DE2812154C3 - Verfahren zur Bestimmung von a -Amylase - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von a -Amylase

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DE2812154C3
DE2812154C3 DE2812154A DE2812154A DE2812154C3 DE 2812154 C3 DE2812154 C3 DE 2812154C3 DE 2812154 A DE2812154 A DE 2812154A DE 2812154 A DE2812154 A DE 2812154A DE 2812154 C3 DE2812154 C3 DE 2812154C3
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Alexander Dr.Rer.Nat. Hagen
Sigmar Dr.Phil. 8131 Berg Klose
Michael Dr.Rer.Nat. 8121 Polling Stoltz
Guenter Dr.Rer.Nat. Weimann
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Description

X—(CH2)„
JO
(D
substituiert wurde, in der
R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Rest
-X-(CH2)*. W
X eine zur Bildung einer covalenten öindung mit einer OH-Gruppe der Stärke geeignete Funktion
η die Zahl 1,2,3 oder 4 bedeuten.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 4-, dadurch gekennzeichnet, daß eine Stärke verwendet wird, weiche mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II
R1-Ο
(H)
(CH2Jn
8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet daß X eine Oxirangnippe, ein Halogenatom, eine Säurechloridgruppe, Isocyanatgruppe, Isothiocyanatgruppe, Tosylatgruppe, Dichlortriazingruppe oder Mesilatgruppe bedeutet
9. Verfahren nach Anspruch 4,5,6 oder 7, dadurch gekennzeichnet daß als weitere Farbstoffbildungskomponente ein Diazoniumsalz verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet daß als weitere Farbstoffbildungskomponente eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet daß ein N-Alkyl-pyridon-{4)-hydrazon-derivat insbesondere N-Methyl-benzthiazolonhydrazin, Aminodimethylanilin oder l-PhenyI-23-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet daß zur oxidativen Kupplung FeCI3, Kaliumferricyanid, Kupfersulfat Silbernitrat Natriumhypochlorit, Bleidioxid, Ce(SOOi H2O2 oder eine H2O2 bildende Reaktion verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß die Abtrennung des niedermolekularen löslichen Spaltprodukts durch Dialyse, Filtration oder Zentrifugation erfolgt
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man bei löslichen Stärkederivaten die niedermolekularen löslichen Spaltprodukte durch Dialyse abtrennt, indem man aus einem ersten kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom die Spaltprodukte zu einem prozentualen Anteil in einen zweiten Flüssigkeitsstrom dialysiert der auf der anderen Seite der Dialysemembran entlanggeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Dialysemembran mit hoher Durchlässigkeit verwendet.
umgesetzt wurde, in der v>
Ri ein Wasserstoffatom oder eine leicht abspaltbare Schutzgruppe, wie eine Acylgruppe, darstellt und
X und /? die in Anspruch 4 angegebenen Bedeutungen aufweisen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3. ho dadurch gekennzeichnet, daß eine Stärke, bei der jede 10. bis 50. Glucoseeinheit oxidiert wurde, mit einem Anilin- bzw. Phenylhydrazin-derivat umgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn- hr> zeichnet, daß die entstehenden Schiff'schen Basen bzw. Hydrazone durch Reduktion in die entsprechenden Amine überführt werden.
Das Enzym Λ-Amylase spaltet bekanntlich die a-l,4-glycosidische Bindung in Polysacchariden, wie Amylose, Amylopectin und Glycogen sowie in deren Abbauprodukten mit einer Kettenlänge von mindestens D-Glucose-resten. Reaktionsprodukte ist das Disaccharid Maltose. Die Maltose kann z. B. von «-Glucosidase in Glucose gespalten werden, welche wiederum enzymatisch bestimmt werden kann. Bei dieser komplexen Nachweisreaktion stört unter anderem die im Serum schon enthaltene Glucose.
Bei einer anderen bekannten Nachweisreaktion für Λ-Amylase nutzt man die bekannte Jodstärkereaktion. Dabei mißt man das Verschwinden der blauen Farbe der Jodeinschlußverbindung im Stärkemolekül. Da diese Einschlußverbindung von einer helikalen Kettenstruktur der Stärke abhängt, die nur teilweise vorliegt, ist diese Bestimmiingsmethode relativ ungenau (DE-OS 08 714).
Eine größere Bedeutung hat dagegen ein Bestimmungsverfahren erlangt, bei dem aus einer durch einen Farbstoff gefärbten unlöslichen Stärke durch die
ti!
ίίί
Einwirkung der α-Amylase lösliche farbige Bruchstücke freigesetzt werden, die dann die überstehende Lösung anfärben. Die Anfärbung dieser Lösung ist ein Maß für die Menge der «-Amylase. Neben der Schwierigkeit, ein reproduzierbar gleich stark vernetztes unlösliches ■> Stärkederivat herzustellen, stört bei dieser Methode auch stets der durch Hydrolyse freigesetzte Farbstoff, der einen gewissen Leerwert bedingt Besonders störend wirkt sich auch das hche Molekulargewicht des Reaktivfarbstoffs aus. Dies bedingt, daß in unmittelbarer ι ο Nachbarschaft der Bindungsstelle an der Zuckerkette aus sterischen Gründen kein Angriff durch die α-Amylase erfolgen kann. Die Konzentration des Farbstoffs auf der Stärke kann daher nicht beliebig erhöht werden, wodurch auch die meßbare Extinktion begrenzt ist. Da das Molekulargewicht von Stärkebruchstücken im Verhältnis zu dem des Farbstoffs relativ klein ist, ist z.B. auch keine Trennung von niedermolekularen, gefärbten Bruchstücken von gefärbter löslicher Stärke durch Dialyse möglich. Gerade eine derartige Abtrennung im fließenden Lösungssystem wäre aber für eine Bestimmung mit Analysenautomaten erwünscht
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Nachweismethoden zu beseiti- 2r> gen und ein Verfahren zur Bestimmung von α-Amylase zu schaffen, welches sich auch für die Anwendung auf Analysenautomaten mit mehreren getrennten Lösungskreisläufen eignet
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von «Amylase unter Verwendung eines oligomeren oder polymeren Stärkederivats als Substrat, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Stärkederivat verwendet, welches einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten trägt, die bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte aus der stärkehaltigen Phase abtrennt, mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente kuppelt und den so gebildeten Farbstoff mißt 4«
Wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Verwendung eines Stärkederivats, welches nicht mit einem Farbstoff, sondern nur mit einer zur Farbstoffbildung befähigten niedermolekularen Verbindung substituiert ist. Es ist dabei nicht erforderlich, ein vernetztes <r> unlösliches Stärkederivat einzusetzen, vielmehr läßt sich sowohl lösliche als auch unlösliche Stärke verwenden.
Die Derivatisierung muß derart sein, daß bei der Spaltung durch die «-Amylase ein Bruchstück abgespalten wird, welches mit einer weiteren Farbstoffbildungs- 50 komponente unter Farbstoffbildung reagieren kann. Da das Stärkederivat keinen umfangreichen Farbstoffrest trägt, wird auch der Angriff der «-Amylase nicht gehindert so daß ein sehr hoher Substitutionsgrad in der X1 = N gewählt werden kann. Dies hat zur Folge, daß der 55 größte Teil der entstehenden Spaltprodukte einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten trägt und die Bestimmung daher einen hohen Empfindlichkeitsgrad aufweist Vorzugsweise wird daher ein Stärkederivat verwendet welches auf je 6 bis 30 e>o Glucoseeinheiten einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten aufweist. Es ist jedoch möglich, auch Stärkederivate mit noch höherem Substitutionsgrad einzusetzen. Andererseits kann es unter gewissen Umständen auch ausreichen, wenn ein br> kupplungsfähiger Substituent auf mehr als 30 Glucoseeinheiten kommt falls hohe Empfindlichkeit nicht gefordert wird. Für die Anwendung auf Analysenauto
maten hat sich ein Stärkederivat besonders bewährt, welches auf je 15 bis 25 Glucoseeinheiten einen kupplungsfähigen Substituenten trägt
Prinzipiell läßt sich jede zur Farbstoffbildung geeignete Komponente als Substituent der Stärke verwenden, welches nicht hochmolekular ist lösliche Spaltprodukte bei Einwirkung der α-Amylase ergibt und sich zu einem gut meßbaren Farbstoff umsetzen läßt Bevorzugt werden solche Substituenten, welche klein genug sind, um das abgespaltene Bruchstück, das bei der Substratspaltung gebildet wird, dialysierbar zu halten. Geeignete Farbstoffbildungskomponenten sind dem Fachmann bekannt desgleichen die zur Farbstoffbildung führenden Reaktionen und Kupplungskomponenten. Der Substituent darf jedoch keine die enzymatische Aktivität der α-Amylase beeinträchtigenden Funktionen enthalten.
Als besonders geeignst erwiesen sich im Rahmen der Erfindung Stärkederivate, welche mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I
X-(CH2),
substituier! sind, in der
R ein V/asserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Rest -(CH2Jn-X,
X eine zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der Stärke geeignete Funktion und
π die Zahl 1,2,3 oder 4 bedeuten.
Eine andere bevorzugte Gruppe von Stärkederivaten entspricht der allgemeinen Formel Il
(H)
X-(CH2),
in der Ri ein Wasserstoffatom oder eine leicht abspaltbare Schutzgruppe, wie eine Acylgruppe, und X und η die bei Formel I angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Eine weitere Gruppe von Stärkederivaten entspricht der allgemeinen Formel III
- X1
bzw. Ν — Ν
i
H
(III)
und S den Stärkerest bedeuten.
Als zur Bildung einer covalenten Bindung mit einer OH-Gruppe der Stärke geeignete Funktion haben sich besonders bewährt Oxirangruppen, Halogenatome, Säurechloridgruppen. Isocyanatgruppen, Isothiocyanatgruppen, Tosylatgruppen, Dichlortriazingruppen oder Mesilatgruppen. Diese Aufzählung ist jedoch nicht erschöpfend und zahlreiche weitere, mit einer OH-Gruppe der Stärke reaktionsfähige Gruppen sind dem Fachmann bekannt.
Die mit den Substituenten der allgemeinen Formel I
und II unter Farbstoffbildung kupplungsfähige weitere Komponente ist vorzugsweise eine Diazoniumsalz oder eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung. Besonders geeignet innerhalb dieser bevorzugten Grupp·; sind N-Alkylpyridon-(4-)hydrazonderivate, insbesondere N-Methylbenzthiazolon-hydrazon, Aminodimcthylanilin oder 1-Phenyl-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on (4-Aminophenazon).
Zur oxidativen Kupplung eignen sich vor albm FeCIi Kaliuraferricyanid, Kupfersulfat, Silbernitrat, Natriumhypochlorid, Bleidioxid, Ce(SO4)I H2O2 oder allgemein H2O2 bildende Reaktionssysteme.
Eine bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel I ist N-Methyi-N-l-(23-epoxy)-propylanilin. Bei der oxidativen Kupplung mit N-Methylbenzthiazolon-hydrazon (MBTH) entsteht ein Farbstoff mit einem sehr hohen Extinktionsmaximum bei den Wellenlängen 570 bis 600 mu, der für die Messung besonders gut geeignet ist
Die Abtrennung der bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen löslichen Spaltprodukte kann beispielsweise durch Dialyse, Filtration oder Zentrifugation erfolgen. Diese Methoden eignen sich besonders bei Verwendung eines unlöslichen Stärkederivats. Bei Verwendung von löslichen Stärkederivaten hingegen wird besonders die Dialyse oder Ultrafiltration zur Abtrennung eingesetzt. Vorzugsweise trennt man bei löslichen Stärkederivaten die niedermolekularen Spaltprodukte durch Dialyse ab, indem man aus einem ersten kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom einen prozentualen Anteil der Spaltprodukte in einen zweiten Flüssigkeitsstrom ausdialysiert, der auf der anderen Seite der Dialysemembran entlanggeführt wird. Als Dialysemembran verwendet man hierzu zweckmäßig eine solche mit hoher Durchlässigkeit sowohl bezüglich der Qualität als auch der Molekülgröße.
Wie oben bereits erwähnt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren gut zur Anwendung auf üblichen Analysenautomaten, insbesondere auch auf solchen, bei denen mehrere getrennte Lösungskreisläufe vorliegen, die miteinander durch eine Dialysemembran in Verbindung stehen. Dann enthält der Primärkreislauf das lösliche oder unlösliche Stärkederivat. Das niedermolekulare lösliche Spaltprodukt mit dem zur Farbstoffbildung befähigten Substituenten, tritt durch die Dialysemembran in den Sekundärkreislauf über und wird dort zum Farbstoff umgesetzt und letzterer gemessen. Die Messung des Farbstoffs erfolgt üblicherweise unter Verwendung eines Photometers, welches im sichtbaren Bereich oder gegebenenfalls auch im UV mißt.
Das erfindungsgemäß verwendete Stärkederivat wird im allgemeinen in Mengen zwischen 0,05 und 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 2 Gew.-%, eingesetzt. Die Einwirkung der «-Amylase erfolgt bei pH-Werten zwischen 5,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5. Zur Aktivierung der Amylase werden zweckmäßig Chloridionen, z. B. NaCl oder KCl, in Mengen zwischen 0,01 und 12%, vorzugsweise 0,05 und 5%, zugesetzt. Die Inkubationszeit hängt ab von der Temperatur und dem Substitutionsgrad des verwendeten Stärkederivats. Bei einer Inkubationstern; ::·..·:- von 45°C reichen im allgemeinen Inkubationszeiten zwischen 3 und 12 Minuten aus.
Ein Reagens zur Bestimmung der a-Amylase enthält als wesentlichen Bestandteil ein Stärkederivat, welches einen unter Farbstoffbildung Kupplungsfähigen Substituenten trägt.
In einer Ausführungsform enthält das Reagens ein Stärkederivat der allgemeinen Formel IV
(IV)
in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder den Rest -(CH2)B-Y-S, Y den Rest einer mit OH-Gruppen reaktiven Funktion, S die Stärke und π die Zahl 1, 2, 3 oder 4 bedeuten.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Stärkederivat der allgemeinen Formel V
S-Y-(CH2).
verwendet, in der
Ri ein Wasserstoffatom oder eine leicht abspaltbare Schutzgruppe, wie eine Acylgruppe, und
S, Y und η die zu Formel IV angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Das Reagens enthält getrennt vom Stärkederivat eine Farbstoffbildungskomponente, die mit dem Substituenten des Stärkederivats unter Farbstoffbildung reagieren kann. Es handelt sich hierbei um Diazoniumsalz oder um eine zur oxidativen Kupplung mit Phenolen oder Anilinen geeignete Verbindung, zusammen mit einem Oxidationsmittel. Zur oxidativen Kupplung geeignete Verbindungen sind insbesondere N-Alkylpyridon-(4)-hydrazon-derivate, wie N-Methylbenzthiazolonhydrazon, Aminodimethylanilin oder 4-Aminophenazon.
Ferner enthält das Reagens zweckmäßig noch Puffersubstanz und Chloridionen.
Das Reagens kann auch auf einem saugfähigen Träger imprägniert vorliegen, welches blattförmig oder stäbchenförmig sein kann. Bei derartigen Teststreifen ist es auch möglich, die modifizierte Stärke covalent mit dem Trägermaterial, beispielsweise Filterpapier zu verbinden. Eine derartige Verbindung ist mit OH-Reagentien, wie den oben erwähnten, möglich, beispielsweise mittels Epichlorhydrin.
Die Teststreifen werden in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und nach einer bestimmten Reaktionszeit wieder entnommen. Anschließend kann die Farbkupplungsreaktion entweder in der Lösung, die die derivatisierten Bruchstücke enthält, vorgenommen werden, oder auf dem Teststreifen selbst, wobei in diesem Fall die Kupplung mit den nicht abgespaltenen farbstoffbildenden Substituenten erfolgt
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
A. Herstellung der derivatisierten Stärke
100 g Zulkowski-Stärke (K. Zulkowski, Ber. 13, (1880) 1395) werden in einer Lösung von 600 ml und 20 g NaOH gelöst. Hierzu werden 10 ml N-Methyl-N-l-(2,3-epoxy)-propylanilin (hergestellt nach J. Chem. Soc. (1950). 890 ff) gegeben. Die entstehende Emulsion wird 5
Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird anschließend durch Eintropfen in die 4fache Menge Methanol ausgefällt, abgesaugt und getrocknet.
Ausbeute 95%
Stickstoffgehalt 0,46% (entspricht einer Anilingruppe je 18Glucoseei heiten)
B. Oxidative Kupplung mit MBTH
Eine 0,5%ige wäßrige Lösung der nach A. mit κ Epoxypropyl-N-methylanilin derivatisierten Zulkowski-Stärke in 0,1 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 5% NaCI wird mit Hilfe einer Schlauchpumpe über einen Schlauch mit einem Fließvolumen von 1,0 ml/min angesaugt. Nach Luftsegmentierung dieses Flüssigkeits- ι Stroms wird mil eitlem F'iießvoiumen von 0,1 ml/min die Serumprobe mit a-Amylase zudosiert. Dieser luftsegmentierte Flüssigkeitsstrom wird nach einer Inkubationszeit von 7 Minuten bei 45°C oberhalb einer Dialysemembran entlanggeleitet. Die durch die α-Amy- :i läse abgespaltenen Anilin-Stärke-Bruchstücke dialysieren zu einem über den jeweiligen Bereich gleichbleibenden Prozentsatz. Auf der Gegenseite der Dialysemembran strömt netzmittelhaltiges Wasser mit einem Fließvolumen von 1 ml/min entlang. Zu diesem ebenfalls j ■ luftsegmentierten, durch das Dialysat angereicherten Flüssigkeitsstrom wird eine 0,5%ige wäßrige Lösung von Methylbenzthiazolonhydrazon (MBTH) mit 0,1 ml/min zudosiert und nach Mischen in einer Mischschlange wird eine l%ige wäßrige Lösung von κ K3[Fe(CN)6] mit 0,23 ml/min zugegeben. Die Extinktion des entstehenden violetten Farbstoffs wird in einer Durchflußküvette im Photometer bei 560 nm gemessen und durch einen Schreiber aufgezeichnet. Durch Vergleich mit der Extinktion einer Probe mit bekannter j-Konzentration an a-Amylase wird die a-Amylasekonzentration in der unbekannten Probe ermittelt.
Beispiel 2
A. Kupplung von Anilin über Schiffsche Base 4I
an oxidierte Stärke
Zu einer Lösung von 100 g Zulkowski-Stärke in 1,3 1 Wasser werden 6,6 g Natriumperjodat gegeben. Der Ansatz wird über Nacht gerührt, dann wird die oxidierte a ■ Stärkelösung durch Eintropfen in 4 1 Methanol ausgefällt.
50 g der oxidierten Stärke werden in 600 ml Wasser gelöst, dann werden 350 ml 15%ige Essigsäure zugegeben. Zu dieser Lösung werden langsam unter -,<■ Rühren 50 ml Anilin getropft Nach 20 Stunden Reaktionszeit wird das Produkt durch Eintropfen in die 3fache Menge Methanol gefällt, abgesaugt, mit Äther gewaschen und getrocknet
B. Oxidative Kupplung mit 4-Aminophenazon ''
Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch unter Verwendung des durch Oxidation und Kupplung mit Anilin erhaltenen Stärkederivats von A. An Stelle von MBTH wird 4-Aminophenazon einge- «i setzt, als Oxidationsmittel dient FeCb. Die Auswertung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3
A. Herstellung des Derivats b3
100 g unlösliche Stärke werden in einer Lösung von 150 ml Wasser und 20 g NaOH suspendiert Dann werden 10 ml Ortho-2,3-epoxypropylphenol (hergestellt gemäß J. Org. Chem. 24 (1959) 1197) zugegeben und die erhaltene Mischung wird 5 Tage bei Raumtemperatui gerührt. Das Produkt wird abfiltriert, mit Wassei gewaschen und getrocknet
B. Oxidative Kupplung mit 4-Aminophenazon
Zu einer Suspension von 10 mg des nach A hergestellten Substrats in 10 ml Phosphatpuffer (2C mMol/1), pH 7,0 unter Zusatz von 50 mMol/1 NaC; werden 0,1 ml die a-Amylase enthaltende Probe gegeben. Es wird 15 Minuten bei 3O0C inkubiert Anschließend wird der nicht in Lösung gegangene Anteil des Substrats abzentrifugiert. Zum Überstand werden 0,1 ml einer 0,5%igen wäßrigen Lösung von 4-Äminophenazon sowie 0,i mi einer i°/oigen Lösung von Kj[Fe(CNJt,] gegeben. Die Extinktion des entstandenen Farbstoffs wird bei 578 nm gemessen.
Beispiel 4
POD-katalysierte oxidative Kupplung
Eine 2%ige wäßrige Lösung der mit Epoxypropyl-N-methylanilin derivatisierter Zulkowski-Stärke von Beispiel 1 in 0,1 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 0,06% NaCl und 2 U Giucoseoxidase (GOD)VmI wird mit Hilfe einer Schlauchpumpe über einen Schlauch mit einem Fließvolumen von 0,8 ml/min angesaugt. Nach Luftsegmentierung dieses Flüssigkeitsstromes wird mit einem Fließvolumen von 0,1 ml/min die Urinprobe zudosiert, weiterhin eine wäßrige Glucoselösung mit einer Konzentration von 200 mg/100 ml mit 0,1 ml/min. Dieser Flüssigkeitsstrom wird nach einer Inkubationszeit von 7 Minuten bei 45°C oberhalb einer Dialysemembran entlanggeleitet. Die durch die a-Amylase abgespaltenen Anilin-Stärke-Bruchstücke und das durch die GOD-Reaktion entstandene H2O2 wandern durch die Membran, auf deren anderer Seite strömt netzmittelhaltiges Wasser mit einem Fließvolumen von 0,6 ml/min. Zu diesem ebenfalls luftsegmentierten, durch das Dialysat angereicherten Flüssigkeitsstrom wird eine 0,05%ige wäßrige Lösung von MBTH und 5 U Peroxidase (P0D)/ml in 0,1 mol/l Citronensäure/Citrat-Puffer, pH 4,0 mit 0,42 ml/min zugegeben. Nach Mischen in einer Mischschlange wird der Flüssigkeitsstrom durch eine Durchflußküvette in einem Photometer geleitet. Die Extinktion des entstandenen Farbstoffs wird bei 560 nm gemessen und über einen Schreiber aufgezeichnet. Durch Vergleich mit der Extinktion einer Probe mit bekannter Konzentration an a-Amylase wird die a-Amylasekonzentration in der unbekannten Probe ermittelt
Beispiel 5
Diazokupplung mit Echtrotsalz
Es wird die Versuchsanordnung von Beispiel 1 verwendet Im Sekundärkreislauf wird jedoch mit einem Fließvolumen von 0,6 ml/min netzmittelhaltigem Wasser aufgenommen. An Stelle von MBTH wird eine 0,6%ige Lösung von Echtrotsalz in 0,025 N H2SO4 mit einem Fließvolumen von 0,4 ml/min zugegeben.
Die Messung der Extinktion erfolgt bei 505 nm.
Beispiel 6
Herstellung eines Teststreifens
Filterpapier wird in Streifenform geschnitten und in eine Lösung von Epichlorhydrin in Aceton eingetaucht
Nach 1 Stunde werden die Streifen entnommen und mit einer nach Beispiel 1 A. hergestellten derivatisierten Stärke beschichtet. Das beschichtete modifizierte Filterpapier wird mit erwärmter 2 η NaOH behandelt. Hierbei erfolgt eine covalente Verknüpfung zwischen Papier und Stärke. Der so erhaltene Streifen wird noch mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von a-Amylase unter Verwendung eines oligomeren oder polymeren Stärkederivats als Substrat, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Stärkederivat verwendet, welches einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten trägt, die bei der Substratspaltung gebildeten niedermolekularen lösliehen Spaltprodukte aus der stärkehaltigen Phase abtrennt, mit einer weiteren Farbstoffbildungskomponente kuppelt und den so gebildeten Farbstoff mißt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stärkederivat verwendet wird, welches einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten auf je 6 bis 30 Glucoseeinheiten aufweist
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stärkederivat verwendet wird, welches einen unter Farbstoffbildung kupplungsfähigen Substituenten auf je 15 bis 25 Glucoseeinheiten trägt
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stärkederivat verwendet wird, welches mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I
DE2812154A 1978-03-20 1978-03-20 Verfahren zur Bestimmung von a -Amylase Expired DE2812154C3 (de)

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