung von Verfahrensstufen angewandt werden. Als ein Beispiel für das erstgenannte könnte
immobilisierte Penicillinase bei der Überwachung von Penicillin, das während des Herstellungsverfahrens dieses Arzneimittels
hergestellt wird, verwendet werden. Als ein Beispiel für das letztere könnte immobilisierte Protease oder Nuclease brauchbar
zur Entfernung oder Inaktivierung von verunreinigenden Proteinen oder Nucleinsäuren sein. Die erfindungsgemäßen Einsätze oder
Einlagen lassen sich leicht an jeder gewünschten Stufe der Reaktion entfernen, so daß das Ausmaß der gewünschten Reaktion leicht
gesteuert werden könnte.
Die Gegenwart eines Enzyms von klinischer Bedeutung in einer Probe eines biologischen Materials kann außerdem dadurch bestimmt
werden, daß man ein Substrat für das auf der Pestphasen-Matrix immobilisierte Enzym schafft. Ein Beispiel einer Bestimmung, die
für die Verwendung auf diese Weise angepaßt werden könnte, ist die in der DE-OS 27 47 853 beschriebene Methode. Eine Lysozymbestimmung,
worin radioaktiv markierter Micrococcus lysodeikticus covalent an die Oberfläche einer Pestphasen-Matrix ge-
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bunden ist, veranschaulicht weiter die Verwendung eines immobilisierten
Substrats in einer Enzym-Bestiramungsreaktion.
Weitere Beispiele für brauchbare Festphasen-Reaktionen stellen die spezifischen Bindungsreaktionen gewisser Proteine dar.
Zu diesen gehören beispielsweise ß-Lactoglobulin, das Folsäure
spezifisch bindet, spezifische Rezeptorproteine, die Hormone zu binden vermögen, wie die Rezeptorsubstanz, die aus Rattenbztust-Tumorzellen
rein gewonnen wird, die spezifisch Prolactin binden und die Vielzahl der Pflanzenproteine wie Concanavalin A,
das gewisse Kohlehydrate spezifisch zu binden vermag.
übliche chemische Reagentien können für die Verwendung in Festphasen-Reaktionen
geeignet sein. Festphasen-Reagentien, die in
der Lage sind, gefärbte Komplexe zu bilden wie durch Bildung von Glycosylderivaten oder durch Diazo-Kupplung an das auf der
Oberfläche einer Festphasen-Matrix immobilisierte Reagens, können für die Bestimmung entweder allein oder in Kombination
mit einer enzymkatalysierten Reaktion geeignet sein, um eine Farbänderung auf der Oberfläche der Matrix zu erzeugen. Außerdem,
können Ionenaustauschreaktionen zweckmäßigerweise durchgeführt
werden unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Festphasen-Matrix. Außer den vorstehend genannten gibt es noch viele
weitere Möglichkeiten der Anwendung.
In einer solchen Festphasen-Technologie ist das in dem Verfahren verwendete Reagens oder die Reagentien gewöhnlich dadurch immobilisiert,
daß sie überzogen oder gebunden sind, entweder covalent oder durch Adsorption an das Festphasen-Material, das
dann in die zu testende Probe eingetaucht wird. Die Art der Kupplung solcher Reagentien an das Festphasen-Material ist bekannt
,vg&. beispielsweise US-PSs 3 652 76I, 3 879 262 und
3 896 217.
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Beispiele von üblicherweise verwendeten Pestphasen-Materialien
sind Glas- oder Polymerröhrchen, die mit dem Reagens oder den
Reagentien an der inneren Oberfläche überzogen sind, polymere überzogene Stäbchen, Mikro- und Makrokügelchen, die aus Polymeren
und Glas-und poröser Matrices hergestellt wurden.
Immunchemische Bestimmungen sind höchst wertvoll bei klinischer
Forschung und Diagnose. Sie sind hoch spezifisch aufgrund der hoch selektiven Natur von Antigen-Antikörper-Reaktionen. Die
Antigen-Antikörper-Bindung ist sehr eng, so daß, wenn die Bindungsreaktion
ein mal Gelegenheit hatte zu erfolgen, die Grenze der Bestimmbarkeit durch die Meßbarkeit bestimmt wird, mit der
die Markierung bestimmt werden kann. Immunchemische Bestimmungen
sind außergewöhnlich vielseitig aufgrund der Tatsache, daß sie zur selektiven Messung von spezifischen Substanzen gegen einen
Hintergrundvon chemische ähnlichen Substanzen verwendet werden
können. Wegen dieser wünschenswerten Attribute besteht ein beachtliches Interesse, die Einfachheit der Handhabung, die
Empfindlichkeit, die Genauigkeit, die Geschwindigkeit und die Anwendbarkeit von immunchemischen Bestimmungen zu verbessern.
Die Entwicklung von Pestphasen-Immunbestimmungsmethoden ist
einer der Hauptvorteile auf diesem Gebiet gewesen.
Zu den Vorteilen der Festphasen-Systeme gehört, daß das Reaktionsprodukt oder die Produkte von der Reaktionslösung relativ leicht
abgetrennt werden kann, d.h. durch physikalische Entfernung des Festphasen-Materials. Dies steht im Gegensatz zu einer Nichtfestphasen-
oder homogenen Reaktion, die typischerweise in einer homogenen Lösung resultiert, welche komplexere Trenntechniken
erfordert.
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Die Einführung der Festphasen-Technologie hat den Einsatz neuer Verfahren gestattet, die vorher bei der Anwendung der freien
Lösungs-Technologie außergewöhnlich schwierig waren. Ein Beispiel dafür ist die Sandwich-Bestimmungstechnik, die vorstehend beschrieben
wurde. Um in homogener Lösung durchgeführt zu werden, würde die Sandwich-Technik einen großen Überschuß einer der
Reaktionsteilnehmer erfordern. Was noch wichtiger ist, die Abtrennung
des ersten Antigen-Antikörper-Komplexes von einer Homogenphasen-Lösung erfordert die Anwendung von ausgefallenen
physikalisch-chemischen Techniken, insbesondere wenn das Antigen im Vergleich zum Antikörper relativ klein ist und Molekulargewichtsunterschiede
zwischen freiem Antikörper und komplexem Antikörper gering sind. Im Gegensatz dazu ist das Trennverfahren
in einem Festphasen-System äußerst einfach. Wie nachstehend beschrieben wird, wird einer der Hauptvorteile der Festphasen-Technologie,
nämlich die Leichtigkeit der Trennung von fester und flüssiger Phase,bei der Durchführung der Erfindung maximiert,
wobei extrem einfache Maßnahmen zum Trennen der Phasen geschaffen werden.
Während theoretisch die Festphasen-Technologie zahlreiche Vorteile
gegenüber den freien Lösungs- oder homogenen Systemen bietet, besitzt es gewisse Grenzen aufgrund der bisher verwendeten
Festphasen-Konfigurationen. Beispielsweise ist mindestens eines der Reagentien in einem Festphasen-System wirksam immobilisiert,
indem es an die Oberfläche gebunden ist, während die Reaktionsgeschwindigkeit von Festphasen-Systemen im allgemeinen langsamer
ist als die von homogenen oder freien Lösungs-Systemen. Außerdem kann normalerweise eine maximale Menge an Reagens an die Festphasen-Oberfläche
gebunden werden, wobei diese maximale Menge generellTOn der Oberfläche, der Reinheit des Reagens und dem
spezifischen Verfahren, das zur Bindung des Reagens an die Ober-
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fläche angewandt wird, abhängig ist. Optimalerweise sollte soviel wie möglich von der Oberfläche des festen Materials überzogen
sein, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen und die Reaktionszeit herabzusetzen.
Die frühesten Festphasen-Systerne waren Teströhrchen, die auf der
Innenseite der Oberfläche überzogen waren. Zu den handelsüblichen Beispielen der Technologie der überzogenen Röhrchen gehören
das Immunotub-System, vertrieben durch Smith Kline Instruments
von Sunnyvale, California, und das Rianen-System von New England
Nuclear, North Billerica, Massachusetts, und die in der US-PS 3 867 517 beschriebenen Rohre. Obgleich überzogene Rohrsysteme
sich für immunologische Bestimmungszwecke als geeignet erwiesen,
besitzen sie nicht den vollen Bereich von potentiellen Vorteilen, die durch Festphasensysteme geboten werden. Ein prinzipieller
Nachteil besteht darin, daß das Oberflächen zu Volumen-Verhältnis relativ klein ist und Reaktionskinetiken weiterhin durch die
Tatsache behindert werden, daß die reaktive Oberfläche an der Grenze des Lösungsyölumens sitzt, das relativ weit entfernt vom
Hauptkörper der Lösung sein kann. Somit ist der Durchschnittsabstand zwischen mobilen Reaktionsteilnehmern und der reaktiven
Oberfläche groß. Außerdem muß jedes Testrohr getrennt unter statischen Bedingungen Überzogen sein, woraus unterschiede in
der Menge an aufgebrachtem Überzugsmaterial von Rohr zu Rohr und schließlich in den Bestimmungsergebnissen vorliegen können.
Der so hergestellte überzug kann ungleichmäßig oder sogar diskontinuierlich
sein, so daß einige Bereiche der potentiell reaktiven Oberfläche keinen überzug aufweisen, während andere
für eine optimale Reaktivität zu stark überzogen sein können. In jedem Falle ist die Menge an Oberfläche, die tatsächlich für
die Reaktion mit der mobilen Komponente verfügbar ist, verringert,
und zwar auf eine nicht gleichmäßige Weise, wodurch Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit verloren geht. Die absatzweise Methode
des Überziehens der Rohre ist außerdem relativ teuer. Reaktionen,
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die in überzogenen Rohren durchgeführt werden, unterliegen Fehlern, die durch Konvektion in der Reaktionsflüssigkeit verursacht
werden. Ergebnisse, die um das lOfache schwanken, können durch Konvektion in diesen Systemen verursacht werden.
Versuche, die Eigenschaften von überzogenen Rohren zu verbessern, haben zu einer Vielzahl von Systemen ge führt, die dazu geschaffen
wurden, um das Oberflächen zu Volumen-Verhältnis des Festphasen-Systems zu erhöhen. Zu diesen Methoden gehören die
Schaffung von hochspiralförmigen Oberflächen, wodurch das Volumen der erforderlichen Flüssigkeit reduziert wird, und die
Schaffung von Oberflächen aus feinteiligem Material.
Das SPAC-System der Mallinkrodt Chemical Company ist grundsätzlich
ein überzogenes Rohr-System, das die Strategie der Schaffung einer spiralförmigen Oberfläche veranschaulicht, um den Oberflächenbereich
im überzogenen Rohr zu erhöhen. Außerdem sind die Rohre mit einem abnehmbaren niederen Abschnitt ausgestattet,
der absatzweise überzogen werden kann, um von Rohr zu Rohr größere Gleichmäßigkeit zu erzielen.
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Eine Folge der absatzweisen Immobilisierung auf überzogenen
Röhrchenböden besteht darin, daß sowohl die Außenseite als auch die Innenseite der Röhrchen überzogen werden. Dies erschwert
dem Labortechniker, mit den Röhrchen zu arbeiten.ohne mit dem
an seiner Oberfläche überzogenen Material in Berührung zu kommen, wobei wertvolle immunologische Reaktionsteilnehmer verloren gehen.
Die spiralenförmige Oberfläche kann die Menge an verfügbarer reaktiver Oberfläche drei- bis viermal vergrößern. Jedoch
bleibt die reaktisre Oberfläche an der Peripherie der Lösung. Dies kann eine suboptimale Geometrie sein vom Standpunkt des
Durchschnittsdiffusionsabstandes von der Lösung zur reaktiven Oberfläche. Aufgrund der Komplexizität der Oberfläche können
Schwierigkeiten beim Freiwaschen der Oberfläche von verunreinigenden Substanzen auftreten. Wie die überzogenen Röhrchensysterae
im allgemeinen kann das SPAC -System ziemlich empfindlich gegenüber Konvektionsströmen sein, was große Fehler zur Folge
hat, wie vorstehend beschrieben. Konvektion kann vermindert werden, wenn man die Reaktion in einem konstanten Temperatur—
bad durchführt. Jedoch fordert dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für das klinische Laboratorium. Zum Messen von
Haptenantigenen ist das System außerdem nicht optimal, wenn die Reaktion gemäß den Empfehlungen des Herstellers bei 37°C durchgeführt
wird. Es erwies sich, daß die Erhöhung der Temperatur gewisser Antikörper-Hapten-Reaktionen die Dissoziationsgeschwindigkeit
des Antikörper-Hapten-Komplexes, bezogen auf seine Bildungsgeschwindigkeit, erhöhen kann, vgl. Smith, T.W. und
Skubitz, K.M., Biochemistry 14, 1496 (1975) und Keave,. P.M.,
Walker, W.H.C, Gauldie, J*. and Abraham, G.E., Clin.Chem. 22,
70 (1976).
Es wurden verschiedene Typen von Festphasen-Matrices beschrieben,
die sich zur Einführung in die Reaktionsflüssigkeit eignen.
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Ein Beispiel einer spiralförmigen oder schwammartigen Matrix, die sich dafür eignet, in die Testlösung eingeführt zu werden,
ist die in der US-PS 3 951 7^8 beschriebene. Dieses Material bietet
relativ große Oberflächen, jedoch kann es schwierig sein, dasselbe sorgfältig zu waschen oder abtropfen zu lassen.bei Beendigung
der Reaktion. Außerdem können derartige Systeme in der Praxis auf die Verwendung von Reaktionsteilnehmern und Reagentien beschränkt
sein, die leicht von der schwammartigen Matrix zu eluieren
sind. Was noch bedeutender ist, die schwammartigen Matrices
können extensiv mit nur einem Teil der Reaktionsflüssigkeit
reagieren, d.h. dem Teil, der tatsächlich die Poren der Matrix durchdringt.
Ein zweiter Typ eines Einsatzes, der sich die Strategie zunutzemacht,
die Reaktionsflüssigkeit zu zwingen, sich in einer Dünnschicht über der überzogenen Matrixober fläche auszubreiten, "■*
wird in der US-PS 3 826 619 und 3 464 798 beschrieben. Beide
Fälle beschreiben eine Kombination aus einem Behälter und einer festsitzenden Einsatzmatrix, die so geformt sind, daß
die Reaktionsflüssigkeit in eine Dünnschicht zwischen den Behälterwänden und der Matrixoberfläche ausgequetscht wird. Die Einsatzmatrix
muß in Behälter mit einer festen Toleranz sitzen und das Volumen der Reaktionsflüssigkeit muß sorgfältig kontrolliert
werden, da Abweichungen die Reproduzierbarkeit der Bestimmung nachteilig beeinträchtigen können. Die Apparatur der US-PS
3 826 619 eignet sich für die Verwendung in einem direkten immunchemischen Test, der nur qualitativ ist. Da die Reaktionslösung in einen Dünnfilm durch den Einsatz geärückt wird, muß
das Reaktionsvolumen zwangsläufig gering sein und die US-PS 3 826 619 beschreibt tatsächlich, daß diese Art der Bestimmung
für geringe Mengen an unverdünntem Serum geeignet ist. Einer der Nachteile dieser Art von Bestimmung besteht darin, daß
Fehler in der Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktionen durch Veränderungen des pH-Wertes( der in klinischen Proben
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zwischen pH 6 und pH 9 liegen kann, des unverdünnten Serums verursacht werden können. Der pH-Wert kann durch Zugabe eines
Puffers gesteuert werden, jedoch Puffersalzkonzentrationen von über 0,1 Mol können die Antigen-Antikörper-Komplexe trennen.
Deshalb muß ein überschüssiges Volumen an einem Puffer mit einer geringen Ionenstärke verwendet werden, um den pH-Wert genau zu
steuern,und dies kann das Reaktionsvolumen auf eine unannehmbare Menge vergrößern. Fehler aufgrund des pH-Wertes können in
qualitativen Bestimmungen wie sie durch die US-PS 3 826 619 beschrieben werden, insbesondere in Proben, die relativ reich
an unbekannten Konzentrationen sind, toleriert werden, jedoch nicht in quantitativen Bestimmungen, für die die vorliegende
Erfindung gedacht ist. Wo Verdünnung durch Puffer erforderlich ist, kann eine niedrige Konzentration der unbekannten Komponente
unter den Bestimmungsspiegel verdünnt sein und zu falsch — negativen
Ergebnissen mit der in der US-PS 3 826 619 oder US-PS 3 464 798 beschriebenen Vorrichtung führen. Eine Ausführungsform
des in der US-PS 3 826 619 beschriebenen Einsatzes ist ein Flügeleinsatz, der gewisse Ähnlichkeit mit dem vierflügeligen
Stäbchen der vorliegenden Erfindung hat. Seine Verwendung ist für qualitative Analysen beschrieben, wo größere
Mengen an Serum verfügbar sind, jedoch ist dort kein Hinweis auf irgendeine andere Art der Handhabung der DünnfiImmethode,
die mit der runden oder konischen Version verwendet wird. Die in der US-PS 3 826 619 beschriebene Vorrichtung wurde soweit
bekannt handelsmäßig nicht vertrieben.
Eine dritte Art von Festphasen-Einsatzmatrix ist die StiQ" Bestimmung
der international Diagnostic Technology Corporation, Santa Clara, California, die dazu bestimmt ist, eine in der US-PS
4 020 151 beschriebene Festphasen-Bestimmung durchzuführen.
In diesem System ist eine scheibenförmige nichtüberzogene Einsatzmatrix aus eine» Material vorgesehen, das Proteine von Serum zu
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adsorbieren vermag. Dieses System ist nicht nur aufgrund des Oberflächen:Volumen-Verhältnisses oder geometrischer Überlegungen
begrenzt, sondern in der Hauptsache aufgrund von Problemen, die mit der anfänglichen Adsorptionsstufe verbunden sind, wie die
Gegenwart von störenden Substanzen und die Schwierigkeit, in der niedrigen Konzentration meßbare Adsorptionskcrrponenten zu erzielen.
Ein anderes Beispiel eines Versuchs, das Verhältnis von Oberfläche
zu Volumen durch die Reduzierung des Reaktionsvolumens zu verbessern, wird von Friedel, R. und Dwenger, A., Clin.Chem.
21, 967 (1975) beschrieben. In diesem System sind kapillarförmige
Röhrchen auf der Innenseite mit einem spezifischen Adsorbans überzogen,und das Reaktionsgemisch wird in den Hohlraum
des kapillarföriTiigen Röhrchens eingeführt.
Ein System, das eine große Oberfläche für das Gesamtvolumen bietet, ist das überzogene Mikroglaskügelchen-Fystem, wie beispielsweise
das Immo Phase -System von Corning Glass Works. Dieses System verkörpert die Verwendung von feinteiligen Teilchen.
Es liefert eine große überzogene Oberfläche mit einer entsprechend hohen Reaktionsgeschwindigkeit. Aufgrund des Absetzens
der Teilchen während der Reaktion erfordert die Optimierung dieser Art Testsystem,daß die Teströhrchen, in die sie
getan werden, während der Reaktion verschlossen sind und während der Reaktion vertikal gemischt werden, um sicherzustellen, daß
die gesamte Oberfläche in Kontakt mit den Reaktionsteilnehmern
kommt. Außerdem macht die Verwendung von Teilchen eine mehrfache Zentrifugierung und das Waschen erforderlich, um das immobilisierte
Produkt von den Reaktionsteilnehmern in der Lösung vollständig zu trennen. Glasteilchenoberflächen besitzen den weiteren
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Nachteil, daß gegenüber Glas eine größere nicht spezifische Proteinbindung besteht als gegenüber Plastik.
Frühere Versuche, überzogene Röhrchen als eine Peststoff-Reaktionsmatrix
zu verbessern, resultierten allgemein in einer gewissen Verbesserung der Reaktionsgeschwindigkeit oder der
Zeit, die zum Durchführen einer meßbaren Reaktion erforderlich ist. Derartige Verbesserungen wurden im allgemeinen erzielt
durch ein gleichzeitiges Anwachsen der HandhabungsSchwierigkeiten
oder durch den Verlust an Flexibilität. Die vorliegende Erfindung liefert beides, und zwar sowohl ein verbessertes Verhältnis
von Oberfläche zu Volumen und verbesserte Reaktionskinetiken sowie verbesserte Vielseitigkeit und Leichtigkeit der Handhabung.
Ein anderes Patent, obgleich es keine Pestphasen-Matrix verwendet,,
ist die US-PS 3 206 602.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchführen einer chemischen, enzymatisehen oder immunchemischen Reaktion, worin
einer oder mehrere der Reaktionsteilnehmer, jeder als fixierte Komponente bezeichnet, an eine Festphasen-Oberfläche gebunden
sind und ein oder mehrere andere Reaktionsteilnehmer, jeder als
mobile Komponente bezeichnet, frei diffusionsfähig in einem
flüssigen Medium sind^worin die feste Phase eingetaucht ist.
Insbesondere ist ein fixierter Reaktionsteilnehmer an eine einheitliche Matrix gebunden, die in die Flüssigkeit eingetaucht
werden kann. Die Form der Matrix ist so konstruiert, daß für die Reaktion ein großes Oberflächen zu Volumen-Verhältnis
sowie ein kürzerer Übergangsabstand für die mobilen Reaktionsteilnehmer aus der Lösung zur Oberfläche der festen Phase geschaffen
werden und sie frei bei der Entfernung aus der Reaktionsflüssigkeit abtropfen kann.
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- "21 -
Zu den Vorteilen der Erfindung gehören der Wegfall von Zeitnaiuaefehlern
beim Starten und beim Stoppen der Reaktionen, hohe Reaktionsgeschwindigkeiten, Verringerung von volumetrischen
Übergangsfehlern, verringerte Fehler beim Messen bei einem
gegebenenen Empfindlichkeitsspiegel und Leichtigkeit der Handhabung. Die hohe Reaktionsgeschwindigkeit mit den bevorzugten
Ausführungsformen gestattet,immunchemische Bestimmungen bei
Raumtemperatur oder darunter durchzuführen, was gegenüber höheren Reaktionstemperaturen vorteilhaft sein kann, die ein Gleichgewicht
schaffen. Von der Vorrichtung ist zu erwarten, daß sie leicht zu handhaben ist mit ständiger Wirtschaftlichkeit und
Gleichmäßigkeit des Produktes. Eine große Vielzahl von Matrices kann gemäß den vorliegenden Prinzipien und Lehren verwendet werden.
Das wesentliche Merkmal der Matrix ist ein Griffteil und eine Vielzahl von daran befestigten im wesentlichen glatten planen
oder kurvigen Oberflächen, die bezüglich der Reaktionsflüssigkeit so angeordnet und geformt sind und derartige Abmessungen
besitzen, daß das Einsetzen der Matrix darin den durchschnittlichen Diffusionsabstand der Moleküle der mobilen Komponente
zur Matrixeberfläche im Vergleich zu ihrem Durchschnittsdiffusionsabstand
zu den inneren Oberflächen des Reaktionsgefäßes, wenn keine Matrix vorhanden ist, reduziert. Die tatsächliche
Form einer gegebenen Matrix der Erfindung kann,jedoch muß nicht,
gemäß der Größe und der Form des Reaktinnsgefäßes gestaltet sein,
in das sie hinein getan wird. Außerdem ist keine enge Toleranz oder enger Sitz innerhalb des Reaktionsgefäßes erforderlich.
Außerdem muß die Matrix sich im wesentlichen durch die Tiefe der Flüssigkeitsprobe erstrecken. In einigen Systemen erstrecken
sich die Matrixoberflächen vorzugsweise über die Oberfläche der Reaktionsflüssigkeit£ wobei sie eine im wesentlichen konstante
geometrische Beziehung durch die Tiefe der Reaktionsflüssigkeit erzeugen und außerdem dafür sorgen, daß die gleiche geometrische
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-ye.
Beziehung erfolgt, unabhängig von irgendwelchen Veränderungen im Flüssigkeitsvolumen. Vorrichtungen der bevorzugten Ausführungsform einer gegebenen Größe sind beispielsweise ebenfalls für
Bestimmungen geeignet, worin das Reaktionsvolvrren um das
Dreifache differiert.
Eine alternative Ausführungsform betrifft eine Festphasen-Matrix
Tür Verwendung in chemischen, enzymatischen und immunchemischen
Bes^iinmungsmethoden, die eine spezielle Verwendung im Zusammenhang
mit automatischer. Pipettierungseinrichtungen findet. Die
Matrix kann außerdem für übliche mit Hand durchgeführte Einzelanalysen
Anwendung finden. Die Matrix hat eine geschlossene Trägeroberflache, die ein schachtartiges Volumen bildet, worin
eine Flüssigkeitsprobe abgelegt werden kann, wenn die Matrix
in einen Flüssigkeitsbehälter hineingegeben wird wie in ein Testr-chrchen.
Eine Vielzahl von naoh innen sich erstreckenden Teilen wird vorzugsweise als ein einheitlicher Teil der Innenseite der
geschlossenen Trägeroberfläche gebildet. Der innerste Abschnitt der sich erstreckenden Teile bildet ein zentral angeordnetes
zylindrisches Volumen, in das eine automatische Pipettierungsvorrichtung hineingegeben werden kann, um Flüssigkeitsproben anzusaugen
und abzugeben.
Die Verwendung der Flügelstabgeometrie hat in einigen Fällen eine unerwartete und zur Zeit unerklärte Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit
über diejenige zur Folge, die auf der Basis der Oberfläche bestimmt wurde. Aufgrund der Entdeckung, daß geometrische
Faktoren dip Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen,
war es wichtig, eine gleichmäßige Festphasen-Geometrie von einer Probe zur anderen zu schaffen, um gleichmäßige Ergebnisse zu
erzielen. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen schaffen eine
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solche Gleichmäßigkeit und tragen ferner dazu bei, menschliche
und mechanische Fehler wie Veränderung der Rührgeschwindigkeit, Zeitfehler oder Konvektion auszuschalten-
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Pestphasen-Reaktion
ausgeführt, indem man eine oder mehrere Reaktionskomponenten verwendet, die fest an die Oberfläche der in die Reaktionsflüssigkeit
eingetauchten Matrix gebunden sind. Zur Erläuterung werden Reaktionen, die in Teströhrchen durchgeführt werden, beschriebeny
und Matrices, die so beschaffen sind, daß sie in die Teströhrchen hineingegeben werden können, werden abgehandelt. Die Reaktion
wird leicht eingeleitet, indem man die Matrix in das Röhrchen tut, das die mobile Komponente enthält,und kann durch Entfernung
des Einsatzes beendet werden. Gegebenenfalls kann die Reaktion wieder eingeleitet werden, indem man die Matrix einfach wieder
hineingibt.oder eine zweite Reaktion kann eingeleitet werden,
indem man eine neue Matrix, die eine zweite fixierte Komponente trägt, hineingibt. Die Matrix kann gegebenenfalls in ein zweites,
das Reagens enthaltende Röhrchen hineingegeben werden oder direkt in eine radioaktive Zählkammer oder andere Heßvorrichtungen
je nach Art der Bestimmungsmethode übergeführt werden.
Die Pestphasen-Reaktionskinetiken sind komplexer als für Homogenphasen-Reaktionen. Eine ins Einzelne gehende theoretische
Basis zum Optimieren von Einsatzformen ist nicht verfügbar. Jedoch können gewisse allgemeine Grunderwägungen berücksichtigt werden.
Die Gesamtoberfläche in Kontakt mit der Lösung ist ein wichtiger Faktor. Je größer die Oberfläche ist, desto größer ist die
Menge an fixierter Komponente, die in der Reaktion vorliegen kann. Die Erhöhung der effektiven Konzentration jeder der Komponenten
erhöht im allgemeinen die Gesamtreaktionsgeschwindigkeit.
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Da die Menge an fixierter Komponente unter anderem durch die Oberfläche der Festphase bestimmt wird, sollte die Reaktionsgeschwindigkeit
sich direkt mit dem Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ändern. Ein vergrößertes Verhältnis von Oberfläche zu
Volumen wird erfindungsgemäß dadurch erzielt, daß man einen Einsatz
schafft, der eine vergrößerte Oberfläche im Verhältnis zu derjenigen, die auf der inneren Oberfläche des Teströhrchens verfügbar
ist, aufweist. Ein zweiter, wahrscheinlich die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussender Paktor ist der durchschnittliche
Diffusionsabstand zwischen den mobilen und den stationären bzw. fixierten Reaktionsteilnehmern. Unter dem Ausdruck "durchschnittlicher
Diffusionsabstand" versteht man die Summe der
Abstände, die jedes der Moleküle der mobilen Komponente diffundieren muß, durch den kürzestmöglichen Weg, um eine fixierte
Komponente zu erreichen, geteilt durch die Gesamtanzahl derartiger Moleküle. Die erfindungsgemäßen Matrices sind so beschaffen,
daß sie weitestgehend den Durchschnittsdiffusionsabstand
der Mobilphasen-Moleküle zu der an den Oberflächenelementen der Matrix haftenden Komponente gegenüber dem Durchschnittsdiffusionsabstand
derartiger Moleküle zu einer fixierten Komponente, die auf den inneren Oberflächen des Reaktionsgefäßes
festgehalten werden, wenn Keine Matrix vorhanden ist, reduziert. Der übergang der mobilen Reaktionsteilnehmer zur reaktiven
Oberfläche wird durch Verringerung des Durchschnittsabstands zwischen den mobilen Reaktionsteilnehmern und den reaktiven
Oberflächen erleichtert. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Einsätze wurden erhöhte Reaktionsgeschwindigkeiten beobachtet,
wie im einzelnen in den Beispielen beschrieben wird.
Unerwarteterweise wurde in einer Anzahl von Fällen beobachtet, daß die beobachtete Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit größer
war als auf der Basis des erhöhten Verhältnisses von Oberfläche zu
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Volumen erwartet worden war. Gleichermaßen scheinen Reaktionen das Gleichgewicht bei Verwendung der Flügelstab-Matrices schneller
zu erreichen als bei der Verwendung eines überzogenen Röhrchens. Obgleich diese Erscheinung nicht besonders gut gekennzeichnet oder
quantitativ bestimmt worden sind, scheinen sie häufiger und leichter beobachtet zu werden bei der Verwendung von Flügelstäben
mit einer größeren Anzahl an Flügeln.
Obgleich nicht ständig beobachtet, tritt das Phenomen der erhöhten
Reaktionsgeschwindigkeit und schnelleren Erzielung des Gleichgewichtes mit ausreichender Häufigkeit auf, um die Vermutung zu
stützen, daß geometrische Faktoren der Matrixkonfiguration,bei
denen es sich nicht um die Oberfläche als solche handelt, die Festphasen-Reaktionsgeschwindigkeiten bedeutend beeinflussen
können. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices schafft
somit vorteilhafte Reaktionsgeschwindigkeit für Festphasen-Reaktionen im allgemeinen. Praktische Erwägungen diktieren eine
Obergrenze der einzelnen Elemente wie beispielsweise Flügel, die an dem Griff des Stabes befestigt werden können. Beispielsweise
sollten die Elemente nicht zu eng beieinander sein,oder irgendwelche
anderen Kapillarkräfte verursachen die Retention des Reaktionsgemischs zwischen den Elementen, die das Waschen oder
selbst einfaches Abtropfen schwierig machen. Außerdem kann, wenn ein Flügelstab durch Gießen herzustellen ist, die
Anzahl an Flügeln durch die Möglichkeit, eine Form mit der gewünschten Anzahl an Flügeln herzustellen, begrenzt sein. Die
obere Grenze, die durch derartige Überlegungen gegeben ist, hängt von der Größe des Stabes und dem Zweck ab, für den er
verwendet »erden soll. Für Stäbe, die für Reaktionsvolumen in der Größenordnung von etwa 1 ml verwendet werden sollen, ist die
bevorzugte Anzahl an Flügeln mindestens 8. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform werden 18 Flügel, die radial um einen
zentralen Griff angeordnet sind, verwendet.
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Zusätzliche Vorteile werden durch die vorliegende Erfindung gegeben.
Eine vergrößerte Gesamtoberfläche macht es möglich,
quantitative Bestimmungen über einen weiteren Bereich von mobilen Reaktionskonzentrationen durchzuführen aufgrund der erhöhten
Feststellbarkeit am niedrigen Ende des Konzentrationsbereichs und erhöhter Bindungskapazität dahingehend, daß die proportional
aufgeteilte Reaktion bei höheren Konzentrationen des mobilen Reaktionsteilnehmers möglich ist. Außerdem können die erfindungsgemäßen
Matrices zur Durchführung von quantitativen Direktoder Sandwich-Bestimmungen verwendet werden. Für diese Anmeldung
ist die erhöhte Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Matrices
erforderlich, um die Materialien über den gesamten Bereich der potentiellen Konzentrationen zu immobilisieren und nicht nur
einen einfachen "Ja-Nein"-Test zu erzielen, vgl. US-PS 3 826 619. Für immunologische Bestimmungen vom Sandwich-Typ ist der
Bereich an Antigen-Konzentrationen, der unter Verwendung der ^
bevorzugten Ausführungsform der Erfindung quantitativ gemessen
werden kann, sehr groß, wie in Beispiel 7 veranschaulicht wird. Für konkurrierende immunologische Bestimmungen wird der anwendbare
Bereich der Bestimmung durch <~-:r.* komplexe Wirkung bestimmt,
wozu die Geometrie der Matrix, die Kenge und die Verteilung von
auf der Matrixoberfläche immobilisiertem Antikörper und die Methode der Immobilisierung gehören. Die Anzahl, der Sitz, die
Größe und die Form der Matrixoberflächenelemente beeinflussen die Kinetiken der immunchemischen Reaktion, die ihrerseits die
Menge an immobilisierter Komponente beeinflußt, die erforderlich ist, um eine unterschiedliche Reaktion mit der zu messenden Menge
an mobiler Komponente zu schaffen. Außerdem sind die Stabilität der gebundenen Komponente und die Gleichmäßigkeit ihrer Verteilung
Parameter, die die Beschaffenheit der überzogenen Matrix beeinflussen.
Vorteilhafte Ergebnisse werden bei der Verwendung der erfindungsgemäßen überzogenen Matrices in einer konkurrierenden
immunologischen Bestimmung erzielt, indem man die Steuerung
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aller bedeutenden, die Empfindlichkeit, die Geschwindigkeit und
die Reproduzierbarkeit beeinflussenden Paktoren gestattet. Außerdem verwendet das erfindungsgemäße Verfahren ein Reaktionsvolumen, das groß genug ist, um zu gestatten, daß eine Serumprobe
mit einem Puffer verdünnt wird, um den pH-Wert zu steuern und um Fehler zu reduzieren, die aufgrund der Veränderung des
pH-Wertes in der Probe auftreten,oder andere Faktoren wie
Proteinkonzentration undjfalls erforderlich«von Probe zu Probe
ein konstantes Volumen zu schaffen. Erfindungsgeinäße Vorrichtungen
sind nicht für die Verwendung mit einem einzigen definierten Reaktionsvolumen begrenzt, da sie in das Reaktionsgefaß nicht
innerhalb einer engen Tolerenz hineinpassen müssen. Es ist keine besondere Größe oder Form des Reaktionsgefäßes erforderlich.
Die erfindungsgemäße Matrix muß nicht eng in das Reaktionsgefäß
hineinpassen oder sogar dessen Wände berühren. Die Matrixelemente mit glatten planen oder kurvigen Oberflächen sollten gleichmäßig
innerhalb der Tiefe der Reaktionsflüssigkeit verteilt sein und
in einigen Systemen vorzugsweise sich über diese Oberfläche erstrecken, um eine im wesentlichen gleichmäßige geometrische
Beziehung zwischen Mobilkomponentenmolekülen und der Matrixoberflächen
über einen weiten Bereich der Reaktionsflussigkeitsvolumen
zu schaffen.
Sowohl in immunchemischen konkurrierenden als auch Sandwich-Bestimmungen
hängt die zur Durchführung dieser Bestimmung erforderliche Zeit von der Geschwindigkeit ab, mit der die Reaktion
ihr Gleichgewicht erreicht. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführte Reaktionen erreichen das Gleichgewicht schneller
als übliche Bestimmungsmethoden mit überzogenen Röhrchen und können deshalb in kürzerer Zeit durchgeführt werden. Außerdem
schafft die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrix sehr wirksame
und genaue Mittel zum Starten und Stoppen der Reaktionen. Dieser Vorteil wird bedeutend, wenn es erforderlich ist, eine Vielzahl
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an Bestimmungen gleichzeitig durchzuführen. In diesen Fällen wird die für die Handhabung des Startens und Stoppens der Reaktion
erforderliche Zeit auf ein Minimum reduziert und kann für alle Proben in der Reihe präziser gesteuert werden. Dieses Merkmal
ist besonders vorteilhaft im Vergleich mit überzogenen Röhrchen, die dekantiert werden müssen, Schwämme, die ausgedrückt oder
massiert werden müssen, um die letzten Spuren des Reaktionsgemischs zu entfernen, und insbesondere zu Materialien, die zentrifugiert
und dekantiert werden müssen.
Ein weiterer Vorteil,der sich aus der erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit
und erhöhten Kapazität der erfindungsgemäßen Matrices ergibt, besteht darin, daß die gleiche Vorrichtung sowohl für
Sandwich- als auch konkurrierende Bestimmungen verwendet werden kann. Bei der Verwendung in einer quantitativen konkurrierenden
Bestimmung schafft die Vorrichtung einen weiten Bereich an proportional aufgeteilten Reaktionen wie vorstehend beschrieben
und in den Beispielen veranscrt-ulicht wird.
Weitere Verteile resultieren uus der geometrischen Konfiguration
der im erfindungsgemäßen Verfenr.^n verwendeten Vorrichtungen.
Wie vorstehend ausgeführt, resultiert die Verwendung der Vorrichtungen
in einer sichtbaren Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit,
für die nicht die vergrößerte Oberfläche als solche verantwortlich ist. Zwar gibt es für diese Erscheinung im Augenblick
keine Erklärung, jedoch wird vermutet, daß die Schaffung einer Reihe von planen oder kurvigen Oberflächen, die sich durch die
Tiefe der flüssigen Probe erstrecken, den Durchschnittsabstand zwischen mobilen Reaktionsteilnehmern und der auf jeder Oberfläche
verteilten fixierten Komponente reduziert und daß eine solche Reduktion in einer sehnelleren Gesamtreaktionsgeschwindigkeit
resultiert. Außer den schnelleren Reaktionsgeschwindigkeiten
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und den sich daraus ergebenden Vorteilen liefern die beschriebenen
Vorrichtungen gleichmäßigere Ergebnisse. Die geometrische Beziehung zwischen den mobilen und den fixierten Reaktionsteilnehmern
ist konstant und von Versuch zu Versuch reproduzierbar im Gegensatz zu bestimmten Festphasen-Systeinen, worin die
Teilchen die Tendenz besitzen, sich mit einer Geschwindigkeit abzusetzen, die von der Teilchengröße und der Teilchengrößenverteilung
abhängt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist weniger empfindlich
gegenüber Fehlern aufgrund von Konvektion, was eine wesentliche Schwierigkeit ist, die mit der Verwendung von überzogenen
Röhrchen verbunden ist. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen sind mit im wesentlichen glatten Oberflächen ausgestattet,
um ein schnelles Abtropfen des Reaktionsgemische zu gestatten, wenn die Matrix aus der Lösung entfernt wird. Durch
dieses Merkmal können die Reaktionen schnell beendigt werden, die Waschstufen vereinfacht oder weggelassen werden, und es werden
potentielle Verunreinigungsgefahren bei der Verwendung von Radioisotopen reduziert. Viele Quellen von potentiellen menschlichen
Fehlern fallen hierbei weg. Vorzugsweise verwendet man Stauchen mit maximaler Oberflächenglätte, die durch ein Verfornungsverfahren
hergestellt wurden, worin die Formoberflächen su Spiegelglatte poliert worden sind. Maximale Oberflächenglätte
kann durch Herstellung der Matrix ausgegossenem Kunststoff
u.:r;er Verwendung einer Form mit zu Spiegelglätte polierten Oberflächen
erzielt werden« Dieser aus der Verwendung von maximal Slat';an Oberflächen sich ergebende Vorteil mag im Gegensatz zu
«lan Irwartnngen stehen^ da die rauheren Oberflächen einen größeren
Oberflächenbereich liefern. Jedoch werden solche maximal glatten
Oberflächen in einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung
verwendet, um die Entfernung der Reaktionsflüssigkeitskompcnenten
von den Matrixoberflächen zu maximieren und niehtspesifische
Hintergrundsstörungen auf ein Minimum herabzusetzen.
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- 50 -■
Aus vorstehendem ist ersichtlich, daß die Gestaltung einer richtij
funktionierenden Matrix in jeder Richtung Aufmerksamkeit erfordert
und daß Abweichungen die durchzuführende Reaktion beeinflussen. Außer der Schaffung einer strukturellen Basis für
erhöhte Reaktionsgeschwindigkeiten, einfache Handhabung» auf ein Mindestmaß herabgesetzte Hintergrund3störung und aller
anderen erfindungsgemäßen Vorteile ist es wichtig, eine überzogen«
Oberfläche zu schaffen, auf der die immobilisierten Reaktionsteilnehmer so verteilt sind, daß deren Reaktivität maximal ist.
Die immobilisierte Komponente sollte so gleichmäßig wie möglich auf der Oberfläche verteilt sein. Hohlräume im überzug, die
beispielsweise durch eine Luftblase auf der Matrixoberfläche während der Überzugsstufe verursacht werden könnten, müssen vermieden
werden. Die Moleküle des immobilisierten Reaktionsteilnehmers
müssen auf der Matrixoberfläche frei liegen und dürfen nicht durch überschüssige Reaktionsteilnehmer oder anderes
Trägermaterial begraben sein. Vorzugsweise sollte der immobilisierte Reaktionsteilnehmer so fest an die Matrix gebunden sein,
daß keine wesentliche Menge an Reaktionsteilnehmer desorbiert oder auf andere Weise während der Inkubations- und Waschstufe
der Reaktion entfernt wird.
Ausführungsformen mit einer Vielzahl an einzelnen herausragenden Oberflächen wie Flügel oder Stäbe sind brauchbare Methoden zur
Durchführung verschiedener Tests auf einmal, indem man einzelne Flügel oder Stäbe schafft mit unterschiedlichen, darauf immobilisierten
Materialien. Die in Figur 3 gezeigte Konfiguration au3 einem Bündel von Stäben ist besonders für derartige Techniken
geeignet. Die Stäbe können so gefertigt seih, daß sie einzeln anzubringen und abzunehmen sind, so daß jede Kombination an für
diesen Zweck geexgneten Bestxmmungen in einer einzelnen Reaktionsstufe durchgeführt werden kann und die Ergebnisse nicht einzeln
gemessen werden müssen.
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-U-
Außer den vorstehend genannten Vorteilen des Einsatz-Matrixsystems
in quantitativen Analysen besteht ein Produktionsvoi-teil
von wirtschaftlicher Bedeutung. Insbesondere können die Techniken zum Immobilisieren der fixierten Komponente so gestaltet sein,
daß sie auf eine große Vielzahl an Matrices zur gleichen Zeit angewandt werden können, entweder in einem diskontinuierlichen
oder kontinuierlichen Herstellungsverfahren. Die sich daraus ergebende Wirtschaftlichkeit des im Großen herzustellenden
Produktes mit erhöhter Gleichmäßigkeit bedeuten einen klaren Vorteil.
Eine Ausführungsform der Pestphasen-Matrix, die sich für die Verwendung
mit einer automatischen Pipettierungsapparatur eignet, kann nach den Prinzipien der vorliegenden Erfindung konstruiert
werden. Eine sobhe Matrix hat kein Griffteil und hat anstelle
dessen eine Trägeroberfläche, die ein zylindrisches schachtartiges Volumen bildet, das mit einer Flüssigkeitsprobe gefüllt
wird, wenn die Matrix in ein Testrohr getan wird. Eine Vielzahl an radial nach innen ragenden Teilen haben ihr äußeres Ende
mit der Innenfläche der Trägeroberfläche verbunden. Die sich erstreckenden Teile und die Trägeroberfläche werden vorzugsweise
durch Gießen oder Extrudieren als eine einheitliche Struktur oder alternativerweise als einzelne Stücke hergestellt, die durch
geeignete Verbindungstechniken wie Nut und Feder oder einen Klebstoff miteinander verbunden werden. Die inneren Ende der
s ich erstreckenden Teile bilden ein zentral angeordnetes zylindrisches Volumen, das einen schnellen Zutritt und Austritt
einer Sonde einer automatischen Pipettierungsapparatur in den Boden des die Matrix enthaltenden Testrohres gestatten. Die
radial sich erstreckenden Oberflächen sind in Ebenen angeordnet, die die zentrale Achse des zentral angeordneten zylindrischen
Volumens schneiden. Je größer die Anzahl der sich erstreckenden Teile ist, desto größer ist die reakti. ve Oberfläche und desto
KJ
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schneller die Reaktionszeit innerhalb der praktischen Grenzenf
wie vorstehend diskutiert für die Flügel-Stab-Ausführungsform.
Alternativerweise kann die Matrix ein geschlossenes Ende haben unter Bildung eines Rohres mit nach innen sich erstreckenden
Oberflächen, deren freie Enden ein zentrales Volumen bilden, in das eine Pipette eingesetzt werden kann.
Die erfindungsgemäßen Matrices können außerdem Anwendung finden
in industriellen Labors für Qualitätskontrolle für chemische oder enzymkatalysierte Routinereaktionen, die in einem Festphasen-System
durchgeführt werden können. Außerdem können die Vorrichtungen für kontinuierliche oder nichtkontinuierliche Produktionsverfahren
verwendet werden, worin es erwünscht ist, eine bestimmte Substanz vom Reakticnsgemisch zu entfernen.
Beispielsweise können Matrices, die mit Ionenaustauschharz überzogen sind, zur Entfernung bestimmter Ionen von der Lösung
verwendet werden. Bestimmte auf den erfindungsgemäßen Matrices immobilisierte spezifisch adsorbierende Proteine können zur
Entfernung von Verunreinigungen wie Spurenmetalle aus dem Produktionsstrom verwendet werden, übliche Katalysatoren können
zum überziehen der Oberflächen der beschriebenen Einsatz-Matrices verwendet werden für kontinuierliche Umwandlung von
Reaktionsteilnehmern, Behandlung von ausfließenden Stoffen u.a.. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können, wenn sie so angepaßt
sind, daß sie in die entsprechende Größe des Reaktionsgefäßes
passen, für großindustrielle als auch LabOratoriumsverfahren
verwendet werden. Festphasen-Reaktionen mit gasförmigen Reaktionsteilnehmern, Dämpfen, Aerosols, Teilchensuspensionen und
ähnlichem sind ebenfalls vorgesehen. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen
finden besondere Anwendung in fließenden Systemen,
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2624742 3d
worin es erwünscht ist, Reaktionssysteme ohne Reduzierung der
Pließgeschwindigkeit oder der Schaffung eines Rückstaus in das System durchzuführen.
Figur 1 veranschaulicht die bevorzugte Ausführungsform eineV
Pestphasen-Matrix, die erfindungsgemäß konstruiert ist.
Figur 2 veranschaulicht eine Modifikation der in Figur 1 veranschaulichten
Ausführungsform, worin eine Vielzahl von Aussparungen
angebracht ist, um die reaktive Oberfläche zu vergrößern.
Figur 3 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung
mit einer Vielzahl von nach unten sich erstreckenden Zinken.
Figur 4 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung
mit konzentrischen zylindrischen Oberflächen.
Figur 5 veranschaulicht; eine andere Aus führungs form der Erfindung
mit einer sich kontinuierlich erstreckenden Oberfläche in Form einer Spiralrampe.
Figur 6 veranschaulicht eine andere Ausführungsform in Form
von gestapelten Scheiben.
Figuren I1Ia und l4b sind Abtastelektronenmikrographs von Matrixoberflächen.
Figur 1 veranschaulicht die bevorzugte geometrische Form eines Festphasen-Einsatzes 10, der erfindungsgemäß konstruiert ist.
Der Einsatz hat eine Vielzahl von im gleichen Abstand angeordneten Flügeln 12 mit äußeren Enden 14, die ein im allgemeinen
zylindrisches Volumen bilden, das in das Testrohr 16 hineinpaßt,
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in enger Nachbarschaft mit der Innenwand 18. Das Testrohr 16 funktioniert als Flüssigkeitsbehälter für die zu bestimmende
Probe zur Bestimmung der Konzentration oder des Vorhandenseins von Komponenten wie Antikörpern und Antigenen gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren, Der Einsatz hat ein vertikal sich erstreckendes Griffteil 22, an das eine Vielzahl von im gleichen
Abstand angeordneten radial sich erstreckenden Flügeln angebracht sind, die einen Radius aufweisen, der gleich oder etwas
geringer ist als der Radius des Testrohres. Der Stab funktioniert als ein Griff. Der untez^Teil/jedes Flügels ist vorzugsweise
so geformt, daß der Einsatz dem Boden des Testrohres angepaßt ist. Die Flügel sind vorzugsweise als Teil einer einheitlichen
Struktur gebildet, die einen mittleren Stab enthält. Jedoch können die Flügel an den Stab mit Hilfe physikalischer Verbindungen
wie Nut und Feder oder eines geeigneten Klebstoffs befestigt sein.
Während die Ausfuhrungsform der Figur 1 8 sich radial erstreckende
im gleichmäßigen Abstand angebrachte Flügel veranschaulicht, kann eine andere Anzahl und andere Konfigurationen von Flügeln
bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Es wurde gefunden, daß eine Vergrößerung der Oberfläche des Einsatzes
durch Anb ringen einer erhöhten Anzahl an Flügeln die Reaktionsg eschwindigkeit der mobilen und der fixierten Komponente erhöht.
Außerdem wurde unerwarteterweise gefunden, daß in vielen Fällen ein 8-flügeliger Einsatz eine proportional größere Reaktionsgeschwindigkeit
gegenüber einem bekannten überzogenen Rohr hat als durch den Unterschied ihrer relativen Oberflächen erklärt
werden kann, vgl. Figuren 7 und 10. Ähnliche Vorteile wurden beobachtet mit einer größeren Anzahl an Flügeln wie 12, 16 und
Im Hinblick auf diese Beobachtungen ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung eine Flügelmatrix ähnlich der in Fig.l
gezeigten mit einer Vielzahl an Flügeln von 8 bis 18. Eine
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18-flügelige Matrix, die die am meisten bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung darstellt, wurde hergestellt. Bei den Flügelvorrichtungen des in Figur 1 gezeigten Typs wird die
Anzahl an Flügeln, die praktisch verwendbar ist, durch die erhöhte Schwierigkeit begrenzt, ein freies Ablaufen zu erzielen
aufgrund der kapillaren Haftung der Reaktionsflüssigkeit, insbesondere im Bereich des Griffteils, wo die Flügel sich gegenseitig
näher kommen bei spitzer werdendem Winkel, wenn die Anzahl an Flügeln erhöht wird.
Ein Vergleich der Daten der Figur 7 zwischen dem 8-flügeligen
Einsatz mit dem des bekannten überzogenen Rohres zeigt an, daß andere Erwägungen die Reaktionsgeschwindigkeit der mobilen
und der fixierten Komponenten außer dem Bereich der freiliegenden Oberfläche, die mit der fixierten Komponente überzogen ist,
beeinflussen. Obgleich diese Gesichtspunkte zur Zeit nicht bekannt sind, wird angenommen, daß die Verringerung des durchschnittlichen
Diffusionsabjstandes in dem 8-flügeligen Einsatz
gegenüber demjenigen im überzogenen Rohr mindestens einer dieser Gesichtspunkte ist.
Figur 2 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung,
die mit der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform in allen Punkten
identisch ist, außer daß eine Vielzahl an Aussparungen 28 in den Flügeln angebracht ist, um die Oberfläche der fixierten
Komponente zu erhöhen, die durch die zu bestimmende Probe benetzt wird. Die Aussparungen 28 können sich vollständig durch
die Flügel erstrecken. Wie veranschaulicht ist, können die Aussparungen kreisförmig oder länglich sein oder können irgendeine
andere Form haben. Um die Oberfläche des Einsatzes durch Anbringen von kreisrunden Aussparungen zu vergrößern, muß der
Radius der Aussparungen weniger als das 2-fache der Wandstfirke
betragen.
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-J6-
2624742
In Figur 3 wird eine weitere Ausführungsform der Erfindung gezeigt
mit einem Griff 50, an dem flache Scheiben 52 angebracht sind, die so geschnitten sind, daß ihr Durchmesser etwas geringer
ist als ein Testrohr, in das die Vorrichtung hineinpassen soll. Eine Vielzahl an sich nach unten erstreckenden Zinken 54 ist
mit der Scheibe 52 verbunden. Die unteren Enden der Zinken 56
können von gleichmäßiger Länge oder von abgestufter Länge sein in Anpassung an den Rundboden eines Testrohres. Die Zinken 54
sind mit zylindrischem Querschnitt gezeigt, jedoch können sie in anderen Ausführungsformen andere Querschnittsformen aufweisen.
Die Zinken 54 können einzeln von der Scheibe 52 abnehmbar und
ansetzbar sein. Die Ausführungsform der Figur 3 eignet sich
besonders für komplexe Analysen, die verschiedene unterschiedliche Testreaktionen in der gleichen Probe umfassen, zusätzlich zu
ihrer allgemeinen Brauchbarkeit in Festphasen-Reaktionen.
Figur 4 zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung mit
einem als Mittelstab ausgebildeten Griffteil 22, mit dem eine Vielzahl von konzentrischen zylindrischen Oberflächen mit Hilfe
von radial sich erstreckenden Streben 64 verbunden sind. Figur 4 zeigt ein Paar solcher zylindrischer Oberflächen 60 und
62. Zur Anpassung an den Rundboden des Testrohres erstreckt sich der innere konzentrische Zylinder 60 unter den äußeren
Zylinder 62 und der Mittelstab 22 erstreckt sich etwas über den inneren Zylinder 60 hinaus. Ein Satz von unteren Streben
verleiht dem unteren Ende der Struktur Starrheit und erleichtert außerdem das freie Abtropfen der Flüssigkeit.
Figur 5 zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung mit einer
im allgemeinen radial sich erstreckenden Oberfläche in Form einer Spiralrampe 36, die sich um einen Zentralkern 32 windet,
der mit dem Griffteil 22 verbunden ist. Die Vorrichtung schafft eine kontinuierliche im wesentlichen horizontale Oberfläche 36
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-Vl-
und eine vertikale Oberfläche 34, die durch die Rampe bzw.
ihre Außenfläche gebildet wird. Die Schräge der Rampe sorgt für das freie Ablaufen der Reaktionsflüssigkeit durch Gravität
wenn die Vorrichtung aus der Reaktionsflüssigkeit entfernt wird. Die Ausführungsform der Figur 5 ist besonders geeignet für Reaktionen,
in denen Rühren erwünscht ist. Die Vorrichtung verjüngt sich am unteren Ende 38, um einen guten Paßsitz mit dem Boden
eines Testrohrbehälters, wie er in Figur 1 gezeigt ist, zu
schaffen.
Figur 6 ist eine andere Ausführungsform der Erfindung mit einer
Vielzahl von horizontal angeordneten Scheiben 42, die an einem zentralen Griff 22 befestigt sind und die im wesentlichen parallel
laufende obere und untere Oberflächen 44 und vertikale Kanten 46
aufweisen. Die Scheiben verjüngen sich am unteren Ende des Stabes 48 in Anpassung an den Rundboden des Testrohres. Während
die geometrische Konfiguration der Figur 6 zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, erfordert dieselbe und ähnliche
Ausführungsformen,die keine frei abfließen lassende Oberflächen
aufweisen, im Verhältnis mehr Arbeitszeit wegen der Wascherfordernisse, die bei den frei abließen lassenden geometrischen
Konfigurationen der Figuren 1 und 5 nicht vorhanden sind.
Andere geometrische Konfigurationen des Einsatzes als diejenigen die in den Figuren 1 bis 6 veranschaulicht sind können bei der
Durchführung der Erfindung verwendet werden. Diese geometrischen Konfigurationen sollten vorzugsweise vertikal ausgerichtete
glatte Oberflächen in Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe haben, um das Ablaufen durch Gravität nach ihrer Entfernung aus dem
Testrohr zu erleichtern. Jede geometrische Konfiguration,die eine frei abfließen lassende niativ große Oberfläche aufweist,
kann zur Durchführung der Erfindung verwendet werden. Je größer
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- 58 -
die benetzbare Oberfläche ist, desto schneller ist die Reaktionsgeschwindigkeit
zwischen dennobilen und den fixierten Komponenten.
Vor der Verwendung eines erfindungsgemäßeη Einsatzes durch
Hineingeben desselben in eine Flüssigkeitsprobe, die eine quantitativ oder qualitativ zu bestimmende mobile Komponente enthält,
waren alle Oberflächen mit der fixierten Komponente, wie vorstehend bereits diskutiert, überzogen. Eine Vielzahl von Einsätzer
kann gleichzeitig überzogen werden, um die Herstellungskosten bis auf einen Punkt zu senken, an dem das Wegwerfen des verwendeten
Einsatzes wirtschaftlich ist.
Der Einsatz kann aus so ziemlich jedem stabilen wasserunlöslichen Material hergestellt werden, wie beispielsweise Polymethacrylat,
Polypropylen und Polystyrol.
Figur l4a ist ein Abtastelektronenmikrograph der Oberfläche
einer bevorzugten Ausführungsform, einer 18-flügeligen Matrix,
die in einer polierten Form gegossen worden ist. Vergrößerung: 30Ofach; Abtastwinkel 45°.
Figur 14b ist ein Abtastelektronenmikrograph der Oberfläche
eines Matrixprototyps, der aus dem gleichen Plastikmaterial wie in Figur I2Ia verwendet wurde gegossen wurde, jedoch mit
einer nicht polierten Form. Vergrößerung: 30Ofach; Abtastwinkel
U5 .
Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
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ErfindungsgemäRe Matrices in Form von 2-flügeligen, *!-flügeligen
und 8-flügeligen Stäben aus Polymethacrylat wurden hergestellt
für die Verwendung in der Pestphasen-Reaktion im Vergleich mit
einem bekannten überzogenen Polystyrol-Rohr« Die Stäbe waren im wesentlichen wie in Figur 1 gezeigt konstruiert mit der Ausnahme,
daß die Flügel am unteren Ende nicht abgerundet waren und somit sich nicht in den Rundbodenteil des Reaktionsrohres
erstreckten. Die gemessenen Oberflächen für jede Konfiguration der Festphase war wie folgt:
Überzogenes Rohr
2-flügeliger Einsatz ^-flügeliger Einsatz 8-flügeliger Einsatz
2-flügeliger Einsatz ^-flügeliger Einsatz 8-flügeliger Einsatz
Die Reaktion war eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen
I -Thyroxin (TH) und Kaninchen-Anti-Thyroxin-Antikörper.
Der Antikörper wurde als fixierte Komponente verwendet und das radioaktive Antigen als mobile Komponente.
Um den Antikörper auf den vorstehenden Festphasen-Oberriächen
zu immobilisieren, wurde eine 2,5£ige Lösung von Glutaraldehyd
mit einem gleichen Volumen eines Q35M Natriumcarbonatpuffers
mit einem pH von 9,5 verdünnt. Die Festphasen-Oberflächen wurden in die Glutaraldehydlösung mindestens 3 Stunden lang bei Raumtemperatur
eingetaucht und dann ait Wasser gewaschen. Die «it Glutaraldehyd behandelten Oberflächen wurden dann sofort eit
899 | ma2 2 TIHB |
660 | 2 |
1 075 | 2 mm |
0Q9807/O678
einer 1:1000 verdünnten Lösung von Kaninchen-Anti-T4-Serum in
0,5M Natriumcarbonat mit einem pH von 9,5 12 Stunden lang bei
Raumtemperatur zur Reaktion geb rächt.
Die Oberflächen wurden dann mit Wasser gewaschen und aufbewahrt in einer phosphatgepufferten Salzlösung aus 0,006M NaH„PO^,
O,O24m K2HPO11 und 0,15M Natriumchlorid mit einem pH-Wert von
7,4, der 0,1% Bovinserumalbumin und soviel Merthiolat zugesetzt worden waren, um jegliches an das Serumprotein gebundene T4
freizusetzen, wobei das komplette Gemisch im nachstehenden als Τ-4-Puffer bezeichnet wird.
Die Reaktionen wurden durchgeführt, indem man die überzogene
Oberfläche, die den immobilisierten Anti-Thyroxin-Antikörper
125 trug, mit einer geringen Menge an I -Thyroxin in einem Gesamt reaktionsvolumen
von 1,6 ml inkubierte. Die Proben wurden unterschiedlich lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ergebnisse
werden in nachstehender Tabelle gezeigt:
% an gebundener Markierung zur angezeigten Zeit
erfindungsge mäße Matri ces |
bekann te Matrix |
15Min. | 30Min. | 45Min. | IStd. | 2Std. | l6Std. | 65Std |
2-flügeliger Stab |
9,3 | 17,4 | 21,7 | 26,7 | 31,9 | 52,0 | 68,2 | |
4-flügeliger Stab |
14,2 | 22,2 | 28,3 | 34,2 | 38,1 | 70,6 | 75,7 | |
8-flügeliger Stab |
20,4 | 31,1 | 40,3 | 36,6 | 58,7 | 81,4 | 85,3 | |
über- | ||||||||
zogenes Rohr |
16,1 | 21,8 | 24,4 | 28,5 | 36,4 | 60,6 | 73,6 |
809807/0678
-JH-
Die Reaktxonscharakteristika der Flügeleinsätze gegenüber dem
überzogenen Rohr werden durch vorstehenden Versuch veranschaulicht. Zunächst darf bemerkt werden, daß das I ^-Thyroxin etwa 85
bis 90 % rein war, so daß die maximale Bindung, die erzielt werden konnte, etwa 85 bis 90 % betrug. Es ist somit ersichtlich, daß
der 8-flügelige Einsatz nach 16 Stunden in etwa ein Gleichgewicht
erreicht hatte. Noch bedeutender ist, daß der 4-flügelige Einsatz,
obgleich er nur etwa 3A der Oberfläche des überzogenen
Rohres besaß, das Antigen mit einer etwas größeren Geschwindigkeit immobilisierte als das überzogene Rohr. Außerdem hatte
der 2-flügelige Einsatz mehr Antigen je Oberflächeneinhext
immot£Lisiert als das überzogene Rohr.
Man verfuhr nach Bespiel 1 mit dem Unterschied, daß die Reaktionen
unterschiedlich lang bei Raumtemperatur und bei 37°C
durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in Figur 7 bei 37°C und in Figur 10 bei Raumtemperatur abgetragen. Daraus ist
ersichtlich, daß der ή-flügelige Einsatz, trotzdem er weniger
Oberfläche hatte als das überzogene Rohr, in der Lage war, einen höheren Prozentsatz Antigen während des größten Teils des
Reaktionsablaufs bei Raumtemperatur zu binden. Bei 37 C band der 4-flügelige Einsatz nicht mehr Antigen als das überzogene
Rohr. Jedoch hatte der 8-flügelige Einsatz, trotzdem er nur das Ij2faehe der Oberfläche des überzogenen Rohres aufwies, fast
das l,6fache an Antigen am Ende einer 60minütigen Inkubationszeit.
Die Reaktion von Flügeleinsätzen auf wachsende Konzentration von Antigen wurde mit derjenigen von überzogenen Rohren verglichen.
809807/0678
Man verfuhr im wesentlichen nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, das die Antigen-Xonzentration durch Zugabe von nicht markiertem
Standard auf der Basis von Thyroxin-Frotein verändert wurde, während die Konzentration von I ^-Thyroxin konstant blieb.
Die Antigen-Konzentration wurde von 25 auf 400 Kanogramm Thyroxin
je ml Serum auf der Bsäs eines Probenvolumens von 0,025 ml
verändert. In Figur 11 wurden 2-, 4- und 8-flügelige Matrices
mit einen überzogenen Rohr bei einer 3stündigen Inkubation bei 37°C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 1,?25 ml verglichen.
Der Reaktionspuffer war der T^-Puffer von Beispiel 1. Während
die erfindungsgemäßen Flügelstäbe einer Familie von Kurven der gleichen allgemeinen Form zu folgen schienen, waren die überzogenen Rohre in ihrem Verhalten unterschiedlich, was wiederum
anzeigt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen den Einsätzen und dem überzogenen Rohr sich zu unterscheiden schien. Es ist
außerdem ersichtlich, daß die Kurven der Flügeleinsätze,insbe- '
sondere der H- und 8-flügeligen Einsätze, einem steileren
Gefalle über einen weiten Bereich an Antigen-Konzentration folgen, als die Kurve für das überzogene Rohr. Die Flügeleinsätze sind
somit in der Lage, eine bessere unterschiedliche Reaktion über einen weiten Bereich von Antigen-Konzentration zu schaffen.
In Figur 8 werden die Ergebnisse eines ähnlichen Versuches gezeigt, wobei das verhalten von 8-flügeligen und l6-flügeligen
Einsätzen verglichen wird. In diesem Versuch wurden die Matrices 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Gesamtreaktionsvolumen
von 1,428 ml für den 8-flügeligen Einsatz und 1,025 al für den l6-flügeligen Einsatz inkubiert. Der l6-flügelige Einsatz ist
für quantitative analytische Zwecke vorteilhaft, wegen seiner allgemein größeren Reaktion und *m allgemein steileren Gefälle
seiner Reaktionskurve bei den meisten Konzentrationen von Antigen.
Ö09807/0678
Figur 9 zeigt die Ergebnisse eines ähnlichen Versuches unter Verwendung einer 8-flügeligen Matrix in einer 45minütigen Reaktion
bei 22 C. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 1,325 ml
und das Probenvolumen 0,025 ml. Unter diesen Bedingungen ergab
die 8-flügelige Matrix eine brauchbare Reaktion über den gesamten
getesteten Konzentrationsbereich in einer relativ schnellen Reaktion.
Man stellte einen Vergleich an zwischen einem 8-FlÜgelstab
und einem überzogenen Rohr in einer immunchemischen Insulinbestimmung.
Meerschweinchen-Antiserum gegen Insulin wurde auf den Oberflächen von Rohren und Stäben gemäß dem im Beispiel 1
beschriebenen Verfahren immobilisiert. Die Reaktion wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt mit dem Unterschied, daß Insulin als
Antigen verwendet wurde. Jedes Reaktionsrohr enthielt eine identische Menge an mit I 3 markiertem Insulin zusammen mit einer
Menge an nichtmarkiertem Insulin in phosphatgepufferter Salzlösung,
die Bovinserumalbumin enthielt. Das Gesamtreaktionsvolumen für beide Systeme war 1,3 ml, die 300 ul eines nichtmarkierten
Insulin-Standards und 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung wie in Beispiel 1 enthielten, die 50 mg/ml Bovinserumalbumin enthielt.
Die Daten, ausgedrückt als % des gesamten, an die reaktiven Oberflächen gebundenen markierten Materials, werden
in nachstehender Tabelle wiedergegeben.
909807/0678
% an gebundenem markierten Antigen
Zeit
(Std.)
(Std.)
6s25 u-Einheiten 25 u-Einheiten
8-flügeliger
Stab der
Erfindung
Stab der
Erfindung
überzogenes
Rohr
Rohr
8-flüge- über-
liger zoge-
Stab der nes
Erfindung Rohr
200 ^u-Einheiten
8-flügeliger Stab der Erfindung
überzogenes Rohr
35
51
19
20
20
33 33 44
25 30
6 7
Der Prozentsatz an mit dem 8-Flügelstab beobachteter Bindung
betrug im allgemeinen mehr als das 2fache der bei dem überzogenen Rohr beobachteten Menge, obgleich der erstere nur etwa/T,2fache
der Oberfläche des letzteren hatte, wie in Beispiel 1 gezeigt wurde.
Der nachstehende Versuch war dazu bestimmt, um die Wirkungen von unterschiedlichen Oberflächen, von Flügeln, die sich nicht in
den Rundbodenteil des Reaktionsrohres erstrecken und von möglichen Unterschieden in der Bindungsaffinität zwischen Polymethacrylat
und Polystyrol in einem Vergleich zwischen den 8-Flügelstab-
und überzogenen Rohr-Festphasen zu kontrollieren. Die Reaktion wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt unter Anwendung
von Inkubationen für die angezeigten Zeiten bei Raumtemperatur.
909807/0678
Sowohl die in diesem Versuch verwendeten Rohre als auch die Stäbe waren aus Polymethacrylat konstruiert. Die Rohre waren mit
einem flachen Boden ausgestattet und einer überzogenen Oberfläche,
die groß genug war, um eine Oberfläche zu liefern, die gleich derjenigen des überzogenen Stabes war. Die Daten sind in Figur
13 gezeigt. Daraus ist ersichtlich, daß der Wegfall der vorstehend genannten Variablen das allgemeine Ergebnis der vorstehenden
Beispiele nicht wesentlich verändert, d.h. daß die Bindung an die überzogenen Stäbe der Erfindung im allgemeinen
schneller erfolgt als an überzogene Rohre, selbst wenn die überzogenei
Oberflächenfür beide die gleichen sind.
Die Ergebnisse einer Sandwich-Bestimmung von a-Petoprotein
im Vergleich zwischen 8-flügeligen und 12-flügeligen Matrices
mit einem überzogenen Rohr werden in Figur 12 gezeigt. Antikörper gegen a-Fetoprotein wurden durch Adsorption immobilisiert.
Die 8- und 12-flügeligen Stäbe wurden in 1,5 ml einer Lösung, die 18 ug a-Fetoprotein-Antikörper je ml 0,5M Natriumcarbonatpuffer
mit einem pH-Wert von 9,5 enthielt,und 2 Stunden lang
bei 37°C inkubiert. Polystyrolrohre wurden auf die gleiche Weise überzogen, indem man sie in 1,5 ml der gleichen Antikörperlösung
in das Rohr tat und unter den gleichen Bedingungen inkubierte. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Rohre und die
Matrices abgespült und 1 Stunde lang in eine.-phosphatgepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4, die 10 ml/mg Bovinserumalbumin
enthielt, getan. Die Rohre und Matrices wurden wieder gespült,und der Bestimmungspuffer wurde den Rohren zugesetzt, die
die 8-Flügelstäbe, Gesamtvolumen 1,5 ml, 12-Flügelstäbe,
Gesamtvolumen 1,1 ml,und die überzogenen Rohre, Gesamtvolumen 1,5 ml, enthielten. Der Bestimmungspuffer war identisch mit dem
909807/0678
-K-
vorstehend beschriebenen T^-Puffer im Beispiel limit dem Unterschied,
daß das Merthiolat weggelassen wurde und der Gehalt an Bovinserumalbumin 10 mg/ml betrug. Es wurde a-Petoprotein
den Reaktionsrohreη zugesetzt, wobei eine Gesamtkonzentration
von 1 ng, 2 ng, 20 ng, 200 ng und 400 ng je ml Serum auf der
Basis eines Probevolumens von 0,1 ml erzielt wurden. Unmittelbar nach Zugabe von a-Petoprotein wurden 100 ul I ■'-markierter
Antikörper gegen a-Fetoprotein zugesetzt, wobei eine Gesamtmenge von 1IO 000 cpm erhalten wurde. Das Gemisch wurde 1 1/4 Stunden
lang bei 37 C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Matrices entfernt und die Rohre dekantiert. Sowohl Rohre als auch Matrices
wurden kurz gespült und die daran gebundene Radioaktivität in einem Gammazähler gemessen.
Die erfindungsgemäßen Plügelstabmatrices gaben unterschiedliche Reaktionen von größerer Vergrößerung bei allen Antigen-Konzentrationen
als mit den überzogenen Rohren beobachtet wurde, was von besonderer Bedeutung ist bei den niederen getesteten Konzentrationen.
Die 12-flügelige Matrix gab eine Reaktion von größerer
Vergrößerung als alle Konzentrationen von getestetem Antigen und lieferte eine etwas größere Differentialreaktion.
Eine immunologische Bestimmung von Thyroxin-Stimmulierungshormon
(TSH) wurde unter Anwendung einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung durchgeführt. Matrices in der Form, wie sie im wesentlichen in Figur 1 dargestellt werden, mit 18 Flügeln wurden
aus gegossenem Polypropylen unter Verwendung einer Form mit polierten Oberflächen hergestellt, um den an dem Griffteil befestigten
planen Flügeln maximale Glätte zu verleihen.
909807/0678
Die Matrix wurde mit Anti-TSH-Antikörper überzögen, indem man
den Flügelteil 2 Stunden lang bei 37°C in 1,2 ml einer Losung
eintauchte, die etwa 1 ug gereinigten Antikörper und 10 ug Bovinserumalbumin in 0,QlM Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert
von 9 enthielt. Die Matrix wurde anschließend mit Wasser gewaschen und in eine 0,005?ige Losung (Y/V) von Glutaraldehyd
in O3OlM Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 9,5 gegeben
und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Matrix wurde nochmals mit Wasser gewaschen, dann 10 Minuten lang mit einer langsam
fließenden wäßrigen Lösung von Triton-X-100,vertrieben durch
Rohm und Haas Corporation (2 mg/ml) bei einem pH-Wert von 1,85 und schließlich mit Leitungswasser gewaschen und bis zum Gebrauch
in phosphatgepufferter Salzlösung bei 4°C aufgehoben.
Matrices, die wie beschrieben hergestellt worden waren, wurden in Rohre eingetaucht, die 0,2 ml von TSH-Standards in Mengen, die s
125 von Rohr zu Rohr unterschiedlich waren und 0,2 ml I -markierten
Anti-TSH-Antikörper enthielten, was eine Gesamtzählung pro Minute pro Rohr von 17^ 535 ergab. Eine Reaktion dieser Art,
in der die mobile Komponente der Festphasen-Reaktion und der Indikator gleichzeitig mit dem Festphasen-Reaktionsteilnehmer
inkubiert werden, bezeichnet man als simultane Sandwich-Bestimmung. Ein Satz Matrices wurde 2 Stunden lang bei 370C
und ein zweiter Satz 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 0,4 ml.
Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle wiedergegeben:
909807/0678
TSH 2stündige Quäler Durch-(Anzahl
Inkubier- schnitt der der ung gesamten ge-Einhei- gebundene bundenen
ten/ml) Zählungen/ Zählungen: Minute korrigiert auf 65£ige Antikörper-Affinität
3stündige
Inkubierung
gebundene
Zählungen/
Minute
Quäler Durchschnitt der gesamten gebundenen
Zählungen: korrigiert auf 652ige Antikörper-Affinität
0 | 1036 1207 |
0,99 | 1100 IO98 |
• 0,97 |
0,75 | 1603 1621 |
1,46 | 1544 1767 |
1,46 |
1,5 | 1716 2080 |
1,67 | . 2124 2171 |
1,89 |
3,1 | 2352 2388 |
2,09 | 3017 2958 |
2,63 |
6,2 | 3652 3615 |
3,20 | 4346 4463 |
3,88 |
12,5 | 6330 6297 |
5,57 | 7207 7506 |
6,48 |
25 | 11020 IOO95 |
9,31 | 1216O 12175 |
10,73 |
50 | 17191 I8943 |
15,93 | 2O6O6 21983 |
18,77 |
100 | 31707 32014 |
28,08 | 35447 36223 |
31.59 |
909807/0678
Die Ergebnisse der zweifachen Vers-uche zeigen ein hochreproduzierbares
Reaktionssystem an. Die relativ geringe Erhöhung der Menge an gebundenem markiertem Stoff als Ergebnis einer
zusätzlichen lstündigen Inkubierung zeigt eine schnelle Reaktionsgeschwindigkeit
an, bei der die meiste Bildung bereits in den ersten beiden Stunden erfolgte. Das System besitzt eine Empfindlichkeit,
um Mengen von nur 1,5 Mikroeinheiten/ml TSH-Antigen
zu messen, während es gleichzeitig eine Kapazität zur Messung von bis zu mindestens 100 Mikroeinheiten/ml aufweist.
Eine Bestimmung nach der konkurrierenden Methode unter Verwendung einer bevorzugten Ausführungsform einer 18-flügeligen Matrix,
wie sie im Beispiel 7 beschrieben wird, wird erläutert. Die Matrix war mit Anti-Digoxin-Antikörper überzogen im wesentlichen
nach dem im Beispiel 7 zum Überziehen einer Matrix beschriebenen Verfahren. Es war soviel Antikörper vorhanden, um etwa 250 ng
Antikörper je Matrix zu erzielen.
Die konkurrierende Reaktionsflüssigkeit enthielt unmarkiertes
Digoxin in einer Menge von 0, 0,5 und 6,0 ng/ml und 16 163 Gesamtzählungen/Minute Γ"H _7 Digoxin in Ο,ΟΙΜ Kaliumphosphatpuffer
bei einem pH-Wert von 7,5. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 1,2 ml. Die Reaktionsflüssigkeit wurde in Gegenwart
der Matrix bei 37°C oder bei Raumtemperatur während der in nachstehender Tabelle angegebenen Zeit inkubiert. Die Ergebnisse
werden als % an gebundenem markiertem Digoxin ausgedrückt, wobei der Durchschnitt der Ergebnisse aus 2 Versuchen angegeben wird.
909807/0678
Reaktionstemperatur
Inkub ier ungs ■ zeit(Min.)
Digoxin-Konzentration (ng/rol) 0 Ö75 6,0
37°C | 10 | 41,0 % | 30,3 % | 5,5 % |
30 | 57,0 % | 41,1 % | 7,9 % | |
90 | 66,2 % | 43,1 % | 7,9 Ji | |
Raum | 10 | 33,5 % | 25,6 Ji | 6,5 % |
temperatur | 30 | 56,3 % | 34,3 % | 5,9 X |
90 | 58,5 % | 43,7 * | 6,1 Ji |
Bei der 0,5 ng/ml-Menge erhielt man einen maximalen Unterschied
mit einer 90minütigen Inkubierung bei 37 C, obgleich leicht meßmare
Unterschiede bei lOminütigen Inkubierungen entweder bei 37°C oder bei Raumtemperatur erzielt wurden,
Eine simultane Sandwich-BeStimmung für TSH, wie sie in Beispiel
7 beschrieben wurde, wurde ausgeführt unter Verwendung einer hier nicht gezeigten Parallel-Plügelmatrix mit 6 Flügeln und einem
flachen Boden, die in einer nichtpolierten Form wie in Beispiel 10 beschrieben gegossen worden war.
Antikörper gegen TSH wurden durch Adsorption in Ο,ΟΙΜ Kaliumphosphat
mit einem pH-Wert von 9,0, das 1,5 ^ug/ml Anti-TSH-Antikörperprotein
und 15 ug/ml IgG enthielt, 1,5 Stunden lang bei 37°C immobilisiert. Nach der Adsorptionsperiode wurden die
Matrices zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung, die 10 Bovinserumalbumin enthielt, gewaschen.
Die Reaktion wurde in Gegenwart der angegebenen Mengen TSH durchgeführt unter Verwendung eines _/ I ^/-markierten Anti-
909807/0678
-.51 -
H2
TSH-Antikörper-Indikators mit Gesamtzählungen/Minute von
127 000. Der Beaktionspuffer war phosphatgepufferte Salzlösung
und die Reaktionen wurden während der angezeigten Zeiten bei 37°C durchgeführt. Um das Ablaufenlassen von und das Waschen
der Vorrichtung zu erleichtern, wurde die Matrix aus der Reaktionsflüssigkeit
entfernt, kurz abgetrocknet, indem man den flachen Boden gegen ein saugfähiges Polster drückte und dann
in einem Rohr zentrifugiert, das zur Stütze der Matrix eine
Glaskugel enthielt, um die letzten Spuren der Reaktionsflüssigkeit zu entfernen. Die Matrix wurde dann in einen Waschpuffer
eingetaucht und das Verfahren zweimal wiederholt. Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle wiedergegeben.
TSH % an gebundener I ^-markierter Substanz (^-Einheiten/ml) korrigiert für 75 %ig:e Affinität
1 Stunde
0 2,2 %
25
50 5,8 %
Obgleich das vorstehende eine der am wenigsten bevorzugten Ausführungsformen ist, ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße
Vorrichtung und das Verfahren selbst wenn sie auf diese Weise angewandt werden wirksam sind.
2 Stunden | Ib Stunden |
2,6 % | 4,4 % |
2,7 % | 4,4 % |
4,9 % | 5,1 % |
7,6 % | 7,2 % |
Eine 18-flügelige bevorzugte Matrix wie die in den Beispielen
und 8 verwendeten wurde unter einem Abtastelektronenmikroskop geprüft, um die Wirkung der Oberflächenglätte der bei der Her-
909807/0678
stellung verwendeten polierten Form zu bestimmen. Zum Vergleich wurde die Oberfläche eines Prototyps einer Matrix, die aus dem
gleichen Plastikmaterial in einer unpolierten Form gegossen worden war, ebenfalls geprüft. Figur I1Ia zeigt die Oberfläche
der in der polierten Form gegossenen Matrix in 300facher Vergrößerung bei einem Abtastwinkel von 45 . Figur I1Ib zeigt die
Oberfläche der in der nichtpolierten Form gegossenen Matrix unter den gleichen Bedingungen. Die Verwendung einer Form mit
spiegelpolierten Oberflächen hat eine wesentlich verbesserte Oberflächenglätte zur Folge.
Obgleich beide Oberflächen vom sensorischen Standpunkt aus im wesentlichen glatt sind und somit innerhalb des Rahmens der
Erfindung liegen, ist interessanterweise laufend festzustellen, daß die in der polierten Form hergestellte Matrix bevorzugt
wird. '
Die Verwendung der Matrix der bevorzugten Ausfuhrungsform wie
sie in Figur 14a gezeigt wird hatte hochreproduzierbare Ergebnisse zur Folge mit einem geringen Hintergrund von nichtspezifischer
Bindung.
Die in Beispiel 7 beschriebene Festphasen-Matrix wurde in einer enzymgebundenen immunologischen Bestimmung für Ferritin verwendet
und die Ergebnisse mit denjenigen verglichen, die unter Verwendung
eines überzogenen Rohres erzielt wurden. Die Bestimmungsmethode
war eine Sandwich-Bestimmung, worin die l8-flügelige Matrix bzw. das Reaktionsrohr mit Antikörper gegen Ferritin überzogen
worden waren und wobei man dieselben in einer Reaktionsflüssigkeit, die eine Testprobe von Ferritin enthielt,
9098 0 7/0678
reagieren ließ. Die Matrix oder das Rohr wurden dann von der Reaktionsflüssigkeit abgetrennt, gewaschen und mit einem enzymkonjugierten
Antiferritin-Antikörper inkubiert. Alternativerweise könnte eine simultane Sandwich-Bestimmung durchgeführt werden,
worin die Ferritin- und Antiferritin-Antikörper-Enzymkonjugate
zusammen mit dem immobilisierten Antiferritin-Antikörper inkubiert werden. In jedem Falle gestattete die Gegenwart von Ferritin
die Bindung des Antikörper-Enzymkonjugats an die Festphase
in Mengen, die proportional der vorhandenen Ferritinmenge waren. Die Menge an gebundenem Antikörper-Enzymkonjugat wurde durch
Einführung eines chromogenen Enzymsubstrats gemessen, wobei die Wirkung des gebundenen Enzymteils des Konjugats eine Farbänderung
verursachte. Die Menge an Farbänderung war proportional der Menge an gebundenem Konjugat.
Beim Vergleich der Ergebnisse einer solchen Bestimmung unter Verwendung von entweder der l8-flügeligen Matrix oder einem
überzogenen Rohr wurde festgestellt, daß bei der gleichen Inkubierungszeit
die Verwendung der 18-flügeligen Matrix eine
optische Dichte zur Folge hatte, die in der Größenordnung von 8 oder mehrfach größer war als diejenige, die bei Verwendung
eines überzogenen Rohres erzielt wurde.
Für: Roger Norman Piasio
Yarmouth, Maine, V.St.A.
David Allan Perry Portland, Maine, V.St.A.
Pangal Narayan Nayak
Belmont, Massachusetts, V.St.A.
Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt
909807/0678
Leerseite
Claims (13)
1.)Verfahren zur Durchführung klinischer Diagnose-Tests in
^-' vitro unter Verwendung eines Festphasen-Bestimmungs-Systems,
bei dem die Menge an mobiler Komponente in einer Flüssigkeitsprobe, die mit einer fixierten auf einer Festphasen-Einsatzmatrix
immobilisierten Komponente reagiert, bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) einen Flüssigkeitsbehälter, der eine Flüssigkeitsprobe mit
einer unbekannten Menge der zu messenden mobilen Kompo- nente
enthält und ..'..*■■..
(b) eine entfernbare impermeable Einsatzraatrixeinheit, bestehend
aus einem Griffteil, an dessen einem Ende eine Vielzahl .-von
Elementen mit im wesentlichen'glatten planen oder
gekrümmten Oberflächen befestigt sind, die gegenseitig und gegenüber dem Griffteil so angeordnet sind und :.
eine derartige Größe und Form aufweisen, daß, wenn die . Matrix in den Flüssigkeitsbehälter eingesetzt wird,
die Matrix sich im wesentlichen durch die Tiefe der Flüssigkeitsprobe erstreckt und der Durchschnittsdiffusionsabstand
der Moleküle der mobilen Komponente -. zu den Oberflächen dieser Elemente im Verhältnis zum 7
Durchsehnittsdiffusionsabstand der Moleküle der mobilen Komponente zu dem Flüssigkeitsbehälter, wenn keine d*
Matrix darin ist, weitestgehend reduziert wird, wobei/auf den Oberflächen dieser Elemente immobilisierte, fixierte
Komponente mit der mobilen Komponente in einer als =eine
Funktion der Konzentration der mobilen Komponente meßbaren "
909807/0678
ORIGINAL INSPECTED
Geschwindigkeit oder ■ einem Ausmaß zu reagieren vermsg,
bereitstellt, . . ". ■■ . ·
(c) den Einsatz in den Flüssigkeitsbehälter tut, um zwischen,
der fixierten Komponente der Einsatzmatrix und der in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen mobilen Komponente
unbekannter Menge für eine bestimmte Zeit einen " ί Kontakt herzustellen, damit· eine Reaktion erfolgen kann-,
"und- ' · · .-..- V . / , : -; . ■"
(d) die Veränderung, die eine Funktion der Konzentration-der
mobilen Komponente ist, mißt, um die Menge an mobiler
Komponente zu bestimmen.- . ··- '
Für
Piasio, Perry L Nayak
(Dr.H.kWolff)
Rechtsanwalt
909307/0678
COPY
COPY
Ergänzungsblatt zur Oilcnlcgungsschnft
Offenlegungstag: /S- Oi. /973
Int.Cl.2: &0 4 N 23 '/C
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man.
als fixierte Komponente einen Antikörper und als mobile Komponente ein Antigen verwendet.und das Antigen an den
Antikörper bindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als fixierte Komponente ein Enzym und als mobile Komponente
einfSubstanz verwendet, die eine enzymkatalysierte chemische Umwandlung erfahren kann.
4. Verfahren nach Anspruch I3 dadurch gekennzeichnet, daß man
als mobile Komponente ein Enzym und als fixierte Komponente eine Substanz verwendet, die eine enzymkatalysierte chemische
Umwandlung erfahren kann.
5- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Festphasen-Einsatzmatrix verwendet, die einen Mittelstab und eine Vielzahl von flügelartigen herausragenden Teilen enthält,
die sich nach außen von diesem Stab entlang eines Teils der Länge dieses Stabes erstrecken und deren Außenkanten etwa
der Form des Flüssigkeitsbehälters angepaßt sind.
copy
Ergänzungsblatt zur Offenlegungsschrift
Offenlegungstag: /S~. Oi. /f
" ■> ~ Int CIA 6,0 A N 33- /C
6. Festphasenmatrix zum Einsatz in ein Reaktionsgefäß, das
eine auf die Gegenwart einer gegebenen mobilen Komponente zu untersuchende Flüssigkeitsprobe enthält, gekennzeichnet
durch
1) einen Griffteil, an dessen einem Ende eine Vielzahl von Elementen mit im wesentlichen glatten planen oder gekrümmten
Oberflächen befestigt sind, die gegenseitig und gegenüber dem Griffteil so angeordnet sind und eine
derartige Größe und Form aufweisen, daß der Durchsehnittsdiffusionsabstand
zwischen den Molekülen der mobilen Komponente und der festen Oberfläche im Verhältnis zum
Durchschnittsdiffusionsabstand zwischen den Molekülen der mobilen Komponente und den Wänden des Reaktionsgefäßes,
wenn keine feste Matrix vorhanden ist, weitestgehend reduziert ist, wobei
2) jedes der Elemente im wesentlichen gleichmäßig mit einer Zusammensetzung überzogen ist, die die fixierte Komponente
enthält, an der die zu bestimmende mobile Komponente, falls vorhanden, haften wird, wobei die I'enge an fixierter
Komponente so ausgewählt ist, daß die Haftung der mobilen Komponente in einer als eine Funktion der Gesamtkonzentration
der mobilen Komponente in der Flüssigkeitsprobe meßbaren Geschwindigkeit erfolgt und wobei
3) Anzahl, Sitz, Größe und Form dieser Elemente der Menge an fixierter Komponente und den anderen physikalischen und
chemischen Eigenschaften der Überzugs zusammensetzung angepaßt sincijSO daß eine maximale Verfügbarkeit der aktiven
fixierten Komponente an den Oberflächen der Elemente sichergestellt ist.
to?/
Ergänzungsblatt zur Oilenlegungsschnft o?o »?Y
Offenlegungstag: /5". Oj. /9 7j
- 4 - Int. Cl.*: 6Β
7- Pestphasen-Matrix nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
sie einen Mittelstab und eine Vielzahl von flügelartigen herausragenden Teilen enthält, die sich von dem Stab nach
außen entlang eines Teiles der Länge dieses Stabes erstrecken.
8. Pestphasen-Matrix nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der flügelartigen herausragenden Teile 8 bis 18
•beträgt.
9. Pestphasen-Matrix nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der flügelartigen herausragenden Teile 16 bis
18 beträgt.
10. Festphasen-Matrix nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
sie durch ein Gießverfahren unter Verwendung einer Form mit polierten Oberflächen hergestellt wurde.
11. Festphasen-Matrix nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die an dem Griffteil befestigten Elemente so dimensionier'-,
sind, daß sich die Matrix der gleichen Größe für die Verwendung in Reaktionsflüssigkeitsvolumen eignet, die mindestens um
das 3fache schwanken.
12. Festphasen-Matrix zum Einsatz in ein Reaktionsgefäß, enthaltend
eine Flüssigkeitsprobe, die Moleküle einer zu messenden oder festzustellenden mobilen Komponente enthält, gekennzeichnet
durch
(a) eine Trägeroberfläche, die dazu geschaffen ist, um in ein Reaktionsgefäß eingetaucht zu werden, " demeine die
mobile Komponente enthaltende Flüssigkeitsprobe zugesetzt
wird, wobei diese Oberfläche ein erstes Volumen bildet, das die Flüssigkeitsprobe nach Zugabe de?s&LJ~><z,n
in das die Matrix enthaltende Gefäß enthält,
904
(3OPY
Ergänzungsblatt zur Offenlcgungsschrift ti*
Offenlegungstag: /S. - 5 - InLQ*: £>0
(b) eine Vielzahl an herausragenden Oberflächen mit einem ersten und einem zweiten Ende, wobei das erste Ende jeder
herausragenden Oberfläche an die Trägeroberfläche gebunden ist und die herausragenden Oberflächen sich in das
Volumen erstrecken und gegenseitig sowie gegenüber der Trägeroberfläche so angeordnet sind und eine solche Größe
und Form aufweisen, daß, wenn die Matrix in das Reaktionsgefäß eingetaucht ist, der Durchschnittsdiffusionsabstand
de.v Moleküle einer mobilen Komponente zur Oberfläche der Matrix gegenüber dem Durchschnittsdiffusionsabstand einer
mobilen Komponente zum Reaktionsgefäß, wenn keine Matrix
vorhanden ist, weitestgehend reduziert ist,
(c) das zweite Ende jeder herausragenden Oberfläche ein zweites Volumen bildet, das sich in der Kitte des ersten
Volumens befindet und wo hinein eine Vorrichtung zum Pipettieren von Flüssigkeit eingesetzt werden kann und
(d) eine auf den Oberflächen der Matrix immobilisierten fixierten Komponente, die mit der mobilen Komponente
in einer als eine Funktion der Konzentration der Moleküle der mobilen Komponente meßbaren Geschwindigkeit oder
einen 'fiußmaß zu reagieren vermag.
13.Festphasen-Matrix nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Trägeroberfläche ein zylindrisches Rohr ist, dessen eines Ende geschlossen ist, wodurch die Matrix ein Testrohr mit
nach innen ragenden Flügeln umfaßt.
901
COPY
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US80548077A | 1977-06-10 | 1977-06-10 | |
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