JP2523171B2 - 免疫測定方法及びそれに用いる試薬キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、溶液中での抗原抗体反応を利用して免疫学
的に物質の量を測定するに際し、特異的反応を低下させ
ることなく、非特異的反応を低下させる免疫測定方法と
それに用いる試薬キットに関する。

背景技術 抗体を用いた免疫測定法は、その特異性の高さや感度
の高さから広く用いられている方法であり、1975年モノ
クローナル抗体の発見とともに、ますます発展が期待さ
れる。

この免疫測定法の検出手段に関しても、従来放射性物
質（I¹²⁵）が用いられていたが、近年、酸素、蛍光物質
などが用いられるようになり、放射性物質の使用のため
の使用者の特殊な訓練が不要になったことも、この免疫
測定法の発展に拍車がかかった要因の１つであろう。

さて、この免疫測定法が高感度であるためには、抗原
−抗体反応のみに由来する特異的な反応は高く、それ以
外の非特異的反応は極力低いことが、必須条件である。

この非特異的反応をおさえることが高感度免疫測定法
を完成するための重要な技術的ポイントである。それゆ
えに従来から種々の試みが行われている。その手段とし
て最も広く行われている手段は、免疫反応系に非特異的
反応を抑えるための添加剤を添加することであり、その
手段は大きく２つに分かれる。第１の方法は非タンパク
性の物質である界面活性剤等を用いるものであり、第２
の方法は、体液ないしはタンパク溶液を用いるものであ
る。第１の方法の例として、特開昭57−182169号公報に
おいては、免疫反応を行なう反応媒体に可溶なポリアニ
オンを用い、また特開昭58−187862号公報においては、
非イオン界面活性剤を用いて非特異的吸着除去を工夫し
ている。一方、第２の方法として、特開昭59−25184号
公報では疎水性蛋白の0.1％以上を塩類の存在下に用い
ることを特徴とするものや、特開昭61−65162号公報の
ようなマウス腹水等を用いることにより、非特異性吸着
の低減を見ている。

しかしながら、前記した従来の方法はそれぞれ欠点を
有しており決定的な非特異的吸着除去法になりえないの
が現状である。

すなわち第１の方法はしばしば特異的な反応も妨げて
しまい、結果として、低感度の測定系を導くことにな
る。また第２の方法として、疎水性蛋白の使用をあげて
いるが、本発明者らの検討によれば疎水性は非特異的吸
着除去にほとんど全く影響を及ぼさなかった。

また第２の方法としてマウスの腹水を用いた場合に
は、腹水の成分の再現性に問題があることや、この成分
によって特異的反応が低減し、免疫測定法本来の目的に
反するところとなる。

一方、免疫反応を上記の溶液でなく、ニトロセルロー
スなどのメンブレインの上で行う反応も、抗原をメンブ
レイン上で濃縮することによって高感度化を達成しうる
という期待感も手伝い、好んで近年用いられるようにな
った。Brianらは、J.Biochem.Biophys.Methods 12,271
〜279（1986）に、スキムミルクの10％懸濁液を用いて
メンブレインをブロッキングすることにより、飛躍的な
非特異反応の低下を見たことを報告している。

このような固相上の反応ブロッキング剤として、Ahma
dらも、スキムミルクを用いており、彼らはJ.Clin.Micr
obiol.23,3,563〜567（1986）の中で５％のスキムミル
ク溶液を用いpseudorabies virusの抗原を固定したニト
ロセルロースメンブレインをブロッキングすることによ
り、患者血清中の抗pseudorabies virus抗体を測定して
いる。

しかしながら、５％〜10％のスキムミルク懸濁液をブ
ロッキング剤として用いると、Brianらもその報告の中
で述べているように、特異的な反応をも大幅に低下させ
てしまい、前述の免疫測定方法が高感度であるための２
つの必須条件のうち、一方（抗原抗体反応に由来する特
異的な反応は高いこと）が欠如してしまい高感度測定が
達成できないことになる。

その特異反応が妨害される理由としては、スキムミル
クは、かかる濃度では水に不溶であり、その懸濁液を用
いてブロッキングするため、ミクロ的に見れば、スキム
ミルクの大きな不溶物が抗原をおおうため、抗体が近づ
けなくなり、結果として抗原抗体反応が大きく阻害され
ることになる。

従来のブロッキング剤としてのスキムミルクの利用
は、ほとんど上記の固相の免疫反応を利用したものであ
り、溶液状態における免疫反応を利用したものではな
い。

従来、スキムミルクを溶液状態における免疫反応の添
加剤として用いた報告は、１つを除いてない。その１つ
とは、KurokiらがPedialr.Res.19.1017（1985）の中で
２％のスキムミルク懸濁液を用い、羊水中の肺−サーフ
ァクタントアポプロテインの測定を行うに際し、添加剤
として２％のスキムミルクを用いている。しかしなが
ら、このような方法での利用は２つの大きな問題点があ
る。その問題点とは、第１に、スキムミルクが懸濁液で
あるため前述の理由により、特異的な免疫反応をおさえ
てしまうこと、そして第２として、非特異的反応を抑え
るのに必要な濃度である２％のスキムミルク懸濁液を使
用すると、冷蔵庫の保存により、２〜３週後に沈澱が生
じ、この沈澱はどのように再溶解を試みても不可能であ
り、非特異的反応の抑制効果も消失してしまう。すなわ
ち、調製後すぐに使用しなければ、非特異的反応の抑制
のための役割を果しえず、試薬として、まったく不十分
のものと言わざるをえない。

発明の開示 従って、本発明は前記した従来技術の問題点を排除
し、溶液中における抗原−抗体反応を利用した免疫測定
を行なう際に、特異的反応を実質的に低下させることな
く、非特異的反応を抑えることによって免疫測定反応を
高感度で測定することのできる免疫測定方法及びそれに
用いる試薬キットを提供することを目的とする。

本発明のその他の目的及び有利な点は以下の記載から
明らかな通りである。

本発明に従えば、溶液中における抗原−抗体反応を利
用して免疫測定を行なうに際し、免疫反応溶液に平均分
子量が1.6〜5.0万で等電点が1.0〜5.0であるタンパク質
又はそれを含む混合物を完全溶解状態で含む溶液を抗原
−抗体反応調整剤として存在せしめ、抗原−抗体反応調
整剤の免疫反応溶液における最終濃度を0.02〜0.9重量
％に調整する免疫測定方法が提供される。

本発明に従えば、更に、平均分子量が1.6〜5.0万で等
電点が1.0〜5.0であるタンパク質又はそれを含む混合物
を完全溶解状態で含む溶液を抗原−抗体反応調整剤とし
て抗原−抗体反応調整剤の免疫反応溶液における最終濃
度が0.02〜0.9重量％になるような量でその構成要素の
一部として含む免疫測定に用いる試薬キットが提供され
る。

本発明において、タンパク質の「平均分子量」は浸透
圧法によって測定した分子量を意味し、具体的には高分
子溶液と純溶媒と溶媒分子は自由に透すが、溶出高分子
は透さない半透膜を境として接した際に両液の浸透圧差
が高分子の分子量のパラメータとなることを利用してタ
ンパク質の平均分子量を測定するもので、本発明では6.
66M尿素溶液を用いて４℃で測定した値である。また
「等電点」はタンパク質をその等電点に従って分離する
クロマトフォーカシング法によって測定した値をいい、
具体的にはPBE94（ファルマシア製）ゲルを充填したカ
ラム（0.5cmφ×45cm）を用い溶出液0.025Mイミダゾー
ル塩酸（pH7.4）で測定した値をいう。

図面の簡単な説明 第１図は、各濃度のスキムミルク水溶液の保存時の溶
解状態保持率を示し、 第２図は、α_２PI−プラスミン複合体測定系における
スキムミルク濃度とその添加効果を示しており、 第３図及び第４図は、夫々、α_２PI及びプロテインＣ
測定系におけるスキムミルク添加効果を、スキムミルク
無添加の場合と比較した検量線を示し、 第５図は、免疫反応溶液中にスキムミルク0.5重量％
を添加した場合の本測定法（実施例５）によるヒト・プ
ロテインＳの免疫学的測定用の検量線を示し、 第６図は免疫反応系にスキムミルクを添加しなかった
場合のヒト・プロテインＳの免疫学的測定用の検量線
（比較例２）を示し、 第７図はヒト・胎盤由来酸性GST測定系におけるスキ
ムミルク添加濃度による免疫反応への影響を示し、 第８図はコンドロカルシン測定系におけるスキムミル
ク添加濃度による免疫反応への影響を示し、 第９図はIC測定系におけるスキムミルク添加濃度によ
る免疫反応への影響を示し、 第10図は非特異反応率と各種タンパクの分子量の相関
を示し、 第11図は、非特異反応率と各種タンパクの等電点との
相関を示し、 第12図は、オロソムコイドの添加濃度による免疫反応
への影響を示し、 第13図はペプシンの添加濃度による免疫反応への影響
を示し、そして 第14図はヒト肺表面アポ蛋白の測定系におけるスキム
ミルクの添加濃度による免疫反応への影響を示す。

発明を実施するための好ましい態様 本発明においては、溶液中における抗原−抗体反応を
利用して免疫測定を行なうに際し、免疫反応溶液に分子
量が1.6〜5.0万、好ましくは2.0〜4.6万で等電点が1.0
〜5.0、好ましくは1.2〜4.8であるタンパク質を抗原−
抗体反応調整剤として用いる。

本発明におけるかかるタンパクとしては、カゼイン、
ペプシン、オボグリコプロテイン、オロソムコイド等が
あげられる。分子量1.6万未満のタンパクを用いた場合
には、非特異的吸着が上昇する傾向にあり、また5.0万
を超えると分子量では免疫非特異的反応の低減が不充分
かつ特異的免疫反応の低下が見られる傾向にあり、従っ
て、本発明において使用するタンパク質の分子量は1.6
万〜5.0万、好ましくは2.0〜4.6万である。

一方、等電点に関しては等電点5.0を超えるタンパク
質を添加した場合には、非特異的吸着が上昇し、また等
電点1.0未満では特異的反応がおさえられるために本発
明に使用するタンパクの等電点は1.0〜5.0、好ましくは
1.2〜4.8である。

本発明に従えば前記したタンパク質を含む混合物を抗
原−抗体反応調整剤として使用することができる。この
ような混合物としては、例えば主成分として前記タンパ
ク質10〜60重量％、好ましくは20〜50重量％、糖（例え
ば乳糖）30〜80重量％、好ましくは40〜60重量％、その
他脂肪（例えば0.5〜２重量％）、灰分（例えば５〜12
重量％）、水分（例えば２〜８重量％）などを含むこと
ができる。このような混合物として典型的なのはスキム
ミルクである。スキムミルクはタンパク質としてカゼイ
ンを含むものであるが、カゼインを単独で使用した場合
に比べて、スキムミルクは、免疫反応溶液中における分
散性が良く、タンパク質単位重量当りのNBS（Non−spec
ific binding）効果が高く、温度４℃における保存性が
良い（沈澱が生じにくい）という特長を有する。なお、
本発明に用いるスキムミルクとしては、脱脂したミルク
であれば、何の由来の乳であっても良い。一番典型的な
ものは、市販されているDifco社製のスキムミルクであ
る。

本発明におけるかかるタンパク質溶液（又はスキムミ
ルク溶液）は次のように調整される。すなわち、リン酸
緩衝生理食塩水に適度な濃度のタンパク質又はその混合
物（例えばスキムミルク）を加えて約１時間攪拌する。
次いで超音波をかけて溶解させ、例えば0.45μミリポア
通過溶液といて用いる。種々の濃度のタンパク溶液（又
はスキムミルク溶液）を用いて、免疫測定方法を行なっ
たところ、0.02重量％未満のタンパク質溶液（又はスキ
ムミルク溶液）を用いると、抗原が０であるにもかかわ
らず非特異的反応が著しく増加したため、タンパクの濃
度の下限は0.02重量％である。また0.9重量％を越える
濃度では特異的免疫反応の低下が見られ、また冷蔵庫に
おける保存安定性が低下する傾向にあるので、タンパク
の濃度の上限は0.9重量％である。以上の２つの事実を
考慮し、試薬の安定性を満足し、かつ非特異的反応を効
果的に減ずるタンパク質濃度は、0.02〜0.9重量％の範
囲が適当であり、好ましくは0.05〜0.7重量％である。

本発明に係る免疫測定に用いる試薬キットとは、公知
の試薬キット、例えば２つの抗体を用いるサンドイッチ
法による免疫測定に用いる試薬キットであって、（ａ）
酵素標識抗体、（ｂ）抗体固定ビーズ、（ｃ）アッセイ
緩衝液、（ｄ）基質液、（ｅ）発色剤、（ｆ）発色停止
液、（ｇ）スタンダード、（ｈ）洗浄液等から構成され
るものであり、好ましくはこれらのいずれかに、前記タ
ンパク質の溶液を含有せしめたものである。なかでも
（ａ）酵素標識抗体又は（ｃ）アッセイ緩衝液に含有せ
しめるのが、特に（ｃ）アッセイ緩衝液に含有せしめる
のが好ましい。タンパク質溶液は凍結乾燥状態に保持さ
れ、使用時に水等で再溶解して復元させることにより、
所定の濃度範囲になるようにしても構わない。

本発明に従えば、本発明の条件を満足するタンパク質
又はそれを含む混合物（典型的にはスキムミルク）を免
疫測定系に添加することにより特異的反応をほとんど低
下させる事なしに、充分非特異的反応を低下させる作用
を有する事が確認され、高感度な免疫測定法が可能にな
った。

従来のブロッキング作用を発現しうるスキムミルクの
水溶液は、短い放置時間でさえも、放置の間にスキムミ
ルクが凝集し、沈澱が出現し、再溶解しえないものにな
ってしまった。そしてその状態では、スキムミルクのブ
ロッキング作用もまったく消失してしまった。しかしな
がら、抗原−抗体反応調整剤として本発明のスキムミル
クを用いた場合には、すなわち、本発明において使用さ
れる0.02重量％〜0.9重量％のスキムミルク溶液は、１
年間水溶液の状態にて冷蔵庫に保存しても、凝集塊が発
生することは全くなく、免疫測定法についても利用可能
であり、測定試薬として、その保存安定性を満足しうる
ものになった。

しかも、このように作成したスキムミルク溶液を用い
て免疫反応を行なったところ、0.02重量％という、従来
ではブロッキングの作用が考えられなかった希薄なスキ
ムミルク溶液でも、十分非特異的反応を低下させうる作
用を有することがわかり、また、この範囲のスキムミル
ク濃度では、特異的な免疫反応性をほとんど低下させな
いことも確認され、高感度な免疫測定法が可能になっ
た。

本発明による測定法が、特異的な免疫反応性をほとん
ど低下させない理由は次のごとく考えられる。

すなわち、従来は水溶姓のスキムミルクの粒子が抗原
や抗体の周りを囲んだため、抗体が近づけず、結果とし
て特異的な免疫反応を低下させたと考えられる。しかし
ながら、スキムミルクを希薄な水溶液にして、しかも超
音波等を用いることにより、完全な溶解状態のスキムミ
ルクが作製できる。このスキムミルク溶液を用い免疫反
応を行なっても、スキムミルクは完全な溶解状態のた
め、抗原−抗体の反応を阻害しないと考えられる。しか
もこの濃度で、十分、非特異的反応を阻害することも確
認された。

本発明の方法を用いることにより、種々の抗原を測定
することができる。そのような抗原としては例えばα_２
プラスミン・インヒビター（α_２PI）、α_２PI−プラス
ミン複合体、プロテインＣ、プロテインＳ等の凝固線溶
系因子、肺−サーファクタント・アポ蛋白及びAFP、CEA
等の腫瘍マーカー等が挙げられる。

また、上述のような種々の抗原を測定する際に使用す
る抗体としては、これら抗原に対するポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体、それらのフラグメント、例え
ばＦ（ab′）_２,Fab′,Fab,Facb等を標識または固定抗
体として用いることができる。なかでも抗体としてモノ
クローナル抗体を用いた場合には特異性の高い測定が可
能となること、またFab′を用いた場合にはより高感度
の測定が可能となるので好ましい。

かかるポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及
びそれらのフラグメントは公知の方法、例えば、それぞ
れ日本生化学会編、続生化学実験講座、５巻、１−10
頁、東京化学同人、1986年；ケーラーとミルシュタイン
による細胞融合法（G.Kohler and Milstein,Nature（Lo
ndon），256,495−497（1975））；およびエー．ニソノ
フら、ピー．パーハムの方法（A.Nisonoff et al.,Arc
h.Biochem.Biophys.,89,23（1960）;P.Parham,J.Immuno
l.,131,2895（1983）で得ることができる。

また、かかるモノクローナル抗体のうち、抗ヒト・プ
ロテインＳモノクローナル抗体としては、例えば先に出
願された特願昭61−296766号（昭和61年12月15日出願：
発明の名称“モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、モ
ノクローナル抗体の製造方法及びヒト・プロテインＳの
分離方法”）の特許出願明細書（特開昭63−148994号公
報）に詳細に説明されている（ａ）ヒト・プロテインＳ
とヒト補体系制御因子のc4b結合タンパクとの複合体を
特異的に認識し結合するヒト・プロテインＳに対するモ
ノクローナル抗体、及び（ｂ）フリーのヒト・プロテイ
ンＳを選択的に認識し、ヒト・プロテインＳとヒト補体
系制御因子のc4b結合タンパクとの複合体は認識しな
い、ヒト・プロテインＳに対するモノクローナル抗体等
を挙げることができる。

また抗原−抗体反応としては、抗原のそれぞれ異なる
抗原決定部位を認識する２種類の抗体を用いる、いわゆ
るサンドイッチ法、あるいは二抗体法など、従来知られ
ている免疫学的測定法を挙げることができるが、なかで
も、サンドイッチ法を好ましく挙げることができる。

実施例 以下、実施例に従って本発明を更に詳しく説明する
が、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するも
のでないことはいうまでもない。以下の例において
「％」は特にことわらない限り重量基準である。

実施例1:スキムミルクの溶解性および、溶解状態保持試
験 各濃度のスキムミルク水溶液（2.0,1.5,1.0,0.8,0.7,
0.6,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.05,0.02,0.01％）を室温で
スターラーバーを用いて攪拌し、その後、超音波を10分
間かけ、溶解させた。これらの各溶液にチメローサール
を0.01％になるように加え、冷蔵庫に12ケ月保存し、保
存開始時のタンパク質と12ケ月保存品のそれとを比較
し、Bradfordのタンパク測定キットを用いて各濃度にお
ける溶解状態保持の程度を検討した。第１図に、各濃度
における溶解状態保持率（％）を示す。第１図におい
て、 の式を用いた。第１図に示すごとく、スキムミルクが0.
8％以下であれば、充分にその溶液状態で安定に保存し
うることがわかる。

実施例2:α_２PI−プラスミン複合体の免疫測定法におけ
る特異的反応性および非特異的反応性のスキムミルク濃
度依存性の検討 実施例１のスキムミルク溶液を用い、α_２PI−プラス
ミン複合体0,50,100,200ng/mlにおける免疫測定を行な
い、非特異的反応（Ag＝０）と特異的反応（Ag＝200ng/
ml）における測定値を、スキムミルク非添加系と比較し
た。

その結果は、第２図に示したごとくであり、スキムミ
ルクが、0.02％より小さくなると、免疫に非特異的な反
応が上昇することがみとめられた。また、スキムミルク
が、0.8％をこえると、特異反応が阻害されはじめ、ス
キムミルク濃度は、0.02〜0.8が溶液中の免疫反応を高
感度に行なうのに最適であることが確認された。

実施例3:α_２−プラスミン・インヒビター（α_２PI）の
免疫測定法 ヒトα_２プラスミン・インヒブター（α_２PI）に対す
るモノクローナル抗体を固定したポリスチレン製ボール
（直径6mm）と、このモノクローナル抗体とはα_２PIに
対する反応部位が異なる抗ヒトα_２PI−モノクローナル
抗体のペルオキシダーゼ標識体とを用いて、0.5％BSA及
び0.1％スキムミルクを含有する0.01Mリン酸緩衝生理食
塩水（pH7.4）中において、ヒトα_２PI濃度0,200,400,8
00ng/mlの各水準について、37℃の温度で60分反応を行
なった後、ボールと反応液とを分離し、ポールを生理食
塩水でよく洗浄した。次に、これをテトラメチルベンジ
ジン−H₂O₂の発色系を含有する水溶液中において反応さ
せた後、反応停止剤を加えて酸素反応を停止させて、65
0nmの波長の吸収強度を測定し、濃度と吸収強度とをプ
ロットして検量線を得た。

これを、0.1％スキムミルクが存在しない他は、上記
方法と全く同じ方法で反応させて作成した検量線と比較
したところ、第３図に示した如く、0.1％スキムミルク
を添加した測定系では、スキムミルク添加のない系に較
べて、ヒトα_２PI濃度0ng/mlの吸収強度が低く、非特異
的反応が少なく良好なことが認められた。

実施例4:プロテインＣの免疫測定法 ヒトプロテインＣのGla領域に対する抗ヒトプロテイ
ンＣ−モノクローナル抗体を固定したポリスチレン製ポ
ール（直径6mm）と、このモノクローナル抗体と反応部
位が異なる抗ヒトプロテインＣ−モノクローナル抗体の
ペルオキシダーゼ標識体とを用いて、0.5％BSA、0.1％
スキムミルク、5mM塩化カルシウム、及び1U/mlへパリン
を含有する0.05Mトリス緩衝生理食塩水（pH7.4）中にお
いて、プロテインＣ濃度0,12.5,25,50ng/mlの各水準に
ついて、37℃において30分反応を行なった後、ボールと
反応液を分離してからポールをよく洗浄した。次に、こ
れをテトラメチルベンジジン−H₂O₂の発色系で発色させ
た後、反応停止剤を加えて酸素反応を停止させて、650n
mの波長の吸収強度を測定し、濃度と吸収強度とをプロ
ットして検量線を得た。これを、0.1％スキムミルクが
存在しない他は、上記方法と全く同じ方法で反応させた
検量線と比較したところ、第４図に示した如く、0.1％
スキムミルクを添加した測定系では、スキムミルク添加
のない系に較べて、プロテインＣ濃度0ng/mlの吸収強度
が低く、非特異的反応が少ないことが認められた。

参考例1:抗ヒト・プロテインＳ（PS）モノクローナル抗
体の製造及び精製 精製したヒト・PSを雌のBalb/Cマウス（４周齢）２匹
に対して14日間隔で４回免疫した。初回の免疫はPBSに
溶解した。50μｇのヒト・PSを当量のフロイントの完全
アジュバント（Complete Freund′s adjuvant）と混合
し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与した（0.5mg/he
ad）、２回目、３回目は、同じく50μｇのヒト・PSをフ
ロイントの不完全アジュバント（Freund′s imcomplete
adjuvant）と混合し、同じく腹腔内に投与した。最終
免疫は30μｇのヒト・PSをPBS溶液のまま、マウス尾静
脈から追加投与した。最終免疫の３日後に免疫したマウ
スの膵臓細胞を細胞融合に用いた。

免疫したマウスの膵臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細
胞（P3U1）を約2:1〜約15:1の割合で混合し、50％ポリ
エチレングリコール1540（和光純薬（製））を融合促進
剤としてKohlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行な
った。融合後の細胞は、１×I0⁶cells/mlの細胞濃度と
なるように10％FCS・−RPMI−1640倍地に懸濁し、96wel
lsマイクロプレート（Coster）に１ウエルあたり100μ
ｌずつ分注した。

融合細胞は、CO₂インキュベーター（５％CO₂、37℃）
中で培養し、ヒポキサンチン、アミノプテリン；チミジ
ンを含む培地（HAT培地）で培地交換を行ない、HAT培地
中で増殖させて、膵臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイ
ブリドーマのスクリーニングを行なった。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・PSを
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いELIS
A法により検出した。第２抗体には、アルカリホスファ
ターゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、抗原PSに対
する結合性を調べた。融合細胞をまいた合計494のウエ
ルのうち、487のウエルにコロニーの形成が認められ、
このうち抗原PSに対して結合性を示す抗体産生陽性ウエ
ルは94ウエルであった。

これらの抗体産生陽性ウエルのうち４つのウエルにつ
いて限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行
ない、６個のクローンを得た。得られたクローンは、90
％FCS−10％DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保存した。

各クローンの産生するモノクローナル抗体をクローン
をBalb/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロテ
インＡ−Sepharose 4Bカラムを用いて精製した。

参考例2:精製したモノクローナル抗体の性質 マウス腹水から精製した各クローンのIgGについてク
ラス及びヒト・プロテインＳに対する結合性を調べた。

マウスモノクローナル抗体のクラスは、各クラス特異
性の抗マウス抗血清を用いて、オクタロニー法により決
定した。

この結果を下記第２表に示した。

ヒト・プロテインＳに対する結合性は、マイクロタイ
タープレートに固相化したヒト・プロテインＳと適当な
濃度になるように希釈したモノクローナル抗体とを反応
させ、アルカリ性フォスファターゼ標識化したヤギ抗マ
ウスIgGで検出することにより評価した。

その結果６種類のモノクローナル抗体のヒト・プロテ
インＳに対する結合の強さは、2B9F122B9C10＞3C3G8
＞3C4G4＞2B9G3＞＞2E12 C7であることが判明した。

参考例3:ヒトC4bpとプロテインＳ複合体に対する反応性 精製した前記６種類のモノクローナル抗体を10μg/ml
の濃度でマイクロタイタプレートにコーティングし、１
％BSAでBocking後、適当な濃度になるように希釈したヒ
ト健常人血漿を加え、血漿中のC4bp−プロテインＳ複合
体とモノクローナル抗体とを反応させた。次に、アルカ
リ性フォスファターゼ標識化した抗C4bp抗体を加え、６
種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロテインＳ複合体
に対する結合性を検出し、調べた。

その結果、モノクローナル抗体2E12C7は、フリーのプ
ロテインＳに対しては非常に結合性が弱いが、C4bp−プ
ロテインＳ複合体に対しては、高度に特異的に結合性を
示し、６種類のモノクローナル抗体のC4bp−プロテイン
Ｓ複合体に対する結合の強さは、2E12C7＞＞2B9F102B
9C12＞3C3G8＞3C4G4＞2B9G3であることが判明した。

参考例２及び３で示されるように、C4bpとプロテイン
Ｓとの複合体は認識せず、フリーのヒト・プロテインＳ
を特異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体とし
て2B9F12及び2B9C10が得られた。

実施例５ （１）抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径6mm）を、山羊抗ヒト・
プロテインＳ抗体（ポリクローナル抗体;American Diag
nostica社製）の20μg/mlの濃度を有するpH7.4の0.01M
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中に４℃の温度で１
昼夜放置した後、PBSで洗浄してから0.5％牛血清アルブ
ミン（BSA）水溶液中に４℃の温度で１昼夜放置してポ
ストコーティング処理を実施することにより抗体固定化
ビーズを得た。

（２）ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ標識モノク
ローナル抗体の調製 フリーのヒト・プロテインＳを特異的に認識するモノ
クローナル抗体（2B9F12）の1.0mg/mlのPBS溶液1.0ml
に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイ
ミドエステル（MBS）の10mg/mlのジメチルホルムアミド
溶液50μｌを添加し、25℃の温度で30分間反応させた
後、セファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.0）でゲル濾過を行ない、マレイ
ミド化モノクローナル抗体と未反応MBSとを分離した。

一方、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HR
P）の1.0mg/mlのPBS溶液2.0mlに、Ｎ−サクシンイミジ
ル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）
の10mg/mlエタノール溶液を添加し、25℃で30分間反応
させた後、セファデックスＧ−25で充填したカラムを用
い、0.01M酢酸緩衝液（pH4.5）でゲル濾過して精製し、
ピリジルジスルフィド化HRPを含有する画分を採取して
コロジオンバック中で氷冷下に約10倍に濃縮した。次
に、これに0.85％NaClと0.1Mジチオスレイトールとを含
有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）1mlを添加して、25℃で
30分間攪拌してHRP分子中に導入したピリジルジスルフ
ィド基を還元した後、セファデックスＧ−25カラムを用
い、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）でゲル濾過して、チオ
ール化HRPを含有する画分を得た。

次に、得られたマレイミド化モノクローナル抗体とチ
オール化HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷
冷下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１昼夜放
置した後、ウルトロゲルAcA44（仏LKB社製）を充填した
カラムを用いてPBSでゲル濾過することによりHRP標識モ
ノクローナル抗体を得た。

（３）ヒト・プロテインＳの測定 山羊抗ヒト・プロテインＳ抗体を固定化したビーズ各
１個と精製したヒト・プロテインＳを0,50,100,200,400
ng/mlの各濃度で含有する0.1％BSA及び0.1％スキムミル
ク含有PBS溶液（pH7.4）200μｌと、HRP標識モノクロー
ナル抗体を含有する0.1％BSA及び0.1％スキムミルク含
有PBS溶液（pH7.4）200μｌとを各試験管（ｎ＝２）に
添加して37℃の温度で１時間インキュベートした。

次に、試験管内の溶液を吸引除去した後、PBSで２回
洗浄してから、テトラメチルベンジジン塩酸塩0.02％及
び過酸化水素0.005％を含有する0.1Mリン酸−クエン酸
緩衝液（pH4.0）を400μｌずつ各試験管に加え、37℃の
温度で30分間インキュベートした後、反応停止剤として
0.1％NaF及び２％酢酸を含有する水溶液1mlを各試験管
に加えて酵素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて650nmの波長
の吸収強度を測定し、これをヒト・プロテインＳ濃度と
プロットすることにより、濃度依存性を有するヒト・プ
ロテインＳ濃度測定用の検量線を得た（第５図参照）。

血漿検体中のヒト・プロテインＳの濃度測定として、
正常混合人血漿を0.1％BSA及び0.1％スキムミルク含有P
BS溶液（pH7.4）で50倍に希釈した溶液200μｌを、抗体
固定ビーズ及びHRP標識モノクローナル抗体溶液200μｌ
と共に試験管に加え、検量線を作製した方法と同様にし
て免疫反応及び発色反応を行なった後、分光光度計にて
吸光光度を測定した。この値を検量線を用いて血漿中の
濃度に換算したヒト・プロテインＳ濃度を求めた結果、
血漿中濃度は10.4μg/mlであった。

比較例１ 実施例５と同様の方法で調製した山羊抗ヒト・プロテ
インＳ抗体を固定化したビーズ各１個と精製したヒト・
プロテインＳを0,50,100,200,400ng/mlの各濃度で含有
する0.5％BSA含有PBS溶液（pH7.4）200μｌと、同じく
実施例５と同様の方法で調製したHRP標識マウス抗ヒト
・プロテインＳ−モノクローナル抗体を含有する0.5％B
SA含有PBS溶液（pH7.4）200μｌとを各試験管（ｎ＝
２）に添加して37℃の温度で１時間インキュベートし
た。

次に、各試験管内の溶液を吸引除去した後、PBSで各
２回洗浄してから、テトラメチルベンジジン塩酸塩0.02
％及び過酸化水素0.005％を含有する0.1Mリン酸−クエ
ン酸緩衝液（pH4.0）を400μｌずつ各試験管に加え、37
℃の温度で30分間インキュベートした後、反応停止剤と
して0.1％NaF及び２％酢酸を含有する水溶液1mlを各試
験管に加えて酵素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて650nmの波長
の吸収強度を測定し、これをヒト・プロテインＳ濃度に
対してプロットすることにより検量線を作製した（第６
図参照）。

この検量線は、非特異的反応のために基線が吸収強度
0.28と非常に高く良好な感度が得られず、測定系として
は不十分であった。

比較例２ 実施例５と同様の方法で調製した山羊抗ヒト・プロテ
インＳ抗体を固定化したビーズ各１個と精製したヒト・
プロテインＳを0,50,100,200,400ng/mlの各濃度で含有
する0.5％BSA及び２％スキムミルク含有PBS溶液（pH7.
4）200μｌと、同じく実施例５と同様の方法で調製した
HRP標識マウス抗ヒト・プロテインＳ−モノクローナル
抗体を含有する0.5％BSA及び２％スキムミルク含有PBS
溶液（pH7.4）200μｌとを各試験管（ｎ＝２）に添加し
て37℃の温度で１時間インキュベートした。

次に、実施例５と同様の方法で発色反応及び反応停止
を行なった後、この溶液を分光光度計を用いて650nmの
波長の吸光度を測定し、これをヒト・プロテインＳ濃度
とプロットすることにより、実施例５の場合と同様の濃
度依存性を有する良好な検量線が得られた。

しかし、0.5％BSA及び２％スキムミルク含有PBS溶液
（pH7.4）からなる免疫反応用緩衝液及びHRP標識モノク
ローナル抗体を含有する0.5％BSA及び２％スキムミルク
含有PBS溶液（pH7.4）を無菌状態でバイアルに充填し、
冷蔵庫中に１ケ月間保存したところ、これらの溶液中の
スキムミルクが凝集塊を形成した。

この凝集塊を分離して免疫学的測定を実施したとこ
ろ、もはや濃度依存性を有する検量線を得ることができ
ず、測定不能であった。

実施例6:ヒト・胎盤由来酸性グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ測定系におけるスキムミルク添加試験 免疫測定用緩衝液（１％牛血清アルブミン0.01Mリン
酸0.85％NaCl緩衝液pH7.2）で、ヒト・胎盤由来酸性グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以後ヒト・胎盤由
来酸性GSTと記す）の0,25及び50μg/ml溶液を作製しそ
の100μｌと、同上緩衝液で最終濃度が0,0.05,0.1,0.2
％となるよう調整したスキムミルク含有溶液100μｌ、
及びホースラディッシパーオキシダーゼ標識抗ヒト・胎
盤由来GSTモノクローナル抗体を含有する同上緩衝液200
μｌを試験管に入れ、よく混和した。これに、兎抗ヒト
・胎盤由来酸性GSTポリクローナル抗体を固定したビー
ズ１個をそれぞれの試験管に入れて、37℃の温度で２時
間反応させた。次に試験管内の溶液を吸引除去した後、
生理食塩水2mlで３回洗浄してから、3,3′、5,5′テト
ラメチルベンジジン塩酸塩0.02％、H₂O₂2.5mMを含有す
る0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.0）を0.4mlずつ各
試験管に加えて、37℃の温度で30分間反応させた後、反
応停止剤として、1N硫酸水溶液を1mlずつ加えて酸素反
応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて、精製水を対
照として450nmにおける吸収強度を測定し、得られた結
果を第７図に示した。

実施例7:コンドロカルシン測定系におけるスキムミルク
添加試験 免疫測定用緩衝液（１％牛血清アルブミン含有0.01M
リン酸、0.85％NaCl緩衝液pH＝7.2以後１％BSA−PBSと
略記する）で、ウシコンドロカルシンを希釈し、0,2ng/
ml溶液を作成し、その50μｌと同上緩衝液で終濃度0,0.
00625,0.0125,0.025,0.05,0.1,0.2,0.4及び0.8％となる
様に調整したスキムミルク含有溶液50μｌを加えよく混
和し、ウサギ抗ウシ・コンドロカルシン・ポリクローナ
ル抗体を固定したマイクロプレートに同上溶液100μｌ
を入れ、37℃で２時間反応させた（一次反応）。次い
で、PBS−0.05％Tween−20で洗浄後ペルオキシダーゼ標
識抗ウシ・コンドロカルシン・ポリクローナル抗体のFa
b′を免疫測定用緩衝液で希釈し、各ウエルに100μｌ入
れ37℃で１時間反応させた（二次反応）PBS−0.05％Twe
en−20にて洗浄後パーオキシダーゼ用基質液（2.5mM H₂
O₂、0.0225％3,3′、5,5′−テトラメチルベンジジンを
含む）を100μｌ加え、37℃で0.5時間発色させ、1N−硫
酸溶液25μｌを加えて停止反応を行ない、450nmでプレ
ートリーダーにて吸収強度を測定した。その結果を第８
図に示した。この図から明らかな如く、スキムミルク濃
度0.00625％以上のスキムミルク濃度で非特異的吸着が
防止出来る。

実施例8:IgA−IC（IgA型免疫複合体）測定系におけるス
キムミルク添加試験 免疫測定用緩衝液（0.5％牛血清アルブミン、0.01Mリ
ン酸、0.85％NaCl緩衝液pH7.2、以後0.5％BSA−PBSと略
記する）にて、標準物質（IgA−C₃）の1,25及び50μg/m
lを100倍に希釈して、0.2mlを試験管に採取した。次に
0.5％BSA−PBSにて終濃度が0,0.05,0.1,0.2％となるよ
う調整したスキムミルク含有溶液を0.2ml加えよく混和
した。そこへ、兎抗ヒトC₃Facbを固定したビーズを１個
ずつ入れ37℃で１時間反応させた（一次反応）。次い
で、この試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水
（以後生食と記す）２μｌにて３回洗浄してから、ホー
スラディシュパーオキシダーゼ標識、山羊抗ヒトIgA抗
体（カッペル社製）の原液を、スキムミルク0,0.05,0.1
及び0.2％含有する0.5％BSA−PBS溶液にて、各々10,000
倍に希釈したものを一次反応時のスキムミルク含有量が
同一のチューブに0.4mlずつ加え37℃で１時間反応させ
た（二次反応）。次いで、試験管内の溶液を吸引除去し
た後、生食2mlで３回洗浄してから、2,2′−アジノビス
−（３−エチル−６−ベンズチアゾリンスルホン酸）ジ
アンモニウム塩（ABTS）0.05％、過酸化水素1mMを含
む、0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH4.5）を0.4mlずつ
試験管に加え37℃で30分間反応させた後、反応停止剤と
して0.1Mシュウ酸水溶液1mlずつを加えて酵素反応を停
止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて、波長420nm
における吸収強度を試薬ブランク（標準物質の代りに0.
5％BSA−PBSを使用したもの）を対照として測定し、結
果を第９図に示した。

実施例9:免疫反応における非特異的反応（Ｎ）／特異的
反応（Ｓ）比に対する各種タンパク添加の影響 ヒトプラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体を
固定したポリスチレン製ボール（直径6mm）と、抗ヒト
α_２PI−モノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識体
とを用いて、ウレアーゼ、ゼラチン、牛血清アルブミ
ン、卵アルブミン、ペプシン、α−カゼイン、β−カゼ
イン、カゼイン、スキムミルク、PFC（IgGの部分FC）、
NZ Case（カゼインのペプシン分解物）、ゼラチンハイ
ドロリゼートエンザイマティックアシッド（Hydrolysat
e Enzymatic−Acid）、オロソムコイド、オボグリコプ
ロテインの各種タンパク0.25％を含有する0.01Mリン酸
緩衝生理食塩水（pH7.4）中において、ヒトα_２PI−プ
ラスミン複合体濃度0,100ng/mlの各水準について、37℃
の温度で60分反応を行なった後、ボールと反応液とを分
離し、ボールを生理食塩水でよく洗浄した。次に、これ
をテトラメチルベンジジン−H₂O₂の発色系を含有する水
溶液中において反応させた後、反応停止剤を加えて酸素
反応を停止させて、650nmの波長の吸収強度を測定し
た。

以下の計算式を用いて、非特異反応率を算出し、分子
量又は等電点との相関を各々第10図及び第11図に示し
た。

第10図より分子量1.6万〜5.0万、第11図より等電点1.
0〜5.0の範囲のタンパクの添加が非特異的反応の著しい
低下を導くことは明白である。また第11図より、等電点
1.0〜5.0のタンパクの添加が非特異的反応を低減する効
果が良好であることがわかる。

実施例10:オロソムコイド、ペプシンの添加濃度による
免疫反応への影響 ヒトプラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体を
固定したポリスチレンボールと、抗ヒトα_２PIモノクロ
ーナル抗体のペルオキシダーゼ標識体とを用いてオロソ
ムコイド、ペプシンの各種濃度を含有する0.1Mリン酸緩
衝液（pH7.2）中において、ヒトα_２PI−プラスミン複
合体濃度0,50,100ng/mlの各水準について37℃の温度で6
0分反応を行なった後、ボールと反応液とを分離し、ボ
ールを生理食塩水でよく洗浄した。次に、これをテトラ
メチルベンジジン−H₂O₂の発色系を含有する水溶液中に
おいて反応させた後、反応停止剤を加えて酵素反応を停
止させて、650nmの波長の吸収強度を測定した。

結果をそれぞれ第12図（オロソムコイド）と第13図
（ペプシン）に示した。第12図および第13図から、低タ
ンパク濃度では非特異的反応が著しく増加すること、高
タンパク濃度では特異的反応が低下していることが明ら
かである。

実施例11:肺−サーファクトタント−アポタンパク測定
系におけるスキムミルク添加試験 免疫測定用緩衝液（１％牛血清アルブミン0.01Mリン
酸0.85％NaCl緩衝液pH7.2）で、ヒト肺表面アポタンパ
ク（以下LSP）の、0,50ng/ml溶液を作製し、その100μ
ｌと同上緩衝液で最終濃度が0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.
6,0.7％となるよう調整したスキムミルク含有溶液100μ
ｌ、及びホースラディッシパーオキシダーゼ標識抗ヒト
LSPモノクローナル抗体を含有する同上緩衝液200μｌを
試験管に入れ、よく混和した。これに、抗LSPモノクロ
ーナル抗体を固定したビーズ１個をそれぞれの試験管に
入れて、45℃の温度で30分反応させた。次に試験管内の
溶液を吸引除去した後、生理食塩水2mlで３回洗浄して
から、3,3′,5,5′テトラメチルベンジジン塩酸塩0.02
％、H₂O₂2.5mMを含有する0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液
（pH4.0）を0.4mlずつ各試験管に加えて、45℃の温度で
15分間反応させた後、反応停止剤として、1N硫酸水溶液
を1mlずつ加えて酸素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて、精製水を対
照として450nmにおける吸収強度（O.D.）を測定し、得
られた結果を第14図に示した。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−275654（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，25 （３）Ｐ．509−515，（1987) Ｐａｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，19（10），Ｐ．1017−1020, （1985) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，12，Ｐ．271−279 （1986)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】溶液中における抗原−抗体反応を利用して
   免疫測定を行なうに際し、免疫反応溶液に平均分子量が
   1.6〜5.0万で等電点が1.0〜5.0であるタンパク質又はそ
   れを含む混合物を完全溶解状態で含む溶液を抗原−抗体
   反応調整剤として存在せしめ、抗原−抗体反応調整剤の
   免疫反応溶液における最終濃度を0.02〜0.9重量％に調
   整することを特徴とする免疫測定方法。
2. 【請求項２】前記抗原−抗体反応調整剤がカゼイン、及
   びオロソムコイドの群から選ばれた少なくとも一種のタ
   ンパク質である請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】前記抗原−抗体反応調整剤が主要成分とし
   てタンパク質10〜60重量％及び糖30〜80重量％を含む請
   求の範囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】前記抗原−抗体反応調整剤がスキムミルク
   である請求の範囲第３項記載の方法。
5. 【請求項５】測定対象がα_２プラスミン・インヒビタ
   ー、α_２プラスミン・インヒビター−プラスミン複合
   体、プロテインＣ、プロテインＳ、ヒト・胎盤由来酸性
   グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、コンドロカルシ
   ン、IgA型免疫複合体、肺−サーファクタント・アポタ
   ンパク、AFP又はCEAである請求の範囲第１項記載の方
   法。
6. 【請求項６】平均分子量が1.6〜5.0万で等電点が1.0〜
   5.0であるタンパク質又はそれを含む混合物を完全溶解
   状態で含む溶液を抗原−抗体反応調整剤として抗原−抗
   体反応調整剤の免疫反応溶液における最終濃度が0.02〜
   0.9重量％になるような量でその構成要素の一部として
   含む免疫測定に用いる試薬キット。
7. 【請求項７】前記抗原−抗体反応調整剤がカゼイン、及
   びオロソムコイドの群から選ばれた少なくとも一種のタ
   ンパク質である請求の範囲第１項記載の試薬キット。
8. 【請求項８】前記抗原−抗体反応調整剤が主要成分とし
   てタンパク質10〜60重量％及び糖30〜80重量％を含む請
   求の範囲第１項記載の試薬キット。
9. 【請求項９】前記抗原−抗体反応調整剤がスキムミルク
   である請求の範囲第８項記載の試薬キット。
10. 【請求項１０】測定対象がα_２プラスミン・インヒビタ
    ー、α_２プラスミン・インヒビター−プラスミン複合
    体、プロテインＣ、プロテインＳ、ヒト・胎盤由来酸性
    グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、コンドロカルシ
    ン、IgA型免疫複合体、肺−サーファクタント・アポタ
    ンパク、AFP又はCEAである請求の範囲第６項記載の試薬
    キット。