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BESCHREIBUNG
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Das Hauptpatent ......... (Anmeldung P 26 38 089.2) betrifft Lipase-Präparate,
die durch Zusatz von 10 - 50 Gewichtsteilen Süßmolkenpulver mit einem Gehalt von
8 - 20 % Molkenprotein pro 1 Gewichtsteil Lipase stabilisiert sind.
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Es wurde nun gefunden, daß Lipase niciit-tierischen Ursprungs ganz
allgemine durch tierisch-globuläre Proteine beziehungsweise Proteingemische stabilisiert
werden kann.
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Die Erfindung betrifft die durch die Patantansprüche gekennzeichnet
Gegenstände.
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Als tierisch-globuläre Proteine kommen beispielsweise die folgenden
in Betracht: Albumine (Ov-albumin, Lact-albumin, sorum-albumin), Globuline, Prolamine
und Gluteline, Globine, Protamine, Histone. Derartige Prote ne können einzel verwendet
werden oder aber es können auch Gemischc aus diesen Proteinen zur Anwendung kommen.
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Erfidnungsgemäße werden zur Stabilisierung von einem Gewichtsteil
Lipase 5 - 50 Gewichtsteile, vorzugsweise 5 - 25 Gewichts teile Einweiß verwendet.
Insbesondere werden lo - 20 Gezichtsteile Eiweiß verwendet pro ein Gesichtsteil
Lipase.
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Anstelle der reinen Proteine können auch Proteinpräparate vorwendet
werden, deren Hauptbestandteil ein tierisch-globuläres Protein beziehungsweise Proteingemisch
ist. Solche Präparate sind im Handel und werden nach hierzufür üblichen Gewinnungsmethoden
und eventueller anschließender Anreichung des glebularen Proteins aus natürlichen
Proteinquellen erhalten (verglciche Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie,
Dritte Auflage, Band 14, Seiten 409 - 431). Beispiele für
solche
Präparatc sind: Molkenproteinpräparate, Plasmaproteinpräparate, Proteinpräparte
des Eiklars.
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Die zu verwendende Menge richtet sich bei solchen Präparaten die noch
andere Bestandteile enthalten, ausschließlich nach der Menge des globluären Proteinanteils.
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Die erfindungsgemäßen Präparate können auch 0,1 - 5 Gewichtsteile,
vorzugsweise 1 - 2 Gewichtsteile (bezogen auf ein Gewichtsteil Lipase) Mineralstoffe
enthalten. Als derartige Mineralstoffe kommen beispielsweise in Betracht: Phosphate,
Citrate, Chloride, Sulfater Carbonate des Natriums, Kaliums, Calciums, Magnesiums
und spurenweise auch des Eisens. Diese Salze können einzeln oder als Gemsich vorliegen.
Falls sie im Gemisch vorliegen, ist der Gehalt der Metalle in der Salzmischung in
Gewi chtsprozenten beispielsweise der folgende: Natrium 2 - 8, vorzugsveise 4 -
5 Gewichtsprozent, Kalium 10 - 30, vorzugsweise 15 - 20 Gewichtsprozent; Calcium
2 - 30, vorzugsweise 4- 15 Gewichtsprozent; Magnesium 0,5 - 3, Vorzugsweise 0,8
- 1,5 Gewichtsprozent; Eisen 0,01 - 0,1, vorzugsweise 0,02 - 0,08 Gewichstsprozent.
Innerhalb der Mischung kommen, bezogen auf ein Gewichteil Magnesium beispielsweise
3 - 8, vorzugsweise 5 - 7 Gewichtsteile Natrium, 2 - 15, vorzugsweise 4 - 8 Gewichtsteile
Calcium und 15 - 30, vorzugsweise 18 - 25 Gewichtsteile Kalium.
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Der Gehalt an Säuren in Gewichtsprozenten in der Salzmischung ist
beispielsweise folgender: Phosphatanion (PO43-) 10 - 50, vorzugsweise 15 - 25 Gewichtsprozent;
Citratanion 10 - 30, vorzugsweise 15 - 25 Gewichtsprozent; Chloridanion 10 - 20,
vorzugsweise 12 - 16 Gewichtsprozent; Sulfatanion 2 -. 8, vorzugsweise 3 - 6 Gewichtsprozent;
Carbonatanion 2 - 15, vorzugsweise 5 - 10 Gewichtsprozent; bezogen auf 1 g Sulfatanion
kommen innerhalb der Mischung beispielsweise 2 - 5 vorzugsweise 2,5 - 3 Gewichtsteile
Chloridanion, 3 - 10, vorzugsweise 14 - 6 Gewichtsteile Phosphatanion, 3 - 10, vorzugsweise
4 - 6 Gewichtsteile Citratanion und 0,5 - 2, vorzugsweise 0,8 - 1,5 Carbonatanion.
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bezogen auf 100 g Gewicht dor Präparate enthalten diese im allgemeinen
0,5 - 5 Gewichtsteile, vorzugsweise 0,8 - 2, insbesondere 0,8 - 1,5 Gewichtsteile
Lipase.
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Die zu stabilisierende Lipase kann tierischen oder nichttierischen
Ursprungs sein. Beispielsweise handelt es sich um Lipase aus Pankreas oder um Lipase
aus Pflanzen, beispielsweise aus Ricinusbohnen oder Lipase aus Mikroorganismen,
beispielsweise aus Pilzen wie Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oryzae,
Rhizopus delemar, Aspergillusarten wie Aspergillus niger9 Aspergillus oryzae oder
Welchia perfringens, Mycotorula lipolytica, Candida cyclindracea, Geotrichum candidum.
Vorzugsweise handelt es sich um Lipase nicht-tierischen Ursprungs.
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Die Gewinnung der in Betracht lcommenden Lipasen erfolgt in der hierfür
bekannten weise und ist beispielsweise angegeben in-Ul.lmanns Encyklopädie der technischen
Chemie, Band 7 (1956), Seite 391 - 397, 406 - 411 oder in Bulletin de la Société
de Chimie Biologique 1966, 48 Nr. 6, Seite 747 - 770 und 1968, 50 Nr. 11, Seite
2179 - 2182. Beispielsweise wird eine Pilzlipase- entsprechend Bulletin de la Société
de Chimie Biologique 1966, 48 Nr. 6, Seite 747 ff. wie folgt erhalten. Das nach
Abtrennung des Myzels aus Kulturen von Pilz sporen erhaltene Filtrat wird im Valcuum
bei 300 C konzentriert, zentrifugiert und aus der oberen Schicht nach Verdünnung
das Enzym.mit Aceton bei 0° C gefällt und im Vakuum getrpocknet, Zur weiteren Reinigung
wird in Wasser suspendiert, zentrifugiert-, S04-Ionen durch Zusatz von Bariumchlorid
ausgefällt, das Enzym wiederum mit Aceton ausgefällt und der so erhaltene Rückstand
nach Auflösen in destilliertem Wasser über eine mit Calcium belandene Austauschsäule
XE64 bei pH 4,7 aufgebracht und durch eine Calziumacetatlösung bei Pl' 5,7 eluiert.
Aus dem Eluat wird nach Einstellen auf pH 6 mit verdünntem Ammoniak das Enzym mit
Aceton gefällt und
das so erhaltene Produkt durch Suspension in
demineralisiertem Wasser nochmals über eine Sephadexsäule G25 chromatographiert.
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Aus dem so erhaltenen Eluat wird durch Gefriertrocknung (-70° C) die
Lipase als Pulver erhalten0 Besonders auffällig ist die stabilisierende Wirkung
bei einer Lipase aus Rhizepusarten, insbesondere Rhizopus arrhizus.
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Gemäß dem obenangegebenen Verfahren aus Bull. Soc. Chim.
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Biol. 1966, Seite 747 ff. wird beispielsweise eine Lipase mit einer
Aktivität von 8.800.Q00 Einheiten/g (Besti;nmung mittels einer Olivenc;lemulsion)
erhalten. Diese Lipase stellt ein reines Product dar und ist hauptsächlich dadurch
gekennzeichnet, daß sie zwei Optima-pH besitzt, das eine um pH 7 das andere um pII
3,5. Sie verhält sich sowohl in der Papierelektrophorese, in der Polyacrylamidgelektrophorese
als auch in der Chromatographie an Sephadexsäulen wie ein einziges Protein und nähert
sich in ihrer Wirkungsweise insbesondere auf Triglyceride der Pankreas-Lipase. (Weitere
Eigen schaften siehe Bull. Soc. Chim. Biol. 1966, 48 Nr. 6, Seite 756 - 766.) Eine
Aktivitätssteigerung dieser Lipase kann durch eine weitere Reinigung über eine Sephadexkolonne
G 700 (in destilliertem Wasser) erhalten werden, wonach man ein Produkt erhält,
mit einer Aktivität von 11.000.000 Einheiten/g (siehe Bull. Soc. Chim. Biol. 1968,
50 Nr. 11, Seite 2179 - 2182).
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Die erfindungsgemäßen Proteine bewirken eine Verbesserung der Haltbarkeit
von Lipase, beimn Zusammenbringen und/oder Mischen mit Zusätzen wie sie für Enzym-Hyndelspräparate
üblich sind, insbesondere solchen mit oberflächenaktiven Eigenschaften wie aktive
Tenerde, Aluminiumhydroxyd,
Aluminiumoxyd, hochdisperse Kieselösäure
(Aerosil), Magnesiumcarbonat, Aluminiumsalzen (Aluminiumtrisilikate, Aluminiumphosphate),
Dialkylpolysiloxane, Silicagel, Kieselgur und ähnliche.
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Unter dem Bcgriff "aktive Tonerde" werden pulverförmige Oxyde, Oxydhydrate,
Hydroxyde und basische Salze des Aluminiums verstanden, die nicht weniger als 40
% Al 203 enthalten (siehe Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, dritte Auflage,
Band 4, Seite 545/546 und Band 13, Seite 356).
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Insbesondere handelt es sich um ein Aluminiumhydroxyd-Gel, welches
durch Fällung von Aluminiumsalz-Lösungen (zum Beispiel Sulfat Lösungen) mit Ammoniumcarbonat
oder Natriumcarbonat und Trocknen des Filterkuchens erhalten wird. (Gehalt an Al203
nicht weniger als 47 , vorzugsweise 50 - 60 %.) Dcr pH einer 4 %igen (Gewichts/Vakuum)
Suspension in CO2-freiem Wasser- soll nicht über 10;0 liegen. Solche Aluminiuhydroxyd-Gele
sind zum Beispiel unter der Bezeichnung "Tag" im Handel.
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Bei der hochdispersen Kieselsäure handelt es sich um eine Kieselsäure,
die durch Hydrolyse von Siliciumtetrachlorid in der Wasserstoff-Flamme erhalten
wird (Aerosil). B ispielsweise hat eine solche Kieselsäure folgende Nenngrößen:
Oberfläche (m2/g) nach BET: 50 - 225, vorzugsweise 120 - 225 bzw. 170 - 225; mittlere
Größe der Primärteilchen in Millimikron: 12 - 30, vorzugsweise 12 - 16; Schüttgewiclit
(normale Ware) in g/Liter: ca. 60; Stampfvolumen (normale Ware nach DIN 53 194)
in ml/100 g: 1500 - 2000, vorzugsweise 1700 - 2000; pH-Wert (nach DIN 53 200). in
4 %iger wässriger Dispersion: 3,5 - 4,3, vorzugsweise 3,6 - 4,3.
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Die Dialkylpolysiloxane sind bekannt und im Handelt erhältlich und
werden nach den üblichen Verfahren erhalten, beispielsweise durch Polymerisation
von Siliconen oder durch ilydrolyse und chemische Kondensation von einer oder mehreren
hydrolysierbaren Siliconverbindungen der allgemeinen Formel R2 SiX2, wobei R eine
niedere Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 - 2 C-Atomen ist
und X ein Halogenatom (beispielsweise Chlor) oder eine niedere Alkoxygruppe darstellt.
Beispiele für solche Ausgangsverbin dingen sind Dimethyldichlorsilan, Diäthyldichlorsilan,
Dimethyldiäthoxysilan, Methyläthyldichlorsilan, Dibutyldichlorsilan, Dihexylchlorsilan,
Äthylbutyldiäthoxysilan und ähnliche.
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Hierbei wird beispielsweise das hydrolysierbare Silicon unter definierten
Bedingungen mit Wasser umgesetzt und so ein Polysiloxan mit der gewünschten Viskosität
erhalten. Das bevorzugte Polysiloxan ist Dimethylpolysiloxan.
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Beispielsweise handelt es sich um ein Material mit dem Freinamen Simethicon.
Dieses Material besteht im wesentlichen aus Dimethylpolysiloxan und 4 bis 4 1/2
Gewichtsprozent eines Siliciumdioxid-Aerogels. So besitzt beispielsweise das Silicon-Fließmittel
dieser Mischung, welche von der Dow-Corning Chemical Company hergestellt wird, ein
Molekulargewicht zwischen 14.000 und 21.000, einen Siliciumgehalt von 37,3 bis 38,5
, eine Viskosität bei 25 C von 300 bis 600 centistokes (cs), eine Dichte bei 250
C von 0,965 bis 0,970 und einen Brechungsindex 25 von 1.403 + 0,002.
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nD -Das mittlere Molgewicht der Dialkylpolysiloxane liegt vorzugsweise
zwischen 14.000 und 30.000, beispielsweise bei ca. 24,000. Die Viskosität der Dialkylpolysiloxane
kann beispiclsweise zwischen 900 - 1.100 cp (250 C) liegen; vorzugsweise
liegt
sie zwischen 950 - 1050 cp. Der Anteil an Niederpolymeren (bis zu einem Molgewicht
von 700) soll gering sein und unter 0,5 % liegen.
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Silica-Gel ist eine aktive Kieselsäure, die zum Beispiel aus 5 mm
- 4 mm großen Körncrn bestcht. Die innere Gesamtoberfläche von 1 g Silica-Gel kann
zum Beispiel 400 - 800 qm groß sein (siehe Römpp Chemie-Lexikon 1966 Band IV 5915
-5916; Ullmanns Encyclopädie der Technischen Chemie Band 15 (1964) Seite 716 - 732).
Vorzugsweise liegt die Korngröße zwischen 5 - 100 mµ vorzugsweise 10 - 50 mfL. Das
verwendetc Siliciumdioxid hat beispielsweise eine Oberflache von 2 2 100 - 250 m
/g, vorzugsweise 150 bis 200 m /g. Der Wassergehalt lie6t beispielsweise bei 0,5
- 2 , vorzugsweise zwischen 0,7 -1,5 . Die Herstellung des Siliciumdioxids kann
nach bekannten Verfahren erfolgen, wie durch Einwirkung von Schwefelsäure auf Wasserglas
oder durch Hydrolyse von SiCl4 (Degussa-Verfahren; siehe beispielsweise US-Patent
3 os6 851, DAS 1 163 784, DAS 1 210 421, DAS 1 150 955).
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Die lipasehaltigen Präparate können darüberhinaus noch weitere Enzyme
enthalten, zum Beispiel proteolytisch wirksame Enzyme und Amylasen (zum Beispiel
Proteasen und Amylasen, wie sie beispielsweise in Enzymkonzentraten asu Aspergillus-Arten
wie Aspergillus oryzae oder auch Aspergillus parastiticus vorliegen).
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Die Herstellung der Praparate erfolgt durch Vermischen der Lipase
mit dem erfindungsgemäßen Stabilisierungsmittel sowie gegebenenfalls weiteren üblichen
Zusätzen in hierfür üblichen Mischern und Homogenisiergeräten (zum Beispiel Taumelmischer,
Zwangsmischer).
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Beispiel 1 Ein Gewichtstcil Lipase wird mit 20 Gewichtsteilen Aluminiu,-hydroxyd-Gel
(getrocknet) und 13,5 Teilen Eialbumin in einem Mörser fein zerrieben und vcrmischt
(Temperatur 20° C).
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wird das Eialbumin weggelassen und durch 13,5 Gewichtsteile Glucose
ersetzt, dann zeigt sich, daß nach dem Vermischen gegenüber der Mischung mit dem
Eialbumin ein Aktivitätsvorlust von rund 40 % eingetreten ist.