DE2408998A1 - Verfahren zur herstellung eines fructan abbauenden enzyms - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines fructan abbauenden enzyms

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DE2408998A1 DE19742408998 DE2408998A DE2408998A1 DE 2408998 A1 DE2408998 A1 DE 2408998A1 DE 19742408998 DE19742408998 DE 19742408998 DE 2408998 A DE2408998 A DE 2408998A DE 2408998 A1 DE2408998 A1 DE 2408998A1
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Description

Priorität: 26. Februar 1973, Japan, Nr. 22 843/1973
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Fructan abbauenden Enzyms >
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein neues Verfahren zur Herstellung eines Fructan abbauenden Enzyms mit Hilfe eines ein Fructan abbauendes Enzym bildenden Mikroorganismus des Genus Talaromyces, Eupenicillium, Sporotrichum, Sordaria, Chaetomium,-Gelasinospora, Stachybotris oder Actinomyces.
Es hat sich kürzlich gezeigt, daß Zahn- und Mundkrankheiten, wie Alveolar-Pyorrhöe, Periodonditis und dergleichen, auf die Bildung und Ablagerung von Zahnbelag zurückzuführen sind, der Läevan, eine Art eines Fructans, enthält, das durch gewisse im Mund vorkommende Mikroorganismen gebildet wird. Es wurde ferner gefunden, daß ein Fructan abbauendes Enzym ein geeignetes Mittel zum Verhindern dieser Krankheiten ist (gleichzeitig eingereichte deutsche Patentanmeldung P der Anmelderin (entsprechend japanischer Patentanmeldung 22842/1973)).
Es wurde bisher berichtet, daß ein Fructan abbauendes Enzym durch
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Schimmelpilze der Genera Aspergillus, Fusarium, Humichora, Penicillium und dergleichen und Bakterien der Genera Arthrobacter, Streptococcus, Streptomyces und dergleichen' gebildet .wird.
Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß Mikroorganismen des Genus Talaromyces, Eupenicillium, Sporotrichum, Sordaria, Chaetomium, Gelasinospora, Stachybotris oder Actinomyces ein Fructan abbauendes Enzym bilden können, das durch Hydrolyse die ^-(2-*6)- und/i-(2-»1)-Fructo-furanosidbindung spalten kann, so daß die Viskosität von Fructan innerhalb kurzer*Dauer vermindert wird, und daß insbesondere ein Mikroorganismus des Genus Talaromyces in weit höherem Maß zur Produktion eines Fructan abbauenden Enzyms befähigt ist, als die bisher bekannten Mikroorganismen. Auf diesen Feststellungen beruht das erfindungsgemäße Verfahren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues und wirksames Verfahren zur Herstellung eines Fructan abbauenden Enzyms durch Fermentation zugänglich zu machen.
Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fructan abbauenden Enzyms durch Züchtung eines Mikroorganismus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einem Kulturmedium einen Mikroorganismus des Genus Talaromyces, Eupenicillium, Sporotrichum, Sordaria, Chaetomium, Gelasinospora, Stachybotris oder Actinomyces, der ein Fructan abbauendes Enzym bildet, züchtet und das gebildete Fructan abbauende Enzym aus der Kulturbrühe gewinnt.
Zu erfindungsgemäß geeigneten Mikroorganismen, die ein Fructan abbauendes Enzym bilden, gehören beispielsweise die nachstehend aufgeführten Mikroorganismen, die zum Teil bei dem Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial
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Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, hinterlegt sind und von dem Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, Japan, und im Institute for Fermentation, Osaka, Japan, erhältlich sind.
Hinterlegungsnummer des Mikroorganismus
Talaromyces flavus var. flavus Sordaria humana Chaetomium subspirale Gelasinospora longispora Stachybotris lobulata Eupenicillium javanicum Sporotrichum schenkii Talaromyces stipitatus Talaromyces luteus Sordaria fimicola Chaetomium aureum Chaetomium atrobrunneum Gelasinospora cerealis Stachybotris atra Actinomyces longisporus Actinomyces cyanoalbus Actionomyces lavendofoliae
Es ist zu betonen, daß erfindungsgemäß auii natürliche und künstliche Mutanten und Varianten der vorstehend aufgezählten Mikroorganismen verwendet werden können.
Die vorstehend angegebenen Mikroorganismen sind bekannte Stämme, und ihre mykologischen Eigenschaften sind in den nachstehenden Literaturstellen beschrieben:
F 223-8 1892 ■ IFO-12885
F 651-4 189o IFO-12857
F 216-4 1888 IFO-12882
F 652-2 1889
F 61-1 1891
F 11-6 IAM-8o67
F 61-7 IFO-5984
F 223-4
F 222-8
F 222-1
F 2o3-4
F 2o3-1
F 218-1
F 82-10
Talaromyces flavus var. flavus
F 223-8
Stolk et al.: Studies in Micology, Bd. 2, S. 11 (1972)
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T. stipitatus
T. luteus
Sordaria humana
S. fimicola
Chaetomium subspirale
C. aureum
C. atrobrunneum
G. cerealis
Stachybotris lobulate
S. atra
F 223-4
F 222-8
F 651-4
F 222-1
F 216-4
F 2o3-4
F 2o3-1
Gelasinospora longispora F 652-2
F 218-1
F 61-1 F 82-1o Stolk et al.: Studies in Micology, Band 2, S. 29 (1972) Stolk et al.: Studies in Micology, Bd. 2,
s. 23 (1972) Cain: Bibliotheca Mycologica, Bd. 9» S. 18 (I934-) Cain: Bibliotheca Mycologica, Bd. 9»
s. 17 (1934-) Udagawa: The Journal of General and Applied Microbiology, Band 6, S. 247 (i960) Ames: Bibliotheca Mycologica, Bd. 17, S. 14 (1961) Ames: Bibliotheca Mycologica, Bd. 17, S. 14 (1961) Udagawa et al.: Transactions of the Mycological Society of Japan, Bd. 8, S.
Udagawa et al.: Bulletin of the National Science Museum, Tokyo, Bd. 16, S. 326 (1973) Tsubaki: Nagaoa, Bd. 4, S. 16 (195*0 Ellis: Dematiaceous Hyphomycetes, S.
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Eupenicillium javanicum F 11-6
Sporotrichum schenkii Actinomyces logisporus
A. cyanoalbus
Stolk et al.: Persoonia, Bd. 4-, S. 398 (1967)
F 61-7 Fukumi et al.: Byogenbi s e ibut sugakusaikinhen (japanisch), St 956 (Igaku-Syoin, 1966)
IFO 12855 E.B. Shirling and D. Gottlieb: International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 18, S. 342 (1968)
IFO 12857 E.B. Shirling and D.
Gottlieb: International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 18, S. 314 (1968)
IFO 12882 E.B. Shirling and D.'
Gottlieb: International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 18, S. 339 (1968)
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein Mikroorganismus des Genus Talaromyces,, Eupenicillium, Sporotrichum, Sordaria, Chaetomium, Gelasinospora, Stachybotris oder Actinomyces, der zur Bildung eines Fructan abbauenden Enzyms befähigt ist, durch Oberflächenkultur oder Submerskultur in einem festen oder flüssigen Kulturmedium, das Nährstoffquellen enthält, unterschiedlicher Zusammensetzung gezüchtet werden, das üblicherweise als natürliches oder flüssiges Medium verwendet wird. Als Nährstoffquellen können beispielsweise Weizenkleie, Sojabohnenmehl "Pharmamedia" (hergestellt durch Traders Oil Mill Company, USA), Maisquellflüssigkeit, Pepton, .Stärke, Glucose, Saccharose, Ammoniumsulfat, Harnstoff, verschiedene anorganische Salze oder eine Kombination dieser Nährstoffe eingesetzt werden. Insbesondere
A. lavendofoliae
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dann, wenn die Züchtung in einem Kulturmedium erfolgt, dem o,5 bis 2 % Fructan (beispielsweise Laevan, erhalten aus Aerobacter levaniucum oder Inulin) zugesetzt wurde, kann, speziell in einer flüssigen Kultur, eine um das zehnfache oder stärker erhöhte Bildung eines Fructan abbauenden Enzyms er;-reicht werden als ohne Zugabe eines Fr-uctans.
Die Züchtungstemperatur und der pH-Wert des Kulturmediums sind nicht besonders kritisch; es wird jedoch in praktischer Hinsicht erfindungsgemäß bevorzugt, die Temperatur bei etwa 280C zu halten und den pH-Wert des Kulturmediums auf 5» 5 bis 7» ο einzustellen. Die Züchtungsdauer ist von den verwendeten Züchtungsbedingungen abhängig; die Züchtung kann jedoch gegebenenfalls unterbrochen werden, nachdem die Zeit festgestellt wurde, bei der die maximale Aktivität erzielt wird. Die maximale Aktivität kann gewöhnlich durch 3- bis 5-tägige Züchtung erzielt werden.
Um das gewünschte Enzym aus einer flüssigen Kulturbrühe oder wässrigem Koji-Extrakt zu gewinnen und zu reinigen, kann wahlweise jede übliche Methode angewendet werden, die bereits für die Gewinnung und Reinigung eines Enzyms aus einer Kulturbrühe oder Koji-Extrakt, der dieses Enzym enthält, bekannt war. So ist es beispielsweise möglich, irgendeine Methode zum Konzentrieren einer Kulturbrühe oder eines wässrigen Koji—Extraktes unter vermindertem Druck, eine Methode des Aussalzens mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Kochsalz und dergleichen, Methoden der fraktionierten Fällung mit einem Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, Adsorptions- und Elutionsmethoden unter Verwendung eines geeigneten Adsorptionsmittels, Fällungsmethoden unter Verwendung eines Protein-Fällungsmittels, Methoden der Fällung am isoelektrischen Punkt, Methoden zum Abtrennen von Verunreinigungen mit Hilfe eines Schwermetalls, Elektro-. dialysemethoden und ähnliche Heinigungsmethoden für sich oder in Kombination anzuwenden.
Das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältliche Fructan abbauende Enzym hat höhere Aktivität zum Abbau und zur
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raschen Verflüssigung von Fructan als die bisher bekannten Enzyme. Seine optimale Aktivität zeigt es bei einem pH-Wert von 4 bis 5» die optimale Temperatur ist 4o bis 4-50G. Der pH-Wert, bei dem es stabil ist, beträgt 3 bis 9» und es ist stabil bei einer Temperatur von nicht mehr als 550C
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher verdeutlicht, ohne daß sie auf diese beschränkt sein soll.
In einen Sakaguchi-Kolben mit 5oo ml Fassungsvermögen wurden 1oo ml eines flüssigen Kulturmediums (pH 6,o) gegeben, das o,5 % Fructan (erhalten aus Aerobacter levanicum), ο,5 % Maisquellflüssigkeit, o,5 % Pharmamedia, o,15 % Ammoniumsulfat, o,o5 % Harnstoff, o,2 % saures Kaliumphosphat, o,o3 % Magnesiumsulfat und o,o3 % Calciumchlorid enthielt. Das Medium wurde sterilisiert und mit jedem der angegebenen, ein Fructan abbauendes Enzym bildenden Mikroorganismen angeimpft. Die Züchtung wurde durch Schüttelkultur bei 28°C während 72 Stunden durchgeführt. Die Aktivität des Fructan abbauenden Enzyms wurde nach der Viskositätsverminderungsmethode und der Methode der Bildung von reduzierendem Zucker gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Zum Messen der Aktivität wurden folgende Methoden angewendet:
Viskositätsverminderungsmethode
Zu 2 ml einer 5 %-igen Lösung von Fructan (von Aerobacter levanicum) in m/2o Zitratpuffer (pH 5,4) wurde o,2 ml der Kulturbrühe gegeben, und das Gemisch wurde bei 4o°C gehalten. Nach 3 Stunden und 19 Stunden wurde die spezifische Viskosität jedes Gemisches mit Hilfe eines Ostwald-Viskosimeters gemessen.
Methode der Bildung von reduzierendem Zucker Als Vertreter für ein Fructan mit ß~(2-»6)-Bindungen als Hauptkettenbindung und für ein Fructan mit ß-(2->1)-Bindungen wurden Laevan aus Aerobacter levanicum und Inulin gewählt. Zu 1 ml einer'5 %-igen Lösung jedes Fructans in m/2o Zitratpuffer (pH 5*4)
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wurde ein ml der Kulturbrühe gegeben. Das Gemisch wurde 3>o Minuten bei 4o°C belassen. Dann wurde der so gebildete reduzierende Zucker mit Hilfe der ^i^-Dinitrosalicylsäure-Methode als Fructose bestimmt. Die Menge des Enzyms, die zur Bildung von 1 mg Fructose in 6o Minuten erforderlich ist, ist als eine Einheit definiert.
Stamm
die Viskosität vermindernde Aktivität Aktivität zur Bildung von reduzieremden ! Zucker Einheiten/ml
spezifische S Viskosität nach 3 Std.
spezif.Viskosität nach 19 £Jtd. Laevan als J Inulin als, Substrat ! Substrat
Talaromyces flavus var. flavus F 223-4
T. stipitatus
F 223-4
T. luteus
F 222-8
Sordaria humana F 561-4
S-. fimicola
F 222-1
Chaetomium subspirale F 216-4
; C. aureum
j F 2o3-4
C. atrobrunneum! F 2o3-1
1,9
4,3
4,5
3,9
5,6
4,3
4,8
5,2
o,2 18,o
2,6 1,6
1,6
1,7
4,6 o,4 o,6
2,2 2,4
3,3
3,6 2,0 2,4
14,2
33,6
3,6
o,86
o,4
9,8
7,4
1,6
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Gelasinospora 4,5
longispora
' F 652-2 5,5
G. cerealis
F 218-1
Stachybotris 5,2
lobulate
F 61-1 5 5
S. atra
F 82-10
; Eupenicillium 4,1
javanicum
F 11-6
Sporotrichum 2,6
schenkii
F 61-7
Actinomyces 2,2
logisporus
IFO 12885 5,5
A. cyanoalbus ^ # ^
IFO 12857 5,4
A. lavendofoliae
IFO 12882		 5,6
Vergleich
2,9 o,2 : 8,4
4,2 o,7 o,5
5,8 o,4 o,4
4,1 0,4 o,9
1,5 1,6 o,2
1,o 5,ο 9,4
ο,5 5,ο 1,6
2,5 1,o o,4
2.5 1,8 : ο,6
5.6 !
In einen Fermenter mit 1oo 1 Fassungsvermögen wurden 5o 1 eines flüssigen Kulturmediums (pH 6,ο) gegeben, das durch. Zugabe von o,5 % Fructan (von Aerobacter levanicum), o,5 % Pharmamedia, o,1596Ammöhiuinsulfat, 0,05 % Harnstoff, o,2 % saurem Kaliumphosphat, o,o5 % Magnesiumsulfat zu Leitungswasser erhalten worden war. Das Medium wurde sterilisiert und mit 2 1 einer Impf-
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kultur von Talaromyces flavus var. flavus angeimpft, das vorher während 2 Tagen durch Schüttelkultur bei 28°C erhalten worden . war. Die Züchtung wurde 48 Ütunden bei 28°C mit 23o Upm, einer
2 Belüftung von 1 V/V/min. und bei einem Innendruck von 1 kg/cm durchgeführt. Die Aktivität an Fructan abbauendem Enzym in der Kulturbrühe (bestimmt als Einheiten der Aktivität der Bildung von reduzierendem Zucker, gemäß der Bildungsmethode für reduzierenden Zucker unter Verwendung von Laevan aus Aerobacter levanicum als Substrat) betrug 2o Einheiten/ml.
Die Brühe wurde bei niederer Temperatur auf 1o 1 konzentriert, und zu dem Konzentrat wurde das dreifache Volumen Aceton zugesetzt, um das Fructan abbauende Enzym auszufällen, welches dann durch Filtration gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet wurde. 126 g einer Enzymprobe wurden in Form eines weißen Pulvers erhalten. Die Aktivität dieser Probe (angegeben in den vorstehenden Einheiten) betrug 4.375 Einheiten/g.
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Claims (4)

  1. (i) Verfahren zur Herstellung eines Fructan abbauenden Enzyms durch Züchtung eines Mikroorganismus, der zur Bildung eines Fructan abbauenden Enzyms befähigt ist, in einem Kulturmedium und Gewinnung eines Fructan abbauenden Enzyms aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus des Genus Talaromyces, Eupenicillium, Sporotrichum, Sordaria, Chaetomium, Gelasinospora, Stachybotris oder Actinomyces züchtet.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Talaromyces flavus var. flavus, Talaromyces stipitatus, Talaromyces luteus, Sordaria humana, Sordaria fumicola,- Chaetomium subspirale, Chaetomium aureum, Chaetomium atrobrunneum, Gelasinospora longispora, Gelasinospora cerealis, Stadiybotris lobulata, Stachybotris atra, Eupenicillium javanicum, Sporotrichum schenkii, Actinomyces longisporus, Actinomyces- cyanoalbus oder Actinomyces lavendofoliae verwendet.
  3. 3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Talaromyces flavus var. flavus F 223-8, Talaromyces stipitatus F 223-4· oder Talaromyces luteus F 222-8 verwendet.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch g ekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium o,5 bis 2 % eines Fructans zusetzt.
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    5· Verfahren nach einem der Ansprüche Λ bis 4, dadurch g ekennze ichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 28°C und einem pH-Wert im Bereich von 5»5 his 7,o durchführt.
    409836/101 1
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