DE2522484A1

DE2522484A1 - Verfahren zur herstellung eines produkts mit enzymatischer aktivitaet

Info

Publication number: DE2522484A1
Application number: DE19752522484
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Leuba
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1975-04-10
Filing date: 1975-05-21
Publication date: 1976-10-14
Also published as: IL49315A0; FR2306997B1; DE2522484B2; DE2522484C3; GB1476741A; JPS5745555B2; IL49315A; CH596233A5; FR2306997A1; JPS51128489A; US4094743A

Description

Patentanwalt

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Tel. (O 03) SLdöi25

Soclete* des Produits Nestle S.A. in Vevey / SCHWEIZ

"Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit enzymatischer Aktivität"

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit enzymatischer Aktivität, welches in wäßrigen Medien unlöslich ist.

Durch die immer häufigere Anwendung von enzymatischen Reaktionen sind die vielfachen Vorteile von Produkten mit enzymatischer Aktivität, die in wäßrigen Medien unlöslich sind, mehr und mehr aufgefallen. Diese Produkte gestatten einerseits die Stabilität des Enzyme unter den vorgesehenen Arbeitsbedingungen zu verbessern und außerdem das Enzym vom zu behandelnden Stoff (der üblicherweise als Substrat bezeichnet wird) leicht abzutrennen, wodurch es ermöglicht wird, eine enzymatische Reaktion durch einfache mechanische

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Trennung des "unlöslichen" Enzyms und des Substrats anzuhalten, ohne daß man das Enzym durch Erhitzen inaktivieren muß und ohne daß dabei das Substrat verunreinigt wird.

Es hat sich als besonders interessant erwiesen, ein Enzym auf einem inerten Träger zu fixieren. Es gibt zahlreiche Verfahren zur Fixierung von Enzymen auf Trägern, wie z.B. die Adsorption eines Enzyms auf einem unlöslichen Träger oder die Fixierung eines Enzyms auf einem Träger mit Hilfe eines bifunktionellen Reagenses.

Die durch Adsorption eines Enzyms auf einem unlöslichen Träger erhaltenen Produkte sind jedoch nur wenig stabil, da die Haftung des Enzyms auf elektrostatischen Kräften beruht. Produkte, die durch Fixierung eines Enzyms auf einem Träger durch ein bifunktionelies Reagens erhalten werden, sind dagegen wesentlich stabiler, da die Haftung des Enzyms auf der Anwesenheit von kovalenten Bindungen beruht. Der Träger besteht üblicherweise aus Materialien wie keramischen Stoffen, Glas, Kieselsäure usw. Das bifunktionelle Reagens liegt im fertigen Produkt in polymerisierter Form vor. Anders ausgedrückt, das Produkt besteht aus einem inerten Träger, der von einer Schale aus einem Polymer umgeben ist, auf welchem das Enzym fixiert ist.

Im allgemeinen zeichnen sich solche Produkte nicht durch eine besonders hohe enzymatische Aktivität aus, was im Gegensatz zu den in wäßrigem Medium unlöslichen Produkten mit enzymatischer Aktivität steht, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren, bei welchem ein inerter Träger

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mit Hilfe eines Dialdehydes als bifunktionelles Reagens behandelt und das Enzym auf dem so behandelten Träger fixiert wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß als inerter Träger Chitosan verwendet wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin das durch das oben definierte Verfahren erhaltene Produkt. Das Produkt kann in enzymatischen Reaktionen anstelle des entsprechenden löslichen Enzyms verwendet werden. Das Produkt kann entweder am Schluß der Reaktion durch mechanische Abtrennung zurückgewonnen oder als Füllung für Kolonnen, durch welche das Substrat hindurchgeführt wird, verwendet werden.

Chitosan ist ein natürliches Polymer, das durch Deacetylierung von Chitin in stark basischem Medium und bei erhöhter Temperatur erhalten wird. Es ist in Wasser unlöslich, wenn keine verdünnte Säure, mit Ausnahme von Schwefelsäure, anwesend ist.

Chitin ist der organische Hauptbestandteil der Schutzhülle von wirbellosen Tieren (Schilde von Schalentieren oder Oberhäutchen von Insekten). Außerdem findet sich Chitin in der Skeletthaut gewisser niedriger Pflanzenformen (wie z.B. Pilze). Es handelt sich um ein lineares Polymer von N-Acetyl-D-glucosamin mit hohem Molekulargewicht (ungefähr 200 000), welches durch ß-Bindungen (1—> ¹I-Bindungen) ausgezeichnet ist. Die N-Acetylgruppe ist schwierig abzuspalten. Die Deacetylierung verläuft niemals vollständig und liegt bei handelsüblichen Produkten im allgemeinen in der Größenordnung von 50 bis 85 %. Diese Produkte werden mit dem Namen "Chitosan" bezeichnet.

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Der als bifunktionelles Reagens verwendete Dialdehyd kann beispielsweise ein Dialdehyd mit einer Kette von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorteilhafterweise 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, sein. Spezielle Beispiele hierfür sind Malonaldehyd, Bernsteinaldehyd, Glutaraldehyd und Adipinaldehyd. Im allgemeinen wird die Verwendung von Glutaraldehyd bevorzugt, da er ein wohlfeiles Handelsprodukt ist und Produkte mit bemerkenswerter enzymatischer Aktivität ergibt.

Die Fixierung des Enzyms erfolgt in zwei Stufen. Bei der ersten Stufe, welche als "Aktivierung" bezeichnet wird, wird das Chitosan mit dem aus den Dialdehyden ausgewählten bifunktionellen Reagens, wie z.B. Glutaraldehyd, behandelt. Der Dialdehyd wird auf dem Chitosan durch eine der Aldehydgruppen fixiert, Es wird dabei ein Zwischenprodukt erhalten, das als "aktiviertes" Chitosan bezeichnet wird und dessen Oberfläche mit Aldehydgruppen bedeckt ist. In der zweiten Stufe wird das Enzym auf dem aktivierten Chitosan fixiert. Die Maßnahmen erfolgen durch einfaches Zusammenbringen, beispielsweise durch Eintauchen der festen Phase in der flüssigen Phase unter folgenden Bedingungen:

Behandlung des Chitosans

Dialdehydlösung mit pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise gepuffert;

Temperatur 2 bis 35°C, vorzugsweise Raumtemperatur; Dauer der Behandlung 30 min bis 24 st; Behandlung vorzugsweise unter Luftausschluß und Beseitigung des Überschußaldehyds durch Waschen mit Wasser.

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Fixierung des Enzyme

Suspension des aktivierten Chitosans in einer Lösung mit einem pH von 2 bis 11, vorzugsweise in einer Pufferlösung mit pH von 8,0, und mi¹" einem Gehalt an CaCl₂ in einer Konzentration von 0,02m;

Zusatz des in einem wäßrigen Medium gelösten Enzyms;

Temperatur zwischen 2°C und der Temperatur, bei der das Enzym inaktiviert wird, vorzugsweise etwa

2°C;

Dauer der Behandlung 2 bis 24 st; Entfernung des nlcht-fixierten Enzyms durch Waschen mit einer Kochsalzlösung, mit der Pufferlösung der Fixierung und dann mit Wasser.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf Enzyme anwendbar, die funktionelle Gruppen, welche mit den auf dem aktivierten Chitosan vorliegenden freien Aldehydgruppen reagieren können, beispielsweise freie Aminogruppen gewisser Aminosäuren, wie z.B. Lysin, enthalten.

Die physikalische Natur des verwendeten Chitosans besitzt keinen starken Einfluß auf das Verfahren der Fixierung des Enzyms. Die Auswahl des Chitosans wird vielmehr durch die Kriterien der Anwendung bestimmt. Zwei Formen von Chitosan wurden besonders verwendet: ein Chitosan in Form eines feinen Pulvers (welches in der folgenden Beschreibung als Form I bezeichnet wird), welches nach der Aktivierung und Fixierung des Enzyms ein Produkt mit enzymatischer Aktivität ergibt, welches ohne Aktivitätsverlust lyophilisiert werden kann,(dieses Produkt wird vorzugsweise in Suspension unter starkem Rühren verwendet und durch Filtration oder Zentrifugieren zurückgewonnen), und ein Chitosan in ziemlich groben Blätt-

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chen, welche unter mechanischen Schlägen Jedoch zerbröckeln (welches in der folgenden Beschreibung als Form II bezeichnet wird), welches keine Neigung zum Setzen bzw. Zusammenbacken zeigt (dieses Produkt wird vorzugsweise zum Füllen von Kolonnen verwendet.)· Die Herstellung dieser beiden Formen von Chitosan ist in den Beispielen beschrieben.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindunpcsgemäßen Verfahrens wird das Produkt mit enzymatischer Aktivität dadurch stabilisiert, daß man die restlichen Aldehydgruppen, die während der Fixierung nicht mit dem Enzym reagiert haben, zum Verschwinden bringt. Beispielsweise kann man sie mit einem geeigneten chemischen Stoff zur Reaktion bringen, beispielsweise mit einem Stoff, der eine Aminogruppe trägt. Die Verwendung von Glycin, von Asparagin und insbesondere von Lysin hat sich als günstig erwiesen. Das so erhaltene Produkt mit enzymatischer Aktivität zeigt eine bemerkenswerte Affinität für Substrate mit proteinischer Natur. Es ist auch möglich, die restlichen Aldehydgruppen» beispielsweise mit Hilfe von Natriumborohydrid, zu reduzieren, wodurch die Stabilität des Produkts mit enzymatischer Aktivität beträchtlich verbessert wird. Es ist auch möglich, diese beiden Behandlungen zu kombinieren.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Produkt besitzt eine enzymatische Aktivität, die nahe an derjenigen des entsprechenden freien Enzyms liegt. Solche Eigenschaften sind bei Produkten von bekannten Fixierungsverfahren kaum anzutreffen. Darüberhinaus ist das Produkt mehrere Monate stabil und besitzt eine wesentlich höhere Inaktivierungstemperatur, als das entsprechende freie Enzym.

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Wie bereits erwähnt, kann das Produkt bei enzymatischen Reaktionen anstelle des entsprechenden freien Enzyms verwendet werden, und zwar entweder als Suspension (vorzugsweise Chitosan der Form I) oder in Kolonnen (vorzugsweise Chitosan der Form II). Die Anwendung in der Nahrungsmittelindustrie ergibt keinerlei größere Schwierigkeiten, da Chitosan ein natürlicher organischer Stoff ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

BEISPIEL 1

Herstellung von pulverförmigern Chitosan (Form I) 30 g Chitosan werden in verdünnter Essigsäure, die aus 700 ml Wasser und 10 ml Eisessig hergestellt worden ist, unter heftigem Rühren vollständig aufgelöst. Die erhaltene viskose Lösung wird durch zwei Gazeschichten filtriert und dann in kleinen Portionen in E 1 Wasser einlaufen gelassen, das mit Hilfe von Ätznatron auf pH 11,0 eingestellt worden ist. Unter diesen Bedingungen fällt das Chitosan in Form feiner und leichter Teilchen aus. Während des Verfahrens wird der pH des alkalischen Wassers durch Zusatz von Ätznatron auf dem Anfangswert gehalten. Nachdem alles Chitosan ausgefallen ist, wird der pH der Lösung durch vorsichtige Zugabe von verdünnter Salzsäure auf 7*5 abgesenkt. Die durch Zentrifugieren abgetrennte Ausfällung wird zweimal mit Wasser gewaschen und dann •lyophilisiert. Auf diese Weise wird ein gebrauchsfertiges Chitosanpulver der Form I erhalten.

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Fixierung von Trypsin

2,5 g Chitosan der Form I werden in 50 ml einer 0,05m Acetatpufferlösung (pH 6,0) 2k st suspendiert. Dann werden 16,5 ml 2O5Siger Glutaraldehyd (hergestellt durch Verdünnung von handelsüblichem 50/Eigem Glutaraldehyd mit Hilfe der oben erwähnten Pufferlösung) zugegeben, worauf 30 min bei Raumtemperatur gerührt wird. Nach einer Waschung mit zweifach destilliertem Wasser wird das aktivierte Chitosan in 50 ml 0,1m Boratpufferlösung (pH 8,0), welche 0,02 Mol/l CaCl₂ enthält, dispergiert. Diese Suspension wird auf 2°C abgekühlt, worauf dann 250 mg Trypsin (Merck, kristallisiert) zugegeben werden, welches vorher in 10 ml 0,001 η HCl aufgelöst worden ist, zugegeben, worauf 2 st bei 2⁰C gerührt wird. Nach einer Zentrifugierung wird das Produkt mit jeweils 50 ml einer 0,15m NaCl-Lösung, 0,1m Boratpufferlösung (pH 8,0) und zweifach destilliertem Wasser (3mal) gewaschen und dann in 50 ml einer eisgekühlten 0,1m Boratpufferlösung (pH 8,0) eingebracht, worauf 100 mg festes Natriumborohydrid zugegeben werden. Nach 20 min bei 2°C wird das unlösliche Produkt mit enzymatischer Aktivität durch Zentrifugierung abgetrennt, von neuem mit Wasser gewaschen und in edner 0,05m Boratpufferlösung (pH 7*5), welche Natriumazid als Konservierungsmittel enthält, aufbewahrt.

Die Menge des auf dem Chitosan durch den Glutaraldehyd fixierten Enzyms wird aus dem Unterschied zwischen der zugefügten Menge und der in der Restlösung und den Waschwässern gefundenen Menge ermittelt. (Die Bestimmung erfolgt durch UV-Absorption bei 280 nm).

Die Amidaseaktivität des Produkts wird an einem synthetischen Substrat getestet, nämlich an DL-BAPA (p-Nitroanilid von N-Benzoyl-DL-Arginin), und zwar durch das

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Verfahren von Erlanger et.al., Arch. Biochem. Biophys., 95, 271 (196I). Das Verfahren beruht auf der Verfolgung des durch enzymatische Hydrolyse in Freiheit gesetzten p~Nitroanilids, wobei die spezifische Absorption bei 410 nm gemessen wird. Die kaseinolytisehe Aktivität wird wie folgt bestimmt: Zu 5 ml einer 2?igen Lösung eines Substrats, das aus Kasein von der Type Hammarsten besteht, in einer 0,05m Tris-Pufferlösung (pH 7,5) (oder Tris· hydroxymethyl-aminomethan), die 15 min auf 100°C erhitzt worden ist, werden ή ml der oben erwähnten Boratpufferlösung und 1 ml Enzymlösung, die 3Q0,ug freies Trypsin oder das äquivalent unlösliche Trypsin enthält, zugegeben. Nach 30 min Reaktion bei 35°C wird 1 ml des Mediums mit 3 nil 3Jiger TriChloressigsäure gemischt. Nach der Zentrifugierung wird die optische Dichte des Überstands bei 280 nm gemessen. Die optische Dichte bei 200 nm/mg Protein/30 min wird willkürlich als kaseinolytisehe Aktivität genommen.

Die erhaltenen Resultate sind wie folgt:

Für 100 mg Trypsin, die zu 1 g Chitosan zugegeben worden sind, werden 92,9 mg fixiertes Trypsin gefunden. Die spezifische Amidaseaktivität (BAPA)(^uMoI in Freiheit gesetztes p-Nitroanilin/min/mg Enzym) des Präparats beträgt 49,l6? und die spezifische kaseinolytisehe Aktivität beträgt 38,261.

Das Produkt wird in Gegenwart seines doppelten Gewichts Mannit lyophilisiert, und das Lyophilisat wird 1 Monat konserviert. Dann wird die enzymatische Aktivität des Lyophilisats gemessen. Sie ist die gleiche wie bei dem frischen Produkt.

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BEISPIEL 2 Fixierung einer Protease-AP

2,5 g Chitosan (Form I) werden wie in Beispiel 1 mit Glutaraldehyd behandelt. Nach der Waschung wird das Produkt in 50 ml 0,05m Tris-Pufferlösung (pH 8,0), die 0,02 Mol/l CaCl₂ enthält und auf 2°C gehalten wird, dispergiert. Es werden 250 mg handelsübliche Protease (Protease-AP der Societe Suisse des Ferments S.A., mit einer Subtilo-peptidase-Aktivität) als Lösung in 10 ml 0,05m Tris-Puffer (pH 7,5), der 0,02 Mol/l CaCl₂ enthält, zugegeben. Nach 2 st Kontaktzeit unter Rühren bei 2°C wird das Produkt mit einer 0,15m NaCl-Lösung, mit einer 0,05m Tris-Pufferlösung (pH 8,0) und mit Wasser gewaschen. Es wird dann in 50 ml eina*Q,lm Lysinlösung (pH 8,0) 15 min lang aufgenommen, gewaschen und schließlich unter den Bedingungen von Beispiel 1 mit Natriumborohydrid behandelt.

Die Esteraseaktivität des Enzyms wird an einem synthetischen Substrat bestimmt, nämlich an TAME (Methylester von p-Tosyl-L-arginin). 5 ml TAME (0,025m in H₃O) 1 ml einer Im KCl-Lösung und 4 ml Wasser werden in einen pH-Stat eingebracht und bei 30⁰C thermostatisiert. Der Titrationsendpunkt wird auf pH 8,0 festgelegt und mit 0,1 η NaOH-Lösung eingestellt. Die Reaktion wird durch Zusatz von 0,2 bis 1 mg Protease initiiert. Der NaOH-Verbrauch wird festgehalten. Eine TAME-Einheit entspricht dem Abbau von 1 ,uMol Substrat (d.h. 1 ,u-Äqulvalent NaOH) je min, und die spezifische Aktivität wird in TAME-Einheiten/mg Enzym ausgedrückt. Das Maß der kaseinolytischen Aktivität wird nach dem Verfahren von Hagihara et. al., J. Biochem., ^_5, I85 (1958) abgeleitet. Zu jeweils 1 ml Kasein (1,2£ in einer 0,05m

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Tris-Pufferlösung, pH 9,0), wird jeweils 1 ml Enzymlösung mit wachsenden Konzentrationen an freier oder fixierter Protease (0 bis lBO.ug) zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 10 min bei 30⁰C wird das nicht-hydroIysierte Kasein durch 3 nil eines Gemischs aus Trichloressigsäure (0,11m), Natriumacetat (0,22m) und Essigsäure (0,33m) ausgefällt. Die optische Dichte des Überstands wird bei 250 nm gemessen. Die spezifische Aktivität ist gleich der optischen Dichte bei 275 nm/min/mg Enzym (Bestimmung der Steigung am Ursprung der kinetischen Kurven). Dabei wird festgestellt, daß von 100 mg Protease AP, die zu 1 g Chitosan zugegeben worden sind, 33,7 mg fixiert sind. Im Verhältnis zum löslichen Enzym ist die spezifische Ssteraseaktivität 75,9% (der Verlust durch Behandlung mit Borohydrid beträgt 3» 3/0· Die kaseinolytische Aktivität ist l»6,15*.

BEISPIEL 3 Fixierung von Pronase

Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt, wobei 250 mg Pronase verwendet werden und wobei keine Reduktion mit Natriumborohydrid durchgeführt wird. Die kaseinolytische Aktivität des Produkts mit enzymatischer Aktivität wird wie in jenem Beispiel gemessen, wobei jedoch die folgenden Abwandlungen vorgenommen werden: 1 ml 2^iges Kasein in 0,05m Tris-Pufferlösung (pH 7,5) und 1 ml Enzymlösung (freie oder fixierte Pronase mit verschiedenen Konzentrationen von 10 bis I60 ,ug) werden 10 min bei 40°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zusatz von 3 ml 5%iger Trichloressigsäure abgebrochen und die optische Dichte des Überstands wird bei 275 nm gemessen.

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Dabei wird festgestellt, daß von 100 ng Pronase, die zu 1 g Chitosan zugegeben worden sind, 29 mg, fixiert worden sind. Die kaseolytische Aktivität beträgt 57,60$.

BEISPIEL 1

Herstellung von Chitosan in Plättchen (Form II) Chitosan wird in verdünnter !,Wiger Essigsäure aufgelöst, derart, daß seine Konzentration im Medium 2,5 Gew.-? beträgt. Die erhaltene Lösung wird durch zwei Gazeschichten filtriert und dann auf Metallplatten (Oberfläche mit Teflon behandelt) geschüttet, so daß eine homogene Schicht erhalten wird (5^ ml Lösung/100 cm ) Das Produkt wird in einem Ofen mit 70 C eingetrocknet, bis ein dünnei Film von Wasserfreiem Chitosan gebildet worden ist. Letzterer wird in Plättchen mit den mittleren Abmessungen 1 bis 2 cm aufgebrochen und in dieser ^orm für die Fixierung verwendet (Chitosan der Form II).

Fixierung einer Bakterienprotease

5 g Chitosan der Form II werden in 150 ml einer 0,1m Pufferlösung (pH 8,0) dispergiert. Mach einer Verweilzeit von 5 min werden 15 ml 25$iger Glutaraldehyd zugegeben, worauf das Gemisch 1 st bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Das erhaltene Produkt wird filtriert und nach einer Waschung in 30 ml 0,1m Veronalpufferlösung (pH 8,0), welche 0,02 Mol/l CaCl₂ enthält und auf 2°C abgekühlt ist, suspendiert. Hierauf wird eine konzentrierte (5 ml, 1100 TAME-Einheiten, d.h. 1,7 g handelsübliches Produkt) Bakteriennroteaselösung (Alcalase Novo der Societe Suisse des Ferments S.A.) eingeführt. Nach einer Nacht bei 2°C unter mäßigem Rühren wird das Produkt

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durch ■Filtration abgetrennt, mit einer 0,15™ NaCl-Lösunp, mit einer Veronalnufferl'^sunr und abs».hl lebend mit Wasser gewaschen. Die Reduktion mit Borohydrid, 1 mg/ml 0,1m Veronal-Pufferlösung (pH R,0) wird wie in Beispiel 1 ausgeführt.

Die Bestimmung- der Esteraseaktivität (TAKE) wird wie im BeisDiel 2 durchgeführt. Die kaseinolytische Aktivität wird wie folgt bestimmt: 1 ml ljEige Kaseinlösung in 0,2m Tris-Pufferlösung (pH 9,0) und 1 ml einer Lösung mit verschiedenen Alcalase-Konzentrationen (10-1000 ,ug) oder eine bekannte Menge des unlöslichen Produkts werden 10 min be3 37°C inkubiert. Dann werden 3 ml 5£ige Trichioressigsäure eingeführt, worauf die optische Dichte des Überstands bei 2P0 nm gemessen wird. Die für das freie Enzym erhaltene Kurve (ontische Dichte als Funktion der Konzentration) dient als Eichkurve .

Es wird festgestellt, daß die unlöslich gemachte Alcalase 41,2 TAME/Einheiten/ρ trockenes Produkt enthalt, was 66,4 mg der Ausgangsalcalase äquivalent ist (spezifische TAME-Aktivität: 0,62 Einheiten/mg). Die kaseinolytische Aktivität entspricht 11 mg freier Alcalase/r" trockenes Produkt. Die Ausbeute, bezogen auf TAME-Einheiten, beträgt 18,1%.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

/IJ Verfahren zur Herstellunp eines in wäßripen Medien unlöslichen Produkts mit enzymatischer Aktivität durch Behandlung eines inerten Träpers mit einem aus den Dialdehyden ausgewählten bifunktionellen Reapens und Fixierunf eines Enzyms auf dem so behandelten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß als inerter Träger Chitosan verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch pe kenn zeichnet:, daß als bifunktionelles Peapens Glutaraldehyd verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch pekennzeichnet, daß als Enzym ein Enzym mit freien Aminoprunpen verwendet wird.
¹I. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch pel'ennzei chnet, daß als Chitosan pulverförmipes Chitosan verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch pekennzeichnet, daß als Chitosan plättchenförmipes Chitosan verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch pekennzeichnet, daß das plättchenförmige Chitosan durch Zerbrechen eines PiIms von wasserfreiem Chitosan erhalten worden ist.

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7. Verfahren nach AnsDruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in wäßrigen Medien unlösliche Produkt mit enzymatischer Aktivität mit einer Verbindung, welche eine freie Aminopruppe träert, oder mit einem Reduktionsmittel behandelt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in wäßrigen Medien unlösliche Produkt mit enzymatischer Aktivität mit einer Verbindung, die eine Aminopruppe träft, und mit einem Reduktionsmittel behandelt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch pekennzeichnet, daß als Verbindung, die eine Aminogruppe trägt, Lysin verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch rekennzeichnet, daß als Reduktionsmittel Natriumborohydrid verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in wäßrigen Medien unlösliche Produkt mit enzymatischer Aktivität lyonhilisiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das in wäßrigen Medien unlösliche Produkt mit enzymatischer Aktivität in Gegenwart der doppelten Qewichtsmenge Mannit lyophilisiert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei chimt, daß dan Chitosan und der Dialdehyd bei einem pH zwischen 6 und 8 zur Renkt! cn rebracht werden.

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Verfahren nach Anspruch 1, dadurch Gekennzeichnet, daß das Chitosan und der Dialdehyd bei einer Temoeratur zwischen 2 und 35°C zur Reaktion gebracht werden.

15· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym bei einem pH zwischen 2 und 11 fixiert wird.

l6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym bei einer Temperatur zwischen 2 C und der Temperatur, bei welcher das Enzym inaktiv wird, fixiert wird.

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