DE2807090C2 - - Google Patents

Description

Das nicht vorveröffentlichte Patent 26 38 089 betrifft Lipase- Präparate, die durch Zusatz von 10-50 Gewichtsteilen Süßmolken­ pulver mit einem Gehalt von 8-20% Molkenprotein pro 1 Gewichtsteil stabilisiert sind.

Es wurde nun gefunden, daß Lipase, insbesonders solche nicht-tierischen Ursprungs, ganz allgemein durch tierisch-globuläre Proteine beziehungs­ weise Proteingemische stabilisiert werden kann.

Die Erfindung betrifft die durch die Patentansprüche gekenn­ zeichneten Gegenstände.

Als tierisch-globuläre Proteine kommen beispielsweise die folgenden in Betracht: Albumine (Ov-albumin, Lact-albumin, Scrum-albumin), Globuline, Globine Protamine, Histone. Derartige Proteine können einzeln verwendet werden oder aber es können auch Gemische aus diesen Proteinen zur Anwendung kommen.

Erfindungsgemäß werden zur Stabilisierung von einem Gewichts­ teil Lipase 5-50 Gewichtsteile, vorzugsweise 5-25 Gewichts­ teile Eiweiß verwendet. Insbesondere werden 10-20 Gewichts­ teile Eiweiß verwendet pro ein Gewichtsteil Lipase.

Anstelle der reinen Proteine können auch Proteinpräparate ver­ wendet werden, deren Hauptbestandteil ein tierisch globuläres Protein beziehungsweise Proteingemisch ist. Solche Präparate sind im Handel und werden nach hierfür üblichen Gewinnungs­ methoden und eventueller anschließender Anreichung des glo­ bulären Proteins aus natürlichen Proteinquellen erhalten (vergleiche Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie, Dritte Auflage, Band 14, Seiten 409-431). Beispiele für solche Präparate sind: Molkenproteinpräparate, Plasmaprotein­ präparate, Proteinpräparate des Eiklars.

Die zu verwendende Menge richtet sich bei solchen Präparaten die noch andere Bestandteile enthalten, ausschließlich nach der Menge des globulären Proteinanteils.

Die erfindungsgemäßen Präparate können natürlich auch 0,1-5 Gewichts­ teile, vorzugsweise 1-2 Gewichtsteile (bezogen auf ein Ge­ wichtsteil Lipase) Mineralstoffe enthalten. Als derartige Mineralstoffe kommen beispielsweise in Betracht: Phosphate, Citrate, Chloride, Sulfate, Carbonate des Natriums, Kaliums, Calciums, Magnesiums und spurenweise auch des Eisens. Diese Salze können einzeln oder als Gemisch vorliegen. Falls sie im Gemisch vorliegen, ist der Gehalt der Metalle in der Salz­ mischung in Gewichtsprozenten beispielsweise der folgende:
Natrium 2-8, vorzugsweise 4-5 Gewichtsprozent, Kalium 10-30, vorzugsweise 15-20 Gewichtsprozent; Calcium 2-30, vorzugs­ weise 4-15 Gewichtsprozent; Magnesium 0,5-3, vorzugsweise 0,8-1,5 Gewichtsprozent; Eisen 0,01-0,1, vorzugsweise 0,02-0,08 Gewichtsprozent. Innerhalb der Mischung kommen, bezogen auf ein Gewichtsteil Magnesium beispielsweise 3-8, vorzugsweise 5-7 Gewichtsteile Natrium, 2-15, vorzugsweise 4-8 Gewichtsteile Calcium und 15-30, vorzugsweise 18-25 Gewichtsteile Kalium.

Der Gehalt an Säuren in Gewichtsprozenten in der Salzmischung ist beispielsweise folgender: Phosphatanion (PO₄ ^3-) 10-50, vorzugsweise 15-25 Gewichtsprozent; Citratanion 10-30, vorzugsweise 15-25 Gewichtsprozent; Chloridanion 10-20, vorzugsweise 12-16 Gewichtsprozent; Sulfatanion 2-8, vorzugsweise 3-6 Gewichtsprozent; Carbonatanion 2-15, vorzugsweise 5-10 Gewichtsprozent; bezogen auf 1 g Sulfat­ anion kommen innerhalb der Mischung beispielsweise 2-5, vor­ zugsweise 2,5-3 Gewichtsteile Chloridanion, 3-10, vorzugs­ weise 4-6 Gewichtsteile Phosphatanion, 3-10, vorzugsweise 4-6 Gewichtsteile Citratanion und 0,5-2, vorzugsweise 0,8-1,5 Carbonatanion.

Bezogen auf 100 g Gewicht der Präparate enthalten diese im allgemeinen 0,5-5 Gewichtsteile, vorzugsweise 0,8-2, insbesondere 0,8-1,5 Gewichtsteile Lipase.

Die zu stabilisierende Lipase kann tierischen oder nicht- tierischen Ursprungs sein. Beispielsweise handelt es sich um Lipase aus Pankreas oder um Lipase aus Pflanzen, bei­ spielsweise aus Ricinusbohnen oder Lipase aus Mikroorga­ nismen, beispielsweise aus Pilzen wie Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oryzae, Rhizopus delemar, Aspergillusarten wie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Welchia perfringens, Mycotorula lipolytica, Candida cyclindracea, Geotrichum candidum. Vorzugsweise handelt es sich um Lipase nicht-tierischen Ursprungs.

Die Gewinnung der in Betracht kommenden Lipasen erfolgt in der hierfür bekannten Weise und ist beispielsweise angegeben in Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie, Band 7 (1956), Seite 391-397, 406-411 oder in Bulletin de la Socit de Chimie Biologique 1966, 48 Nr. 6, Seite 747-770 und 1968, 50 Nr. 11, Seite 2179-2182. Beispielsweise wird eine Pilz­ lipase entsprechend Bulletin de la Socit de Chimie Biolo­ gique 1966, 48 Nr. 6, Seite 747 ff. wie folgt erhalten. Das nach Abtrennung des Myzels aus Kulturen von Pilzsporen er­ haltene Filtrat wird im Vakuum bei 30°C konzentriert, zen­ trifugiert und aus der oberen Schicht nach Verdünnung das Enzym mit Aceton bei 0°C gefällt und im Vakuum getrocknet. Zur weiteren Reinigung wird in Wasser suspendiert, zentri­ fugiert, SO₄-Ionen durch Zusatz von Bariumchlorid ausge­ fällt, das Enzym wiederum mit Aceton ausgefällt und der so erhaltene Rückstand nach Auflösen in destilliertem Wasser über eine mit Calcium beladene Austauschsäule XE 64 bei pH 4,7 aufgebracht und durch eine Calziumacetatlösung bei pH 5,7 eluiert. Aus dem Eluat wird nach Einstellen auf pH 6 mit verdünntem Ammoniak das Enzym mit Aceton gefällt und das so erhaltene Produkt durch Suspension in demineralisiertem Wasser nochmals über eine Sephadexsäule G 25 chromatographiert. Aus dem so erhaltenen Eluat wird durch Gefriertrocknung (-70°C) die Lipase als Pulver erhalten.

Besonders auffällig ist die stabilisierende Wirkung bei einer Lipase aus Rhizopusarten, insbesondere Rhizopus arrhizus. Gemäß dem obenangegebenen Verfahren aus Bull. Soc. Chim. Biol. 1966, Seite 747 ff. wird beispielsweise eine Lipase mit einer Aktivität von 8 800 000 Einheiten/g (Bestimmung mittels einer Olivenölemulsion) erhalten. Diese Lipase stellt ein reines Produkt dar und ist hauptsächlich dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie zwei Optima-pH besitzt, das eine um pH 7 das andere um pH 3,5. Sie verhält sich sowohl in der Papier­ elektrophorese, in der Polyacrylamidgelelektrophorese als auch in der Chromatographie an Sephadexsäulen wie ein ein­ ziges Protein und nähert sich in ihrer Wirkungsweise insbe­ sondere auf Triglyceride der Pankreas-Lipase. (Weitere Eigen­ schaften siehe Bull. Soc. Chim. Biol. 1966, 48 Nr. 6, Seite 756-766.) Eine Aktivitätssteigerung dieser Lipase kann durch eine weitere Reinigung über eine Sephadexkolonne G 100 (in destilliertem Wasser) erhalten werden, wonach man ein Produkt enthält, mit einer Aktivität von 11 000 000 Einhei­ ten/g (siehe Bull. Soc. Chim. Biol. 1968, 50 Nr. 11, Seite 2179-2182).

Die erfindungsgemäß eingesetzten Proteine bewirken eine Ver­ besserung der Haltbarkeit von Lipase beim Zusammenbringen und/oder Mischen mit Zusätzen, wie sie für Enzym-Handels­ präparate üblich sind, insbesondere solchen mit oberflächen­ aktiven Eigenschaften wie aktive Tonerde, Aluminiumhydroxyd, Aluminiumoxyd, hochdisperse Kieselsäure (Aerosil), Magne­ siumcarbonat, Aluminiumsalzen (Aluminiumtrisilikate, Alu­ miniumphosphate), Dialkylpolysiloxane, Silicagel, Kiesel­ gur und ähnliche.

Unter dem Begriff "aktive Tonerde" werden pulverförmige Oxyde, Oxydhydrate, Hydroxyde und basische Salze des Alu­ miniums verstanden, die nicht weniger als 40% Al₂O₃ ent­ halten (siehe Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie, dritte Auflage, Band 4, Seite 545/546 und Band 13, Seite 356). Insbesondere handelt es sich um ein Aluminiumhydroxyd-Gel, welches durch Fällung von Aluminiumsalz-Lösungen (zum Beispiel Sulfat-Lösungen) mit Amminiumcarbonat oder Natriumcarbonat und Trocknen des Filterkuchens erhalten wird (Gehalt an Al₂O₃ nicht weniger als 47%, vorzugsweise 50-60%). Der pH einer 4%igen (Gewicht/Vakuum) Suspension in CO₂-freiem Wasser soll nicht über 10,0 liegen. Solche Aluminiumhydroxyd- Gele sind zum Beispiel unter der Bezeichnung "Teg" im Handel.

Bei der hochdispersen Kieselsäure handelt es sich um eine Kieselsäure, die durch Hydrolyse von Siliciumtetrachlorid in der Wasserstoff-Flamme erhalten wird (Aerosil). Bei­ spielsweise hat eine solche Kieselsäure folgende Kenngrößen:
Oberfläche (m²/g) nach BET: 50-225, vorzugsweise 120-225 bzw. 170-225; mittlere Größe der Primärteilchen in Milli­ mikron: 12-30, vorzugsweise 12-16; Schüttgewicht (nor­ male Ware) in g/Liter: ca. 60; Stampfvolumen (normale Ware nach DIN 53 194) in ml/100 g: 1500-2000, vorzugsweise 1700-2000; pH-Wert (nach DIN 53 200) in 4%iger wäßriger Dispersion: 3,5-4,3, vorzugsweise 3,6-4,3.

Die Dialkylpolysiloxane sind bekannt und im Handel erhält­ lich und werden nach den üblichen Verfahren erhalten, beispiels­ weise durch Polymerisation von Siliconen oder durch Hydrolyse und chemische Kondensation von einer oder mehreren hydrolysierbaren Siliconverbindungen der allgemeinen Formel R₂SiX₂, wobei R eine niedere Alkylgruppe mit 1-3 Kohlen­ stoffatomen, vorzugsweise 1-2 C-Atomen ist und X ein Halogenatom (beispielsweise Chlor) oder eine niedere Alk­ oxygruppe darstellt. Beispiele für solche Ausgangsverbin­ dungen sind Dimethyldichlorsilan, Diäthyldichlorsilan, Dime­ thyldiäthoxysilan, Methyläthyldichlorsilan, Dibutyldichlor­ silan, Dihexylchlorsilan, Äthylbutyldiäthoxysilan und ähn­ liche.

Hierbei wird beispielsweise das hydrolysierbare Silicon unter definierten Bedingungen mit Wasser umgesetzt und so ein Poly­ siloxan mit der gewünschten Viskosität erhalten. Das bevor­ zugte Polysiloxan ist Dimethylpolysiloxan. Beispielsweise handelt es sich um ein Material mit dem Frei­ namen Simethicon. Dieses Material besteht im wesentlichen aus Dimethylpolysiloxan und 4 bis 4 ¹/₂ Gewichtsprozent eines Siliciumdioxid-Aerogels. So besitzt beispielsweise das Silicon-Fließmittel dieser Mischung ein Moleku­ largewicht zwischen 14 000 und 21 000, einen Siliciumgehalt von 37,3 bis 38,5%, eine Viskosität bei 25°C von 300 bis 600 centistokes (cs), eine Dichte bei 25°C von 0,965 bis 0,970 und einen Brechungsindex n_{D ²⁵ von 1.403 ± 0,002. Das mittlere Molgewicht der Dialkylpolysiloxane liegt vor­ zugsweise zwischen 14 000 und 30 000, beispielsweise bei ca. 24 000. Die Viskosität der Dialkylpolysiloxane kann bei­ spielsweise zwischen 900-1100 cp (25°C) liegen; vorzugsweise liegt sie zwischen 950-1050 cp. Der Anteil an Niederpolymeren (bis zu einem Molgewicht von 700) soll gering sein und unter 0,5% liegen. Silica-Gel ist eine aktive Kieselsäure, die zum Beispiel aus 5 mµ-4 mm großen Körnern besteht. Die innere Gesamtober­ fläche von 1 g Silica-Gel kann zum Beispiel 400-800 qm groß sein (siehe Römpp Chemie-Lexikon 1966 Band IV 5915- 5916; Ullmanns Encyclopädie der Technischen Chemie Band 15 (1964) Seite 716-732). Vorzugsweise liegt die Korngröße zwischen 5-100 mµ, vorzugsweise 10-50 mµ. Das verwen­ dete Siliciumdioxid hat beispielsweise eine Oberfläche von 100-250 m²/g, vorzugsweise 150 bis 200 m²/g. Der Wassergehalt liegt beispielsweise bei 0,5-2%, vorzugsweise zwischen 0,7- 1,5%. Die Herstellung des Siliciumdioxids kann nach bekannten Verfahren erfolgen, wie durch Einwirkung von Schwefelsäure auf Wasserglas oder durch Hydrolyse von SiCl4 (Degussa-Verfahren; siehe beispielsweise US-Patent 30 86 851, DE-AS 11 63 784, DE-AS 12 10 421, DE-AS 11 50 955). Die lipasehaltigen Präparate können darüber hinaus noch weitere Enzyme enthalten, zum Beispiel proteolytisch wirksame Enzyme und Amylasen (zum Beispiel Proteasen und Amylasen, wie sie beispielsweise in Enzymkonzentraten aus Aspergillus-Arten wie Aspergillus oryzae oder auch Aspergillus parastiticus vorliegen). Die Herstellung der Präparate erfolgt durch Vermischen der Li­ pase mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Stabilisierungsmittel sowie gegebenenfalls weiteren üblichen Zusätzen in hierfür üblichen Mischern und Homogenisiergeräten (zum Beispiel Taumelmischer, Zwangsmischer). Beispiel 1 Ein Gewichtsteil Lipase wird mit 20 Gewichtsteilen Aluminium­ hydroxyd-Gel (getrocknet) und 13,5 Teilen Eialbumin in einem Mörser fein zerrieben und vermischt (Temperatur 20°C). Wird das Eialbumin weggelassen und durch 13,5 Gewichtsteile Glucose ersetzt, dann zeigt sich, daß nach dem Vermischen gegenüber der Mischung mit dem Eialbumin ein Aktivitätsver­ lust von rund 40% eingetreten ist.}

Claims (4)

1. Lipase enthaltende Enzympräparate, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Stabilisierungsmittel auf ein Gewichts­ teil Lipase 5-50 Gewichtsteile eines tierisch globulären Proteins beziehungsweise Proteingemisches enthalten, wobei 10-50 Gewichtsteile eines Proteins oder einer Proteinmischung mit einem Gehalt von 8-20 Gewichtsprozent Molkenprotein ausgenommen sind.

2. Präparate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Stabilisierungsmittel Eialbumin oder Süßmolkenpulver mit einem Gehalt von 21-50 Gewichts­ prozent Molkenprotein enthalten.

3. Verfahren zur Herstellung des Lipase enthaltenden Enzympräparates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipase pro 1 Gewichtsteil mit 5-50 Gewichtsteilen eines tierisch globulären Proteins beziehungsweise Proteingemisches als Stabilisierungs­ mittel, wobei 10-50 Gewichtsteile eines Proteins oder einer Proteinmischung mit einem Gehalt von 8-20 Gewichtsprozent Molkenprotein ausgenommen sind, vermischt.

4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung des Präparates nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stabilisierungsmittel Eialbumin oder Süßmolkenpulver mit einem Gehalt von 21-50 Gewichtsprozent Molkenprotein einsetzt.