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Die Erfindung betrifft ein mehrschichtiges analytisches Element
mit einer Reagens-Schicht und einer Registrier-Schicht, die gegebenenfalls
auf einer; Schichtträger aufgetragen sein können, für
die Analyse von Flüssigkeiten.
Es ist bekannt, für die Untersuchung von Flüssigkeiten wie beispielsweise
Wasser, Nahrungsmitteln, wie beispielsweise vrilch und
biologischen Flüssigkeiten sog. analytische Elemente zu verwenden. Derartige analytische Elemente enthalten oftmals ein Reagens für
die Bestimmung einer bestimmten chemischen Substanz, d.h. eines sog. "Analyten". Gelangt das Reagens in Kontakt nit einer flüssigen
Probe, die den Analyten enthält, so erzeugt das Reagens eine farbige Verbindung oder eine andere bestimmbare Verbindung oder aber
es bewirkt einen Abbau einer farbigen Verbindung oder einer in anderer
Weise bestimmbaren Verbindung.
Auf bestimmten Gebieten ist es oftmals erforderlich, daß die durchgeführten
Analysen rasch zu quantitativen Ergebnissen führen.
In jüngster Zeit sind analytische Elemente für die Durchführung diagnostischer und klinischer Untersuchungen bekannt geworden, d.h.
für die Untersuchung biologischer Flüssigkeiten, einschließlich Körperflüssigkeiten wie z.B. Blut, Blutserum und Urin, wo es gilt
quantitative Ergebnisse schnell und zuverlässig zu erhalten.
Um die Bedürfnisse klinischer Laboratorien nach analytischen Verfahren,
die rasch zu quantitativen Ergebnissen führen,zu befriedigen, sind eine Vielzahl von chemischen Verfahren, die mit Lösungen
arbeiten,bekannt geworden. Sie lassen sich als sog. "nasse chemische
Verfahren" bezeichnen. Derartige Verfahren sind insbesondere für die automatisierte klinische Analyse entwickelt worden. Im Falle
derartiger "nasser chemischer Verfahren" werden bestimmte Reagenzien in einem wäßrigen flüssigen Trägermedium gelöst oder suspendiert.
Obgleich sich derartige Verfahren für die Analyse von biologischen Flüssigkeiten eignen, haben derartige "nasse" Verfahren doch den
Nachteil, daß zu ihrer Durchführung eine vergleichsweise komplizierte
Vorrichtung erforderlich ist und daß die Durchführung dieser
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Verfahren recht umständlich ist. Eine analytische Vorrichtung für die Durchführung eines "nassen chemischen Verfahrens" ist beispielsweise
aus der US-PS 2 797 149 bekannt. Derartige Vorrichtungen sind oftmals kostspielig, ganz abgesehen davon, daß die Behandlung und
Verarbeitung der Flüssigkeiten sehr komplex ist.
Als Alternative für die nassen chemischen analytischen oder Lösungs-Bestimmungsverfahren sind verschiedene analytische Elemente
für die Durchführung klinischer Analysen bekannt geworden, welche auf "trockenem chemischen Wege" arbeiten, d.h. die dadurch gekennzeichnet
sind, daß sie chemische Reagenzien enthalten. Bei diesen sich "trocken anfassenden" Elementen handelt es sich um einschichtige
Teststreifen, mehrschichtige analytische Testelemente und dergleichen. Analytische Verfahren, bei denen derartige analytische
Elemente verwendet werden, weisen gegenüber dem "nassen chemischen Verfahren" wesentliche Vorteile bezüglich Lagerung, Handhabung
und dergleichen auf. Bis heute haben derartige trockene chemische Analyseverfahren und Abänderungen hiervon jedoch im allgemeinen
nur einen recht begrenzten Erfolg gehabt und derartige Verfahren wurden primär lediglich für qualitative und halb-quantitative
Testverfahren eingesetzt, normalerweise unter Verwendung von Teststreifen.
Auf dem Gebiet der n*gen chemischen klinischen Analysen und
trockenen chemischen klinischen Analysen erfolgt die Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in typischer Weise durch Verwendung
eines Reagens, das bei Kontakt mit der zu analysierenden Substanz einer bestimmbaren Veränderung unterliegt, oftmals einer
Farbveränderung, z.B. durch Erzeugung oder Abbau einer bestimmbaren chemischen Verbindung, z.B. einer farbigen oder fluoreszierenden
Verbindung. Die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration
der zu analysierenden Substanz erfordert somit die Erzeugung oder den Abbau einer bestimmbaren Verbindung, wozu oftmals
eine Reihe von Reaktionen erforderlich sein kann, die nur schlier
zu steuern sind und die störanfällig sind. Beispielsweise stört Katalase Farbanzeigereaktionen, die auf der Erzeugung eines Farbstoffes
unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und einer einen Farbstoff erzeugenden Verbindung in Gegenwart von Peroxidase oder
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einer anderen Verbindung mit peroxidativer Aktivität beruhen. Des weiteren müssen sich Farbstoff und entsprechende bestimmbare
Verbindungen, wenn sie "in situ" während einer analytischen Reaktion oder durch eine Reaktionsfolge erzeugt werden, von einer
Vorläuferverbindung ableiten, die die entsprechende Aktivität in den gewählten Reaktionen aufweist. Farbstoffe und andere bestimmbare
Verbindungen, die aus derartigen Vorläuferverbindungen erzeugt werden und #ine derartige Reaktivität aufweisen, können
in der Bestimmungsumgebung nur schwer genau zu messen sein. So können derartige Farbstoffe unerwünschte Absorptionsspektren aufweisen
(d.h. sie können die Absorption einer Komponente der zu analysierenden Flüssigkeit überlappen), eine übermäßig ausgeprägte
oder ungenügende Absorption aufweisen und dergleichen, wodurch die Messung des analytischen Ergebnisses beeinträchtig werden
kann.
Demzufolge besteht ein Bedürfnis nach analytischen Elementen für
die Durchführung der verschiedensten klinischen Analysen, wobei die Erzeugung einer bestimmbaren Veränderung nicht die Bildung
oder Zerstörung der bestimmbaren Verbindung, die als Basis für die Analyse verwendet wird, erfordert. Dieses ist zum Teil im
Falle verschiedener ncgser chemischer Analysenverfahren oder Lösungs-Analysenverfahren
erreicht worden. Bei der Bestimmung von α-Amyläse
in Lösung beispielsweise werden verschiedene "gefärbte Stärken" verwendet, die nach Lösung oder Suspendierung in einem geeigneten
wäßrigen Träger als Reagens für die Bestimmung von a-Amylase verwendet
werden können. Diese gefärbten Stärken weisen in typischer iVeise einen vorgebildeten Farbstoff auf, der an das Stärkemolekül
unter Bildung der gewünschten Stärke chemisch gebunden ist. Da a-Amylase
ein Enzym ist, das speziell Stärke in biologischen Flüssigkeiten abbaut, stellen derartige gefärbte Stärken nach Einmischen
in einen geeigneten flüssigen Träger ein Reagens für die Bestimmung von a-Amylase in einer zu untersuchenden Flüssigkeits-Testprobe
dar. Die a-Amylase, sofern .vorhanden, baut die gefärbte Stärke ab,
so daß nach Trennung der gefärbten Stärke von der nicht-abgebauten Stärke und durch Vergleich der Färb dichte der abgebauten Stärke
mit der Farbdichte der ursprünglichen nicht-abgebauten Stärke die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von a-Amylase
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in der flüssigen Testprobe möglich ist. Eine typische a-Amylase-Bestimmungsmethode,
bei der dieses "nasse Verfahren" angewandt wird, ist beispielsweise aus der US-PS 3 694 318 bekannt.
Das oben beschriebene nasse chemische Analysenverfahren, bei dem vorgebildete bestimmbare Verbindungen verwendet werden, die nicht
durch Umsetzung des Analyten erzeugt oder zerstört zu werden brauchen,
kann nützlich sein. Nichtsdestoweniger leiden diese Verfahren unter dem bereits erwähnten allgemeinen Nachteil nasser analytischer
Bestimmungsverfahren, wenn versucht wird, sie im Rahmen automatisierter Bestimmungssysteme zu verwenden. Nachteilig an
derartigen Verfahren ist die Notwendigkeit komplizierter Analysenvorrichtungen, die komplizierte Lösungshandhabung und das Auftreten
von Transportproblemen. Ein weiteres Problem, das häufig im Falle nasser chemischer Verfahren auftritt, besteht darin, daß bei
diesen Verfahren die Reaktion zwischen Analyt und farbigem Reagens abgeschlossen sein muß, z.B. die Bildung von gefärbter Stärke
und daß ein Trennungsverfahren, beispielsweise ein Zentrifugierverfahren
angewandt werden muß, um das farbige Reaktionsprodukt zu isolieren, so daß die Bestimmung des Farbtones des Reaktionsproduktes
ermöglicht wird, ohne Störung durch das eingesetzte gleichfarbige Reagens. Dies bedeutet, daß die nassen chemischen
Verfahren nicht ohne weiteres zu Bestimmungsverfahren, bei denen die Reaktionskinetik bestimmt wird, oder zu kontinuierlichen Best
iinmungsverfahren führen, bei denen die Reaktion zwischen zu analysierender Substanz und farbigem Reagens weiter ablaufen kann
und man den Grad der Freisetzung des farbigen Reaktionsproduktes bestimmt. Diese Schwierigkeit macht sich insbesondere nachteilig
im Falle bestimmter Analysen wie enzymatischer Analysen bemerkbar,
die insbesondere für Analysen geeignet sind, bei' denen die Reaktionskinetik
bestimmt wird. Infolgedessen wäre es besonders vorteilhaft, analytische Elemente für die Durchführung trockener
chemischer Analysen zu entwickeln·, welche den Vorteil der Verwendung
von "trockenen" analytischen Elementen aufweisen und die sich für die Durchführung von kontinuierlichen Bestimmungsmethoden
oder Bestimmungsmethoden eignen, bei denen die Reaktionskinetik bestimmt wird, jedoch vorgebildete bestimmbare Verbindungen enthalten.
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Bis heute haben sich trockene analytische Testelemente für die Durchführung quantitativer analytischer Bestimmungsverfahren mit
einem Gehalt an vorgebildeten, bestimmbaren Verbindungen ganz offensichtlich nicht durchsetzen können. Es sind zwar bereits
trockene Elemente bekannt, die vorgebildete bestimmbare yerbinsungen
enthalten, doch bestehen derartige trockene Testeleraente aus fasrigen Teststreifenelementen des aus der US-PS 3 641 235 bekannten
Typs. In diesen bekannten Elementen liegt eine bestimmbare Verbindung, beispielsweise ein Farbstoff, gebunden an ein immunologisches
Reagens vor und das gefärbte immunologische Reagens liegt in der fasrigen Schicht des Elementes vor. Bei Kontakt
dieses gefärbten immunologischen Reagenzes mit der zu bestimmenden Substanz in Gegenwart eines flüssigen Bluierungsmittels, wird
ein Teil des Indikatorfarbstoffes freigesetzt und das Eluierungsmittel wäscht den Farbstoff in einen anderen Bereich der gleichen
fasrigen Schicht. Derartige Elemente eignen sich ganz offensichtlich lediglich für die Durchführung von qualitativen Analysen.
Beispielsweise untersucht man den Teststreifen bei der Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer zu analysierenden
Substanz visuell, um zu bestimmen, oh oder nicht eine Bewegung oder Wanderung des Farbstoffes erfolgt ist. Im übrigen wird bei
Verwendung eines solchen Teststreifenelementes und eines flüssigen Eluierungsmittels zum Zwecke der Überführung von Farbstoff von
einem Bezirk der Schicht in einen anderen Bezirkt der Schicht eine Beendigung der Reaktion zwischen zu analysierender Substanz
und immunologischem Reagens hervorgerufen. Infolgedessen eignet
sich ein solches fasriges Teststreifenelement, wie auch die vorerwähnten nassen chemischen Bestimmungs verfahren nicht für die
Durchführung kontinuierlicher Bestimmungsverfahren oder Schätzverfahren.
Andere analytische Elemente für die Durchführung trockener Verfahren,
die speziell für die Durchführung quantitativerer und präziserer klinischer Analysen entwickelt wurden, wie beispielsweise die
mehrschichtigen integralen analytischen Elemente des aus der BE-PS 801 742 bekannten Typs verwenden keine vorgebildeten bestimmbaren
Verbindungen.
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Die mehrschichtigen analytischen Elemente der BE-PS 801 742
weisen eine ein Reagens enthaltende Schicht auf und eine hiermit in Verbindung stehende isotrop poröse Ausbreit-Schicht, auf die
die zu analysierende Probe aufgebracht wird und die die Verteilung
der Probe innerhalb der Ausbreit-Schicht bewirkt, so daß eine gleichförmige Konzentration an Probenkomponenten der Reagens
enthaltenden Schicht aus der Ausbreit-Schicht zugeführt wird. Vorzugsweise werden derartige Elemente unter Ausschluß von fasrigen
Materialien hergestellt, insbesondere die Ausbreit-Schicht, obgleich auh fasrige Materialien in kleineren Mengen zugegen sein
können oder dann, wenn sie das Ausbreiten der Probe, die Erzeugung des Testergebnisses und/oder die Testbestimmung nicht beeinträchtigen.
Elemente des aus der BE-PS 801 742 bekannten Typs liefern gleichförmige analytische Ergebnisse, die quantitativ
sein können und die genau und präzise bestimmbar sind, beispielsweise unter Verwendung automatisch arbeitender spektrophotometrischer,
fluorometrischer und anderer radiometrischer Analysengeräte.
Wie bereits dargelegt, findet sich jedoch in der BE-PS 801 742 kein Hinweis auf die Verwendung von nicht-diffusionsfähigen Stoffen
mit einer vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung inder Reagens-Sclicht. Vielmehr werden die verschiedenen speziellen Reagenzien,
die in der BE-PS 801 742 aufgeführt werden, für die Erzeugung und/ oder den Abbau bestimmbarer Verbindungen innerhalb des Elementes
verwendet, beispielsweise zur Erzeugung von colorimetrisch oder fluorimetrisch bestimmbaren Verbindungen. Des weiteren ist im Falle
der aus der BE-PS 801 742 bekannten mehrschichtigen analytischen Elemente nicht vorgesehen, daß eine aus einer Reagens-Schicht
freigesetzte vorgebildete, bestimmbare Verbindung selektiv bestimmt werden soll, d.h. ohne Störung durch nicht freigesetzte
bestimmbare Verbindungen, die in der Reagens-Schicht zurückgehalten werden.
Obgleich somit verschiedene analytische Elemente bekannt-geworden sind und sich auf verschiedenen Gebieten der trockenen Analyse
von Flüssigkeiten einsetzen lassen, beispielsweise die vorerwähnten fasrigen Teststreifenelemente der US-PS 3 641 235 und die mehr-
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schichtigen analytischen filemente der BE-PS 301 742, besteht ein
Bedürfnis nach verbesserten analytischen Elementen fi'r die Durchführung
trockener chemischer Analyseverfahren, mit denen sich quantitative Analyseergebnisse erzielen lassen und die Stoffe
wit einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung enthalten, die quantitative und selektiv bestimmbare analytische Ergebnisse
liefern.
Gegenstand der Erfindung ist ein mehrschichtiges analytisches Element mit einer Reagens-Schicht und einer Registrier-Schicht
sowie gegebenenfalls einem Schichtträger für die Analyse einer Flüssigkeit auf ihren Gehalt an einer bestimmbaren Substanz, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß
(a) die Reagens-Schicht einen nicht-diffusionsfähigen Stoff (oder
Verbindung) nrit einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung
enthält, der in Gegenwart der zu analysierenden Flüssigkeit mit der zu bestimmenden Substanz unter Bildung einer diffusionsfähigen
Verbindung aus der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung zu reagieren vermag, daß
(b) die Registrier-Schicht derart ausgestaltet ist, daß sie die diffusionsfähige Verbindung aufzunehmen vermag und daß
die Schichten des Elementes einen solchen Aufbau haben, daß die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung die von der Reagens-Schicht
freigesetzt wurde, im Element selektiv bestimmt werden kann.
Ein erfindungsgemäßes mehrschichtiges analytisches Element eignet sich für die Analyse von Flüssigkeiten, insbesondere biologischen
Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Serum, Urin und dergleichen.
Ein erfindungsgemäßes Element weist mindestens zwei Schichten auf,
die sich unter den Verwendungsbedingungen in "Flüssigkeitskontakt"
miteinander befinden. Der Ausdruck "Flüssigkeitskontakt" oder "Strömungskontakt" wird später noch erläutert werden.
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Die Verwendung erfindungsgemäßer Elemente ist ohne geschultes
Personal möglich. Bei ihrer Verwendung lassen sich quantitative analytische Ergebnisse ohne spezielle Tüpfeltechnik oder genaue
Probendosierung, das Abwaschen oder die Entfernung von überschüssiger Probe und dergleichen erreichen.
Des weiteren lassen sich, wie im folgenden noch näher beschrieben werden wird, bei Verwendung mehrschichtiger analytischer Elemente
nach der Erfindung konstante analytische Ergebnisse erzielen, so daß automatisierte Verfahren zur Messung elektromagnetischer Strahlung
(radiometrische Verfahren) angewandt werden können, um die Analysenwerte zu ermitteln.
Die erfindungsgeinäßen Elemente weisen somit mindestens zwei
Schichten auf, von denen eine eine Reagens-Schicht ist und die andere eine Registrier-Schicht, wobei der Registrier-Schicht eine
vorgebildete bestimmbare Substanz oder Verbindung, die in der Reagens-Schicht freigesetzt wird, zugeführt wird. Die Schichten
eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes sind derart aufgebaut, daß die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung, Substanz
oder Verbindung, die von der Reagens-Schicht freigesetzt wird, selätiv im Element bestimmt werden kann. Dies läßt sich beispielsweise
dadurch erreichen, daß die Elemente derart aufgebaut sind, daß die nicht-freigesetzte, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung,
Substanz oder Verbindung, die in der Reagens-Schicht verblieben ist, selektiv in der Reagens-Schicht bestimmt werden kann, oder
dadurch, daß die freigesetzte, vorgebildete Substanz, Gruppierung oder Verbindung nach Wanderung in die Registrier-Schicht selektiv
in dieser Schicht bestimmt werden kann. Die Schichten eines analytischen Elementes nach der Erfindung sind für die zu analysierende
Flüssigkeit durchlässig. Die Ausdrücke "durchlässig" und "Durchlässigkeit", die hier im Zusammenhang mit einer Substanz oder
Schicht gebraucht werden, sollen anzeigen, daß die Schichten für Gase oder Flüssigkeiten, einschließlich für das Lösungsmittel oder
D ispeisi ons medium einer Flüssigkeit und die Komponenten, die sich
in dem Medium befinden, beispielsweise aufgelöst oder dispergiert sind, durchlässig sind.
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Die Angaben "diffusionsfähig" und "mobil" kennzeichnen die
Fähigkeit eines Stoffes oder einer Verbindung sich innerhalb einer Schicht oder eines analytischen Elementes durch Diffusion
zu beweg-en, wenn die Verbindung oder der Stoff von einer in der Schicht oder dem Element vorhandenen Flüssigkeit aufgenommen wird,
beispielsweise dem Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium einer Flüssigkeitsprobe, die auf das Element aufgebracht wurde. Der
Ausdruck "Komponente" der hier im Zusammenhang mit einer Flüssigkeitsprobe
verwendet wird, bezieht sich auf einen gelösten oder dispergierten Bestandteil der Flüssigkeit, gleichgültig ob sich
die Komponente in ihrem freien Zustand befindet oder sie eine chemische Gruppierung darstellt, die Teil einer komplexeren Verbindung
ist. Zu bemerken ist, daß solche Komponenten oder Bestandteile in der Flüssigkeit nach ihrer Aufbringung auf das Element
erzeugt werden können, beispielsweise durch Ablauf entsprechender chemischer Reaktionen. In verschiedenen Fällen kann die Komponente
aus einer zu analysierenden Substanz oder einer Vorläuferverbindung einer zu analysierenden Substanz oder einem Reaktionsprodukt einer zu analysierenden Substanz bestehen. Zu Reaktionsprodukten
von Komponenten wie zu analysierenden Substanzen gehören chemische Verbindungen, die Zerfallsprodukte oder andere Reaktionsprodukte
einer Komponente darstellen, wie auch andere Produkte, die sich von einer Komponente ableiten, z.B. Reaktionsprodukte,
die das Ergebnis einer enzymatischen Aktivität einer zu analysierenden
Substanz oder eines Analyten oder anderer Komponenten sind.
Der Ausdruck "Flüssigkeitskontakt" oder auch "Strömungskontakt" zwischen Schichten erfindungsgemäßer Elemente besagt, daß ein
Strömungsmittel, gleichgültig, ob es aus einer Flüssigkeit oder einem Gas besteht, in dem Element von einer Schicht in eine andere
Schicht, die übereinander angeordnet sind, übergehen kann. Der
Ausdruck "Flüssigkeitskontakt" oder"Strömungskontakt" besagt somit, daß Komponenten einer Flüssigkeit oder eines Strömungsmittels von
einer Schicht in eine andere Schicht, die sich in Kontakt miteinander befinden, übertreten können, wobei die Möglichkeit zum
Obertritt vorzugsweise gleichförmig längs der Kontaktfläche zwischen
den miteinander in Kontakt stehenden Schichten gegeben ist. Obgleich
Schichten, die sich in Flüssigkeitskontakt oder Strömungskontakt
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miteinander befinden, einander benachbart sein können, können sie doch auch durch Zwischenschichten voneinander getrennt sein.
Schichten des Elementes, die Schichten auf physikalischem Wege voneinander trennen, die in Flüssigkeitskontakt oder Strömungskontakt miteinander stehen, stehen mit diesen Schichten ebenfalls
in Flüssigkeits- oder Strömungskontakt und verhindern den Durchtritt von Flüssigkeit oder Strömungsmittel zwischen den miteinander
in Kontakt stehenden Schichten nicht. Obgleich Schichten sich in Flüssigkeitskontakt oder Strömungskontakt miteinander vor
Aufbringung einer Prohe auf das Element befinden können, kann es
in manchen Fällen zweckmäßig sein, wenn sich die Schichten zunächst nicht im Flüssigkeitskontakt oder Strömungskontakt miteinander befinden,
d.h. getrennt voneinander vorliegen und wenn der Kontakt erst zum Zeitpunkt der Probenaufgabe erfolgt, beispielsweise durch
Anwendung einer Druckkraft auf das Element.
Die Reagens-Schicht soll für die aufgebrachte Probe durchlässig
sein und enthält ein Reagens, das bei der Analyse eine aktive Rolle spielt. Dieses Reagens besteht oder enthält einen nichtdiffusionsfähigen
Stoff oder eine nicht-diffusionsfähige Verbindung mit einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung. Genauer gesagt
ist der nicht-diffusionsfähige Stoff in Gegenwart der Flüssigkeit mitjeiner vorbestimmten chemischen Substanz oder einem chemischen
Analyten, d.h. der Testsubstanz für das Element reaktionsfähig, unter Bildung oder Freisetzeneiner diffusionsfähigen Verbindung,
die die vorgebildete bestimmbare Gruppierung aufweist. Die Registrier-Schicht nimmt die diffusionsfähige Verbindung auf, die in der
Reagens-Schicht erzeugt wurde und ist für diese diffusionsfähige Verbindung permeabel. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der
Erfindung wird die erzeugte bestimmbare Verbindung selektiv in der Registrier-Schicht erzeugt, d.h. ohne Bestimmung oder Störung
durch die nicht freigesetzte, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung in anderen Schichten des Elementes, z.B. durch radiometrische
Bestiramungsmethoden.
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Der Ausdruck"vorgebildete, bestimmbare Gruppierung" ist im weitesten Sinne zu betrachten, d.h. der Ausdruck umfaßt Atome,
chemische Gruppen (d.h. einen Anteil eines Moleküls) oder chemische
Verbindungen, die selbst direkt bestimmbar sind, beispielsweise durch geeignete Messung elektroiiiagne tischer Strahlung, z.B.
Licht, radioaktive Emissionen und dergleichen. Der Ausdruck "vorgebildete, bestimmbare Gruppierung" umfaßt des weiteren Atome,
chemische Gruppen oder chemische Verbindungen, die obgleich nicht direkt bestimmbar, doch bestimmbar gemacht werden können, ohne
Verminderung der Genauigkeit des Analyseverfahrens, z.B. ein Enzym. Eine solche Bestimmbarkeit kann der ganzen Menge der vorgebildeten
bestimmbaren Gruppierung in den diffusionsfähigen Verbindungen, die aus der Reagens-Schicht freigesetzt wurden, erteilt
werden oder der gesamten Menge der nicht freigesetzten, vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, die in der Reagens-Schicht verbleibt,
ohne daß die Menge andiffusionsfähiger Verbindung, die aus der Reaktion der zu analysierenden Substanz resultiert, die die
Basis der beabsichtigten Analyse ist, beeinträchtigt wird. In jedem Falle, d.h. ob direkt oder indirekt bestimmt, sind diese
bestimmbaren Gruppierungen im Reagens vorgebildet vorhanden und werden aus der Reagens-Schicht durch Einwirkung der zu analysierenden
Substanz in Gegenwart des Reagenzes freigesetzt.
Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente liefern analytische
Ergebnisse unter Verwendung einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, die in einer Reagens-Schicht enes Elementes immobilisiert
ist, bevor die zu analysierende Flüssigkeit aufgebracht wird. Bei Aufbringung einer Flüssigkeit mit zu analysierender Substanz
auf das Element und als Folge einer chemischen oder anderen Reaktion des Reagenzes in Gegenwart der zu analysierenden Substanz
wird die vorgebildete bestimmbare Gruppierung in Form oder als Teil einer diffusionsfähigen Verbindung geliefert, die durch
Diffusion in die Registrier-Schicht wandern kann, die gegebenenfalls auf einem Schichtträger angeordnet ist.
Der Schichtträger eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes kann in vorteilhafter Weise strahlungsdurchlässig sein, d.h. durchlässig
für elektromagnetische Strahlung einer oder mehrerer Wellen-
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längen. Die Verwendung eines strahlungsdurchlässigen Schichtträgers
kann besonders vorteilhaft im Falle von Messungen von vergleichsweise geringem Strahlungsniveau oder Strahlungsstärke
sein.
Die Zeichnungen dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. Im einzelnen sind dargestellt in:
Figuren 1, 2 und 3 vergrößerte schematische Darstellungen von
erfindungsgemäßen analytischen Elementen;
Figuren 4 und 5 vergrößerte schematische Darstellungen von erfindungsgemäßen analytischen Elementen im Schnitt, wobei
in Figur 5 ein Element dargestellt ist, bei dem die Reagens-Schicht und die Registrier-Schicht zunächst in einem Abstand
voneinander angeordnet sind. Ira Falle des in Figur 4 dargestellen
Elementes ist die Reagens-Schicht von der Registrier-Schicht abstreifbar;
Figuren 6 bis 9 Diagraume, die Daten veranschaulichen, die
sich bei Verwendung erfindungsgemäßer analytischer Elemente erzielen lassen.
Das in Figur 1 dargestellte analytische Element nach der Erfindung
besteht aus:
(a) einer Ueagens-Schicht 6 mit einem Reagens mit einem nichtdiffusionsfähigen
Stoff mit einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, die in Gegenwart der zu analysierenden Flüssigkeit
nit einem Gehalt an zu bestimmender Substanz eine diffusionsfähige Verbindung aus der vorgebildeten, bestimmbaren
Gruppierung zu bilden vermag und
(b) einer Registrier-Schicht 4 für die Aufnahme der diffusionsfähigen
Verbindung und
(c) einem Schichtträger 2.
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Die Schichten des Elementes haben dabei eine solche Zusammensetzung,
daß die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung, die aus der Reagens-Schicht freigesetzt wird, selektiv innerhalb des
Elementes bestimmt werden kann.
So kann die Reagens-Scnicht beispielsweise ein Trübungsmittel enthalten,
uii die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung, die in der
Reagens-Schicht verbleibt abzudecken und um einen Hintergrund zu liefern, auf dem die in die Registrier-Schicht diffundierte Verbindung
bestimmt werden kann. Andererseits kann, wie beispielsweise in Figur 2 dargestellt, auch eine besondere Strahlung blockierende
Schicht angeordnet werden.
Des weiteren ist es auch möglich, daß die vorgebildete, bestimmbare
Gruppierung in das Reagens der Reagens-Schicht in solcher :'»reise eingearbeitet wird, daß die optische Deckkraft der
Schicht dadurch vermindert wird, wodurch eine optische Störung oder Überlagerung mit der vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung,
die in die Registrier-Schicht diffundiert ist, wirksam vermindert wird.
Alternativ ist es auch möglich, wie in Figur 4 dargestellt, die Reagens-Schicht von der Registrier-Schicht abzustreifen.
Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise ist die Registrier-Schicht
für Strahlung durchlässig (radiation transmissiv).
In typischer Weise weisen erfindungsgemäße analytische Element, wie in Figur 1 dargestellt, einen Schichtträger 2 auf. Vorzugsweise,
jedoch ebenfalls nicht notwendigerweise { ist der Schichtträger
ebenfalls strahlungsdurchlässig (radiation-transmissiv).
Weisen die Schichten eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes
eine ausreichende Festigkeit und Härte auf, so ist die Verwendung eines Schichtträger nicht erforderlich.
In Figur 2 ist ein besonders vorteilhaftes analytisches Element
nach der Erfindung dargestellt. Es besteht aus einem für Strahlung durchlässigen Schichtträger 2, auf dem aufgetragen sind:
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Ca) eine Reagens-Schicht 6, die für die zu analysierende Substanz oder eine entsprechende Vorläuferverbindung durchlässig ist
und die ein Reagens enthält, das in Gegenwart der zu analysierenden Substanz oder der entsprechenden Vorläuferverbindung zu
reagieren vermag,und zwar unter Freisetzen einer diffusionsfähigen
Verbindung mit einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung;
(b) eine Strahlung blockierende Schicht 7, die für die zu bestimmende
Verbindung durchlässig ist und
(c) eine für Strahlung durchlässige Registrier-Schicht 4, die
für die bestimmbare Verbindung ebenfalls durchlässig ist unü in der die vorgebildete bestimmbare Verbindung bestimmt
werden kann.
Gegebenenfalls kann die Registrier-Schicht des weiteren ein Beizmittel
für die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung enthalten.
Die Registrier-Schicht ist vorzugsweise zwischen Schichtträger und Strahlung blockierender Schicht angeordnet und die Strahlung
blockierende Schicht liegt vorzugsweise zv;isehen der Registrier-Schicht
und der Reagens-Schicht.
In vorteilhafter iVeise kann die Reagens-Schicht isotrop porös sein
und vorzugsweise weist sie eine praktisch gleichförmige Durchlässigkeit oder Permeabilität für die zu analysierende Substanz (oder
eine entsprechende Vorläuferverbindung) und die diffusionsfähige, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung auf. Die Strahlung blockierende
Schicht, obgleich im allgemeinen nicht als die offensichtliche Konzentration der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, die
der Strahlung blockierenden Schicht von der Reagens-Schicht zugeführt,wird,
unterbrechend betrachtet, weist in vorteilhafter Weise eine gleichförmige Durchlässigkeit oder Permeabilität für die
vorgebildete, bestimmbare Gruppierung auf. Die Registrier-Schicht v/eist eine entsprechende oder ähnliche Durchlässigkeit oder
Permeabilität in bezug auf die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung auf. Besonders vorteilhafte,Strahlung blockierende Schichten ent-
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halten ein Trübungsmittel, z.B. ein Pigment, ein Polymer in geeigneter
Form, beispielsweise ein sog. Blush-Polymer oder ein Pigment und ein solches Polymer.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung
sind die Strahlung blockierende Schicht und die Registrier-Schicht nicht-fasri.J und eine oder beide dieser Schichten sind für das
Reagens in der Reagens-Schicht undurchlässig oder inmerneabel.
Das in Figur 3 dargestellte, besonders vorteilhafte analytische £1erneut nach der Erfindung besteht aus einem Schichtträger 2,
einer hierauf aufgetragenen Reagens-Schicht 6, einer Registrier-Schicht 4 und gegebenenfalls einer Strahlung blockierenden Schicht
7, wobei diese Schichten den bereits angegebenen Aufbau haben können. Zusätzlich jedoch weist dieses Element eine nicht-fasrige Ausbreit-Schicht
8 auf, bei der es sich vorzugsweise um eine isotrop poröse Ausbreit-Schicht handelt, v/obei diese Schicht im Element derart
angeordnet ist, daß die Reagens-Schicht zwischen der Registrier-Schicht und der Ausbreit-Schicht liegt. Durch die Ausbreit-Schicht
wird erreicht, daß der Reagens-Schicht eine besonders gleichförmige Konzentration der zu analysierenden Substanz oder entsprechenden
Vorläuferverbindung zugeführt wird.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind sämtliche Schichten des Elementes nicht-fasrige, um die
Eignung des analytischen Elementes für die Durchführung quantitativer Analysen weiter zu steigern. Der Ausdruck "nicht-fasrig"
der hier im Zusammenhang mit Schichten und/oder Materialien gebraucht
wird, besagt, daß derartige Schichten oder Materialien frei oder praktisch frei von fasrigen Stoffen oder Materialien
sind, d.h., daß sie keine fasrigen Komponenten in einer solchen Menge oder Konzentration enthalten, die störend auf die Ausbreitung
der zu analysierenden Probe oder störend auf die Bestimmung des analytischen Ergebnisses durch radiometrische Methoden wirken würde.
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Bei der in Figur 4 dargestellten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen
analytischen Elenentes sind Reagens-Schicht 6 und die gegebenenfalls vorhandene Ausbreit-Schicht 3 von der Registrier-Schicht
4 des Elementes abstreifbar. In einem solchen Falle bei- · spielsweise kann sich die Registrier-Schicht 4 auf einem strahlungsdurchlässigen
oder auch opaken Schichtträger 2 befinden und die Konzentration öler Menge an vorgebildeter, bestimmbarer Gruppierung,
die in die Registrier-Schicht entlassen wird, läßt sich auf radiome
tr is ehern. Wege bestimmen durch entsprechende optische Durchlässigkeits-
oder Reflexionsmessungen der Registrier-Schicht nachdem die
Reagens- und gegebenenfalls Ausbreit-Schicht von der Registrier-Schicht
abgestreift worden sind.
Geiiiäii einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung
sind einige oder sämtliche der einzelnen Schichten des Elementes zunächst voneinander getrennt und bei oder nach Aufbringung einer
flüssigen Testprobe auf das Element vn.rd das Element der Einwirkung
einer Druckkraft ausgesetzt, i'/odurca die einzelnen Schichten in
Flüssigkeits- oder Strömungskontakt miteinander gelangen. Ein solcher
Aufbau eines erfindungsgemäßen Elementes ist vorteilhaft, wenn
es gilt, einen Kontakt zwischen einzelnen Schichten des Elementes zu vermeiden, bis die Flüssigkeitsprobe aufgebracht wird, beispielsweise
um eine vorzeitige Wanderung von vorgebildeter bestimmbarer Gruppierung oder Verbindung in die Registrier-Schicht zu vermeiden.
Eine solche zu frühe oder vorzeitige Wanderung kann erfolgen, wenn beispielsweise das Reagens mit der vorgebildeten bestimmbaren
Gruppierung von vergleichsweise geringem Molekulargewicht ist u]id wenn das erfindungsgemäße Element lange Zeit vor seiner Verwendung
gelagert wird oder ungünstigen Lagerungsbedingungen ausgesetzt v/ird, beispielsweise hohen relativen Feuchtigkeiten oder
i'e-.n^eraturen. iJes weiteren kann ein Aufbau eines analytischen
iilenentes wie in Figur 5 dargestellt dann vorteilhaft sein, wenn das Element eine besondere flüssige Komponente enthalten soll, z.B.
durch Versiegeln der Flüssigkeit innerhalb eines oder mehrerer Behalter oder Abteile 9, die Sandwich-artig zwischen oder innerhalb
piner einzelnen Abstand-Schicht 13 des Elementes angeordnet sind, wouarch eine solche flüssige Komponente in das Element zum Zeitpunkt
.l<>r Verwendung desselben durch Einwirkung einer Druckkraft auf das
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Element und Aufbrechen des oder der Behälter oder Abteilungen,
in denen sich die Flüssigkeit befindet, eingeführt werden kann.
Im Falle des in Figur 5 dargestellten Elementes befinden sich auf einem Schichtträger 2 die Registrier-Schicht 4, die Strahlung
blockierende Schicht 7, di'e Reagens-Schicht 6 und die Ausbreit-Schicht
8.
Die Verwendung von einem oder mehreren Behältern 9, die mit der Reagens-Schicht 6 in Verbindung stehen (vergleiche Figur 5) ist
besonders vorteilhaft, wenn die Reagens-Schicht 6 ein Reagens mit einem diffusionsfähigen Farbstoffrest enthält, der durch Einwirkung
der zu analysierenden Substanz in Gegenwart eines hoch korrosiven Mediums, beispielsweise von Alkali oder einer Säure
freigesetzt wird. In einem solchen Falle kann das korrosiv wirkende
Medium, das einen nachteiligen Effekt ausüben kann, wenn es mit den anderen Schichten oder Komponenten des Testelenentes
lange Zeitspannen in Kontakt gelangt oder welches die Handhabung oder Verarbeitung des Elementes erschwert oder die Lagerung desselben
erschwert, innerhalb eines aufspaltbaren für Säuren oder Alkalien impermeablen Behälteis aufbewahrt werden, bis das Element
verarbeitet wird, wodurch die erwähnten unerwünschten Effekte eines solchen korrosiven Mediums vermieden werden. Da die Elemente
nach der Erfindung verworfen werden oder nach der Verwendung versiegelt bleiben können, sind keine nachteiligen Effekte aufgrund
des korrosiven Mediums nach Verwendung des Elementes zu befürchten, solange das Element in geeigneter IVeise versiegelt
oder in anderer Weise behandelt wurde, um ein unerwünschtes Austreten des korrosiven Mediums nach Aufbrechen des Behälters 9 zu
vermeiden und vorausgesetzt, daß geeignete Maßnahmen bei der Beseitigung des gebrauchten Elementes folgen.
2SQU5
Die Reagens-Schichten erfindungsgemäßer Elemente sind permeabel
und gegebenenfalls porös für mindestens die Komponenten der zu analysierenden Flüssigkeit, die sich bei der Analyse aktiv verhalten.
Unter einer Permeabilität oder Durchlässigkeit ist hier auch die Permeabilität bzw. Durchlässigkeit gemeint, die auf
der Porosität, der Fähigkeit zur Quellung oder aufgrund anderer Charakteristika beruht.
Die Reagens-Schichten enthalten normalerweise eine Matrix oder einen Träger, in der bzw. dem das Reagens verteilt ist, d.h. gelöst
oder dispergiert ist. Kann jedoch beispielsweise das Reagens selbst zu einer diskreten Schicht verfomt werden, so ist es nicht
erforderlich, daß die Reagens-Schicht saxx eine Matrix oder einen
Träger enthält. Die Auswahl der im Einzelfalle vorteilhaftesten Matrix hängt zu einem gewissen Grade von dem beabsichtigten Verwendungszweck
des Elementes ab, d.h. ob es zur Durchführung von qualitativen, halbquantitativen oder quantitativen Analysen verwendet
werden soll. Die verschiedensten porösen, fasrigen Materialien, wie Paniere, Vliese , Filze, Webwaren und dergleichen, gleichgültig
ob aus natürlichen oder synthetischen Stoffen hergestellt, können verwendet werden. Die Verwendung derartiger Materialien und ihre
Verwendungsweise zur Herstellung analytischer Elemente ist beispielsweise
bekannt aus den QS-PS 3 302 84 2, 3 S09 605, 3 814
und 3 897 214. Andere poröse, jedoch nicht-fasrige Reagens-Träger, die sich zur Herstellung der Schichten eignen, sind beispielsweise
mikroporöse Polymere, z.B. des aus der US-PS 3 552 929 bekannten Typs, plastische poröse oder schwammige Materialien und
poröse keramische Produkte, beispielsweise des aus der US-PS 3 554 700 bekannten Typs sowie in granulierter Form vorliegende
Stoffe, z.B. des aus der US-PS 3 715 192 bekannten Typs und polymere,
offenzellige Schäume, beispielsweise des aus der US-PS
3 917 453 bekannten Typs.
In vorteilhafter Weise können zur Herstellung der Reagens-Schichten
als Reagens-Träger auch Gelatine-Schichten verwendet werden, die für die aufgebrachten flüssigen Proben durchlässig sind. Ein derartiger
Filmbildner, der beispielsweise aus der US-PS 3 630 957 bekannt ist, liefert Wasser resistente Schichten, die sich für die
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Analyse wäßriger Flüssigkeiten eignen. Schichten, die unter Verwendung
von solchen fumbildenden Stoffen hergestellt werden, werden
nicht als porös im üblichen Sinne betrachtet, da sie nach ihrer Bildung keine Porenstruktur auf Kolloid-"iveau aufweisen
und weil sie Flüssigkeit durch Diffusion anstatt durch eine kapilare Strömung durchlassen, wie sie ins Falle von porösen Materialien
auftritt. Die Auswahl von derartigen permeablen Stoffen hängt von der auf das Element aufgebrachten Flüssigkeit ab und
von der Größe der aktiven Komponenten, die die "eagens-Schicht
durchdringen müssen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der filmbildende Stoff in der zu analysierenden Flüssigkeit quellbar,
uurcn Kontakt nit der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe quillt der filmbildende Träger und erhöht seine Durchlässigkeit oder
Permeabilität für die Flüssigkeit der zu analysierenden Probe. Auf dfese Weise läßt sich die Durchdringung der Reagens-Schicht mit
der Probe beschleunigen, wie auch der effektive Kontakt zwischen Probenflüssigkeit und Reagens, das in der Reagens-Schicht verteilt
ist.
Gel-i3ildner und dergleichen werden oftnals bevorzugt als Reagens-Träger
in Elementen verwendet, die für eine quantitative Analyse bestimmt sind. Sie weisen normalerweise eine viel größere gleichförmige
Durchlässigkeit oder Permeabilität für Flüssigkeiten auf, als fasrige Stoffe. Des weiteren können sie für Licht und andere
elektromagnetische Strahlung durchlässig sein, was im Falle der Verwendung von fasrigen Trägern und anderen porösen Trägern, die,
obgleich nicht-fasrig, opak oder stark brechend gegenüber einfallender Strahlung aufgrund ihrer Porenstruktur sind, nicht zu
sein braucht.
Die Durchlässigkeit oder Permeabilität der Reagens-Schichten, die einen homogenen, filmbildenden Stoff als Reagens-'Iatrix aufweisen,
kann sehr gleichförmig sein, so daß, wenn eine homogene Flüssigkeit gleichförmig auf die Oberfläche der Schicht aufgebracht wird, entsprechende
Messungen der Konzentration der Flüssigkeit innerhalb
ZiOUSi
der Schicht, jedoch an verschiedenen Stellen einer Oberfläche der Schicht, normalerweise zu gleichen oder praktisch gleichen Ergebnissen
führen, d.h. beispielsxieise Ergebnissen, die um weniger als
etwa +_ 10*, und vorzugsweise weniger als um etwa +_ 3 bis 5" voneinander
abweichen, wenn radiometrische Messungen durch eine kleine Öffnung von beispielsweise 3 bis 10 iiikron Breite und 5T bis 100
Mikron Länge durchgeführt werden. Erfolgt bei den Messungen ein kontinuierliches Abtasten, so kann beispielsweise eine Spurenvergrößerung
von etwa 16 in vorteilhafter !ieise verwendet werden, um
die Skala auszudehnen. In vorteilhafter Weise können Reagens Schichten,
die eine praktisch gleichförmige Permeabilität oder
durchlässigkeit für Probenflüssigkeiten aufweisen, auch isotrop
porös sein. Eine weitere Beschreibung von typischen isotrop porösen Schichten erfolgt später im Zusammenhang mit der Beschreibung von
geeigneten isotrop porösen Ausbreit-Schichten.
La Falle einer derartigen gleichförmigen Durchlässigkeit oder
Permeabilität lassen sich unerwünschte Konzentrationsgradienten der Probenkomv.onenten innerhalb der Schicht vermeiden, nies ist
.■„•inscheiiswert, un die quantitative Bestimmung analytischer Ergebnisse
zu erleichtern. Eine sehr gleichföruige Durchlässigkeit oder Permeabilität ist nicht charakteristisch für Schichten, die aus
fasrigen Materialien erzeugt vvcrden, beispielsweise Filterpapieren,
lasri^en Vliesen, Pilzen, Webstoffen und dergleichen. Es wird angenommen,
daß Faktoren wie eine variable Dochtwirkung innerhalb des fahrigen Materials die Bildung von veränderlichen Konzentrationen
der Komponenten der durchlässigen Flüssigkeit innerhalb des fasri-,;.on
Materials wie auch in Schichten aus derartigen fasrigen Materialiesa,
die sich in Strönungskontakt oder Flüssigkeitskontakt litcinander befinden, beeinflussen können. Demzufolge werden derartige
Träger aus fasrigen Materialien als besonders vorteilhaft nur
Γ ir die Jurchfäiirung qualitativer Analysen betrachtet.
Ist das Lösunrsnittelüicdiirn der zu analysierenden Flüssigkeit be-•lunt,
so ist die Auswahl eines geeigneten Filmbildners als :>a;,ens-Schicht-Matrix einfach, wenn die Löslichkeitseigenscliaften
Moses Materials bekannt sind. Beispielsweise eignen sich Cellulose-■/etauj
eines verglei ehr1-'?ise geringen Acetyli erungsgrades oder
809829/0882 &o V:>.^\^
2IQM5I
CellulosenitratE eines vergleichsweise geringen Nitrierungsgrades in den Fällen, in denen Flüssigkeiten mit kurzkettigen Alkanolen
als Lösungsmittelinedium analysiert werden.
im wesentlichen In vielen Fällen kann das Lösungsmittelmedium vollständig/ oder
teilweise wäßrig sein. Eine besonders wichtige Gruppe von wäßrigen Flüssigkeiten, die mit erfindungsgemäßen Elementen analysiert
werden können, sind biologische Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blutplasma, Serum und Jrin. Für die Analysen von biologische*1, biochemischen
und anderen wäßrigen Flüssigkeiten, haben sich hydrophile (d.h. mit Wasser benetzbare) Filmbildner als besonders vorteilhafte
Reagens-Träger für die Herstellung von Reagens-Schichten erwiesen. Derartige hydrophile Reagens-Träger können auch in Wasser
oder anderen wäßrigen Medien einer zu analysierenden Flüssigkeit quellbar sein. Vorteilhafte hydrophile Stoffe bestehen aus natürlich
vorkommenden hydrophilen Kolloiden wie beispielsweise Gelatine; Polysacchariden, wie beispielsweise Gummiarabicum, Agar-Agar und
Agarose; Cellulose sowie Cellulosederivaten sowie synthetischen Stoffen, wie beispielsweise Wasser-löslichen Polyvinylverbindungen,
beispielsweise Poly (vinylalkohol) und Poly (vinylpyrrolidon), Acrylaiitidpolyiaeren
und dergleichen.
In einer Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes liegt ein Reagens mit einem nicht-diffusionsfähigen Stoff vor, der
eine vorgebildete, bestimmbare Gruppierung (moiety) enthält. Je nach der Nat»r des Reagens kann dieses die einzige Komponente
der Reagens-Schicht sein oder aber das Reagens kann gegebenenfalls mit anderen notwendigen oder vorteilhaften Reaktionskomponenten
oder Bestandteilen in der Schicht verteilt sein, und zwar in einem
Träger des bereits beschriebenen Typs.
Wie bereits dargelegt, besteht das in der Reagens-Schicht vorhandene
Reagens aus einem Stoff oder einer Verbindung, die auf chemischen oder physikalischem Wege in Gegenwart der Flüssigkeit mit einer vorbestimmten
zu analysierenden Substanz reagiert, und zwar unter Ausbildung eines diffusionsfähigen Reaktionsproduktes aus der vorgebildeten,
bestimmbaren Gruppierung. Diese vorgebildete, bestimmbare Gruppierung des Reagens ist ein Stoff oder eine Verbindung, die
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28QU5S
bestimmbar ist, beispielsweise auf radiometrische oder andere Weise. Demzufolge läßt sich aufgrund der selektiven Bestimmbarkeit
dieses Stoffes oder dieser Verbindung das Vorhandensein oder die Konzentration einer zu analysierenden Substanz in der zu analysierenden
Flüssigkeit ermitteln.
Bei dem in der Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes
vorhanden Reagens handelt es sich um einen nicht-diffusionsfähigen Stoff, der diffusionsfähig gemacht werden kann oder eine diffusionsfähige,
vorgebildete, bestimmbare Gruppierung enthält. In typischer Weise ist die diffusionsfähige, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung
des Reagens chemisch oder physikalisch an eine nicht-diffusionsfähige
Gruppierung oder Gruppe des Reagens gebunden. In einem solchen Falle erfolgt bei Einwirkung der zu analysierenden Flüssigkeit
mit der zu analysierenden Substanz eine chemische oder eine andere Reaktion des Reagens in Gegenwart der zu analysierenden Flüssigkeit,
bei der aus der Reagens-Schicht eine diffusionsfähige, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung oder Verbindung freigesetzt wird, die in
bezug zum Vorhandensein oder der Konzentration der zu analysierenden Substanz in der Testprobe gesetzt werden kann.
Die spezielle Zusammensetzung des Reagens ist naturgemäß abhängig von der im Einzelfalle zu analysierenden Substanz der Flüssigkeit,
die auf das Element aufgebracht wird und hängt ab von den im Einzelfalle angewandten Bestimmungsmitteln, die für die Bestimmung
der zu analysierenden Substanz angewandt werden. Zu bemerken ist jedoch, daß für die Analyse einer Flüssigkeit mit einer zu analysierenden
Substanz verschiedene Arten von Reagenzien angewandt werden können, je nach den) gewünschten Freisetzungs- oder Verdrängungsmechanismus
für die diffusionsfähige, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung, d.h. je nach der im Einzelfalle ablaufenden
chemischen oder anderen Reaktion zwischen dem Reagens und der zu analysierenden Substanz zum Zwecke der Freisetzung der diffus ionsfähigen,
vorgebildeten, bestimmbaren Verbindung.
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Um einen Aspekt der möglichen Modifizierungen zu veranschaulichen,
die bezüglich des verwendeten Reagens erfolgen können, ist zu bemerken, daß die diffusionsfähige, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung,
die in dem Reagens vorliegt, aus irgendeiner aus einer Vielzahl von verschiedenen Verbindungen oder Materialien bestehen kann.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung besteht die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung aus einer Gruppierung
oder Verbindung, die direkt auf radiometrischem ¥ege bestimmbar
ist. Der Ausdruck "auf radiometrischem Wege" besagt, da£ die Bestimmung
mittels der verschiedensten üblichen bekannten analytischen Abtastverfahren erfolgen kann, bei denen eine Strahlung verwendet
wird, um ein analytisches Ergebnis zu erhalten.
Zu typisch vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen, die direkt
auf radiometrischem Wege bestimmbar sind, gehören Ca) auf colorimetrischem
Wege bestimmbare Gruppierungen oder Verbindungen, wie beispielsweise gefärbte Verbindungen (d.h. Farbstoffe oder Pigmente)
die Extinktionskoeffizienten oder Absorptionsspektren aufweisen, die zur Ermittlung ihres Vorhandenseins oder zur Bestimmung ihrer
Konzentration unter Anwendung üblicher bekannter colorimetrischer Bestimmungsvorrichtungen verwendet werden können und (h) Strahlung
aussendende oder emittierende Verbindungen oder Substanzen, wie beispielsweise fluoreszierende Verbindungen oder Substanzen, z.B.
eine fluoreszierende Verbindung, die mittels einer Vorrichtung bestimmbar
ist, die zum Abtasten von Strahlung geeignet ist, die von derartigen Verbindungen emittiert v/ird.
Es können jedoch auch andere Typen von Strahlung aussendenden Verbindungen oder Stoffen als diffusionsfähige, vorgebildete, bestimmbare
Gruppierungen eines Reagens verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei der zu bestimmenden Verbindung oder Gruppierung
um eine phosphoreszierende Verbindung oder Gruppierung handeln oder eine radioaktiv markierte Gruppierung, so daß bei Einwirkung
der zu untersuchenden Flüssigkeit auf das Reagens eine bestimmte Menge der beispielsweise radioaktiv markierten diffusionsfähigen
Gruppierung freigesetzt wird. Diese radioaktive Gruppierung kann dann in die Registrier-Schicht des Elementes wandern, wo sie aufgrund
ihrer charakteristischen radioaktiven Emission bestimmt werden
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- 35 kann.
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Die Verwendung derartiger Strahlung emittierender Anhänger (tags) ist besonders vorteilhaft bei der Herstellung eines Reagens aus
einerii markierten Antigen-Antikörperkomplex, der nicht-diffusionsfähig
ist und in einer Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes enthalten ist. In Gegenwart der zu analysierenden
Substanz in der zu analysierenden Testflüssigkeit wird der markierte
Teil (d.h. entweder das markierte Antigen oder der markierte Teil (d.h. entweder das markierte Antigen oder der markierte
Antikörper) des Antigen-Antikörperkomplexes der in der Reagens-Schicht
enthalten ist, durch eine bestimmte Menge des nicht markierten Teiles (d.h. entweder des nicht markiertenAitigens
oder nicht markierten Antikörpers) der zu analysierenden Testfliissigkeit verdrängt. Der markierte Teil, der verdrängt wurde,
wandert dann in die Re^istrier-Schicht, wo eine Bestimmung aufgrund
der charakteristischen Emission des Teiles erfolgen kann. Aufgrund der !enge an markierten Teil, der in der Registrier-Schicht
festgestellt wurde, läßt sich die Menge an nicht markierten Teil in der ursprünglichen Flüssigkeitsprobe bestimmen.
Die beschriebene Verwendung von markierten oder gekennzeichneten Antigen-Antikörperkomplexen ist eine bekannte analytische Laboriiiethode.
Diese Methode wurde bisher jedoch nicht unter Verwendung analytischer Elemente des hier beschriebenen Typs angewandt. Erfindungsgemäije
Elemente, die derartige Komplexe als Reagens enthalten,
lassen sich in besonders vorteilhafter Weise beispielsweise im Rahmen von sog. "Immunobestiramungs-" Analyseverfahren
verwenden, bei denen der markierte Antigen-Antikörperkomplex als Substrat für das spezielle Antigen oder den speziellen Antikörper
dient, das bzw. der in der zu analysierenden Flüssigkeit enthalten ist. Derartige Verdrängungsreaktionen und verschiedene Antigen-Antikörperkomplexe
sind beispielsweise aus der US-PS 3 880 934 bekannt.
Außer den vorerwähnten Gruppierungen, die direkt auf radiometrischem
.Vege bestimmbar sind, fallen unter den Begriff der "vorgebildeten,
bestimmbaren Gruppierung" auch vorgebildete Gruppierungen, die ob-
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gleich nicht direkt bestimmbar sind, doch bestimmbar gemacht werden können, ohne dall dabei die Genauigkeit des Analyseverfahrens
leidet.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird die gesamte Menge der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, die
aus der Reagens-Schicht in die Registrier-Schicht wandert, bestimmbar
gemacht, wobei dies ohne Beeinträchtigung der !!enge an diffusionsfähiger Verbindung oder diffusionsfähigen Stoff erfolgen
kann. Beispiele für derartige vorgebildete, bestimmbare Gruppierungen sind fluoreszierende Verbindungen oder Stoffe, die in
ihrem freien Zustand eine vergleichsweise geringe Fluoreszenz aufweisen, die jedoch, werden sie an einen geeigneten Träger gebunden,
stark fluoreszieren. Weitere Beispiele sind durch Enzyme markierte
Antigene,, die in eine Registrier-Schicht wandern, die ein Substrat
für eine solche Enzym-Markierung enthält, wobei das Substrat beispielsweise eine Reaktionsmischung enthält, die durch eine solche
Enzym-Markierung katalysiert wird, unter Bildung eines direktbestimmbaren
Reaktionsproduktes, z.B. eines Farbstoffes.
Aus der vorstehenden Beschreibung ist offensichtlich, daß die verschiedensten bestimmbaren Gruppierungen als vorgebildete, bestimmbare
Gruppierungen in der Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen analytischen Elementes verwendet werden können. Zu diesen
bestimmbaren Gruppierungen oder Verbindungen gehören auch die verschiedensten vorgebildeten Farbstoff- die durch ihr charakteristisches
Absorptionsspektrum bestimmbar sind oder die verschiedensten Strahlung aussenden Stoffe, wie beispielsweise fluoreszierende
Verbindungen oder phosphoreszierende Verbindungen oder radioaktive Verbindungen oder Stoffe, die aufgrund ihres charakteristischen
Emissionsspektrums bestimmbar sind. Typische geeignete Farbstoffe und fluoreszierende Verbindungen sollen später näher beschrieben
werden. Zu den typischen phosphoreszierenden und radioaktiven Stoffen und Verbindungen gehören beispielsweise die verschiedensten
üblichen bekannten Phosphore oder Leuchtstoffe, wie beispielsweise substituierte Cumarine, Fluoreszine, Rhodaminfarbstoffe
und die verschiedensten radioaktiven Gruppierungen oder Stoffe oder Atome, wie beispielsweise Kohlenstoff 14 oder schwerer TVasser-
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stoff (Tritium).
Abgesehen von den speziellen Verbindungen oder Stoffen und Eigenschaften derselben, die als vorgebildete, bestimmbare
Gruppierungen der verwendbaren Reagenzien verwendbar sind, ist festzustellen, daß die verschiedensten Verfahren angewandt
werden können, um eine Freisetzung der diffusionsfähigen, vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung von dem.Reagens zu bewirken.
Die Freisetzung der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung von dem nicht diffusionsfälligen Reagens hängt dabei von
der speziellen Art ab, durch welche die diffusionsfähige, vorgebildete, bestimmbare Gruppierung an das Reagens gebunden ist
und von dem Mechanismus, durch den die Gruppierung freigesetzt wird.
Im folgenden sollen typische Verdrängungs- oder Freisetzungsmechanismen
und Reagenzien, die hier-bei eine Rolle spielen beschrieben werden, durch die die diffusionsfähigen, vorgebildeten,
bestimmbaren Gruppierungen von den Reagenzien abgetrennt oder verdrängt werdenkönnen.
Hydrolytische Freisetzung
Bine hydrolytische Freisetzung bezieht sich, wie bereits der
Name sagt, auf einen Mechanismus, bei dem die diffusionsfähige, vorgebildete bestimmbare Gruppierung vom Reagens als Folge einer
Iiydrolysereaktion freigesetzt wird. Ein typisches Beispiel für einen solchen hydrolytischen Freisetzungsmechanismus, der besonders
vorteilhaften analytischen Kiementen nach der Erfindung zugrundeliegt, läßt sich unter Bezugnahme auf ein erfindungsgemäßes
Element veranschaulichen, das ein Reagens enthält, das für die Bestimmung des α-Ainylasegehaltes einer biologischen Probe, beispielsweise
des ot-Amylasegehaltes von menschlichem Serum geeignet
ist. In einem solchen Falle besteht das Reagens, das als Substrat für die Amylase dient, die in der zu analysierenden Probe vorhanden
ist, aus Stärke mit einer vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung, z.B. einem Farbstoff oder Farbstoffrest, der chemisch an
einzelne wiederkehrende Glucoseeinheiten der Stärke gebunden ist.
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Das Enzym α-Amylase verursacht bekanntlich eine katalytische
Hydrolyse der Stärke, was zu einem Aufbruch der Stärke in eine Reihe von Polysaccharideinheiten eines geringeren Molskulargewichtes
führt. Diese Aufspaltung ist die Folge der Hydrolyse der a-1,4-Bindungen der Amylose- bzw. Amylopectinfraktionen, wobei
diese Fraktionen die hauptsächlichsten Komponenten der Stärke ausmachen.
Es wurde gefunden, daß durch Einverleiben eines derartigen Stärkesubstrates
mit einer vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung in die Reagens-Schicht KioDjexxjex2&txDdxoi^^»xc5ü8»»xein Reagens erhalten
werden kann, das in der Reagens-Schicht in Gegenwart einer a-Amylasefreien
Flüssigkeitsprobe praktisch nicht-diffundierend ist.
In Gegenwart einer Probe jedoch, die a-Araylase enthält, erfolgt
ein charakteristischer katalytisch-hydrolytischer Abbau des Stärkesubstrates. Als Folge hiervon werden vergleichsweise niedrig
molekulare Polysaccharideinheiten freigesetzt, die aufgrund ihres geringen Molekulargewichtes diffusionsfähig sind und in Gegenwart
der wäßrigen Probe durch die Reagens-Schicht in die Registrier-Sciiicht
diffundieren. Das Vorhandensein der niedrig molekularen Polysaccharideinheiten, die in die Registrier-Schicht diffundieren,
läßt sich erfindungsgemäß bestimmen durch Feststellung des Vorhandenseins der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, die
in der Registrier-Schicht auftritt. Da die vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen chemisch an die einzelnen niedrig molekularen
Polysaccharideinheiten gebunden sind, ist es möglich, das Vorhandensein dieser Einheiten in der Registrier-Schicht festzustellen.
Das Vorhandensein dieser Einheiten in der Registrier-Schicht ermöglicht somit festzustellen, ob α-Amylase in der untersuchten
Serumprobe vorhanden ist oder nicht.
Die Auswahl eines speziellen nicht-diffusionsfähigen Stärkesubstrates
mit vorgebildeten bestimmbaren Gruppierungen kann aus einer Vielzahl von entsprechenden Stärkesubstraten erfolgen. Dies
bedeutet, daß zur Herstellung erfindungsgemäßer analytischer Elemente die verschiedensten Stärkesubstrate mit vorgebildeten, bestimmbaren
Gruppierungen verwendet werden können, einschließlich Stärkesubstrate mit radioaktiven Gruppierungen oder Markierungen, mit
28QU55
colorir.ietrisch bestimmbaren Gruppierungen, wie beispielsweise
Farbstoffen, fluoreszierenden Verbindungen und Farbstoffen und dergleichen. Die speziellen vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierungen
sind dabei entweder durch physikalische oder durch chemische Bindung an die einzelnen wiederkehrenden Saccharid-Einheiten
des Stärkemoleküls gebunden. Vorzugsweise sollen die vorgebildeten bestimmbaren Gruppierungen physikalisch und chemisch inert bezüglich
der verschiedenen anderen Komponenten der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe sein.
Besonders vorteilhafte Ergebnisse im Falle der Analyse von «-
Amyläse lasssen sich dann erhalten, wenn als nicht-diffusionsfähige
Stoffe solche Stoffe verwendet werden, die colorimetrisch bestimmbar sind, z.B. Stärken, die komplex-gebundene, übliche,
colorimetrisch bestimmbare Farbstoffe aufweisen, d.h. Farbstoffe,
die dafür bekannt sind, daß sie mit Stärken Komplexe bilden, beispielsweise
die verschiedensten halogenierten Farbstoffe auf Cyatvur- Basis, wie beispielsweise die Chlortriazinfarbstoffe
(im Handel beispielsweise erhältlich von der Firma Ciba-Geigy Co., Inc., unter der Handelsbezeichnung Cibacron Brilliant Orange G.P.
(Reactive Orange 5) und Cibacron Brilliant Blue F3Ga (Reactive Blue 2)) und dergleichen. Die Herstellung derartiger Stärkekomplexe
lit bestimi.ibaren Gruppierungen ist bekannt und braucht deshalb hier
nicht näher erläutert zu werden. Verwiesen wird nur beispielsweise auf die US-PS 3 597 322 und 3 694 318, aus denen die verschiedensten
Komplexe aus Stärke und halogenierten Farbstoffen auf Cyanur-Säurebasis bekannt sind.
Besonders vorteilhafte Ergebnisse lassen sich erfindungsgemäß
auch durch Verwendung von nicht diffusionsfähigen fluoreszierenden
Stürkekomplexen erhalten, deren hydrolytische Spaltung durch a-Auylase
katalysiert wird. Ein Beispiel für einen derartigen fluoreszierenden
Stärkekoiiiplex ist der Komplex, der bei der Umsetzung von
A.aylase wit N-Carboxyanthranilinsäureanhydrid, einer bekannten
fluoreszierenden Verbindung anfällt. Erfolgt diese Umsetzung unter ^eci^neten Bedingungen, z.B. unter Verwendung eines Pyridinl.atalysators
sowie in Gegenwart von Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel,
so läiät sich ein stark fluoreszierendes Stärke-Reaktionsirodifut
erhalten, indem eine vergleichsweise große Anzahl einzelner
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wiederkehrender Glucose-Einheiten des Stärkepolymeren verestert
und in Anthranilat-Einheiten überführt worden ist. Die Herstellung derartiger Stärkekomplexe läßt sich durch die folgende Reaktionsgleichung
wiedergeben:
CII2OH +
Stärkegerüst
Pyridin
Dimethyl sulfoxid
Stärkegerüst
CT1
Ni I „
2(H9O)
+ CO.
Die auf diese Weise herstellbaren fluoreszierenden Stärken weisen
aufgrund der vergleichsweise großen Anzahl von Glucose-Einheiten, die in Anthranilat-Einheiten überführt worden sind, einen hohen
Fluoreszenzgrad auf. Nach dem beschriebenen Verfahren lassen sich insbesondere Stärken herstellen, die im optimalen Falle eine Anthranilat-Einheit
auf 6 Glucose-Einheiten aufweisen.
Die im Einzelfalle verwendete spezielle vorgebildete bestimmbare Gruppierung für die Bestimmung von a-Amylase, hängt zum großen
Teil von den speziellen Eigenschaften des anfallenden Komplexes mit der Amylose-Stärke-bestimmbaren Gruppierung ab, der als Reagens
verwendet werden soll. Beispielsweise läßt sich ein löslicher oder unlöslicher vorgebildeter Komplex mit einer Stärke-bestimmbaren
Gruppierung verwenden, der in einem wäßrigen Medium bei 220C und
einem pH-Wert von 7,0 löslich ist. Ein in Wasser unlöslicher vorgebildeter Stärke-bestimmbarer Komplex, der erfindungsgemäß als Reagens
verwendet werden kann, ist beispielsweise aus der US-PS 3 694 318 bekannt. Weitere Beispiele von verschiedenen in Wasser
löslichen, vorgebildeten Stärke-bestimmbaren Komplexen, die sich erfindungsgemäß
verwenden lassen, sind aus der US-PS 3 597 322 bekannt. Weitere ähnliche in Wasser lösliche Farbstoff-
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Stärkekomplexe, die erfindungsgemäß verwendbar sind, sind die
aus den US-PS 3 705 149 und 3 679 661 bekannten Komplexe.
Zur Herstellung der Stärkekomplexe können Stärken verschiedenen Ursprunges verwendet werden, beispielsweise Stärken, die gewonnen
werden aus Kartoffeln, Mais, Tapioca, Weizen, Reis, süßen Kartoffeln und anderen Stärkelieferanten, wie auch Stärkefraktionen. Sowohl
in V/asser lösliche als auch in Wasser unlösliche Stärken können zur Herstellung der beschriebenen Stärke-Reagenzien verwendet
werden. Das Herausdiffundieren der anfallenden Stärke enthaltenden Reagenzien aus der Reagens-Schicht der analytischen Elemente kann
beispielsweise dadurch verhindert werden, daß die Stärke-Reagenzien in eine Reagens-Schicht gebracht werden, die eine Porengröße aufweist,
die verhindert, daß die nicht-hydrolysierten Stärke-Reagenzien aus der Schicht diffundieren, wobei die Porengröße der
Schicht jedoch groß genug ist, daß die hydrolysierten Stärkereste von vergleichsweise geringem Molekulargewicht durch die Schicht
diffundieren können. Alternativ ist es auch möglich, die nicht hydrolysierten Stärke-Reagenzien in einer Reagens-Schicht unterzubringen,
die \/iederum auf eine gegebenenfalls Strahlung blockierende
Schicht und eine Registrier-Schicht aufgetragen wird (verwiesen l^ird auf Figur 2). Bei dieser Ausgestaltung der Erfindung ist die
Porengröße der Registrier-Schicht und der gegebenenfalls vorhandenen Strahlung blockierenden Schicht derart, daß diese Schichten für
die nicht hydrolysierten Stärke-Reagenzien praktisch undurchlässig sind, jedoch durchlässig für die hydrolysierten Stärkeprodukte von
jeringereu Molekulargewicht. Dies bedeutet, daß die Porengröße der
Reagens-Schicht, der Strahlung blockierenden Schicht und/oder der
Registrier-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes für die Bestimmung
von Aniylase von der Molekülgröße der nicht-hydrolysierten
Stärkeprodukte und der Hydrolyseprodukte abhängt.
Verdrängungs-Freisetzung
Die Freisetzung einer vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung aus einem nicht-diffusionsfähigen Stoff oder Reagens der Reagens-Schicht
läßt sich des weiteren durch einen Verdrängungsmechanismus erreichen.
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Bei dieser Methode der Freisetzung ist die vorgebildete, bestimmbare
Gruppierung physikalisch oder chemisch an einen nicht-diffusionsfähigen Träger gebunden, beispielsweise ein nicht-diffusionsfähiges
Substrat für die zu analysierende Substanz, die in der auf das Element aufgebrachten, zu analysierenden Testprobe enthalten
ist. In einem solchen Falle verdrängt die zu analysierende Substanz als Folge einer chemischen oder physikalischen Reaktion mit dem
nicht-diffusionsfähigen Substrat des Reagens einen Teil der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung, die an das nicht-diffusionsfähige
Substrat gebunden ist oder bewirkt oder verursacht eine Verdrängung. Die dabei anfallende diffusionsfähige Verbindung oder
Substanz aus der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung diffundiert oder wandert dann in die Registrier-Schicht des Elementes, in der
die Bestimmung der in die Schicht gewanderten Verbindung oder Substanz erfolgen kann. Derartige Verdrängungsmechanismen sind bekannt
und werden in der Praxis beispielsweise im Rahmen verschiedener Immuno-Bestimmungsmethoden angewandt.
Ein Verdrängungs-Freisetzungsmechanismus läßt sich jedoch auch
im Rahmen anderer Bestimmungsverfahren anwenden. So können erfindungsgemäße
analytische Elemente beispielsweise auch für die Bestimmung von Bilirubin verwendet werden. In diesem Falle wird als
Reagens, d.h. als nicht-diffusionsfähiger Stoff der Reagens-Schicht ein Bilirubin-aktiver Komplex verwendet, der z.B. aus einem Träger
wie beispielsweise Albumin und einem Liganden, der die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung darstellt, besteht. Werden derartige Komplexe
mit Bilirubin in Kontakt gebracht, so verdrängt das Bilirubin den bestimmbaren Liganden von dem Albuminträger, wodurch der bestimmbare
Ligand freigesetzt wird. Nach Diffusion des Liganden aus der Reagens-Schicht des Elementes in die Registrier-Schicht, läßt sich
das Vorhandensein oder die Konzentration des Bilirubins in der Testprobe durch Bestimmung der Menge an diffusionsfähigem Liganden,
der von dem Bilirubin-aktiven Komplex freigesetzt wurde, vermitteln. Dieses analytische Verfahren zur Bestimmung von Bilirubin beruht
somit auf einer Wettbewerbsverdrängung, einer vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung, beispielsweise einer fluoreszierenden Verbindung
von einem Reagens aus fluoreszierender Komponente und Albumin, die
als Substrat für
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das Bilirubin dient.
Oxidative und reduktive Freisetzung
Dieser Preisetzungsmechanismus beruht, wie bereits der Name sagt,
auf einer Oxidation oder Reduktion des nicht-diffusionsfähigen
Stoffes der Reagens-Schicht in Gegenwart einer zu analysierenden Substanz zum Zwecke der Erleichterung der Freisetzung der diffusionsfähigen,
vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung aus der Reagens-Schicht eines erfindungsgemäßen Elementes. Bs sind die
verschiedensten Freisetzungs-Mechanismen dieses Typs bekannt, beispielsweise aus dem Gebiet der photographischen Chemie, wo derartige
Mechanismen angewandt werden, beispielweise im Rahmen von
Silberhalogenid-Diffusionsübertragungsverfahren. Derartige Mechanismen
können auch mehrschichtigen analytischen Elementen nach der lirfindung zugrundeljegen.
Eine oxidative oder reduktive Freisetzung kann in manchen Fällen direkt als Folge einer Oxidation oder Reduktion des nichtdiffusionsfähigen
Stoffes, der in der Reagens-Schicht enthalten ist, erfolgen. Beispielsweise läßt sich als Substrat für die
zu analysierende Substanz, d.h. als Analyt-Substrat ein nichtdiffusionsfähiger
Stoff auswählen, der chemisch gebunden hieran vorgebildete, bestimmbare Gruppierungen enthält, in welchem Falle
die Bindung durch Oxidation oder Reduktion aufgespalten wird, unter Freisetzung der diffusionsfähigen, vorgebildeten, bestimmbaren
Gruppierung. Andererseits läßt sich als nicht-diffusionsfähiger Stoff auch ein Stoff auswählen, der aufgrund seiner Molekulargrü^e
nicht diffusionsfähig ist oder aufgrund seiner speziellen
iolekularkonfiguration, in welchem Falle die Konfiguration des
Stoffes durch Oxidation oder Reduktion verändert wird, und zwar dahingehend, daß eine diffusionsfähige Verbindung oder Komponente
anfällt, die die vorgebildete, bestimmbare Gruppierung aufweist. So läßt sich beispielsweise als nicht-diffusionsfähiger Stoff oder
Substrat ein Stoff von vergleichsweise hohem Molekulargewicht verwenden, der durch Oxidation oder Reduktion abgebaut wird, unter
Bildung einer Anzaiil kleinerer chemischer Einheiten von beträchtlich
geringerem Molekulargewicht, die dadurch diffusionsfäügsind.
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Des weiteren läßt sich als nicht-diffusionsfähiger Stoff auch ein Stoff verwenden, der eine besondere Gruppe oder einen besonderen
Rest aufweist, die bzw. der den Stoff nicht diffusionsfähig macht. Derartige Gruppen oder Reste werden in der Regel als
"Ballasf'-gruppen bezeichnet. Derartige Ballastgruppen lassen sich
von dem nicht-diffusionsfähigen Stoff aufgrund einer Oxidations oder
Reduktionsreaktion abspalten, wobei diffusionsfähige Stoffe mit der vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung anfallen. Gegebenenfalls
können derartige, den Stoff nicht-diffusionsfähig machende Gruppen als Folge einer Oxidation- oder Reduktionsreaktion auch in löslich machende Gruppen überführt werden.
"Direkte" oxidative oder reduktive Freisetzungsmechanismen ergeben
sicii durch Auswahl eines geeigneten Reagens oder eines nichtdiffusionsfähigen
Stoffes, der in Gegenwart der zu bestimmenden Substanz oxidiert oder reduziert wird, wobei direkt eine
diffusionsfähige Verbindung oder Komponente anfällt, die die
vorgebildete bestimmbare Gruppierung enthält. Reagenzien, die nach einem derartigen "direkten" Freisetzungsmechanismus arbeiten,
sind beispielsweise sog. Leucoform-Ringschlußverbindungen des aus der US-PS 3 443 940 bekannten Typs. Derartige Verbindungen sind
aufgrund des Vorhandenseins geeigneter Ballastgruppen nichtdiffusionsfähig und enthalten einen chemisch gebundenen Farbstoffrest.
Werden diese Verbindungen oxidiert, so unterliegt die chemische Bindung, durch die der Farbstoffrest gebunden ist, einer
Ringschlußreaktion, wobei der Farbstoff freigesetzt wird.
Außer dem beschriebenen "direkten" oxidativen oder reduktiven Freisetzungsmechanismus, sind die verschiedensten Freisetzungsmechanismen bekannt, die als "indirekte" oxidative oder reduktive
Freisetzungsmechanismen bezeichnet werden und erfindungsgemäß verwendbar sind. Auch in diesen Fällen, wie im Falle der sog.
"direkten" Mechanismen wird die Freisetzung einer vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung vom Reagens durch Oxidation oder Reduktion
des Reagens bewirkt oder erleichtert. Im Falle eines "indirekten" Freisetzungsmechanismus werden jedoch eine oder mehrere zusätzliche
Reaktionen durchgeführt, bevor die Freisetzung der vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung, beispielsweise die Freisetzung
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eines Farbstoffes erfolgt, bine Vielzahl derartiger indirekter
oxidativer oder reduktiver Freisetzungsmechanismen ist beispielsweise
aus Patentschriften auf dem Gebiet der Silberhalogenidphotographie
bekannt. Diese Freisetzungsverfahren lassen sich auch in Rahmen der erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen
Elemente einsetzen.
So lassen sich beispielsweise viele der bekannten indirekten oxidativen
oder reduktiven Preisetzungsmechanismen im Rahmen der
Erfindung einsetzen, und zwar durch Verwendung eines immobilen oder nicüt-diffusionsfähigen Stoffes oder Reagens, der bzw. das
mit einen separaten oxidierbaren oder reduzierbaren Co-Reagens in
Kontakt steht, beispielsweise einer photographischen Entwicklerverbindung, einem photographischem Kuppler und dergleichen. Nach
Oxidation oder Reduktion eines solchen Co-Reagens, je nach dem ira Einzelfalle verwendeten Co-Reagens und deu\ erwünschten Oxidationszustand,
reagiert das oxidierte oder reduzierte Co-Reagens mit dem imiaobilen oder nicht-diffusionsfähigen Stoff unter Abspaltung
(z.B. durch eine Kupplungsreaktion oder überkreuz-Oxidationsreaktion)
einer diffusionsfähigen, vorgebildeten, bestimmbaren
Gruppierung, beispielsweise eines Farbstoffes. Ein Beispiel eines solchen Farbstoff-Freisetzungsverfahrens ist beispielsweise
aus der US-PS 3 628 952 bekannt. Bei dem bekannten Verfahren v/erden Sulfonylhydrazonverbindungen mit Ballastgruppen aufweisenden
Farbstoffresten verwendet, die mit oxidierten Entwicklerverbindungen,
beispielsweise Brenzkatechin reagieren und dabei einen einen diffusionsfähigen Farbstoff enthaltenden Rest von dem
Ballastgruppen aufweisenden Ausgangsmaterial abspalten.
Andere indirekte oxidative und reduktive Farbstoff-Freisetzungsmechanismen,
die dem aus der US-PS 3 628 952 bekannten Mechanismus ähneln sind die verschiedenen Kupplungs-Freisetzungsmechanismen,
die beispielsweise aus den US-PS 3 227 550 und 3 476 563 bekannt sind. Im Falle dieser Mechanismen wird ein photographischer
Kuppler, der eine chemisch gebundene Ballastgruppe aufweist,um
ihn nicht-diffusionsfähig zu machen, an seiner Kupplungsposition über eine chemische Bindung an einen Farbstoff gebunden, an den
eine löslich machende Gruppe chemisch gebunden ist. Derartige
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Kupplerverbindungen unterliegen einer Kupplungsreaktion mit
üblichen aus primären aromatischen Aminen bestehenden Farbentwicklerverbindungen
(die selbst oxidiert wurden) unter Abkupplung oder Abspaltung der eine Ballastgruppe aufweisenden Kupplungsgruppe,
wobei sie den Farbstoff freisetzen, der aufgrund der an das Farbstoffiiiolekül
gebundenen löslich machenden Gruppe oder Gruppen diffusionsfähig ist, beispielsweise in einen alkalischen 'lediurii.
Weitere andere Farbstoffe freisetzende Mechanisnen, bei denen diffusionsfähige Farbstoffe durch einen Kunplungs-Freisetzungsmechanismus
erzeugt werden, sind beispielsweise aus der DT-OS 2 415 125 bekannt.
Ein v/eiterer Typ eines indirekten Farbstoff-Freisetzungsmechanisi-ius
ist aus den US-PS 3 443 940 und 3 443 933 bekannt. Dem Freisetzungsmechanis.'iius
liegt eine chemische Kupplungsreaktion zwischen einer oxidierten photographischen Farbentwicklerverbindung und einer
Ballastgruppen auf v/eis enden Farbstoff liefernden Reaktionskomionente
zugrunde. Verwendet werden, wie sich aus den Patentschriften ergibt, bestimmte Ballastgruppen aufweisende phenolische Verbindungen,
an deren Phenolkern über eine chemische Bindung Farbstoffreste gebunden sind. Nach Reaktion mit oxidierter Farbentwicklerverbindung
kuppeln diese Ballastgruppen aufweisenden phenolischen Verbindungen mit den oxidierten Farbentwicklerverbindungen. In den
Produkten dieser Reaktion unterliegen der Rest der aus einem primären Amiη bestehenden Farbentwicklerverbindung und die chemische
Bindung, die den Farbstoffrest an den Phenolkern bindet, einer spontanen Ringschlußreaktion unter Abspaltung und Freisetzung
eines diffusionsfähigen Farbstoffes.
'.'/eitere indirekte oxidative und reduktive Farbstoff-Freisetzungsmechanismen,
die erfindungsgemäß mehrschichtigen analytischen Elementen
zugrundeliegen können, sind des weiteren beispielsweise die Freisetzungsmechanismen, die aus der US-PS 3 728 113 und der
publizierten US-Patentanmeldung B 351 673 bekannt sind. Aus diesen Literaturstellen ist ein Farbstoff-Freisetzungsmechanismus bekannt,
der auf der direkten Oxidation eines zunächst immobilen Farbstoffes unter Erzeugung eines OxiJationsproduktes und der Hydrolyse
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desselben in Gegenwart eines alkalischen Mediums unter Abspaltung
eines diffusionsfähigen Farbstoffes beruht. So sind beispielsweise aus der US-PS 3 728 113 bestimmte Ballastgruppen aufweisende
iiydrochinonverbindungen bekannt, die einen über eine geeignete
diebische Bindung gebundenen Farbstoffrest aufweisen. Nach Oxidation
einer solchen Verbindung wird die Verbindung in die chinoidale Form überführt, welche in Gegenwart eines alkalischen Mediums
einer hydrolytischen Spaltung unter Freisetzung eines diffusionsfähigen Farbstoffes unterliegt. Aus der bekanntgemachten US-Patentanmeldung
B 351 673 sind des weiteren bestimnte nicht-diffusionsfähige
Phenole und Aniline bekannt, die durch Farbstoffreste gekennzeichnet
sind, die chemisch an den Phenolkern über ein bestirntes
.Bindeglied, beispielsweise eine Su lfonami do gruppe gebunden
sind. Diese nicht-diffusionsfähigen Verbindungen Averden nach
erfolgter Oxidation in ihre chinoidale Form überführt, die in Gegenwart eines alkalischen Mediums hydrolytisch aufgespalten wird,
unter Freisetzung eines diffusionsfähigen Farbstoffes.
Ähnliche Ballastgruppen aufweisende und Farbstoffe liefernde Verbindungen,
die einer indirekten oxidativen Reaktion und einer nachfolgenden hydrolytischen Spaltung unter Freisetzung eines Farbstoffes
unterliegen, sind beispielsweise aus der Literaturstelle "Research Disclosure", November 1976, Seiten 68-74 (Nr. 15157) und
den DT-OS 2 402 664 und 2 505 248 bekannt.
liine weitere Gruppe von indirekten oxidativen oder reduktiven
FreisetzungsMechanismen, die auf der Oxidation eines zunächst immobilen oder Ballastgruppen aufweisenden Trägers mit einem
Farbstoffrest und nachfolgender Hydrolyse des oxidierten Produktes
unter Freisetzung eines Farbstoffes oder einer anderen vorgebildeten, bestimmbaren Gruppierung beruhen und bei denen verschiedene
Farbstoffe freisetzende Ilydrochinonverbindungen verwendet
werden, ist beispielsweise aus der US-PS 3 725 062 bekannt. Diese Verbindungen bestehen aus einem Ballastgruppen aufweisenden Hydrochinonkern,
an den ein Farbstoffrest oder eine andere vorgebildete,
bestimmbare Gruppierung chemisch gebunden ist. Durch Oxidation wird
der Hydrochinonkern in die chinoidale Form überführt, die in Gegenwart
eines alkalischen Mediums den Farbstoffrest abspaltet. Ein
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weiterer derartiger indirekter oxidativer Freisetzungsmechanismus ist beispielsweise aus der CA-PS 602 607 bekannt. In dieser Patentschrift
werden Verbindungen nit Ballastgruppen aufweisenden Phenylendiaminkernen
beschrieben, die durch einen diffusionsfähigen Farbstoff rest gekennzeichnet sind, der chemisch über einen der Aminosubstituenten
an die Verbindung geb-unden ist. Nach erfolgter Oxidation dieser Verbindungen erfolgt eine Deaminierung des Oiaminokernes
an der Stelle des Araino-Substituenten, der den Farbstoffrest
an den Kern bindet. In Gegenwart eines alkalischen Mediums wird der diffusionsfällige Farbstoff dann freigesetzt.
Ein weiterer Freisetzungsmechanismus, der einigen der beschriebenen
Freisetzungsmechanismen ähnlich ist, bei dein es sich jedoch um einen
reduktiven und keinen oxidativen Freisetzun^smechanisrTuis handelt,
ist des weiteren beispielsweise aus der US-PS 3 185 567 bekannt.
In dieser Patentschrift werden bestimmte Verbindungen wit einer
vorgebildeten bestimmbaren Gruppierung, z.B. einen Farbstoffrest
beschrieben, der an eine Verbindung wie beispielsweise eine Chinonverbindung gebunden ist, die zunächst unlöslich und in Gegenwart
eines alkalischen Mediums immobil ist, die jedoch nach Reduktion durcli ein geeignetes Reduktionsmittel oder eine photographische
Entwicklerverbindung, z.B. Toluhydrochinon, löslich und in alkalischen Medien mobil wird.
Viele der beschriebenen Freisetzungsmechanismen erfordern die Gegenwart eines alkalischen Mediums, um die Freisetzung der vorgebildeten,
bestimmbaren Gruppierung zu ermöglichen oder zu erleichtern. In solchen Fällen können die erfindungsgemäßen analytischen Elemente
in vorteilhafter tVeise eine Struktur aufweisen, itfie sie beispielsweise
in Figur 5 dargestellt ist oder eine der in Figur 5 dargestellten Struktur ähnliche Struktur, da sich analytische Elemente
einer solchen Struktur insbesondere für solche Fälle eignen, bei denen alkalische Verbindungen verwendet werden, beispielsweise auch
hoch alkalische Flüssigkeiten mit einem pH-IVrert von über 13, ohne
daß dabei Verarbeitungsprobleme auftreten.
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Um die Bestimmung einer dif fusionsf iihigen Verbindung oder eines
diffusionsfähigen Stoffes aus der vorgebildeten bestimmbaren
Gruppierung, die in der Reagens-Schicht freigesetzt wird, zu ermöglichen oder zu erleichtern, weisen die erf iiidungsgemäßen analytischen
lilemente eine Registrier-Schicht auf, die die diffusionsfähige
Verbindung oder den diffusionsEähigen Stoff aus der Reagens-Schicht
aufnimmt.
Eine derartige Registrier-Schicht ist für die diffusionsfähige
Verbindung oder den diffusionsfnhigen Stoff aus der Reagens-Schicht
durchlässig. Des weiteren befindet sich die Schicht in Ströniungs-
oder Flüssigkeitskontakt mit der Reagens-Schicht, mindestens unter
Anwendungsbedingungen.
Vorzugsweise ist die Registrier-Schicht strahlungsdurchlässig. Die Registrier-Schicht kann von der Reagens-Schicht oder auch
Reagens-Schichten, sofern mehrere vorhanden sind, durch eine Strahlung blockierende Schicht getrennt sein, z.B. eine reflektierende
und/oder opake oder trübe Schicht, um das analytische Bestimmungsverfahren,
bei den verschiedene radionetrische Methoden angewandt werden können, zu erleichtern. Die Registrier-Schicht
die in vorteilhafter Weise ebenfalls in der zu analysierenden
Flüssigkeit quellbar ist, kann unter Verwendung von hydrophilen Kolloiden hergestellt werden, wie sie auch zur Herstellung der
Reagens-Schichten verwendet werden können. Vorzugsweise ist die Registrier-Schicht eine nicht-fasrige Schicht, '.'/eist ein erfindungs·
gemäßes Element eine fasrige Reagens-Schicht auf, so läßt sich die Gleichförmigkeit eines analytischen Ergebnisses, das in einer
solchen Reagens-Schicht erzeugt wird, durch eine nicht-fasrige Strahlung blockierende Schicht und eine nicht-fasrige Registrier-Schicht
verbessern.
Wird aus der Reagens-Schicht ein Farbstoff oder eine andere beizbare
Verbindung freigesetzt, so kann die Registrier-Schicht in vorteilhafter Weise ein Beizmittel enthalten, beispielsweise ein solches
Beizmittel, wie es zum Beizen von Bildfarbstoffen zur Herstellung von farbphotographischen. Filmen und Papieren verwendet wird.
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Geeignete Beizmittel sind beispielsweise Polyvinylpyridiiiverbindungen,
wie beispielsweise Poly-4-vinylpyridir!, die- 2-Vinylpyridinpolyr.ieren
und ähnlichen Verbindungen des aus der US-PS 2 49o
bekannten Typs und Cetyltrimethylnnrnoniu a
Gemäii einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung
weist die Registrier-Schicht eines erfir.Jungsgeinßcn Elementes
ein polymeres Beizmittel des aus der 3"-PS 1 261 025 oder des aus
den US-PS 3 625 694, 3 709 690, 3 773 509, 3 859 096, 3 S98 O1JR
oder 3 958 995 bekannten Typs auf.
Als besonders vorteilhaft haben sich solche Beizmittel erviesen,
in deren Polyrnerkette nonomere Einheiten rlev folgenden Formel vorkommen
:
Q
worin bedeuten:
χ9
Λ einen organischen Rest, z.B. einen Alkylenrest, der einen
Teil des Polymergerüstes bildet;
Q eine chemische Bindung oder einen organischen Rest, der den Rest M an A bindet;
M einen quaternären Ammonium- oder Phosphoniumrest und
X ein Anion.
üie Verwendung derartiger polymerer Beizmittel der Formel I hat
sich als besonders vorteilhaft in analytischen Elementen nach der Erfindung erwiesen, bei denen die in der Reagens-Schicht enthaltenden
Reagenzien Farbstoff freisetzen. So haben sich beispielsweise Beizmittel des bescnriebenen Typs als vorteilhaft für die Herstellung
soldier Elemente erwiesen, die für die Bestimmung von a-Amylase
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28OU5
verwendet werden können, bei denen diffusionsftUii^e Polysaccharid-Einheiten
von vergleichsweise geringen iolekulargewicht freigesetzt
werden, an die ein halogenierter Farbstoff auf Basis von . Cyanursäure gebunden ist.
I»ie uereits dargelegt, können die erfindungsgeiiuHen analytischen
Elemente eine Strahlung blockierende Schicht aufweisen, die vorzugsweise zwischen einer Reagens-Schicht und der 'legistrier-Schiciit
angeordnet v;ird. Die Strahlung blockierenden Schichten
sind für die aus den vorgebildeten, bestimmbaren Gruppieruntjen gebildeten
Verbindungen und- Stoffe durchlässig und dienen dazu den Durentritt von elektromagnetischer Strahlung, beispielsweise den
imrciitritt der Wellenlänge oder Wellenlängen, die bei der analytischen
Bestimmung verwendet werden, zu verhindern. Bei Verwendung einer solchen Schicht kann die Farbe oder können andere potentielle
Störfaktoren für die Bestimmung des analytischen Ergebnisses gegenüber
der Regis trier-Schicht oder Reagens-Schicht maskiert werden,
je naci dem, ob eine freigesetzte oder nicht freigesetzte vorgebildete,
bestimmbare Gruppierung bestimmt werden soll. Derartige
Schichten können ein Trübungsmittel enthalten, das aufgrund seiner ■\bsorptionsfänigkeit, Reflexionsfälligkeit und dergleichen einen
Strahlung inhibierenden Effekt ausübt, wenn es in die Schicht eingearbeitet
wird. So kann die Strahlung blockierende Schicht beispielsweise aus einer Matrix aufgebaut sein, die ein Trübungsmittel
enthalt, z.3. ein Pigment, wie Ruß oder ein anderes anorganisches
Pigment, z.B. ein Metalloxid oder ein Metallsalz, z.B. Titandioxid, Zinkoxid oder Bariumsulfat.
Auch können sog. "Blushad'Polymere, die im allgemeinen von Natur
aus reflektieren als Trübungsmittel verwendet werden und Schichten aus derartigen Polymeren eignen sich als Strahlung blockierende
Schichten. Lu übrigen können derartige "Blushed" Polymere auch zur
Herstellung von AusbreitSchichten verwendet werden, die später noch naher beschrieben werden.
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Wird eine mikroporöse Blushed-Polymer-Schicht als Strahlung blockierende Schicht verwendet, so kann eine solche Schicht auch
als Filterschiclit wirken. Eine solche Schicht eignet sich insbesondere
in dem Falle, indem die Registrier-Schicht für filtrierbare Substanzen permeabel ist, die die Bestimmungsreaktion in
der Registrier-Schicht beeinträchtigen könnten, wenn sie aus der Reagens-Schicht in die Registrier-Schicht gelangen könnten.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weisen
aus "Blushed" Polymeren aufgebaute Schichten des weiteren ein reflektives anorganisches Pigment auf, beispielsweise eines der
hier erwähnten hoch-reflektiven Pigmente, um die Reflektivität und/
oder Ausbreitung (auf die im folgenden noch näher eingegangen wird)
zu steigern.
Die Pignentnenje, die in einer Schicht gemeinsam mit einem
"Blushed" Polymeren untergebracht werden kann, kann sehr verschieden
sein. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, etwa 5 bis etwa 1000 Gew.-% Pigment, bezogen auf das Polymergewicht, zu verwenden,
insbesondere Pigmentkonzentrationen von etwa 100 Gew.-ο bis etwa
600 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des "Blushed" Polymeren.
Wie bereits dargelegt, kann ein erfindungsgemäßes Element in vorteilhafter
Weise des weiteren eine Ausbreit-Schicht aufweisen, beispielsweise eine Schicht des aus der US-PS 3 992 158 bekannten
Typs. Bei der Ausbreit-Schicht handelt es sich um eine Schicht, die eine Flüssigkeitsprobe aufnehmen kann, gleichgültig ob die
Flüssigkeitsprobe auf die Ausbreit-Schicht direkt aufgebracht wird oder ihr von einer anderen Schicht oder anderen Schichten, die mit
der Ausbreitschicht in Flüssigkeits- oder Strömungskontakt stehen,
zugeführt wird, und in welcher das Lösungsmittel- oder Dispersionslnedium
der zu analysierenden Probe und mindestens ein gelöster oder dispergierter Stoff oder Bestandteil (Bestandteil der dispergierten
oder internen Phase) oder Reaktionsprodukt eines gelösten oder dispergierten Stoffes derart verteilt wird, daß eine gleichförmige
Konzentration hiervon an der Oberfläche der Ausbreit-Schicht erzeugt wird, die der Reagens-Schicht oder den Reagens-Schichten
des Elementes gegenüberliegt. Zu beachten ist dabei, daß eine
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solche Konzentration mit Konzentrationsgradienten zustande kommen kann, die sich über die Dicke der Ausbreit-Schicht oder in anderen
Richtungen erstrecken. Derartige Gradienten verursachen keine Schwierigkeiten bei der Ermittlung quantitativer Testergebnisse
und können unter Anwendung üblicher Eichverfahren berücksichtigt werden.
Die Ausbreit-Schicht erzeugt in vorteilhafter Weise eine gleichförmige
"apparent" Konzentration von ausgebreiteten Substanzen pro Flächeneinheit auf der Oberfläche, die der Reagens-Schicht gegenüberliegt
und mit der sich die Ausbreit-Schicht in Strömungskontakt
befindet. Eine solche gleichförmige Konzentration läßt sich mittels densitometrischer oder anderer analytischer Methoden bestimmen, wie
sie beispielsweise aus der US-PS 3 992 158 bekannt sind.
In vorteilhafter Weise kann es sich bei den Ausbreit-Schichten um
isotrop-poröse Schichten handeln. Derartige Schichten lassen sich ausgehend von einer Vielzahl von Stoffen herstellen. Beispielsweise
läßt sich ein teilchenförmiger Stoff zur Herstellung derartiger Schichten verwenden, in welchem Falle die isotrope Porosität durch
Zwischenräume zwischen den einzelnen Teilchen hervorgerufen wird. Zur Herstellung der Schichten können die verschiedensten Typen von
teilchenförmigen Stoffen verwendet werden, bei denen es sich in vorteilhafter Weise um Teilchen handelt, die gegenüber den Bestandteilen
der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe chemisch inert sind. Geeignet sind beispielsweise Pigmentteilchen, z.B. aus Titandioxid,
Bariumsulfat und Zinkoxid. Andere geeignete Teilchen bestehen aus Diatomeenerde und mikrokristallinen kolloidalen Produkten, z.B.
mikrokristalliner Cellulose, wobei sich die mikrokristallinen kolloidalen Stoffe von natürlichen oder synthetischen Polymeren ableiten
können. Auch können sphärische oder kugelförmige Teilchen gleichförmiger Größe oder Größen, z.B. aus Harz oder Glas verwendet
werden. Derartige Teilchen können besonders vorteilhaft sein, wenn es auf eine möglichst gleichförmige Porengröße ankommt, z.B. im
Falle von selektiven Filtrationen. Sind die Teilchen, die verwendet werden sollen, nicht-haftend, was
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beispielsweise im Falle von Glaskügelchen und dergleichen der
Fall ist, so können die Teilchen vorbehandelt v/erden, so daß Teilchen anfallen, die an Berührungspunkten aneinander haften,
wodurch die Bildung von isotrop porösen Schichten erleichtert wird. So können nicht-haftende Teilchen beispielsweise mit einer
dünnen Haftschicht beschichtet werden, in dem sie mit einer Lösung
eines hydrophilen Kolloides wie Gelatine oder Polyvinylalkohol behandelt werden, v/o rauf sie in einer Schicht miteinander in
Kontakt gebracht werden. Nach Trocknung der Kolloidheschichtung
wird eine Schicht mit Poren oder offenen Räumen zwischen den einzelnen Teilchen erhalten.
Alternativ oder zusätzlich zu solchen teilchenförmigen Materialien
kann die Ausbreitschicht auch ausgehend von einer isotrop porösen Polymerinasse hergestellt v/erden. Derartige Polymermassen
können beispielsweise nach Methoden hergestellt werden, wie sie auch zur Herstellung von Blushed-Polyneren angewandt werden, und
wie sie beispielsweise aus der US-FS 3555129 bekannt sind. Andere
bekannte Verfahren zur Herstellung von isotrop porösen Polymermassen sind solche, die auf der Verwendung eines"Gases oder auf
der Verwendung von anderen quellbaren Bestandteilen zur Erzeugung von Poren beruhen und die beispielsweise aus den US-PS 2 960
und 2 946 095 bekannt sind. Auch können Verfahren angewandt v/erden, die auf der Lösung eines lösbaren festen Stoffes in der Polymerphase
zum Zwecke der Bildung von Poren beruhen, wie sie beispielsweise aus der JS-PS 3 816 575 bekannt sind.
"Blushed"-Polymerschichten oder "ausgefall.te" Polymerschichten haben
sich als besonders vorteilhaft erwiesen, und lassen sich auf einem
Substrat oder Träger herstellen durch Lösen eines Polymeren in einer Mischung von zwei Flüssigkeiten, von denen die eine einen
vergleichsweise niedrigen Siedepunkt hat und ein gutes Lösungsmittel für das Polymer istund von denen die andere einen vergleichsweise
hohen Siedepunkt hat und ein Nicht-Lösungsnittel oder ein schlechtes Lösungsmittel für das Polymer darstellt. Eine solche
Polymerlösung wird dann auf das Substrat oder den Träger aufgetragen
und unter bestimmten Bedingungen getrocknet. Dabei verdampft
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das Lösungsmittel mit den niedrigeren Siedepunkt schneller und
die Flüssigkeit, die ein schlechtes Lösungsmittel oder Nicht-Lösungsüiittel
für das Polymer darstellt reichert sich immer mehr an. Als Folge dieses Verdampfungsverfahrens bildet das ausfallende
Polymer eine isotrop-poröse Schicht. Zur Bereitung derartiger Schichten können verschiedene Polymere verwendet werden, und zwar
einzeln oder in Kombination miteinander. Typische Polymere für die Herstellung isotrop poröser Ausbreit-Schichten aus "Blushed"-Polymeren
sind Polycarbonate, Polyamide, Polyurethane und Celluloseester ντίe beispielsweise Celluloseacetat. Verschiedene mikroporöse
Filter bestehen oder bestehen teilweise aus "Blushed"-Polyineren,
beispielsweise verschiedene Membranfilter der Firma Millipore
Corporation. Derartige mikroporöse Filter sind beispielsweise aus den US-PS 2 783 894 und 2 772 322 bekannt.
Ausbreit-Schichten lassen sich ausgehend von Lösungen oder Dispersionen
herstellen. i;ür die Herstellung der Ausbreit-Schichten können
die verschiedensten Materialien verwendet werden, insbesondere Materialien, die resistent gegenüber den zu untersuchenden Flüssigkeiten
sind, d.h. unlöslich oder praktisch unlöslich in und nicht quellbar bei Kontakt mit Wasser oder anderen zu analysierenden
Flüssigkeiten. Die Herstellung der Reagens-Schichten erfolgt ausgehend von 3eschichtungslösungen oder Beschichtungsdispersionen
mit einer Matrix und einem nicht-diffusionsfähigen Stoff oder Reagens nach bekannten Beschichtungsverfahren und Trocknung unter
Ausbildung von dimensionsstabilen Schichten. Die Dicke der Reagens-Schicht und ihr Durchlässigkeitsgrad können sehr verschieden
sein, je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck der Schicht. Als zweckmäßig haben sich Schichtstärken, trocken genessen, von
etwa 10 Mikron bis etwa 100 Mikron erwiesen, obwohl auch mit Schichtstärken außerhalb des angegebenen Bereiches vorteilhafte
Ergebnisse erzielbar sind. Werden beispielsweise vergleichsweise große Mengen an nicht-diffusionsfähigem Stoff oder Reagens in
der Reagens-Schicht benötigt, z.B. polymere Stoffe wie Enzyme, so kann er, zweckmäßig sein etwas dickere Reagens-Schichten zu verwenden,
fasrige Reagens-Schichten lassen sich durch Imprägnieren einer fasrigen Matrix nach üblichen bekannten Methoden herstellen.
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Strahlung nlockierende Schichten und Registrier-Schichten 1-issen
sich nach Methoden und in Dicken herstellen, wie sie zur Herstellung von lieagens-Schichten angewandt werden, unter.Verwendung
der entsprechenden, für die Herstellung der Schichten benötigten Komponenten. Die Registrier-Schichten weisen außer ihrer Durchlässigkeit
oder Permeabilität und Strahlun.gsdurchlässigkeit vorzugsweise keine weiteren Charakteristikaauf, die bei der Bestimmung
des analytischen Ergebnisses in den Element störend wirken könnten. Veränderliche Farbtöne oder eine unterschiedliche
Textur innerhalb der legistrier-Schicht, wie sie beispielsweise bei Verwendung von fasrigen Materialien, z.B. einigen Papieren als
permeablen oder durchlässigen Medium auftreten können, können sich
nachteilig auswirken, aufgrund der nicht gleichförmigen Reflexion oder Durchlässigkeit für die zur Bestimmung des analytischen Ergebnisses
verwendete Energie. Dies gilt auch für Schichten, beispielsweise Strahlung blockierende Schichten und Reagens-Schichten,
von denen mindestens die untere Oberfläche für die Strahlung zugänglich ist, die zur Untersuchung der strahlungsdurchlässigen
Registrier-Schicht verwendet wird. Obgleich fasrige Materialien, wie beispielsweise Filterpapiere und andere Papiere im allgemeinen
überall permeabel oder durchlässig sind, können derartige Materialien
doch stark unterschiedliche Durchlässigkeitsgrade aufweisen und keine gleichförmige Permeabilität zeigen, beispielsweise aufgrund
struktureller Unterschiede, wie beispielsweise Faserdimensionen und unterschiedlichen Faserabstände1! Infolgedessen sind derartige
Stoffe nicht die bevorzugten Stoffe zur Herstellung von Registrier-Schichten und anderen Schichten erfindungsgemäßer Elemente, die
für quantitative analytische Bestimmungen eingesetzt werden sollen.
Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können selbsttragende Elemente sein oder aber einen Schichtträger aufweisen. Als Schichtträgermaterialien
eignen sich übliche bekannte Schichtträgermaterialien aus Polymeren, beispielsweise Celluloseacetat, Polyethylenterephthalat),
Polycarbonate und Polyvinylverbindungen, wie beispielsweise Polystyrole und dergleichen.
280U5S
Besonders vorteilhafte Schichtträger sind strahlungsdurchlässige
Schichtträger, die für elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge
oder bestimmter V'ellenlüngen innerhalb eines Bereiches von
etwa 200 nri bis etwa 900 nm durchlässig sind, wie auch Schichtträger,
die für radioaktive Strahlung durchlässig sind. Für fluoriiiietrisciie
Bestimmungen analytischer Ergebnisse durch den Schichtträger kann es zweckmäßig sein, wenn der Schichtträger für eine
etwas breitere Bande durchlässig ist, als für Nicht-Fluoreszenzmessungeri
erforderlich ist oder alternativ, wenn der Schichtträger entsprechend dem Absorptions- und Emissionsspektrum der fluoreszierenden
Verbindungen oder Stoffe, die für die Bestimmung verwendet werden, durchlässig ist. Es kann des weiteren vorteilhaft
sein, einen Schichtträger zu verwenden, der für eine oder mehrere enge Wellenlängenbanden durchlässig und für benachbarte Wellenlängenbanden
undurchlässig ist. Dies läßt sich beispielsweise erreichen durch Imprägnieren oder Beschichten des Schichtträgers mit einem
oder .nehreren Farbstoffen mit entsprechenden Absorptionscharakteristika.
Weist ein Element einen Schichtträger auf, so befinden sich die Reagens-Schicht, die gegebenenfalls vorhandene Strahlung
blockierende Schicht und die Registrier-Schicht normalerweise übereinander angeordnet zwischen dem Träger und der gegebenenfalls
vorhandenen Ausbreit-Schicht, die oftmals die äußerste Schicht des
Elementes darstellt.
Die einzelnen Komponenten einer jeden Schicht und die Schichten-Konfiguration
hängen von dem Vearwendungszweck des Elementes ab.
Wie bereits dargelegt, kann die Porengröße der Ausbreit-Schicht derart gewählt v/erden, daß die Schicht unliebsame Probenkomponenten
ausfiltern kann, die beispielsweise die analytische Reaktion stören könnten oder die Bestimmung des Testergebnisses, das innerhalb
des Elementes erzeugt wird. Für die Analyse von Blut haben sich poröse Schichten mit einer Porengröße von 1 bis etwa 5 Mikron als
besonders vorteilhaft zum Aus filtern von Blutkörperchen erwiesen,
die in typischer Weise eine Größe von etwa 7 bis etwa 30 Mikron iiaben.
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Gegebenenfalls kann ein Element mehrere Ausbreit-Schichten auft,reisen,
von denen eine jede verschiedene Eigenschaften bezüglich Ausbreitung und Filterwirkung haben kann.
Ist eine Hemmung oder Verzögerung des Transportes einer Substanz
innerhalb des Elementes zusätzlich zu der Verzögerung oder Hemmung,
die durch die Ausbreit-Schicht oder Ausbreit-Schichten erreicht wird, erforderlich oder zweckmäßig, so können Filter- oder
üialyseschicliten an einer geeigneten Stelle des Elementes untergebracht
werden. Im Falle der Analyse von Blutglucose beispielsweise kann eine Dialyseschicht, beispielsweise eine semipermeable
Cellulosemembraii den Durchtritt von Proteinen oder anderen
potentiell störenden Substanzen zur Reagens-Schicht verhindern.
Gegebenenfalls kann es des weiteren vorteilhaft sein, zur Herstellung
der einzelnen Schichten ein oder mehrere oberflächenaktive Verbindungen, wie beispielsweise anionische oder nichtionische oberflächenaktive Verbindungen zu verwenden. Diese
können beispielsweise die ßeschichtbarkeit von Beschic'itungsiassen
verbessern und das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Ausbreitung in Ausbreit-Schichten verbessern, die nicht leicht durch Flüssigkeitsproben
benetzbar sind, sofern kein Hilfsmittel, wie beispielsweise eine oberflächenaktive Verbindung zur Herstellung der Ausbreit-Schichten
verwendet wurde. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, eine oberflächenaktive Verbindung, z.B. eine nicht-ionogene
oberflächenaktive Verbindung in einer Ausbreit-Schicht unterzubringen, um den Transport der zu analysierenden Substanz, die
in einer wäßrigen proteinösen Flüssigkeitsprobe enthalten ist, durch die Schicht des Elementes zu normalisieren, 'fit einer solchen
Normalisierung ist gemeint, daß innerhalb der Ausbreit-Schicht eine äquivalente oder gleiche Durchdringung durch Lösungsmittelmedium
und gelöste Komponenten, einschließlich der zu analysierenden Substanz von verschiedenen aufgebrachten Proben wäßriger proteinöser
Flüssigkeiten erfolgen soll, unabhängig von Veränderungen in der Proteinkonzentration zwischen derartigen Proben. Als besonders
vorteilhaft hat es sich erwiesen, oberflächenaktive Verbindung zur Erzielung eines normalisierten Transportes der zu analysierenden
Substanz in Konzentrationen von etwa 1 bis etwa 15 Gew.-^, bezogen
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.so- 28QU5S
auf das Trockengewicht der Schicht zu verwenden.
Des weiteren kann es zweckmäßig oder vorteilhaft sein, in einer oder mehreren der verschiedenen Schichten des Elementes, je nach
der speziellen zu analysierenden Substanz, eine oder mehrere Puffersubstanzen unterzubringen, umcbn geeigneten pH-Wert für das
spezielle Bestimmuugsverfahren einzustellen. In typischer Weise lassen sicii derartige Puffersubstanzen in einer Reagens-Schicht
unterbringen. Jedoch können Puffersubstanzen auch in anderen
Schichten, beispielsweise der Ausbreit-Schicht, der Strahlung
blockierenden Schicht oder der Registrier-Schicht untergebracht werden. Beispielsweise hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Phosphat-Puffersubstanzen
in einer Reagens-Schicht eines analytischen Elementes unterzubringen, das für die Bestimmung von a-Amylase verwendet wird.
Selbstverständlich können jedoch auch die verschiedensten anderen üblichen bekannten pH-Puffersubstanzen zur Herstellung erfindungsge-näioer
Elemente verwendet werden. Geeignete Puffersubstanzen v/erden
beispielsweise von Good in der Zeitschrift "Biochemistry", 5^,
Seite 467 (1906) beschrieben.
ürfindungsgemä.öe analytische Elemente lassen sich für die Durchführung
der verschiedensten chemischen Analysen verwenden, und zwar nicht nur auf dem Gebiet der klinischen Chemie, sondern vielmehr
beispielsweise auch auf dem Gebiet der chemischen Forschung sowie in chemischen Kontroll-Laboratorien. Erfindungsgemäße Elemente
eignen sich insbesondere für die Durchführung klinischer Untersuchungen von Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise 31ut, Blutserum
und Urin, da in diesem Falle oftmals die Durchführung einer großen Anzahl von Bestimmungen erforderlich ist und Testergebnisse
oftmals in kurzer Zeit nach der Probenahme vorliegen müssen. Auf dem Gebiet der Blutanalyse beispielsweise lassen sich erfindungsgemä-jC
mehrschichtige Elemente für die quantitative Analyse von vielen der Blutkomponenten verenden, die rcttinenäßig ermittelt
oder bestiiuiiit werden.
So lassen sich beispielsweise erfindungsgemäße Elemente für die
Analyse von solchen Blutkomponenten wie beispielsweise Albumin, bilirubin, a-Amylase und anderen Komponenten verwenden, und zwar
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durch Auswahl entsprechender Test-Reagenzien.
In Falle der Analyse von Blut unter Verwendung eines analytischen
Elementes nach der Erfindung können die Blutkörperchen zunächst vom Serum abgetrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren,
wo rauf das Serum auf das analytische Elenent aufgebracht wird.
Eine solche Abtrennung der Blutkörperchen ist jedoch nicht erforderlich,
beispielsweise dann nicht, wenn spektrophotometrische Reflexions-Analyseverfahren angewandt werden, um die vorgebildeten,
bestimmbaren Gruppierungen quantitativ zu erfassen oder in anderer Weise zu analysieren. So ist es möglich, dem Element Blut znzxiführen,
in welchem Falle die Blutkörperchen mittels einer Filterschicht abfiltriert und von der Registrier-Schicht ferngehalten
werden, wobei die Filterschicht gleichzeitig eine Strahlung blockierende Schicht sein kann. Das Vorhandensein der Rlutkörperchen
auf den Element stört dabei nicht die spektrophotor.ietrische
Analyse, wenn diese unter Anwendung von "eflexions"iethoden
durchgeführt wird, nit Licht, das durch den Träger und die Registrier-Schicht
gelangt und von der Strahlung blockierenden Schicht oder einer anderen reflektierenden Schicht reflektiert wird, so daß die
zur Bestimmung verwendete Strahlung nicht auf die Zellen auftrifft.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgenäßen integralen analytischen
Elemente beruht auf ihrer Verwendbarkeit zur Analyse von entweder Serum oder Blut.
Die erfindungsgeraäßen analytischen Elemente können in verschiedenen
Formen vorliegen, beispielsweise endlosen oder länglichen Bändern, praktisch jeder Breite, in Form von Blättern oder in Form von
kleineren Chips. Es ist auch möglich die Elemente so auszugestalten, daß sie für die Durchführung von einem oder mehreren
Testen eines Typs verwendbar sind oder einer Vielzahl von Testen von verschiedenen Typen. Im letzteren Falle kann es zweckmäßig
oder vorteilhaft sein auf einen Schichtträger .einen oder ,mehrere
Streifen oder Bezirke zu erzeugen, und zwar gegebenenfalls aus Beschichtungsmassen unterschiedlicher Zusammensetzung unter Erzeugung
eines zusammengesetzten Elementes, das für die Durchführung verschiedener Bestimmungen geeignet ist.
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In typischer Weise hat ein erfindungsgenäßes Element einen
solchen Aufbau, daß eine auf das Element aufgebrachte, zu analysierende Probe zunächst auf eine Ausbreit-Schicht auftrifft,
sofern eine solche vorhanden ist, bevor die Probe auf eine nicht ausbreitende Reagens-Schicht auftrifft, wobei die Probe
zunächst mit der Oberflücne der Ausbreit-Schicht in Kontakt gelangt,
die von der Reagens-Schicht am weitesten entfernt ist. Da die analytische Genauigkeit der erfindungsgemäßen Elemente
nicht oder nicht wesentlich durch Veränderungen des Volumens der aufgebrachten Proben beeinträchtigt wird, insbesondere dann,
wenn eine Ausbreit-Schicht vorhanden ist, kann das Aufbringen der Proben auf manuellem Wege oder maschinell erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen
jedoch kann es vorteilhaft sein, wenn gleiche oder praktisch gleiche Probenvolumina aufgebracht werden.
In typischer i/eise wird bei Durchführung eines analytischen Verfahrens
unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Elementes, das
manuell oder automatisch durchgeführt werden kann, das Element von einer Vorratsrolle abgezogen oder einem Vorratsbehälter, beispielsweise
einem Kipp-Vorratsbehälter entnommen und in eine solche Lage gebracht, daß ein freier Tropfen, Kontakt-Tüpfel oder
eine andere Form der zu analysierenden flüssigen Probe, z.B. aus einem geeigneten Zufuhrgerät oder Dosiergerät aufgebracht werden
kann. Nach Aufbringung der Probe und zweckmäßig nachfeiern die
flüssige Probe von einer Ausbreit-Schicht aufgenommen worden ist, sofern eine solche vorhanden ist, kann das Element konditioniert
werden, beispielsweise durch Erhitzen, durch Befeuchten oder dergleichen, wodurch gegebenenfalls der Erhalt eines Testergebnisses
beschleunigt oder erleichtert werden kann. Im Falle eines automatisierten Verfahrens kann es des weiteren vorteilhaft sein, wenn die
Ausbreit-Schicht ihre Funktion innerhalb von einigen Sekunden erfüllt, uenn jedoch genügend Zeit für eine Zumessung verbleibt,
im Gegensatz zu der praktisch plötzlichen und unregelmäßigen Diffusion,
die im Falle von absorbierenden phasrigen Papieren zu beobachten ist. Dies läi.it sich in bequemer 7eise durch geeignete Auswahl
von verschiedenen Parametern, beispielsweise Schichtdicken, Porenvolumen in den porösen Schichten und dergleichen erreichen.
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m das analytische Ergebnis in Form einer bestimmbaren
Veränderung vorliegt, wird es gemessen, was dadurch erfolgen kann,
daii wan das Element durch eine Zone führt, in der eine geeignete
Vorrichtung vorgesehen ist, die sich für die Durchführung spektrophotometrischer
i>Iessungen eignet, beispielsweise Reflexions-, Transmissions- oder Fluoreszenzmessungen. .'fit einer solchen Vorrichtung
kann beispielsweise ein hnergiestrahl, z.B. ein Lichtstrahl
durch den Schichtträger und die Registrier-Schicht oder die
Reagens-Schicht geführt v/erden. Das Licht wird dann reflektiert, beispielsweise von einer Strahlung blockierenden Schicht des Elementes,
und zwar zurück zu der Bestimuungsvorricntung oder gelangt
durch das Element zu einen Detektor, sofern eine Durchlässigkeitsoder Transi.iissionsbestiHhiung erfolgt. Die Anwendung der Reflexions-Spektrofotometrie
kann in manchen Fällen besonders vorteilhaft sein, da bei Anwendung dieses Verfahrens Interferenzen oder
Störungen von Rückständen, wie beispielsweise Blutkörperchen ausgeschaltet werden können, welche auf oder in den Schichten des
Elementes noch vorhanden sein können. In vorteilhafter t\reise werden
übliche Methoden der Fluoreszenz-Spelctrophoto^etrie angewandt, venn
die bestiijiubare Substanz oder Verbindung fluoresziert. Die Bestimmung
kann unter Anwendung von Energie erfolgen, die die fluoreszierende Substanz anregt und unter Verwendung eines Detektors,
der die Fluoreszenz-Emission ermittelt. IVird Blutserum analysiert
oder werden Maßnahmen getroffen, um unerwünschte ßlutrüclzstände
zu eliminieren, so lassen sich Durchlässigkeitsmessungen oder TranSiüissionsmethoden anwenden, um das oder die anzeigenden Reaktionsprodukte
zu bestinmen oder quantitativ zu erfassen, indem man einen
Strom von Strahlungsenergie, beispielsweise II.V.-Licht, sichtbares
Licht oder Infrarot-Licht auf eine Oberfläche des Elementes richtet und den Austritt der Energie aus der gegenüberliegenden Oberfläche
des Elementes mißt. Ganz allgemein hat sich eine elektromagnetische
Strahlung eines "/ellenlängenbereiches von etwa 200 bis etnra
90ü um als vorteilhaft für derartige Tessungen erwiesen, obgleich auch jede andere Strahlung angewandt werden kann, der gegenüber
das Element durchlässig ist und die sich zur quantitativen Bestimmung cbr Verbindung oder Substanz eignet, die im Element erzeugt
worden ist. Im übrigen können die üblichen bekannten Eichmethoden angewandt werden, um eine Vergleichsbasis zu erhalten. Beispiels-
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weise kann eine Probe einer standardisierten Lösung mit der zu
analysierenden Substanz auf das Element aufgebracht werden, und zwar in einen Bereich benachbart zu dem Bereich, wo der zu analysierende
Tropfen aufgebracht wird, wodurch vergleichende Messungen ermöglicht werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Beispiel 1: Verwendung eines Elementes auf Basis gefärbter Stärke
für die Bestimmung von Araylase
Es wurde ein integrales analytisches Element für die Bestimmung
von a-Ar.iylase des in Figur 2 dargestellten Aufbaues hergestellt,
das in der Ausbreit-Reagens-Schiclit 6 als lichtstabiles Reagens
oder nicht-diffusionsfähigen Stoff eine im Handel erhältliche
gefärbte Stärke enthielt. Bei e'er gefärbten Stärke handelte es
si cn im Aiaylochrome, d.h. ein Stärkeprodukt der l'ina Hoffoian-LaTvOCiIG.
Die Stärke enthielt, chemisch gebunden, als vorgebildete, besti-.iiubiire Gruppierung den Farbstoff Cibachron Bri lliimtblau
F3GA4, d.h. einen reaktionsfähigen Farbstoff auf Cyanur
chloridbasis, Hersteller Ciba-Geigy. Die Reagens-Schicht wies des weiteren als !atrix zur Unterstützung der Ausbreitung der aufge-L.raciiten
Flüssigkeitsprobe mikrokristalline Celluloseteilchcn auf,
uie unter der Handelsbezeichnung Avicel, Hersteller FtC Corporation
i ι {lande1 sind.
Die Strahlung blockierende Schicht 7 enthielt Titandioxidteilchen in ungehärteter Gelatine. Hie ^egistrier-Schicht 4 bestand aus
ungehärteter Gelatine mit einem Beizmittel "A", bestehend aus einem Mischpolymerisat aus Styrol, N-Vinylbenzyl-NjN-dimethyloenzylammoniumchlorid
und Divinylbenzol.
Das Element wurde in folgender l/eise hergestellt:
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Λ. Registrier-Schicht
Zur Herstellung der Schicht wurde eine Beschichtunjrsmasse verwendet,
die bestand aus:
ivasser 7,2 ml
ungehärtete Gelatine (festgewordene Mischung aus Gelatine und 'vasser
mit 10 Gew.-* Gelatine) 10,6 g
Beizmittel "A", 13 gew.-»ige flüssige
ilischung des Beizmittels "A" in Wasser 8,2 ml
p-Nonylphenoxyglycerin, eine oberflächenaktive Verbindung, im Handel erhältlich
unter der Bezeichnung Surfactant 1OG, Hersteller Olin tfatliieson Corp., USA
(10 Gew.-aige Lösung der oberflächenaktiven Verbindung in Wasser) 15 Tropfen
Die Gelatine wurde bei 400C aufgeschmolzen. Wasser, Beizmittel
und oberflächenaktive Verbindung wurden der Schmelze zugesetzt, worauf die Schmelze auf einen transparenten Polycarbonat-Schichtträger
aufgetragen und die aufgetragene Schicht an der Luft getrocknet wurde.
Beschichtungsstärken:
Gelatine 2,16 g/m2
Beizmittel "A" 2,16 g/m2
B. Strahlung blockierende Schicht
1. Zunächst wurde eine Ti02-Dispersion hergestellt unter Verwendung
von:
Wasser 160 ml
TiO2-Teilchen 40 g
Octylphenoxypolyäthoxyäthanol, d.h. eine im Handel erhältliche oberflächenaktive Verbindung, erhältlich als Triton X-
100, Hersteller Rohm & Haas Company 2 g
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Das Titandioxid wurde ueai Wasser zugesetzt, worauf die Mischung
in einer Kolloidmühle gründlich vermählen wurde. Dann wurde die
oberflächenaktive Verbindung zugesetzt.
2. Die erhaltene Dispersion wurde dann iireiterverarbeitet, und
zwar zu einer Beschichtunstsmasse aus:
Wasser 11,0 ml
Ti02-Di3persion (wie oben beschrieben) 29,9 ml
ungehärtete Gelatine (fest gewordene Mischung
aus Gelatine und !Yasser mit 10 Gew.-Ό Gelatine) 9,0 g
Die Gelatine wurde bei 400C aufgeschmolzen, worauf !iasser und
TiO2-Dispersion unter schwachem Rühren (zur Verhinderung von
Lufteinschlüssen) in die Gelatine eingerührt wurden. Die auf diese Weise hergestellte Beschichtungsmasse wurde dann auf die
zunächst erzeugte Registrier-Schiclit aufgetragen und an der Luft
getrocknet.
Beschichtungsstarken:
Gelatine 3,65 g/m
TiO2 24,30 g/m2
oberflächenaktive Verbindung 1,22 g/m"
C. Ausbreit-Reagens-Schicht
Zur Bereitung dieser Schicht wurde eine Beschichtungsmasse aus folgenden Komponenten hergestellt:
Nasser 24 ml
Farbstcff enthaltende Stärke (Amylοchrome-
Stärke), Hersteller Hoffman-LaRoche zehn 233 mg Tabletten
N-tris-Hydroxymethyl (Methyl-2-aminoäthan-
sulfonsäure) als Puffersubstanz 65,5 mg
mikrokristalline Celluloseteilchen
(Avicel) 2,5 g
oberflächenaktive Verbindung (Surfactant 10G) (10 gew.-^ige Lösung der oberflächenaktiven Verbindung
in Wasser) 0,5 ml
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Die Farbstoff enthaltenden .Stärketabletten und die Puffersu'istanz
wurden nit iv'asser in einen Tischgerät vow Typ Paring BlenJor
schwach vorgemischt. )er pii-T-,rert wurde η it verdünnter Natriu-iliydroxidlüsuny
auf 7,0 eingestellt, .iunnehr wurden die mikrokristallinen
Celluloseteilchen zugesetzt, i-.'orauf die Tischung von
neuem in dem Mischgerät gründlich vermischt wurde. Nunmehr wurde die oberflächenaktive Verbindung vorsichtig eingerührt, um den
Einschluß von Luftbläschen zu vermeiden. Die "iischung wurde dann
aufgetragen, vorauf die erzeugte Schicht getrocknet wurde.
öeschichtungsstärken:
Farbstoff enthaltende Stärketabletten 215 Tabletten/m"
.liikrokristalline Cellulose 54,0 g/m
Puffersuijstanz 1,41 g/m"
Das in der beschriebenen ''/eise hergestellte analytische Element wurde
dann auf sein Ansprechvermögen für A.;iylase in folgender ;Veise getestet.
Zunächst wurde ein Amylase-Standard hergestellt, und zwar durch
eine 150-fache Verdiinnung von frischen menschlichen Speicliel nit
einer Higen Albuminlösung. Der Standard v/urde unter Verwendung der ilethode von Somogyi untersucht. Verwiesen wird auf N.!V. Tietz,
"Fundamentals of Clinical Cheuistry", Seite 412 (1370).
Von dem Standard uurde durch weiteres Verdünnen mit einer 1? uigen
Albuminlösung eine Verdünnungsreiae hergestellt. Diese Reihe verdünnter
Lösungen v/urde auf das Element aufgebracht. Die Reaktionen liefen während der Messungen bei 4 2 C ab.
Für die analytischen Bestimmungen v/urde ein Colorimeter verwendet,
das für Reflexionsmessungen von 16 ram breiten Streifen eines analytischen
Materials geeignet war. Das Colorimeter wurde in Verbindung mit einem 620 nm Interferenz-Filter vor der Lichtquelle verwendet.
Aufgezeichnet wurden Reflexions-Zeit-Kurven, die dann in Dichte-Zeit-Kurven überführt wurden. Diese Dichte-Zeit-Kurven sind
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in Figur 6 dargestellt. Jede Kurve ist durch Amylase-Konzentrationen
in Soiuogyi-Einheiten (SU) gekennzeichnet. Bei hohen Ainylase-Konzentrationen
v/eisen diese Kurven für mehrere ?tinuten einen ausgeprägten
geraden Teil auf?, an den sich ein gekrümmter Bereich anschließt.
Die Neigung des ersten Teiles der Dichte-Zeit-Kurve wurde als Maß für die Aniylase-Aktivität verwendet. In den Diagramm
der Figur 7 sind die Anfangsneigungen in Abhängigkeit von der Amylase-Aktivität
aufgetragen. Der Verlauf ist linear bis zu etwa 300 -Sonogyi-Einheiten und die Amylasebestiiniiiung aufgrund des analytischen
blenentes dieses Beispieles ist bis zu etwa 500 Somogyi-Linheiten
Tiöglich.
Beispiel 2: Analytisches Element, hergestellt unter Verwendung
von fluoreszierend gemachter Stärke
In Falle dieses Beispieles wurde ein analytisches Element für die
Bestimmung von Amyläse des in Figur 2 dargestellten Aufbaues hergestellt.
Ιλ Falle dieses Elementes enthielt die Ausbreit-Reagens-Schiciit
als Reagens oder aktiven Stoff eine Stärke, an deren wiederkehrende Einheiten chemisch vorgebildete Gruppierungen
gebunden waren, welche für eine Fluoreszenz der Stärke sorgten.
A. Herstellung der fluoreszierend gemachten.Stärke:
Kartoffelstärke 30 g
N-Carboxyanthranilinsäureanhydrid 5 g
Pyridin 5 ml
Diinethylsulfoxid 130 ml
Die Stärke und das N-Carboxyanthranilinsäureanhydrid wurden in
Fom trockener Pulver gründlich miteinander vermischt. Dann wurde Dimethylsulfoxid zugegeben, worauf die Mischung unter konstanter
Bewegung auf 500C erhitzt wurde. Dann wurde das Pyridin zugegeben,
worauf die Mischung auf einen Dampfbade, von Feuchtigkeit geschützt,
über Wacht erhitzt wurde. Die erhaltene sehr viskose Lösunge wurde
dann in einen Mischer überführt (Waring Blendor), worauf die Stärke durch Zusatz von Wasser ausgefällt und durch Bewegen in
Lösungsmitteln und Absetzen und Dekantieren gewaschen liurde. Zum
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Waschen wurden jeweils 500 nl Aceton, Methanol und nochmals Aceton
verwendet. Die Stärke wurde dann abfiltriert und an der Luft getrocknet,
ils wurden insgesamt 33,1 g "leaktionsprodukt erhalten.
Die Gewichtszunahme entsprach einer etwa 25$igen Bindung des X-Carboxyantliranilinsäureanhydrides.
Eine Stickstoffanalyse nach Kjeldahl ergab 1,33% Stickstoff, entsprechend etwa einen Anthranilatrest
auf 6 Glucosereste der Stärke.
In einei.1 zweiten Versuch wurden 33,7 g Peaktionsprodukt erhalten,
was einer 9uligen Bindung des Säureanhydrides entsprach. Die
Stickstoffanalysen ergaben in diesen Falle Werte von 1,2 bis 1,31.
B. Herstellung der Registrier-Schicht
Es wurde eine Beschichtungssiasse aus folgenden Komponenten hergestellt:
liasser 200 ml
Agarose 8,85 g
Beizmittel "A" (vergl. Beispiel 1)
13 gew.-$ige flüssige Mischung des
Beizmittels in Wasser 13,6 ml
oberflächenaktive Verbindung
(Surfactant 10G) (10 gew.-Sige Lösung
der oberflächenaktiven Verbindung in
liasser 1,5 ml
Die Agarase wurde in heißem V/asser gelöst, worauf das Beizmittel
und die oberflächenaktive Verbindung zugesetzt wurden. Die Beschichtungsmasse Kurde auf einen transparenten Folycarbonat-Schichtträger
aufgetragen und an der Luft getrocknet.
Beschichtungsstärken:
Agarose 5,40 g/m
Beizmittel "A" 1,08 g/ra2
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- 69 C. Strahlung blockierende Schicht
Zunächst wurde eine Agaroselösung ausgehend von folgenden Komponenten
hergestellt:
Nasser 50 ml
Agarose 796 mg
Die Agarose und das l'/asser wurden erhitzt, bis sich die Agarosp
lelöst hatte.
Des v/eiteren wurde eine Mischung aus folgenden Komponenten hergestellt:
Wasser
Dinatriumphosphat
?vUio (15 gew.-^ige Dispersion in
Wasser von Regal 300-Ruß, Hersteller Cabot Company, USA) 5,3 ml
oberflächenaktive Verbindung
(Surfactant 1'JG) (10 gew.-sige Lösung der oberflächenaktiven Verbindung in Wasser) 0,7 ml
Die Salze wurden im wasser gelöst, worauf der pH-Wert durch Zusatz verdünnter HCl auf 7,0 eingestellt wurde.
'ϊαι\η wurden Ruß und die oberflächenaktive Verbindung zugesetzt.
Agaroselösung und Ruß-Dispersion wurden dann vermischt. Die Mischung wurde dann auf die Registrier-Schicht aufgetragen
und an der Luft getrocknet.
Bes chichrungss tärken:
2 Agarose 1,08 g/m
Dinatriumphosphat 1,08 g/m
R"& · 0,54 g/m2
NaCl 0,54 g/m2
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.70- 250
D. Ausbreit-Reagens-Schicht
Zunächst wurde eine Beschichtangsnasse aus folgenden Komponenten
hergestellt:
'.V'asser 50 r-il
fluoreszierend jemachte Kartoffelstärke
2 s
uikrokristalline Cellulose 3 g
oberflächenaktive Verbindung
(Surfactant 10G) (10 gew.-%igen Lösung
der oberflächenaktiven Verbindung in
Wasser) ' 10 Tropfen
Die Stärke wurde in de.ii angegebenen Volumen Viassor durch ultraschallbehandlung
dispergiert. Verwendet wurde ein Beschallungsgerät
von Typ Branson 185 V! Sonifier, das nit voller Kraft 7 ''Iinuten
lang in Betrieb genommen wurde, wobei zur äußeren Kühlung ein Eisbad verwendet wurde. Die erhaltene Dispersion wurde dann
durch ein Käsetuch filtriert, un nicht dispergierte, aufgequollene, jedoch ungelöste Polynierteilchen abzufiltrieren.. Der pll-i'.'ert des
Filtrates wurde durch Zusatz von verdünnter Kaliumhydroxidlösung auf 7 eingestellt. Nunmehr wurde die mikrokristalline Cellulose
zugesetzt, worauf die Mischung in dem Ultraschallgerät 3 'inuten lang bei halber Laufkraft des Gerätes beschallt wurde. Daraufhin
wurde die oberflächenaktive Verbindung vorsichtig eingerührt. Die Mischung wurde dann auf die Strahlung blockierende Schicht aufgetragen,
worauf die aufgetragene Schicht an der Luft getrocknet wurde.
Beschichtungsstarken:
2 Fluoreszierend gemachte Kartoffelstärke 21,6 g/n
mikrokristalline Cellulose 86,4 g/m"
Das in der beschriebenen Weise hergestellte Element wurde dann
auf sein Amylase-Ansprechvermögen getestet, wobei eine standardisierte
Speichel-Amylase wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet wurde. Mittels eines Fluorimeters, ausgerüstet mit einea '.'/ratten
Filter 18A über der Lichtquelle wurde die Veränderung der
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Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Zeit festgestellt. Die erhaltenen
Liri;ebnisse sind in I;i;;ur " dargestellt. Ils wurden Verbuche
.lit 5 verschiedenen Aa/laockonzentrationen und ein O-Versuch
durchgeführt, .vie sich aus Figur 8 ergibt, wurden Kurven eines
praktisch linearen Verlaufes erlnlten. Gemessen wurden die Xei2uri~
^CH der Kurven in\ Auslaufteil nach 5 ünuten. Die Abhängigkeit
dieser i.ei^ungen von der A:.iylasekonzentration ergibt sich aus
Fi^ur 9. V.'ie ein Vergleich der Fi^ur 9 "lit Fi^ur S zei^t, ist
die Jorade der Kurve 9 .uit der Geraden der Figur 7 identisch. Das
aergestellte fluoreszierende, in r-'orin eines Bandes vorliegende
analytische blement zsi^ts scr.iit eine entsprechende Empfindlichkeit
für die ."-las3un.^ von Amylose in üblichen Geru;nkonzontrationen.
Beispiel 5: Lilasisnt für die Bestimmung von A^ylase
iis wurae ein weiteres integrales analytisches Element für die
r>esti:m.!un£ von a-Av:iylase hergestellt. :)ie Herstellung des Elementes
srfol^to in der in Beispiel 1 besciiriebenen Vieise mit der Ausnahw3,
dal.') die gefärbte Stärke des Beispieles 1 durch eine in Wasser unlösliche gefärbte handelsübliche Stärke, nämlich Amylopectin
Azure A, ilersteller Calbiochera, Los Angslss, Californien, USA,
ersetzt v:urue. Des weiteren x\rurde die oberflächenaktive Verbindung,
die zur Herstellung der Strahlung blockierenden Schicht des Beispieles
1 verwendet wurde, durch die oberflächenaktive Verbindung Surfactant 1OG ersetzt. Schließlich wurde anstelle des in Beispiel
1 verwendeten Polycarbonatträgers ein transparenter PoIyütiiylenterephthalatschichtträger
verwendet. Anstelle des zur Herstellung der Ausbreit-Reagens-Sclicht des Elementes des Beispieles
1 verwendeten Puffers wurden ein Natriurdihydrogenphosphatpuffer
in der Registrier-Schicht verwendet. Die Konzentrationen der verschiedenen
Komponenten in den einzelnen Schichten des Elementes wurden zwecks Verbesserung der Beschichtbarkeit und des Ansprechveriaögens
des Elementes modifiziert.
Die einzelnen Bestandteile und Konzentrationen der Registrier-Schicht,
Strahlung blockierenden Schicht und Ausbreit-Reagens-Schicht ergeben sich aus der folgenden tabellarischen Obersicht:
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- 72 Registrier-Schicht Beschi clitungsstärke (g/n'')
ungehärtete Gelatine
oberflächenaktive Verbindung
(Surfactant 10G)
.iatriumdiliydrogenphosphst,
pfi-'vert: 7,0
beizmittel "A" (vergl. Beispiel 1)
Strahlung blockierende Schicht
ungehärtete Gelatine 5,4
oberflächenaktive Verbindung 0,3
(Surfactant 10G)
TiO2 13,0
Ausbreit-Reagens-Schicht
Amylopectin Azure A 21,5
mikrokristalline Cellulose 64,5
Das hergestellte analytische Element eignete sich zur quantitativen
Bestimmung des a-Ainylasegehaltes von unverdünnten menschlichen
Serumproben bei a-Ainylasegehalten von 0 bis etwa 1000 Somogyi-Einaeiten.
Beispiel 4: Element für die Bestimmung von Amyläse
Es wurde ein weiteres integrales analytisches Element für die Lestimmung von a-Amylase hergestellt.
Zur Herstellung dieses analytischen Elementes wurde eine in Wasser
lösliche gefärbte Stärke, d.h. Diamyl-L, Hersteller Warner-Lambert,
anstelle der unlöslichen gefärbten Stärken der Beispiele 1 und verwendet. Des weiteren wurde im Falle dieses Beispieles das
Ausbreit-Reagens-System im Gegensatz zu den Beispielen 1 und 3 als
Zwei-Schichtensystem ausgebildet, in welchem die in Wasser lösliche,
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gefärbte Stärke in Form einer separaten, wäßrigen Beschichtungsmasse
eingesetzt vurde. Die StÖrke wurde dabei von einer zunächst
erzeugten Ausbreit-Schicht aus einem Bluslied-Poly.nsren und Titandioxidteilchen
aufsaugen gelassen. Auch vurde isi Falle dieses iilenientes Agarose anstelle von ungehärteter Gelatine verv;endet, die
zur Herstellung der Strahlung blockierenden Schicht und der ?vegistri3r-Schient
der Elemente der Beispiele 1 und 3 verwendet uurde. Puffer,
oberflächenaktive Verbindungen und transparenter bandförmiger Träger waren identisch mit Puffer, oberflächenaktiver Verbindung und
Träger des Beispieles 3. Die einzelnen Komponenten und Konzentrationen hiervon in den einzelnen Schichten des Elementes ergeben
sich aus folgender tabellarischer Obersicht:
Registrier-Schicht Beschichtungsstärke (g/n )
■ieizmittel "A" (vergleiche Beispiel 1)
Agarose
ouarfliichenaktivb Verbindung
(Surfactant 10G)
;>'atriunidihydrogenphos:>hat, pil-'.vert= 7,0 0,86
Strahlung ülockierende Schicit
TiO2 10,2
Ägarose 1 ,0
oberflächenaktive Verbindung 0,5
(Surfactant 10C)
Aus b reit-Re agens-Sys ten
A. Blushed-Polymer-Ausbreit-Schicht
Celluloseacetat (etwa 40!ige Acetylierung) 7,0
50,0
Polyoxyäthylen (20) Oleyläther (oberflächenaktive
Verbindung) 0,9
Triton X-405 (oberflächenaktive Verbindung,
tiersteiler Rohni und Haas) 1 ,4
Polyuretnanelastomer (Hstane Resin 5715, Hersteller
B.F. Goodrich) 1,5
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.74. 280U58
ii. In .v'asser lösliche gefärbte Starke,
von der Ausbreit-Schicht aufgesaugt
tiiamyl-L 1 ,0
Das hergestellte integrale analytische Elenent dieses Beispieles
eignete sich zur quantitativen Bestimmung des α-Anyläsegehaltes
von unverdünnten menschlichen Serumproben bei a-Amylasegehalten
von 0 bis etwa 1000 Somogyi-Einheiten.
Deispiel S: Analytisches Element für die Bilirubin-Bestimmung
Dies Beispiel beschreibt ein anderes integrales analytisches Element gemäß der Erfindung.
Das ii.i folgenden beschriebene analytische Element eignet sich fur
die ßilirubin-IJestijiunung und vrurJe speziell hergestellt für die
Analyse des Gesamt-Silirubingehaltes v/ädriger flüssiger Proben,
wie beispielsweise Blutserum. Der nicht-diffusionsfähige otoff
oder das Reagens der Reagens-Schicht dieses Elementes bestand
aus eine;:i Bilirubin-aktiven Komplex, dessen VEru'endbar.-ceit auf
einer.i Wettbewerbs-Verurängungsprozef zwischen Bilirubin und den
Reagens beruht.
Der in Falle dieses Beispieles verwendete Bilirubin-aktive Komplex
bestand aus einem Albumintrüger, der Bilirubin zu b-inden vermag
und an den ein vorgebildeter, diffusionsfähiger bestimmbarer
Ligand gebunden war, der durch Bilirubin verdrängbar ist.
eine Flüssigkeitsprobe mit Bilirubin »nit einem solchen
Bilirubin-aktiven Komplex einer Reagens-Schicht in Kontakt gebracht, so wird der vorgebildete bestimmbare Ligand vom Albuminträger durch
!Bilirubin verdrängt, das an den Träger gebunden wird, vrähren-d der
bestimmbare Ligand in die Registrier-Schicht des Elementes wandert,
in der sein Auftreten bestimmt werden kann.
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2S0H5S
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Das hergestellte mehrschichtige anal/tische Element dieses Beispieles
ist ein analytisches Element, das sich für die "trockene"
Besti;i"i,iiun£ von Bilirubin verwenden lä<ot. Das mehrschichtige Element
dieses M;isoieles wurde v.ie folgt hergestellt:
Auf einen Celluloseacetatschichtträ^er wurde zunächst eine Polyvinylalkohol
(PVA) Reristrier-Sciiickt aufgetragen, und zwar in einer
Beschic.itun^sstärke von etva 1,7 n/m^ ^ür die Aufnahme des freigesetzten,
uestinuibaren Li^anden aus den über der Registrier-Schicht
auf[,etra;je!ien Schichten. Auf die Polyvinylalkohol-^egistrier-Schicht
wurde eine polymere Haftschicht aufgetragen und hierauf eine Peaagens-Schicht
mit einem Bilirubin-aktiven Komplex aus einer molaren
Miscliung von menschlichen Serunalbumin und einer fluoreszierenden
Verbindung, d.h. S-Anilinonaphthalin-1-sulfonat, Hersteller
Eastnan Organic Ciienicals, USA, der folgenden Formel:
«iit einen molaren Verlr'iltnis von Serunialbumin zu fluoreszierender
Verbiiivlun^ von 1:1. Das Bindemittel oder die Matrix der Reagensoci.ic'it
bestand aus Celluloseacetat. Des weiteren wurden zur Herstellung
der Schicht als nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung
Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-100) und Titandioxidteilchen
verwendet. In der Reagens-Schicht lag der Bilirubin-aktive Komplex
in einer Konzentration von etwa 5,4 g Komplex pro η Trägerfläche
vor, das Celluloseacetat in einer Konzentration von etwa 6,4 g pro ία" Trägerflache und die oberflächenaktive Verbindung in einer Konzentration
von etwa 1,4 g pro m Trägerfläche. Schließlich lagen
2 die Titandioxidteilchen in einer Konzentration von 49,5 g pro m
Triigerfläche vor. Sämtliche Konzentrationsangaben beziehen sich
i auf das Trockengewicht der einzelnen Komponenten ausschließ-
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- 76 lieh des Gewichtes von ßeschichtungs-Lösun^smitteln.
28QU55
Die Reagens-Schicht wurde ausgehend von einer Lesungsmittel-Nichtlösungsuittelmischung
zwecks Herstellung einer Blushl'olyifier-Schicht
hergestellt.
Eine Reihe von flüssigen Testlcsungen mit verschiedenen Konzentrationen
an Bilirubin von 0 bis etwa 50 mg Bilirubin pro Deziliter
sowie etwa S g Albumin/dl wurde in Form von 10 "ikroliter Probentropfen
auf verschiedene Abschnitte des hergestellten Elementes aufgetüpfelt.
Für die nachfolgenden Fluoreszenzbestimmungen wurde ein Spektrofluorometer
vom Typ Farrand MD-I, Hersteller Farrand Optical Company, Valhalla, N.Y., USA, verwendet. Gemessen wurde die
Fluoreszenz unmittelbar bevor und 5 Minuten nach Zusatz der BiIi rubinprobe.
Aus den erhaltenen Meßergebnissen wurde ein ßilirubin-Eichkurve hergestellt. Es zeigte sich, daß das hergestellte Element zur
quantitativen Bestimmung bekannter Konzentrationen von Bilirubin in verschiedenen Probelösungen, die nachfolgend auf das Element
aufgebracht wurden, geeignet war.
Die Bilirubin-Bestimmungen konnten innerhalb von 5 bis 7 Minuten durchgeführt werden. Das Vorhandensein von Albumin in den BiIirubin-Probelösungen,
die zur Eichung des analytischen Elementes verwendet wurden, wirkte sich nicht störend auf das Ansprechvermögen
auf das Elementes auf Bilirubin aus.
Das Spektrofluororaeter wurde dazu verwendet, die Fluoreszenz der Reagens-Schicht
des Elementes unter Verwendung einer Anregungsifellenlänge
von 396 Nanometern zu messen. Ermittelt wurde sowohl diese Anregungs-tellenlänge wie auch das Emissions-Wellenlängenmaximum
von ANS bei 475 Nanometern.
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Der Celluloseacetatschichtträger wurde ausgewählt, veil er nicht
oder praktisch nicht fluoreszierte, so daß keine Störungen der
Messungen zu befürchten v;aren. Infolgedessen konnten die fluorimetrischen
Messungen direkt durch den Schichtträger des Elements? durchgeführt werden. Die Fluoreszenzmessunr;en ergaben eindeutig
einen praktisch linearen Abfall der Fluoreszenz des-Bilirubinaktiven
Komplexes der Reagens-Schicht des Elementes bei erhöh t-?n Konzentrationen an Bilirubin in den verwendeten 10 Mikroliter
Bilirubin-enthaltenden Testproben, die auf das Element aufgetüpfelt
wurden, woraus sich ergibt, daP das Bilirubin die fluoreszierende Verbindung ANS von de:n Bilirubin-aktiven Komplex verdrängte.
Die fluoreszierende Verbindung ANS zeigt in ihrem freien Zustand keine oder praktisch keine Fluoreszenz, v/ird jedoch an
Albumin gebunden, stark fluoreszierend.
Beispiel 6: Analytisches Element für die Bestimmung von Glucose
Es wurde ein weiteres integrales analytisches Element für die Glucose-Bestimmung hergestellt.
Ln Falle dieses analytischen Elementes enthielt die Reagens-Schicht
als Reagens oder nicht-diffus ions fähigen Stoff einen eine
bailastgruppe und einen Farbstoff/Enthaltenden Stoff, der
als Folge einer hupplungs reaktion mit einer aädierten photographischen
EntwicKlerverbindung den Farbstoff freisetzte.
i?as hergestellte mehrschichtige Element bestand axis einem PoIyüthylenterephthalatschichtträger,
auf den in der folgenden Peihenfolge aufgetragen wurden: eine Registrier-Schicht, eine Strahlung
Blockierende Schicht, eine Reagens-Schicht und eine Ausbreit-Schicht-
Die Registrier-Schicht und die Strahlung blockierende Schicht entsprachen in ihrem Aufüau den entsprechenden Schichten des
in Beispiel 1 beschriebenen Elenentes. Die Ausbreit-Schicht des Elementes dieses Beispieles entsprach der Blushed-Polymer-Ausbreit-Schicht
des Beispieles 4 (vergleiche A unter Ausbreit-Reagens-Systen
von Beispiel 4).
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Die Reagens-Schickt de» Elementes wurde aus einer wäßrigen Lösung
erzeugt und bestand aus einer gehärteten Oelatinsschicnt mit
einer einen Farbstoff und Ballastgruppen aufweisenden Verbindung der folgenden Formel I:
worin Z für ein Pyridiniumfarbstoffsalz der folgenden Forael II
steht:
0{{
■2 I
Die Reagens-Schicht enthielt des weiteren einen Phosphatpuffer,
Psroxidase (POD) , Glucoseoxidase CCOD), Arninoantipyren (ΛΛΓ)
und eine oberflächenaktive Verbindung. Die ßeschichtungsstärlcen
der einzelnen Komponenten betrugen, trocken gemessen:
gehärtete Gelatine |
20 g/.τΤ |
Verbindung der Formel I |
4,4 g/m2 |
Phosphatpuffer (pK-iv"ert 8,8) |
10,1 g/m2 |
POD |
9500 Einheiten/m |
GOD |
22700 Einheiten/m |
oberflächenaktive Verbindung |
|
(Surfactant 10G) |
0,4 g/mZ |
AAP |
0.8 p/m2
|
Wird auf das beschriebene mehrschichtige Element eine kleine
Probe menschlichen Serums aufgebracht, dem zuvor GOD zugesetzt
worden war, so erzeugte die zu analysierende Glucose des Serums
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in Gegenwart des COD (das sowohl in der Serumprobe als auch in der Reagens-Schicht vorlag) H7O9, das durch die Peroxidase der
Reagens-Schicht in O^ überführt wurde. Das O^ oxidierte die photographische
lintv/icklerverbindunp AAP, die wiederum mit der Verbindung
der Formel I reagierte unter Abspaltung des Farbstoffsalzes
der Formel II. Das freigesetzte Farbstoff salz, das diffusionsf;ihig
war, wanderte in die Pepistrier-Schicht, v.'ie sich durch eine Farbveränderung
ergab, die in der Registrier-Scliicht !••ahrnehiabar ^:ar.
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