DE2718700A1 - Verfahren zur gesamtbestimmung von hormonen und pharmaka - Google Patents

Verfahren zur gesamtbestimmung von hormonen und pharmaka

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DE2718700A1 DE19772718700 DE2718700A DE2718700A1 DE 2718700 A1 DE2718700 A1 DE 2718700A1 DE 19772718700 DE19772718700 DE 19772718700 DE 2718700 A DE2718700 A DE 2718700A DE 2718700 A1 DE2718700 A1 DE 2718700A1
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Description

PATENTANWÄLTE DR. KADOR & DR. KLUNKER
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Patentanwälte Kador* Klunker Knoebeletr. 36 8 München 22 DR. ING. H. F. KLUNKER (DIPL. ING.) DR. RER. NAT. U. KADOR (DIPL CHEM.)
Knoebeletraue 36
D-8 München 22
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l!ns<-rZeichenr/Ourref.: K 1 1 707/ 3S Tag/Date
Dipl.-Chem. Dr. Hans A. Thoma
Giselastr. 3
München 40
Verfahren zur Gesamtbestimmung von Hormonen und
Pharmaka
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gesamtbestimmung von Hormonen und Pharmaka.
Es sind verschiedene Verfahren zur Gesamtbestinunung von Hormonen oder Pharmaka, die im menschlichen Serum teilweise an spezifische oder nicht-spezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen, bekannt. Die verhältnismäßig neuen radioimmunologischen Techniken haben zur genauen Hormonbestimmung wesentlich beigetragen.
Eine ausführliche Beschreibung des Radioimmunoassays findet sich beispielsweise in Clinical Chemistry Vol. 19 No. 2, 1973 Seite 145. In Clinical Chemistry Vol. 19 No. 12, 1973 Seite 1339 und Clinical Chemistry Vol. 21 No. 7, 1975, Seite 829 sind radioimmunologische Techniken beschrieben, bei denen ein in Gel eingeschlossener Antikörper verwendet wird. Der Einschluß des Antikörpers in Gel wird von den Autoren als vorteilhaft erachtet, weil dadurch Wechselwirkungen mit Molekülen hohen Molekulargewichts ausgeschaltet werden können. Diese bekannten Arbeitsweisen sind jedoch nicht auf die Gesamthormonbestimmung gerichtet. Die Gesamthormonbestimmung ist jedoch aus medizinischer Sicht wesentlich.
Verfahren zur Gesamtbestimmung von Hormonen durch enzymatische Hydrolyse der Bindungsproteine und mittels radioimmunologischer Techniken sind aus J. Clin. Endocrinol. Metab. 42, 189, 1976 und Clinical Chemistry Vol. 22 No. 11, 1976 Seite 1850 bekannt geworden. In diesen Artikeln wird ausgeführt, daß die enzymatische Spaltung gegenüber den bisher verwendeten Verfahren, wie beispielsweise Lösungsmittelextraktion oder Hitzedenaturierung, wesentliche Vorteile aufweist. Als Vorteile werden insbesondere genannt, daß die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und die chromato-
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graphische Reinigung der Proben entfällt, die Bestimmungszeit und die Kosten verringert werden, die Scintillationszählung in der Flüssigkeit entfällt, Spezifität und Genauigkeit erhöht werden, die Bestimmungsmethode automatisiert werden kann und insbesondere es sich um eine universell anwendbare Methode handelt.
Das zur Hydrolyse des Bindungsproteins verwendete Enzym greift jedoch auch den Antikörper, der im nächsten Arbeitsschritt eingesetzt wird, an und zerstört diesen. Aus diesem Grund muß das Enzym vor der Zugabe des Antikörpers desaktiviert werden. Die Inaktivierung der enzymatischen Aktivität ist auf verschiedene Weise möglich, beispielsweise kann das Enzym durch wesentliche Änderung des pH-Wertes oder durch Hitzeeinwirkung denaturiert werden.
Diese Denaturierungsstufe ist jedoch äußerst nachteilig. Sie erfordert entweder den Einsatz von zusätzlichen Chemikalien, wodurch weitere Störfaktoren in das System eingebracht werden oder benötigt bei der Hitzedenaturierung lange Zeit. Die Hitzeeinwirkung muß etwa 5 min betragen, die Abkühlzeit beträgt etwa 15 min. Diese Denaturierungsstufe ist folglich ein wesentliches Hindernis zur Automatisierung der Bestimmung. Ferner ist je nach verwendetem System, insbesondere dem eingesetzten Enzym, eine andersartige Denaturierung erforderlich, was der allgemeinen Anwendbarkeit der bekannten Bestimmungsmethode und deren Automatisation entgegensteht.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Gesamtbestimmung von Hormonen und Pharmaka, bei dem eine Denaturierungsstufe nicht erforderlich ist, wodurch eine uni-
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verseile Anwendbarkeit der Bestinunungsmethode erreicht wird, die Bestimmungszeit und der Bestimmungsaufwand verringert werden, und eine Automatisierung der Bestimmung ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch ein Verfahren zur Gesamtbestimmung von teilweise an spezifische oder nichtspezifische Bindungsproteine gebundene Hormone oder Pharmaka durch enzymatische Hydrolyse der Bindungsproteine, Reaktion der Hormone oder Pharmaka mit einem Antikörper und radioimmunologische Bestimmung der Hormone oder Pharmaka gelöst, das durch die Verwendung von immobilisierten Antikörpern gekennzeichnet ist.
Vorzugsweise wird der Antikörper in einem Polymergel eingeschlossen. Als Polymergel kommen insbesondere Acrylamidpolymere und Acrylamidcopolymere in Betracht.
Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von immobilisierten Antikörpern sind diese vor dem Enzym geschützt. Die Antikörper sind in der Polymermatrix eingeschlossen, in die das Enzym aufgrund seiner Größe nicht einzudringen vermag. Durch diese einfache und elegante Maßnahme kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auf die Denaturierungsstufe des Enzyms verzichtet werden. Das Verfahren gestaltet sich somit als wesentlich weniger arbeits- und zeitintensiv. Das Verfahren ist universell auf verschiedene Systeme anwendbar, da die spezifische Enzymdenaturierung entfällt. Von besonderer Bedeutung ist das erfindungsgemäße Verfahren in Richtung auf die Automatisierung der Bestimmung.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Bestimmung der verschiedensten Hormone und Pharmaka, die im Serum oder
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oder Plasma zum Teil an spezifische oder nicht-spezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen. In Betracht kommen die Schilddrüsenhormone, insbesondere Thyroxin und Trijodthyronin, die Steroidhormone, wie Cortisol, Testosteron, Progesteron, östron, östradiol und östriol und die Herzglycoside, wie Digitoxin und Digoxin. Ferner können bestimmt werden Vitamine, besonders Vitamin B12 und Folsäure, sowie Pharmaka mit starker Proteinbindung, wie beispielsweise Antikoagulantien, Dicumarol, Anaigetika und Salyzilate.
Zur Durchführung der Bestimmung wird das das Hormon oder Pharmaka enthaltende Serum oder Plasma mit einer Lösung eines Enzyms in Kontakt gebracht, das das Bindungsprotein hydrolytisch spaltet. Die Auswahl des Enzyms richtet sich nach dem spezifischen Bindungsprotein. In Betracht kommen je nach System beispielsweise folgende Enzyme: Aminopeptidase, Bromelin, Carboxypeptidase, Chymotrypsin, Elastase, Ficin, Leucinaminopeptidase, Lipase, Pankreatin, Papin, Pepsin, Pronase, Protease, Proteinase, Thermolysin und Trypsin. Zur Bestimmung von Hormonen wie Thyroxin und Cortisol eignen sich besonders proteolytische Enzyme, wie Proteinase, Pronase oder Pepsin.
Die Reaktion der Probe mit der enzymatischen Lösung kann thermostatisiert bei Temperaturen um 350C oder bei Zimmertemperatur ablaufen. Die benötigte Zeitdauer für die enzymatische Hydrolyse des Proteins ist abhängig von dem verwendeten Enzym und liegt zwischen 15 min und 4h, in vielen Fällen zwischen 15 und 30 min.
Nach der Totalhydrolyse des Proteins wird die Probe mit markiertem Indikatorhapten versetzt und auf den immobilisierten Antikörper aufgegeben.
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Die Aufgabe erfolgt mit Hilfe einer Mehrkanalkolbenpumpe. Bei Rückwärtslauf der Pumpe wird das Reaktionsgemisch quantitativ in Säulchen gesaugt, in denen sich der immobilisierte Antikörper befindet.
Ein anschliessendes Pausenintervall wird zur Reaktion der markierten und nicht-markierten, zu bestimmenden Substanz mit dem immobilisierten Antikörper vorgesehen.
Eine abschliessende Elution mit Wasser oder Pufferlösung ergibt die Trennung von an den Antikörper gebundenem und freiem Hapten.
Die im Eluat bzw. im Säulchen verbleibende Radioaktivität ist ein Maß für die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen.
Das radioimmunologische Prinzip ist beispielsweise aus D.S. Skelley et al, Clinical Chemistry, Band 19, Nr. 2 1973, Seiten 146 ff. bekannt.
Gegebenenfalls kommen auch alternative Bestimmungsmethoden, wie die fluoroimmunologische Bestimmung oder die Bestimmung mittels enzymatischer Markierung, in Betracht.
Die Synthese der Antigene, die Gewinnung von Antiseren, beispielsweise durch Immunisierung von Kaninchen, und die Isolierung sowie Immobilisierung der Antikörper sind bekannt (vgl. beispielsweise D.S. Skelley et al, Clinical Chemistry, Band 19, Nr. 2, 1973, Seiten 146 ff.).
Die Herstellung des immobilisierten Antikörpers erfolgt beispielsweise indem eine Lösung des Antikörpers einem
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Monomergemisch zugegeben wird. Der Ansatz wird radikalisch polymerisiert und das erhaltene Polymerisat zerkleinert, gewaschen und getrocknet. Als Monomer eignet sich insbesondere Acrylamid. Durch Copolymerisation des Acrylamids mit Acrylderivaten mit verschiedenen funktioneilen Gruppen, wie beispielsweise Acrylsäure, Methacrylsäure und Methacrylamid, können jedoch vorteilhafte Variationen der Matrix erzielt werden. Durch den Zusatz von Copolymeren kann insbesondere die Hydrophobizität und die Ladung der Matrix beeinflußt werden und dadurch die Reaktion des Antikörpers mit dem zu bestimmenden Hormon oder Pharmaka beeinflußt werden.
Zur Erzielung einer geeigneten Porengröße der Polymermatrix wird die Monomerkonzentration variiert. Eine Monomerkonzentration im Bereich von etwa 20 % führt zu einer Porengröße von etwa 7 bis 10 Ä.
Vorteilhaft ist auch die Verwendung einer ionenausgetauschten Polymermatrix. Die durch Ionenaustausch erzielbare Pufferwirkung kann dazu verwendet werden, die pH-Werte in der zu bestimmenden Probe zu verändern.
Ein vorteilhaftes System ist beispielsweise ein Copolymerisat von Acrylamid und 20 bis 60 % Acrylsäure und/oder Methacrylsäure, hergestellt aus einer etwa 20 %igen Monomerlösung, bei dem zumindest ein Teil der Säuregruppen in die entsprechenden Alkali- oder Erdalkalisalze überführt sind.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert.
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- 9 Beispiel 1 Bestimmung von Thyroxin durch enzymatische Hydrolyse mit Pronase
Die Antigensynthese erfolgte ausgehend von Thyroxinäthylester und Kupplung an Albumin mittels Carbodiimid. Die Antikörperproduktion erfolgte durch Immunisierung von Kaninchen.
Der Antikörper wurde danach im Polymergel eingeschlossen. Es wurde Acrylamidmonomer einer Konzentration von 2,9 Mol/l verwendet. Für einen Ansatz wurden 5 g Acrylamid und 1,25 g N,N1-Methylenbisacrylamid im Becherglas in 24 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 gelöst. Nach Zumischen des Antiserums in 1 ml Phosphatpuffer wurde die Reaktion mit 0,15 mg Riboflavin und 0,10 ml N,N,N1,N1-Tetramethyläthylendiamin gestartet und mit UV-Licht bestrahlt. Während der Bestrahlungszeit von 45 min wurde die Temperatur unter 500C gehalten. Der Gelblock wurde anschließend zerkleinert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Die Herstellung des Nullserums erfolgte, indem 1 ml Serum und eine Pronaselösung einer Konzentration von 2 mg/ml 30 min bei 35°C reagieren gelassen wurden. Anschließend wurden 2 g Ionenaustauschharz (Amberlite 400) zugegeben.
Anschließend wurden 50 μΐ Nullserum mit einem Gehalt von 18 ng Thyroxin je 100 ml mit 350 ul Enzymlösuhg einer Konzentration von 2 mg je ml 30 min bei einer Temperatur von
- 10 -
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- 10 35 0C umgesetzt.
Zu 100 μΐ dieser Lösung wurden nun 700 μΐ Tracerlösung mit einem Gehalt von 5,2 ng/ml radioaktiv markiertem Thyroxin und 50 μΐ Pufferlösung eines pH-Wertes von 7,2 zugegeben. 350 μΐ der vorgenannten Lösung wurden auf 60 mg des Antikörpergels aufgebracht. Die Inkubationszeit betrug 30 min, die Temperatur 220C. Anschließend wurde 5 min bei einer Pumpgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert.
Eine Dosiswirkungskurve für Thyoxin wurde mittels Thyroxinlösungen mit Konzentrationen von 5 ng, 10 ng, 20 ng und 50 ng je 100 ml aufgestellt. Diese Lösungen wurden mit 350 μΐ Enzymlösung (Konzentration 2 mg/ml) 30 min bei einer Temperatur von 350C umgesetzt.
Zu 100 μΐ dieser Lösung wurden 700 μΐ Tracerlösung (5,2 ng/ml) und anstatt des Puffers 50 μΐ Nullserum zugesetzt.
Die Auswertung zeigte eine Wiederfindung von 99%.
Beispiel 2
Gesamtbestimmung von Thyroxin durch enzymatische Hydrolyse mit Proteinase
Es wurde gemäß der Arbeitsweise des Beispiels 1 verfahren, wobei jedoch anstelle der Pronaselösung eine Proteinase- lösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml eingesetzt wurde.
Das verwendete Serum bestand aus einem Nullserum mit einem Gehalt von 6 mg je 100 ml.
Die Wiederfindung betrug 98,5 %.
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- 11 Beispiel 3
Gesamtbestimmung von Cortisol durch enzymatische Hydrolyse mit Pronase
Es wurde gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise verfahren, wobei jedoch ein Serum eingesetzt wurde, das einen Gehalt von 18 ug Cortisol je 100 ml aufwies. Als Tracerlösung wurde eine Lösung von radioaktiv markiertem Cortisol einer Konzentration von 0,15 ng/ml eingesetzt.
Die Wiederfindung betrug 97 %.
Beispiel 4
Gesamtbestimmung von Cortisol durch enzymatische Hydrolyse mittels Proteinase
Es wurde entsprechend der in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise verfahren, wobei jedoch das Serum 6 ng Cortisol je 100 ml enthielt und mit einer Proteinaselösung einer Konzentration von 2 mg/ml gearbeitet wurde. Die Wiederfindung betrug 98%.
Der bei den Beispielen 3 und 4 eingesetzte Antikörper wurde durch Synthese von Cortisol-C3-0xim und Kupplung an Albumin mit gemischtem Anhydrid und Antikörperproduktion durch Immunisierung von Kaninchen erhalten.
- 12 -
80984W03 3
- 12 Beispiel 5
Gesamtbestinunung von Thyroxin durch enzymatische Hydrolyse mit Pepsin
Es wurde gemäß der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 verfahren.
10 μΐ Serum mit einem Gehalt von 18 ug Thyroxin je 100 ml wurden mit 160 μΐ einer Enzymlösung versetzt, die aus 2 mg/ml Pepsin gelöst in 0,1 η Salzsäure bestand.
Die Reaktion mit dem Enzym wurde bei Raumtemperatur 30 min durchgeführt.
Zu diesen 170 μΐ wurden anschließend 150 μΐ Tracerlösung mit einem Gehalt von 5,2 ng/ml radioaktiv markiertem Thyroxin zugegeben.
Die gesamte Lösung wurde danach auf 60 mg Antikörpergel aufgebracht.
Die Polymermatrix des Antikörpergels bestand aus einem Copolymerisat aus Acrylamid und 40 Mol% des Natriumsalzes der Methacrylsäure, hergestellt aus einer 20 %igen Monomerlösung.
Die Inkubationszeit betrug 30 min, die Temperatur 220C.
Anschließend wurde 5 min bei einer Pumpgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert.
Die Auswertung zeigte eine Wiederfindung von 98 %.
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Claims (3)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur Gesamtbestimmung von teilweise an spezifische oder nicht-spezifische Bindungsproteine gebundene Hormone oder Pharmaka durch enzymatische Hydrolyse der Bindungsproteine, Reaktion der Hormone oder Pharmaka mit einem Antikörper und radioimmunologischer Bestimmung der Hormone oder Pharmaka, gekennzeichnet durch die Verwendung von immobilisierten Antikörpern.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß in einem Polymergel eingeschlossene Antikörper verwendet werden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß in einem Acrylamidpolymer oder Acrylamidcopolymer eingeschlossene Antikörper verwendet werden.
    8098 /»4/033 9
    ORIGINAL INSPECTED
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