DE2600465C3 - Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von Östrogenen - Google Patents
Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von ÖstrogenenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von östrogenen in einer
biologischen Flüssigkeit gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
In »Pharmazie heute«. November 1974. S. 205-208 und «Immunologie Methods in Steroid Determination«,
herausgegeben von F. G. Peron und B. V. Caldwell, New York 1970. S. 161 —166 sind radioimmunclogische
Bestimmungsverfahren für Östrogene beschrieben, bei denen als markierte Komponente ein Konjugat aus dem
betreffenden östrogen und einer durch radioaktives Jod markierten Substanz, insbesondere einem markierten
Protein, verwendet werden. Diese Konjugate sind mühsam herzustellen. Insbesondere ist die Bindung von
Steroiden an vorher jodiertes Histamin nur in sehr geringem Maßstab möglich und sehr schwierig durchzuführen.
Darüber hinaus ist die Lebensdauer der jodierten Steroid-Protein-Konjugate sehr gering und
beträgt z. B. nur 1 bis 2 Wochen. Außerdem sind diese Konjugate häufig immunologisch nur noch wenig
reaktionsfähig.
Bei einem weiteren bekannten Verfahren wird zur
Überwindung der obenerwähnten Schwierigkeiten Tritium anstelle von radioaktivem Jod zur Markierung
verwendet. Östriol liegt in Körperflüssigkeiten in Form eines Gemisches der nicht-konjugierten Form mit
Konjugaten vor. von denen die wichtigsten Östriol-3-hemisulfat,
östriol-16-glucuronid und östriol- j-hemisulfat-16-gluciironid
sind. Da es im allgemeinen erwünscht ist, das gesamte Östriol zu bestimmen und nicht nur das
freie, umfaßt das bekannte radioimmunologische B°- stimmungsverfahren folgende Stufen
a) Saure Hydrolyse der biologischen Flüssigkeit zur Aufspaltung der östriolkonjugate
b) Extraktion des gesamten (freien) Östriols in ein organisches Lösungsmittel und chromatographische
Reinigung.
c) Sättigungsanalyse des Östriols nach Entfernung des organischen Lösungsmittels, mit Hilfe eines mit
Tritium markierten östrenderivates, das mit dem östriol um die Reaktion mit dem spezifischen
Reagenz konkurrieren soll.
Dieses Verfahren besitzt zwei hauptsächliche Nachteile. Erstens ist Tritium ein ^-Strahler und wesentlich
schwieriger nachzuweisen und zu messen als ein y-Strahler wie J-125. Zweitens ist die Extraktion mit
organischen Lösungsmitteln und Chromatographie eine mühsame und zeitraubende Operation, die nicht in
Betracht kommt, wenn mehr als einige wenige Proben bestimmt werden sollen. Aufgrund dieser Nachteile
wird Östriol in Krankenhäusern nicht durch Sättigungsanalyse bestimmt, sondern durch den Kober-Farb-Test.
bei dem es ungünstigerweise erforderlich ist, den Urin des Patienten über einen Zeitraum von 24 Stunden zu
sammeln.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von
östrogenen zu entwickeln, bei dem eine markierte Substanz angewandt wird, die leicht nachzuweisen,
einfach herzustellen und über längere Zeit stabil ist sowie eine gute immunologische Reaktionsfähigkeit
besitzt.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 dadurch gelöst, daß man
als Radio-Jod-Derivat 2-Jod-, 4-Jod- und/oder 2,4-Dijod-Derivate eines östrogens verwendet.
In verschiedenen Vorveröffentlichungen wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß eine derartige
Markierung des Steroidkerns nicht möglich ist bzw. ein solches Produkt nicht für immunologische Bestimmungen
angewandt werden kann, da das Steroid durch Kernsubstitution mit dem im Verhältnis zum Steroidkern
außerordentlich großen Jodatom seine immunologische Reaktionsfähigkeit verlieren würde (s. zum
Beispiel Immunological Methods in Steroid Determination a.a.O: P. W. Nars und W. M. Hunter. Journal of
Endocrinology S. 1 Zeilen 2—4; A. PaIa, M. Ermine und G. Benagiano, Journal of Steroid Biochemistry. 1974, Bd.
5, Nr. 4, S. 306-307 und S. L. Jeffcoate. Pathologie Biologie 1975, Bd. 23, Nr. 10, S. 903-905).
Überraschenderweise hat es sich iun gezeigt, daß ein
derartiger Reaktivitätsverlust nicht auftritt, sondern daß im Gegenteil die radioaktiv jodierten Östrogenderivate
eine hohe immunologische Reaktionsfähigkeit besitzen, eine wesentlich bessere Stabilität als die Konjugate mit
markierten Proteinen (bis zu etwa 6 Monaten verglichen mit 1 bis 2 Wochen für die Steroid-Protein-Konjugate)
und daß sie eine radioimmunologische Bestimmung von Östrogenen auf einfache und zuverlässige und gut
reproduzierbare Weise ermöglichen.
östrogene, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden können sind
Östriol (Ej)
Östron (Ei)
östradiol (E2)
Östetrol (E4)
und deren Derivate/. B. das 16-Glucuronid-Derivat.
Bei den erfindungsgemäß anzuwendenden 2-Jod-, 4-Jod- und 2,4-Di-jod-Derivaten der Östrogene liegt ein
hoher Anteil des Jods als radioaktives Jod-Isotop J-131
oder insbesondere J-125 vor.
Diese Verbindungen können durch bekannte Reaktionen hergestellt werden. Die Östrogene können direkt
jodiert werden mit Hilfe von J-125 und Chloramin-T
ohne daß sie vorher mit einer anderen Substanz ein Konjugat bilden müssen. So werden z. B. Na · J-125 und
Chloramin-T in äthanolischer Lösung zu dem östrogen zugegeben und vermischt. Nach Zugabe von Natriummetabisulfit
wird das jodierte östrogenderivat in ein organisches Lösungsmittel extrahiert und chromatographisch
gereinigt.
Es ist bevorzugt, daß konjugiertes östrogen z. B.
östriol, in biologischen Flüssigkeiten durch Hydrolyse mit Hufe von Enzymen hydrolysiert wird anstatt mit
Säure. Die enzymatische Hydrolyse von östriolkonjugaten ist bekannt und die beiden erforderlichen Enzyme,
Glucuronidase und Arylsulfatase sind beide im Handel erhältlich. Ein großer Vorteil der enzymatischen
Hydrolyse gegenüber der Säurehydrolyse besteht darin,
daß das Hydrolysat für die Bestimmung verwendet werden kann ohne daß eine Lösungsmittelextraktion
des östrogens erforderlich ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
A) Jodierung von östriol
A) Jodierung von östriol
Chloramin-T (0,5 mg in 100 μΐ V/asser) wurde unter
Rühren zu einem Gemisch vun Östr.jl (50 μg in 400 μΐ
Äthanol) und Na125J (lOmCi in 100 μΙ verdünntem
NaOH zugegeben und das Gemisch w itere 5 Minuten
gerührt. Dj; ^ wurde Natrium-metabisulfit (1,2 mg in
500 ilI WoLSS.-.r) zugegeben und das Gemisch 5 Minuten
gerührt bevor 1 ml 0,1 mHCI zugegeben wurde. Das Gemisch wurde dann mit 1 ml Chloroform heftig
gerührt. Die wäßrige Schicht wurde von dem organischen Lösungsmittel abgetrennt und erneut mit einem
weiteren ml Chloroform extrahiert. Die zusammengegebenen Chloroformauszüge wurden unter einem
Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft und der Rückstand erneut in 50 μΐ Äthanol gelöst. Die
Äthanollösung des 125-J-markierlen Östriolderivats
wurde durch Chromatographie gereinigt und das Produkt mit Phospha.puffer, enthaltend Pferdeserum
(10%), Natriumazid (1 mg/ml) und Gelatine (1 mg/ml), verdünnt vor der Anwendung für die radioimmunologische
Bestimmung.
Östron, östradiol, östetrol und östriol-16-(|9-D-glucuronid)
wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren jodiert. Man erhielt folgende Ergebnisse
Oslrogen
Östron
Östradiol
Östetrol
Ö:>rriol-16-(/;-D-glucuronid)
55.3
44,6
87,8
17,9
44,6
87,8
17,9
B) Radioimmunologische Bestimmung von östriol
Proben von 50 μΐ Standardlösungen von Östriol in
Pferdeserum oder die unbekannten Humanserumproben wurden ii; Plastikröhrchen gegeben. Zu jeden
Röhrchen wurder 200 μΙ einer Enzymlösung (extrahiert von der Schnecke Helix pomatia) in Natriumacetatpuffer.
pH 5, gegeben und der Inhalt der Röhrchen kurz vermischt. Die Röhrchen wurden dann mit Stopfen
verschlossen und in eimern Wasserbad von 37° C zwei Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden zur
Wiederholung 50 μ! Proben von dem hydrolysierten Serum entnommen und in Plastikröhrchen gegeben. Zu
jedem Röhrchen wurden dann 200 μΙ Phosphatpuffer, enthaltend 10% Pferdeserum, Natriumazid (1 mg/ml),
Gelatine (1 mg/ml) und das, wie oben beschrieben, mit 125J-markierte Östriolderivat (ungefähr 0,3 μΟ/ηιΙ)
gegeben. Volumina von 200 μΙ des Phosphatpuffers,
enthaltend Pferdeserum, Natriumazid und Gelatine und eine Verdünnung von Antiserum, das gebildet worden
war gegen östriol, das mit Albumin konjugiert war, wurden in jedes Röhrchen gegeben und der Inhalt der
Röhrchen vermischt. Die Röhrchen wurden ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und
500 μΙ einer Ammoniumsulfatlösung (5,4 g in 10 ml Wasser) in jedes Röhrchen gegeben. Nach dem
Vermischen wurden die Röhrchen zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit abgesaugt und die Niederschläge
in den Röhrchen mit Hilfe eines y-Zählers untersucht.
Standard- | Kurven | % gebunden Vergl. |
50ngH·, | lOOngl:, | 200ngE, | 35OngI·, | SOOngtii |
Antiscrum | Gesamtinipulse pro 100 s |
68.2 69.8 |
57.2 55.2 |
47.3 47,3 |
32,6 33.0 |
23,0 21,4 |
17,5 17,3 |
A B |
111,169 111,169 |
||||||
Beispiel 2
Radioimmunoiogische Bestimmung von Östron
östron wurde mii Hilfe des in Beispiel I beschriebenen
Verfahrens bestimmt, wobei jedoch das Antiserum gebildc worden war durch Immunisierung mit (a)
österon-6-carbomethoxy-oxim-thyroglobulin (Miies-Yeda)
und (b) einem Östron-Derivat das in 6-Steliung gekuppelt war (The John Radcliffe Hospital, Oxford).
Standard-Kurven
26 OO
Anliseiuni | Verdünnung des Aniiserunis |
Ges:muimpMlse |)ΓΟ KjIi > |
Aller dei Markierung |
-.L lit.. ■ . . Vergl. |
lug Ö^irrun |
Miles-Yeda J. Radcliffe I Iosp. |
wie geliefert 1/32 000 |
iü 700 19 300 |
23 Tage 30 Tage |
40,1 44,7 |
r.'.-1 11J |
Beispiel 3 Radioimmunologische Bestimmung von östradiol
östradiol wurde mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei jedoch das r,
angewandte Antiserum gebildet worden war durch Immunisieren mit
Standard-Kurven
(a) östradiol-6-carbomethoxyoxim-BSA (Miles-Yeda) und
(b) einem Östradiol-Derivat das in 6-Stellung gekuppelt
war (The John Radcliffe Hospital, Oxford).
Aniiserum
Verdünnung des
Antiserums
Antiserums
Gesamtimpulse
pro 100 s
pro 100 s
Alter der
Markierung
Markierung
% gebunden
Vergl.
Vergl.
!npE-
2ngE2
Miles-Yeda | wie gelieren | 8 !00 | 23 Tage | 26,9 | 4,0 | - |
J. Radclifre | 1/3200 | 14 000 | 30 Tage | 51,5 | 3,0 | 0,5 |
J. Radcliffe | 1/640 | 140 000 | 31 Tage | 79,6 | 32,7 | 13,1 |
Beispiel 4 Radioimmunologische Bestimmung von Östetrol
östetrol wurde mit Hilfe des in Beispiel 1 Immunisierung mit östriol-6-carbomethoxyoxim-BSA
beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei ein Antise- η als spezifisches Reagenz, da ein Antiserum zu Östetrol
rum verwendet wurde, das gebildet worden war durch nicht verfügbar war.
Standard-Kurven: Gesamtimpulse 132 800 pro 100 s (Alter der Markierung 7 Tage)
Antiserum Verdünnung % Bindung % Bindung in des Anti- Vergleich Gegenwart von
serums 20ngE4
A
B
B
1/100
1/100
1/100
58,5 48,7
11,0
Beispiel 5 Analyseneinheit zur radioimmunologischen Bestimmung von Östriol (E3)
Die Ainalysenpackung umfaßt folgendes:
a) 5 Ampullen mit gefriergetrocknetem E3 in Pferdeserum,
das beim Rekonstituieren Standardlösungen der folgenden ungefähren Konzentrationen ergibt:
0,30,80,200 und 400 ng/ml.
b) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 13 ml einer Lösung
von J-E3 in Phosphatpuffer (0,3 μ Ci/ml).
c) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 6,5 ml Enzymlösung zur Hydrolyse von Östriolkonjugaten.
d) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 13 ml einer Lösung eines Anti-Östriolserums.
t) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 16 g Ammoniumsulfat
(fest).
f) 30 Polystyrol-Röhrchen 55 χ 12 mti (Fassungsvermögen
ungefähr 5 ml) zur Verwendung bei der Enzymhydrolyse,
g) 1 Reagenzglasständer aus Polystyrol,
h) Anleitung zur Durchführung des Verfahrens nach Beispiel 1.
Claims (6)
1. Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von östrogenen in einer biologischen
Flüssigkeit, durch Konkurrenzreaktion zwischen dem Ostrogen und einem Radio-Jod-Derivat davon
um ein spezifisches Binde-Reagens für das östrogen; Abtrennung des gebundenen Östrogens und Radio-Jod-Östrogens
von dem nicht-gebundenen östrogen und Radio-Jod-Östrogen und Messung der gebundenen
und/oder ungebundenen Fraktionen, d a durch gekennzeichnet, daß man als Radio-Jod-Derivat
2-Jod-, 4-Jod- und/oder 2,4-Di-jod-Derivate eines östrogens verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Durchführung der Konkurrenzreaktion
in der Probe vorhandene konjugierte Östrogene hydrolisierL
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse enzymatisch
durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Binde-Reagens
einen Antikörper für das nachzuweisende östrogen verwendet
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Binde-Reagens
einen gegen östrogen-6-carboxymethylo\im-BSA
gerichteten Antikörper verwendet.
6. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5 zur Bestimmung von östriol.
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