JPS61501866A - 分析用多層要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 液体、特に生物液体中の物質の化学分析に多数の装置が知られている。ある型の 装置には、高価な装置、高度る。

他の型°の装置は、高価な装置なしに、１１−試験を一度に実施する比較的簡単 な携帯用多層要素である。

１９７３年３月２３日に特許された米国特許第３．７２３．０６４号明細書は、 試験物質との反応用化学試薬をもって含浸され、試験流体に対りる異なった透過 性の第１領域および第２領域を有する透過可能部材を含む層を含む層状試験装置 に向けられている。透過層は、透過可能部材に隣接して配置されて、化学試薬と 試験物質の反応から生じた反応生成物を通して、前記反応生成物と反応して、供 試物質の存在および濃度を示す可視反応を生じるように適した化学薬品をもって 含浸された指示薬層である次層に引き出すのを助ける。

１９７６年１１月１６日に特許された米国特許第３．９９２．１５８号明細書に は、スプレッド層および試薬層を含む一体化分析要素が開示されている。スプレ ッド層は、それ自体の中に適用された液体試料の少なくとも１成分を拡げて均一 な濃度を得、この濃度は次いで反応して検出可能種を形成し得るＦａｌｌ試薬層 に移行する等方性非繊維状多孔層である。

１９７７年８月１６日に特許された米国特許第４．０４２．３３５号明細書は、 生化学液体および生物液体のような液体の分析用多層要素を志向している。

この要素は、分析される物質と相互作用性で拡散性、検出可能種を与える組成物 を含む試薬層および検出可能種が透過性のレジストレーション層を含み、このレ ジストレーション層内でこのような種を検出できる。また、この要素はスプレッ ド層および放射線阻止層を含み、検出可能種の検出を増進し得る。

１９７７年９月２７日に特許された米国特許第４．０５０．８９８号明細書はス プレッド層が、スプレッド層の輸送を規格化する非イオン界面活性剤を含む非繊 維状等方性多孔性スプレッド層である、少なくとも１９７６年１月３日に特許さ れた米国特許第４，０６６．４０３＠明細書は、検体と反応して分解生成物を生 成する第１試薬および前記分解生成物と反応して、検出可能変化を生成するに適 した第２試薬を含み、妨害物質が実質的に不透過性の、前記分解生成物に対すの 分析用一体化分析要素ら向けられている。

１９７８年１月１７日に特許された米国特許第４．０６９．０１６号明細書は、 水性液体試料をビリルビンをもまた結合できるキャリヤーに結合された拡散性の ビリルビン置換可能の検出可能配位子と接触させ、次いでこのように置換された 検出可能配位子を検出することを特徴とする、水性液体試料中のどリルビンの定 量方法に向けられている。

１９７９年３月１３日に特許された米国特許第４．１４４．３０６号明細書は、 試薬層が非拡散性物質に結合゛された予備成形された検出可能部分を有する非拡 散性物質を含む相互作用組成物を含有し、この組成物は検体を含有する液体の存 在下に検体による置換によって予備成形された検出可能部分を含む、拡散性生成 物を与える、少なくとも試薬層およびレジストレーション層を含む多層分析張索 を用いる置換／放出方法を志向している。レジストレーション層は拡散性生成物 を受容する。

も使用できる。前記相互作用組成物の例として、検体がレジストレーション層に 移行する標識部材を置換する標識抗原−抗体複合体が挙げられる。

１９７９年８月２８日付特許された米国特許第４．１６６’、０９３号明細書は 、検体と相互作用可能で放射分析的に検出可能種を与える組成物を含有する放射 ′ｍ透過性試薬層、検体透過性多孔性放射線阻止層および試薬層と放射線阻止層 の間に介在された放銅線透過性層は、前記検体透過可能であり、しかも前記要素 が分析　。

中の液体と接触した時に前記放射分析的に検出可能種の前記多孔性放射線阻止層 への移行を阻害する、液体分析用要素に向けられている。

１９８１年３月２４日に特許された米国特許第４，２５８．００１号明細書は、 熱安定性、非膨潤性荷載重合体粒子および接着剤を含む、粒状構造を有する帯域 を含む拮抗免疫検定用多層要素に向けられている。

蛍光標識゛抗原のような免疫試薬は、粒子に結合できる。

例５０においては、抗体がスプレッド／試薬帯域分散液において固定され、しか も標識抗原が試験要素に適用する前に予備混合される拮抗免疫検定要素が記載さ れている。また、標識抗原は要素中に混入できると記載されている。しかしなが ら、標識抗原が要素に混入されている場合、要素中にあって標識抗原と抗体の早 期結合を避ける固定された抗体から標識抗原を離して維持するように留意しなけ ればならないと記載されている（第３０１［１１１第２行〜第７行）。

Ｄ、　Ｈ，Ｗｅｉｒ　によるイムノケミストリー（１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ＋５ｔ ｒｙ　）第３版、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーション（ ＢｌａｃｋＷｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　）　、英 国、オックスフォード所在、第１巻、第１９章には、抗原を含有する検体を抗体 を含有するコロイド層の中心に入れる半径方向定量免疫沈＠技術が記載されてい る。抗原が中心から放射する距離を測定して、検体中の抗原の定量を与える。

１９８１年１０月１５日付で出願されたヨーロッパ特許出願第００５１１８３号 明細書には、抗原（または抗体）が固定された多孔性媒質層および多孔性媒質層 中の免疫沈殿に関与しなかった物質が拡散し得る層を含み、その後、検出手段を 用いて前記物質の量をめることのできる多層分析要素が開示されている。運転中 は分析される抗原（または抗体）は標識され、次いで多孔性媒質層に適用゛され る。標識抗原くまたは抗体）は固定された抗原（または抗体）と反応して複合体 を形成する。過剰の未反応抗原（または抗体）は複合体から本質的に分離され、 次いで試薬層に拡散する。未反応標識抗原（または抗体）を、光学的に測定して 定量を与える。本特許出願明１［１１は、ゲル中介沈殿反応の定量的性質を示す 。

Ｌ１里１ｌ１ 検出可能種を含有し、検体の８ａ度の関数として前記検体により実質的に非拡散 性となるように適した拡散可能試薬の所定量を含有する反応層；下記レジストレ ーション層に拡散してくる試薬を受容するように適したレジストレーション層： 前記レジストレーション層中の前記試薬を検出する手段；および前記試薬層と前 記レジストレーション層との検出可能種間の識別を与えるに適した前記反応層と 前記レジストレーション層との間の絶縁層：を含むことを特徴とする、検体を含 有する液体の分析用多層要素。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の好ましい多層要素の略断面図であり、 第２図は、検体との接触前の要素の成分の若干の位置を示す第１図の要素の略断 面図であり、発明の詳細な記載 本発明は、検体と反応するように適した分析要素の一層に所定濃度の試薬を含む 分析技術を意図している。すなわち、検体は、検体の量に関連して、通常は拡散 可能のある位の試薬と反応し、次いでその量を不動化する。

また検出可能種をも含有する未反応試薬はレジストレーション層に拡散し、その レジストレーション層では適当な検出手段を用いて検出可能種によってレジスト レーション層の試薬の量を確認する。好ましくは、検出可能種の検出をレジスト レーション層に拡散したものに限定するために、反応層とレジストレーション層 との間に絶縁層が使用される。

本発明は、検出可能種を有する第２の拡散可能物質と反応して、前記第２の物質 を固定でる実質的に任意の物質の分析用に適しているが、本発明は、免疫沈殿技 術を用いる用途に特に適している。簡略化のために、本発明を免疫沈殿について 記載する。

分析技術は、不均質法または均質法として分類できる。

不均質法には、遊離および結合反応体の物理的分離が必要であるが、一層敏感で あると考えられる。均質法は、その操作が容易かつ簡単のために好ましいが、結 合種および遊離種の間の不完全な識別によって生じる高いバックグラウンド水準 の不利をまねく。均質法においては、物理的分離は、起こらないが、むしろキャ リヤーの複合体形成の状態に基づく反応体標識の１つの変調が起こる。

感度の低下した水準は、少なくとも１部分は不完全Ｉｔ別に起因する。

本発明は、一体化一工程形式の不均質免疫沈殿技術を用い、従ってｉｌ膜フォー マットの不均質技術の感度を有しながら均質技術の操作の簡単さを得る。

本３発明の新規な要素および操作は、単一工程でおよび予め形成された薄膜形態 で免疫沈殿技術を用いて、結合および未結金種の分離を行い、しかも検出は検出 可能標識抗体の示差拡散によって行われ、それによって、追加抗原種との競合反 応が避けられる。したがって、本発明により、免疫複合体を生成する任意の物質 は、免疫複合体を生成するもの以外の反応体を使用することなしに分析できる。

本明細書において用いる「免疫複合体」の用語は、免疫グロビンとハブテン性ま たは多価抗原および不均質またはモノクローン抗体を包含する可溶性または不溶 性の何れかの、抗体過剰から抗原過剰までの任意の割合の、前記免疫グロビンを 組み合わせた配位子との凝集体を表わすように意図されている。

操作中、検体を含有する試料液体の所定量は、予め形成された薄膜（ここでは拡 散可能抗体がこの抗体に結合された検出可能種を含有する）に配置された拡散可 能抗体の測定された量と接触される。抗原検体は、抗体と会合して、試料液体中 の抗原の濃度に定量的に比例して、未複合体形成抗体よりも実質的に少なく拡散 可能の複合体積を形成する。複合体化抗体および未複合体化抗体の分離は、抗原 と複合体を形成するに必要なものより過剰の未複合体化抗体の拡散率の差により 起こる。未複合体化抗体の黴の測定は、最初に抗体が配置された層から拡散して 出て、好ましくは、レジストレーション層（ここで抗体が不動化によって濃縮さ れて、要素中の抗体のどのような逆拡散または遊走をも防止する）に拡散する抗 体の量を測定することによって行われる。測定は、抗体−抗原複合体積の量、従 って試料液体中の抗原検体の濃度を示すレジストレーション層中の検出可能種の 量を測定する操作によって行われる。

本発明は、拡散可能抗体に結合している検出可能種を有する拡散可能抗体を用い る、抗原の分析について主として記載されているが、免疫沈殿技術が用いられて いるので、拡散可能抗原に結合されている検出可能種を有する拡散可能抗原を用 いるために抗体が分析されることができると理解されたい。簡略化のために、本 発明は検体としての抗原の点から記載されているが、本発明は両操作を包含する と理解されたい。

下記の例は、薄膜免疫沈殿の原理を具体的に説明する。

し ３ミル　ポリスチレン基材［ダウ・ケミカル・カンパニー、ミシガン州ミツドラ ンド所在によって商標トライサイト（ＴＲＹＣＩＴＥ　）の下に販売］上に下記 の材料を塗布した。１０■／ｆｔ２商標免疫グロブリン（アトランチツク・アン テイボディーズ・インコーホレーテッド、メイン州スカーバロウ所在、販売のＦ ＴＴＣ−抗ヒトアルブミン）、１０００η／ｆｔ２アガロース［エフ・エム・シ ー・マリーン・コＯイズ、メイン州ロックランド所在販売のシーケム（ＳＥＡＫ Ｅ）ｌ）　Ｌ　Ｅ　］およびＯ，ＩＲｇ／Ｉｔ２界面活性剤［オリーン・ケミカ ルコーポレーション、コネチカット州スタッフォード所在により商品名オリーン （ＯＬ１１４）　１０　Ｇの下に販売されているｐ−ノニルフェノキシポリグリ シドール］。このように被覆された基材を乾燥し、次いで１０αＸ１αの細片に 切断した。この細片は、細片の１部を下記抗原の溶液に１０分浸し、次いで蒸留 水中で１０分すすぎ、次に型温において風乾することによって抗原（シグマ・ケ ミカル・カンパニー、ミズーリ州セントルイス所在によって販売の無グロブリン ヒトアルブミン）にざらされた。ホスフェートで緩衝された生理的食塩水中ＯＲ ｇ／ｄｏ、５■／ｄ、１喀／−および２■／−からなる抗原濃度系列を調製した 。試料の相対蛍光強度は、励起４５０　ｎＬスリット５　ｎｍ、発光走査４７０ ｎ［ｎｍ６００　ｒ＋ｍおよび集積光子計数モード（スペックス・インダストリ ーズ・インコーホレーテッド、ニューシャーシー州、メタチェン所在）を用いる フルオロログ（ＦＬＯＵＲＯＬＯＧ　）を使用して個々の試料細片の暴露および 未暴露部分から測定した。試料間の比較は、抗原溶液に暴露したことによって生 じた蛍光の減少％の計算によって行われた。下記第１表を参照して抗原の一層高 い水準は、蛍光抗体の一層高い水準を固定することが分る。

２　０．１２５　２６．５ ３　０．２５０　２３．０ ４　０．３７５　２１．２ ５　０．５００　１８．５ この例は、抗原が、予め形成されたコロイドの薄膜層における予め被覆された抗 体と有効かつ測定可能に反応し、しかも抗体の層外への拡散は層に加えられた抗 原の量に対して示差的にかつ反比例して起こり、従って抗原定量の機構を与える ことを示している。

本発明の新規な要素は、その最も簡単な形態において試料スプレッド層； 拡散可能抗体に結合した検出可能種を有する拡散可能抗体を含む反応層； 実質的に放射線不透過性の多孔層； レジストレーション層に拡散する前記抗体を受容しかつ実質的に不動化するのに 適したレジストレーション層；および 前記各層を支持する放射線透過性基材を用いる。

スプレッド層は試料の吸収の完了後液体の単位面積当たりの一定容積を保持する 空隙率を有しそして試料液体の測定ざ机た量の反応層への正確な供給を与え、従 って計量分配または測定装置が何ら必要なくなる。スプレッド層として使用する のに適した材料の例として、特別の予じめ定められた空隙率を有する繊維状層、 米国特許第３．９９２．１５８号明細書に開示された等方性多孔非繊維状材料お よび１９８１年９月２９日に特許された米国特許第４，２９２．２７２号明細書 の布帛を挙げることができる。

別の態様において、スプレッド層は例えば、紙、石綿またはチタン酸カリウムの ような有ｍｍｎまたは無は繊維の繊維状被覆を含んでもよい。

反応層は親水性コロイドを含み、その親水性コロイドは、液体試料透過性の、蛋 白質に不活性の、膨潤性であるがしかし湿潤強さ一体性を保つように不溶性であ り、しかも抗体に結合した検出可能種を有する抗体が最初に配置され、そして前 記抗体に対して非反応性で且つ非結合性である。反応層に適した材料としては、 ゼラチン誘導体、親水性セルロースＩｉ１体、デキストラン、アラビアゴム、ア ガロースなどの多糖類のような天然に存在する物質およびポリビニルアルコール およびポリビニルピロリドン、アクリルアミド重合体などの水溶性ポリビニル化 合物のような合成物質の両者を包含する親水性ゲル化可能材料がある。熱可逆可 能ゲルは、その製作が簡単なために好ましい。反応層として用いられる重合体は 新酒を避け゛るように留意しなければならない。

検出可能様は、当業界に既知の従来の標識手段を含んでもよい。適当な検出可能 様の中で、放射性標識、例えばγ検出、蛍光標識、酵素標識（比色信号を与える ）および発光標識を挙げることができる。好ましい態様においては、蛍光材料は 、特に検出感度の故に検出可能様として使用される。

好ましい態様においては、反応層の親水性コロイドは、また重合体マトリックス の標識抗体の拡散定数を増進する透過体をも含有する、すなわち、透過体は親水 性コロイド媒質の細孔径を有効に増大する。好ましくは、透過体はポリビニルピ ロリドンまたはソルビトールのような親水性非ゲル化性重合体である。理論によ って束縛されることを意図しないが、透過体はゲル化重合体の水素結合度を減少 して、検出可能様による抗体の拡散に対する一層少ない抵抗を与えると考えられ る。

蛍光検出技術を用いる場合、蛍光の量子効率を低下させ、従って抗体の検出可能 性を実質的に一層少なくする可能性がある物質の使用を避けるように注意すべき である。

重合体マトリックスの透過体の有効性を例示するために、種々の被覆重合体マト リックスについて比較半径方向拡散測定を行った。

補剤をもって製造し、次いで接着を促進するために接着性重合体［ローブレック ス（ＲＨＯＰＬＥＸ　、　Ｏ−ム・アンド・ハース・カンパニー、ペンシルバニ ア州、フィラデルフィア所在］６８．３ｇ、マロン酸ジオクチルの１０％溶液５ ．６ｇ、１０％コロイドシリ力分散液［ルドックス（ＬＵ口Ｏｘ）、イー・アイ ・デュポン・デ・ネモアス・カンパニー、プラウエア州つイルミントン所在］２ ６゜７ｇ、フタル化ゼラチンの１０％溶液４０ｇ、ポリノニルフェノキシグリシ ドール（オリーン　１０Ｇ）の５０％溶液３ｇおよび水８６２ｇを含む組成物を もって下塗りされたポリスチレン基材［トライサイト（ＴＲＹＣＩＴＥ　）　］ 上に押出すことによって被覆した。トレーサー染料としてフルオレジインナトリ ウム塩の５％溶液を用いた。試験する被覆試料を両面粘着テープによってガラス 板に取りつけ、次いでセレクトラソール（５ｅｌｅｃｔｒａｓｏｌ）Ｔ　Ｌ　Ｃ −ソルベント・セレクター・システム（ＳｏｌｖｅｎｔＳｅｌｅｃｔｏｒ　Ｓｙ ｓｔｅｍ　）　［シュライヘル・アンド・シェル・インコーホレーテッド（Ｓｃ ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｅｌｌ、　Ｉｎｃ、　）ニューハンプシャー州、 キーン所在］において試験が行われだ。トレーサー染料溶液を多孔心を通して湿 環境において各試験試料の中心に適用して、溶媒の早期蒸発を防止した。第２表 に、結果をまとめる。

ト直径 試料　被覆石　（マイクロ Ｎｏ、材料／透過体　■／ｆｔ　メートル）１　アガロース　２０００　８ ２　アガロース　１５００　８ ３　アガロース　１０００　８ ４　７７ｊＯ−ス／　１０００１５００　１３５　アガロース／　１０００／１ つ００　１１カルボワツクス ６　アガロース／　１０００／１０００　１０ポリスクロース 使用したカルボワックスは、分子ｆｆ１３０００〜３７．０００のフィッシャー ・サイエンティフィック・カンパニー、ニューシャーシー州、フェアヘイブン所 在のポリエチレングリコールであった。

ボリスクＯ−スはファーマコス・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｏｓ　 Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、スウェーデン、アップサラ所在）販売のフ ィニル（ＦＩＣＯＬＬ＞　４００であった。

第２表は、種々の透過体のアガロース層を通す拡散速度を増大する有効性を具体 的に説明する。

多孔性不透明層は、検出可能様を有する拡散抗体透過可能であり、しかも不透明 性を与えて、記録層における以外の検出可能様の検出のどのような可能性をも除 くことによって誤った読みを防止する。換言すれば、多孔性不透明層は、反応層 に保持された検出可能様の検出を防止する。例えば、蛍光検出技術種の場合に、 多孔性不透明層は蛍光放射線のｇＡ域、例えば可視領域の反射能を維持しながら 、励起放射線、例えば紫外ｉ領域において吸収する。従って、励起放射線は、結 合標識に達するのを有効に抑制するが、レジストレーション層からの放出放射線 は、吸収されるよりもむしろ反射される。多孔性不透明層は結合剤に適当な反射 性材料を含んでもよい。好ましくは、アガロース中の二酸化チタンは種々の被覆 發で被覆されて望まれる多孔度を与える。所望ならば多孔性不透明層は、また不 透明性および反射率を向上させる適当な添加剤をまた含有してもよい。

多くの顔料は、免疫グロブリンの非特異性吸収の高表面結合係数を有するので、 このような顔料を、顔料の表面に強く吸着されるが免疫試薬に対してそれ自体親 和性を有しない他の重合体を用いて前処理するのが望ましい。

下記の例は、望ましくない免疫グロブリンの粒状材料に対する結合を阻止する表 面処理の有効性を具体的に説明する。

鼓ユ 表面処理法 二酸化チタン（ＴｉＰｕｒｅ　Ｒ−９３１、イー・アイ・デュポン・デネモアス ・カンパニー、プラウエア州、ウイルミントン所在）１’ＯＯｇを写真グレード ゼラチン型９１６８［Ｊｌ／セロ−ｍｌ−ボレーション（ＲｏｕｓｓｅｌｏｔＣ ｏｒｐ、　）　、フランス、パリ所在］の１％溶液４００ｇと混合し、次いで４ ０℃において１時間撹拌した。この時間の終りに、二酸化チタンを低速遠心分離 によって分離した。過剰のゼラチンを除き、二酸化チタンを蒸留水に再懸濁し、 次いで遠心分離した。このゼラチン除去工程を３回繰り返した。

匠Ａ 五迩Ｊ口ＩＬ匙亙 例３の操作に従って処理された顔料（０，３ｇ）の試料を標識免疫グロブリン（ ＦＩＴＣ−抗ヒトアルブミン、アトランチツク・アンテイボディーズ・インコー ホレーテッド、メイン州スカーバロウ所在＞３．０ｇとともに１時間撹拌し、ホ スフェートで緩衝された生理的食塩水と１：９に希釈し、次いで水をもって全量 ６．８９ＳＦに希釈した。この混合物を、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ、）　Ｘ　Ｍ 　−３０００１１１フイルター（アミコン・インコーホレーテッド、マサチュー セッツ州ケンブリッジ所在）を有する限外ろ過セルに充てんし、次いで低速で数 分間遠心分離した。限外ろ過液１ｍをホスフェートで緩衝された生理的食塩水を もって１：９に希釈し、次いで蛍光読取り用に組み立てられたベックマン（Ｂｅ ｃｋｉａｎ　）　５８６４スペクトロホトメーター・フルオレッセンス・アクセ サリ−・１９６７７６型（ベックマン・インストルメンツ・インコーホレーテッ ド、カリフォルニア州フラートン所在）をもって蛍光強度を測定した。

対照試料は、試験試料と同じ希釈度の免疫グロブリン澄液であり、しかも試験試 料と同じく超遠心分離された。

第３表には、対照用に１００％に規格化された試料からの蛍光強度（Ｆｌ）測定 値を含む。

未処理Ｔ＋Ｏ□　４．４ 処理Ｔｉ０２（例３）　５４．４ 対照（免疫グロブリン溶液）　１００．００第３表は、免疫グロブリンの結合の 阻止における顔料処理の有効性を具体的に説明する。

レジストレーション層は、拡散してくる抗体を検出可能種で不動化することによ り濃縮するための位置として働く。検出手段は、この層中の検出可能種の量の測 定のために用いられる。抗体を非特異的に結合、不動化または「媒染」するに適 した材料は当業界において既知である。例えば、ジャーナル・オブ・ザ・レテイ キロエンドシ−’）　７７Ｌ／　−’／　サイエテイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　 ｔｈｅＲｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）第３巻、第 ２９頁〜４０頁（１９６６）を参照されたい。

抗体を不動化または媒染することが当業界において既知の材料の多くは、溶液中 において働くが、これらの材料は、アガロースのようなゲル化環境において不活 性化され、従って本発明において使用するにはその選択に特別の注意が必要と思 われる。

下記の非限定例は、標識免疫グロブリンの固定用のレジストレーション層におけ る非特異吸着特性の有効性を具体的に説明する。

例５ 下記の材料を不連続相として中に配合しているアガロースをゲル化環境として用 いることによって一連の被覆を製造した。界面活性剤、ｐ−ノニルフェノキシポ リグリシドール（オリン１０Ｇ）を被覆助剤として加えた。

被覆は、各被覆を、標識抗体溶液の因業された容量と正確に１０分接触させるこ とによって評価された。使用した抗体溶液は、例３に示したものと同じであった 。接触時間の終りに、被覆を蒸留水ですすぎ、次いで環境温度において風乾した 。蛍光（任意の相対単位）は、例４に記載と同じ技術によって測定した。

匙土五 １　アガロース／デンプン　１０００／　１０００　１．７２　アガロース／デ ンプン　１０００／　５００　３．６レンオキシド ３　アガロース／Ｔ　ｉ　Ｏ１０００／　５００　’　６．７４　アガロース／ 重合体Ａ　ｌ００Ｑ／１０００／１０００　８．３／ポリビニルピロリドン ５　アガロース／酸化アル　１０００／　５００　１３．３ミニウム 重合体Ａは、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）上に４−ビニルピリジン（ ４ＶＰ）および塩化ベンジルトリメチルアンモニウム（ＴＭＱ）の比率２．２Ｈ ＥＣ／２．２　４ＶＰ／ＩＴＭＱにおけるグラフトであった。

デンプンは、マリンクロット・インコーホレーテッド、ケンタラキー州パリス所 在によって販売されている可溶性デンプンであった。ポリエチレンオキシドは、 ユニオン・カーバイド・コーポレーション、ニューヨーク州ニューヨーク所在に よって商品名ポリＡツクス（ＰＯＬＹＯＸ）ＷＳＲ−Ｎ−８０の下に販売されて いるエマルジョンであった。二酸化チタンは、例３に記載のものと同じであった 。ポリビニルピロリドンは、ＧＡＦ・コーポレーション、ニューヨーク州、ニュ ーヨーク所在によって販売されている型ＮＰ−に１５であった。酸化アルミニウ ム（０，３マイクロメートル）はフラカ・ケミカル・カンパニー　（Ｆｌｕｋａ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ニューヨーク州１１ａｕｐｐａｕｇｅ所在によっ て販売された。

別法として、抗体は、レジストレーション層において予め被覆されて、媒染特性 を与えることができる。例えば、前記米国特許第４．２５８．ＯＯ’ｌ明細書を 参照されたい。しかしながら、これには、第４表に°記載のレジストレ・−ジョ ン層を用いることは必要ない。なぜならば、これらのレジストレーション層は、 抗体用の有効な媒染剤のみでなく、非特異性でもあるからである。すなわち、こ れらのレジストレーション層はその源にかかわらず実質的にすべての免疫グロブ リンＧに結合する。

本発明において使用される放射線透過性基材は、検出器および検出可能種によっ て放出された放射線透過性である。例えば、好ましい態様においては、検出器は 、励起放射線を放出し、そして検出可能種によって放出される蛍光を検出する。

放射線透過性基材として使用する適当なフィルム基材の例として、酢酸セルロー ス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートおよびポリスチレンのよう なポリビニル化合物のような材料を挙げることができる。接着を促進するために は、フィルム基材を下塗りするのが好ましい。

また、本発明の新規な分析要素には、フィルター層、れたい。例えば、）、イル タ一層は、分析を妨害する可能性のある微小分子および粒状物を除くためにスプ レッド層または反応層上に使用できる。また、タイミング層を設けて抗体と反応 層の接触と検出可能種を有する抗体の拡散との間の遅れを調節して、抗原が反応 層において抗体に結合する鍬会を有する前に抗体の拡散の結果としてのどのよう な誤った読みをも避けるのも望ましいであろう。またフィルター層を用いて、外 来物質がレジストレーション層に入るのを防止できる。

図面を参照して、第１図は本発明の好ましい要素の断面図である。要素１０は、 順に下記の層からなる。すなわち検体が適用されているスプレッド層１２；検出 可能種を有する抗体を含有する反応層１４；前記のようにタイミング層および（ または）フィルター層を含有してもよい中間層１６：検出可能種を有する拡散し てくる抗体のために濃縮または固定要素を含むレジストレーション層２０におけ る検出可能種から、反応層に残存している検出可能種を単離するに適した多孔性 不透明層１８：および要素１０の支持体として働き、しかも下記透過層をとおし て検出器がレジストレーション層２０中の検出可能種からの放出放射線を測定す る放射線透過性層２２から構成される。

第２図および第３図は、第１図の要素１０の動作を示す。検体を含有する試料流 体、この場合には、分析中の物質である抗原は、均一な予め定められた量を受容 しそして次いで反応層１４に拡散させるスプレッド層１２に適用される。抗原は 、層１４に配置された抗体の同様の１と会合して、実質的に非拡散の複合体を形 成する。試料液体の要素を通過して通常拡散することができる、抗原より過剰の 抗体は、中間層１６および多孔性不透明層１８中を拡散しそしてレジストレーシ ョン層中で不動化検出可能種の量がｔｉ１認される。

下記の非限定例は、本発明の要素の動作を具体的に説０．１％ヒト血清アルブミ ン（抗原）（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリ州セントルイス所在）１ ０ｄおよびフルオレジインイソチオシアナート（抗体）（アトランティック・ア ンテイボディーズ・インコーホレーテッド、メイン州スカーパロウ所在によって 販売）によって標識され、ホスフェートで緩衝された生理的食塩水中で１：５に 希釈された山羊抗ヒト血清アルブミンＩｇＧ画分１００＃ｌｉ！を試験中で混合 した。白っぽい沈殿が直ちに形成された。試験管の内容物をａ）アガロース１０ ００１１ｇ／ｆｔ２８よＵ分子ｍ３０００〜３７００（フィッシャー・ケミカル ・カンパニー、ニューシャーシー州、ファシラヮ所在）のポリエチレングリコー ル１０００■／［ｔ２を含む反応層、ｂ）ゼラチンをもって前処理された二酸化 チタン（イー・アイ・デュポン・デ・ネモアス・インコーホレーテッド、プラウ エア州つィルミントン所在によって商品名ＴｉＰｕｒｅＲ−９３３の下に販売＞ 　５２０＋ｙ／ｒｔ２およびアガロース５００η／ｌｔ２を含む放射線に実質的 に不透過性の多孔層、 Ｃ）アガロース１０００■／ｆｔ２およびポリエチレングリコール分子！４００ ０　１１００ＩＩｔ／ｒｔ２を’含＜ｒＬｚジストレー・ジョン層および ｄ）　３ミルの下塗りされたポリスチレン基材（ダウ・ケミカル・カンパニー、 ミシガン州ミツドランド所在）を含む要素上にスポットした。

２時間の吸収期間後、紫外線を、前記要素の基底およびヒト血清アルブミンが山 羊抗ヒト血清アルブミンを塗布されていない対照要素を通して照らした。対照の 場合、相当量の蛍光が検出され、フルオレセイン標識抗体の実質量がレジストレ ーション層に達したことを示したが、一方試験試料は著しく少ない蛍光を示し、 フルオレセイン標識抗体が抗原によって固定され、しかもレジストレーション層 に達しなかったことを示した。

前記の先行技術に示された速度論技術とは反対に、本発明は、終点技術を用いる 。本明細書において用いる「終点技術」の用語は、反応体が実質的に消耗される 若干の指定時間後に全ａが実質的に固定されている検出可能生成物を生じる化学 反応に基づく描写を示すように意図されている。終点技術は、検体の環境水準お よび試薬の化学＠論的量をもって作動し、しかも速度論技術よりも温度の変動に 本質的に敏感でない。

例えば、米国特許第３．９９２．１５８号、同第４．４２２，３３５号および同 第４，１４４．．３０６号明ｍｍに記載された置換放出開溝は、本質的に速度論 検定系である。なぜならば反応を測定可能の速度に促進するために試薬の大過剰 が必要だからである。速度論技術は、温度および時間に敏感であり、かつ速度定 数をめるために複雑な計装が必要である。

本発明の新規な方法および要素は本質的に一層速い反応時間を与える。なぜなら ば会合反応速度は、前記特許に用いられた置換放出に必要な前提条件である解離 よりも何桁も速いからである。

字九所、（Ａリ　イ邑　１１本 手続補正書 昭和６１年６月７２日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．検出可能種を含有し且つ検体の濃度の関数として前記検体により実質的に非 拡散性となるように適している拡散可能な試薬の所定量を保持する反応層；拡散 してくる試薬を受容するに適したレジストレーシヨン層；前記レジストレーシヨ ン層中の前記試薬を検出する手段および前記試薬層と前記レジストレーシヨン層 との検出可能種間の識別を与えるに適した、前記反応層と前記レジストレーシヨ ン層との間の絶縁層を含むことを特徴とする、検体を含有する液体の分析用多層 要素。
2. ２．試料スプレッド層を含む、請求の範囲第１項の要素。
3. ３．前記スプレッド層が、等方性非繊維状延展層である、請求の範囲第２項の要 素。
4. ４．前記スプレッド層が繊維状である、請求の範囲第２項の要素。
5. ５．前記検出可能種が蛍光物質である、請求の範囲第１項の要素。
6. ６．前記検出可能種が、放射性物質である、特許請求の範囲第１項の要素。
7. ７．前記絶縁層が、前記検出可能種からの放射線に対して不透過性である、請求 の範囲第１項の要素。
8. ８．試料スプレッド層： 拡散可能抗体（抗原）に結合された検出可能種を含む拡散可能抗体（抗原）を含 む反応層； 実質的に放射線不透過性の多孔層、 広量してくる前記抗体を受容し、しかも実質的に不動化するに適したレジストレ ーシヨン層および前記層を支持する放射線透過性基材を含むことを特徴とする、 抗原（抗体）を含有する液体の分析用多層分析要素。
9. ９．前記スプレッド層が、等方性非繊維状延展層である、請求の範囲第１項の要 素。
10. １０．前記スプレッド層が、繊維状である、請求の範囲第１項の要素。
11. １１．前記スプレッド層が布帛である、請求の範囲第１項の要素。
12. １２．首記反応層が、アガロースを含む、請求の範囲第２項の要素。
13. １３．前記多孔層が二酸化チタンを含む、請求の範囲第１項の要素。
14. １４．前記検出可能種が、蛍光物質である、請求の範囲第１項の要素。
15. １５．前記レジストレーシヨン層がアガロースを含む、請求の範囲第１項の要素 。
16. １６．前記レジストレーシヨン膚がラテツクスヒーズを含む、請求の範囲第１項 の要素。
17. １７．前記基材がポリスチレンである、請求の範囲第１項の要素。
18. １８．液体を、反応層およびレジストレーシヨン層を包含する多数の層を含む要 素に加え前記反応層は、検出可能種を含有する拡散可能試薬の所定量を含有し、 前記試薬は検体の濃度の関数として前記検体によつて非拡散性にされ、前記レジ ストレーシヨン層は、拡散してくる試薬を受容するに適し、そして前記レジスト レーシヨン層への試薬拡散の量を測定することを特徴とする、液体中の検体の分 析方法。