DE2701523A1

DE2701523A1 - Verfahren und vorrichtung zur zaehlung und klassifizierung von teilchen

Info

Publication number: DE2701523A1
Application number: DE19772701523
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Guenter Dr Rer Eisert
Original assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Current assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Priority date: 1977-01-15
Filing date: 1977-01-15
Publication date: 1978-07-20

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Zählung und Klassifizierung von
Teilchen Die Erfindung, betrifft ein Verfahren zur Zählung und Klassifizierung von Teilchen und/oder deren Teilchen-Inhaltsstoffe, wobei ein Laserstrahl mit einem Strahldurchmesser geringer oder höchstens gleich der Breite der Teilchen zur Zählung und Klassifizierung der Teilchen auf diese gerichtet wird und bei dem die Teilchen hydrodynamisch fokussiert und die durch die Teilchen transmittierte Strahlung detektiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet hierbei in vorteilhafter Weise eine Vorrichtung, wie sie in etwa in der früheren Patentanmeldung P 25 43 310.7 bereits beschrieben wurde. Damit das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist, wurde sie entsprechend und unter Verwendung von z.T. erfinderischen Gedanken variiert.
Die Zählung und Aufnahme der Größenverteilung von Zellen und Partikeln bei gleichzeitiger AufschlIisselung nach bestirnmten Zellqualitäten ist problematisch. So sieht ein unter der Bezeichnung Coulter-Prinzip bekanntes Verfahren vor, eine elektronische Messung des Zellvolumens über Widerstandsänderung einer Elektrolytflüssigkeit beim Durchtritt der Zellen durch eine Öffnung in einer Trentawand vorzunehmen.
Optische Durchflußverfahren versuchen entweder über Fluoreszensmessungen mit einer Anfärbung der Partikel und Differenzierung nach Fluoreszenzintensitäten, eine Streulichtmessung mit einer Streuung einer kohärenten Lichtquelle an Partikeln oder über eine Messung der Absorption der Gesamtzelle auf Objektträgern dieses Problem zu lösen. Dei allen diesen optischen Verfahren ist jedoch das Meßvolumen größer als die zu messende Zelle bzw. Teilchen.
Bei der Messung nac dem Coulter-Prinzip ist der Meßwert abhängig von der Geometrie der Durchflußöffnung und von der Lage der Durchtrittsachse in der Durchflußöffnung. Is sind keine weiteren Aussagen Uber die Partikel möglich. Außerdem besteht uie Gefahr der Verstopfung der Meßöffnung; der maximale Zeildurchmesser ist auf 50 % der Meßöffnung beschränkt. Das Ergebnis ist eine geringe Zählrate, die noch abhängig von der Teilchengröße ist.
Die Fluoreszenzmessungen haben den Nachteil, daß der Meßwert abhängig von Färbungsprozessen ist, d.h. verschiedene Meßserien sind nicht direkt miteinander vergleichbar ul,d Fluoreszenzfärbungen spezieller Zellqualitäten sind oft gar nicht herstellbar ("Fluorescence Techniques in Cell Biology von A.A. Thaer und M. Sernetz).
Bei der Streulichtmessung sind zur Aufnahme einer Größenverteilung gleichzeitige Messungen in mehreren Raumwinkeln notwendig. Dies fahrt dazu, daß nur Größenverteilungen bis maximal ca. 10 um aus Streudaten herleitbar sind. Bei diesen beiden Meßverfahren ist außerdem der Brechungsindex des Suspensionsstrahls, die Teilchen liegen in Suspensionen vor, nicht an das optische System angepaßt.
Die Absorptionsmessungen gelingen bisher nur mit einem Meßfeld, wenn es größer als der Zellquerschnitt ist. ie Zellen werden dabei auf Objektträger aufgebracht, was eine geringe ZAhl- und Analysengeschwindigkeit nach sich zieht, da der Objektträger u.a.
mechanisch bewegt werden muß.
Die Erfindung hat die Aufgabe, sowohl die Crößenverteilung und unterschiedliche optische Eigenschaftei der Zellen, Teilchen oder Partikel selbst aus der Absorption als auch die der Inhaltsstoffe dieser Zellen, Teilchen odei Partikel, sofern vorlianden bzw. von unterschiedlicher 1i'm uiid Größe, aus der Streulichtstrahlung herzuleiten, obwohl die Meßvolumina nicht größer sind als die Zellen, Teilchen oder Partikel selbst, was nach der Auffassung der Pachwelt bisher als (3run<tvoraussetzung hierfür galt.
Die Lösurlg, dieser Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß ein Laserstrahl beliebigen Strahldurchmessers, jedoch höchstens gleich dem bei der Teilchenklassifizierung zur Untersuchung der Teilcheninhaltsstoffe verwendet wird, daß die transmittierte Strahlung zur Zählung und Klassifizierung der Teilchen alleine und bei der Feststellung der Teilcheninhaltstoffe als Referenzstrahlung detektiert wird, und daß die von den Teilchen und Teilcheninhaltsstoffen gestreute Strahlung zur Feststellung und Unterscheidung der Teilcheninhaltsstoffe nachgewiesen wird.
Eine besonderes bevorzugte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, bei der ein Laserstrahl auf aus einer Strömungsdüse hydrodynamisch fokussierte Teilchen trifft und ein Detektor die transmittierte Strahlung aufnimmt, sieht vor, daß der Detektor aus einen Vieldetektorsystem gebildet ist, mit dem sowohl die transmittierte als auch in verschiedene Winkelbereiche gestreute Laserlichtstrahlung aufnehmbar ist.
Eine Weiterbildung dieser erfindungsgemäßen Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Vieldetektorsystem aus nebeneinander angeordneten Photodioden oder aus konzentrisch um einen Kern ang,eordneten, ringförmigen Lichtleitern besteht, die mit Photomultipliern in Verbindung stehen.
Die besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung zur Durchführung desselben sind darin zu sehen, daß Teilcheninhaltstöffe, wie Granulat, Zellkerne, Zellteile oder Einzelzellen eines Zellverbandes, von Teilchen oder Auswüchsen bzw. Aggregaten (auf der Partikeloberfläche aufgesetzte oder geklebte kleinere Teilchen, deren Größe selbst nur im Sub- bis Mikrometerbereich liegen) über Streulichtmessungen erfaßt werden können. Hierbei gilt die transmittierte Strahlung als Referenzstrahlung. Alleine das Vorhandensein von unterschiedlich starker Streulichtstrahlung ermöglicht zudem eine Aussage über die Strukturbeschaffenheit der Teilchen. Die Strahlenbreite ist kleiner als die Teilchengröße, jedoch größer als die Größe der Teilcheninhaltsstoffe bzw. der Oberflächenstrukturen oder Teilchenzusammensetzungen. Die Nachweisoptili und der Strahlungsempfänger sind hierzu entsprechend abgeändert. Dies beaeutet, daf! bei gleichzeitiger Kontrolle der Partikelgrößen eine Analyse der Partikel und/oder der Oberflächen der Partikel m(i£lich wird. Insbesondere können ohne Anfärbung der Proben Analysen der Zusammensetzung von Zell- und Partikelaggregationen vorgenommen werden.
Die Erfindung wird im folgenden anhand zweier Ausführungsbeispiele mittels der Figuren 1 bis 4 näher erl'iutert.
Das für die Ausführung der Meßverfahren verwendete optische Detektionssystem ist in Fig. 1 dargestellt. Im Prinzip handelt es sich hierbei um ein Laser-Durchfluß-Photometer, bei dem ein hydrodynamisch in einer Strömungskammer 1 fokussierter Teilchen-bzw. Zellstrahl 2 von einem Laserstrahl 3 senkrecht durchstrahlt wird. Der Laserstrahl 3 wird hierbei von der Linse 4 auf den hydrodynamisch fokussierten Teilchenstrahl 2 gerichtet. Das durch den Teilchenstrahl 2 transmittiert bzw. an diesem gestreute Licht 5 wird nach einer Saminellinse 6 mit hilfe eines dichroitischen Spiegels 7 von dem Beleuchtungslicht 8 aus der Lampe 9 für die Justierung der Durchflußkammer 1 getrerlnt. Die Divergenz des Laserstrahls 5 nach dem Spiegel j wird weiter mit hilfe der nachfolgenden Bikonkavlinse 10 auf das Detektorsystem 11 eingestellt.
Ein Interterenzfilter 12, welches fast ausschließlich für die Wellenlänge des Laserstrahls 5, 64 durchlässig ist, vermeidet störende einflüsse durch andere Lichtquellen.
Für die gleichzeitige Umwandlung der Lichtsignale (Laserstrahl 5 mit streu- und transmittiertem Anteil) in elektrische Signale, werden zwei verschiedene Systeme verwendet. Bei ausreichenden lntensitätsverhältnissen wird eine Reihe von z.B. fünfzig lialbleiterphotodioden 13 bis 63, die auf ein gemeinsames Keramiksubstrat als Detektorsystem 11 aufgebracht sind, verwendet. Wird der transmittierte Laserstrahl 5 auf die mittlere Diode 38 justiert, so lassen sich für einen Winkelbereich α des Streulichts 64 jeweils zwei Photodioden zusammenschalten (z.B. 39, 37 und 36, 40). Damit läßt sich die Meßfläche für einen Winkelbereich verdoppeln.
Es ist jedoch auch denkbar, dalS die Reihe der Pih-Photodioden 13 bis 63 so einjustiert werden, daß die transmittierte Strahlung 5 eine am Rand stehende Photodiode, z.B. die Photodiode 13 oder 63 trifft. I)ie übrigen Dioden 14 bis 3 bzw. 13 bis 62 gestatten dann eine Detektion des gestreuten Lichtes 6' in verschiedenen Winkelbereichen, abhängig von der Wahl der jeweils benutzten Diode.
Sind nur geringe Streulichtintensitäten c4 zu erwarten, so wird eine Kombination eines mehrarmigen Lichtleiters (siehe Fig. 2) mit mehreren Photomultipliern (nicht näher dargestellt) eingesetzt.
Der transmittierte Laserstrahl 5 wird in einen Kernlichtleiter 65 justiert und über einen der Arrne 66 an einen Photomultiplier angekoppelt. Die konzentrisch um den Kern angeordneten ringförmigen Lichtleiter, z.B. 67, erlauben die Aufnahme des gestreuten Lichtes 64 in verschiedenen Winkelbereichen. Jeder Ring 67 wird über einen der Leiter 66 an einen weiteren Photomultiplier angekoppelt.
Beide Empfangssysteme besitzen mit Anstiegszeiten weit unter hundert ns die fLil eine hohe Meßrate notwendige Zeitauflösung. Die Streulichtstrahlung 64 kann in beiden Fällen entweder nur in einzelnen Winkelbereichen oder in mehreren Winkelbereichen gleichzeitig detektiert werden.
Die Aufbereitung und Speicherung der Streulichtmeßdaten erfolgt in bekannter Weise wie bei Absorptionsmessungen. Die detektierten Impulse werden nach der Impulshöhe, Halbwertsbreite und ach dem Impulsintegral in Analogrechnern ausgewertet. Die Klassifizierung und ^)peicherung der einzelnen Meßlrril',en erfolgt in einem nicht näher dargestellten Vielkanalimpulslllihenonalysator.
Die Intensität der gestreuten Lichtstrahlung 64 ist an gelagerten Blutzellen und Partikeln nach unterschiedlicher Lagerungsdauer während der Messung der Größenverteilung der Partikel und Zellen gemessen und in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Die Fig. 3 zeigt hierbei die Anzahl N der streuenden Zellen über der gestreuten Intensität I (das gleiche gilt für Fig. 4) an unterschiedlichen Lagerungstagen. z.B. zwanzig Tage Unterschied. Die Fig. 3 stellt die Aufzeichnung eines Streuwinkels von 2° und die Fig. 4 die eines Winkels von 4° dar. Deutlich läßt sich die verschiedene Lagerungsdauer, erster und zwanzigster Tag (Kurve 68,70 bzw. 69,71) aus den gestreuten Intensitäten I unterscheiden. Dieses kann dadurch erklärt werden, daß die Zellen - insbesondere die Thrombozyten - sich verändern bzw. absterben und neue Partikel durch Aggregat ionen und teilweise einsetzende Gerinnungsvorgänge gebildet werden.
L e e r s e i t e

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Zählung und Klassifizierung von Teilchen und/oder deren Teilcheninhaltsstoffe, wobei ein Laserstrahl mit einem Strahldurchmesser geringer oder höchsten gleich der Breite der Teilchen zur Zählung und Klassifizierung der Teilchen auf diese gerichtet wird und bei dem die Teilcnen hydrodynamisch rokussiert und die durch die Teilchen transmittierte Strahlung detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein Laserstrahl (3) beliebigen Strahldurchmessers, jedoch höchstens gleich dem bei der Teilchenklassifizierung zur llntersuchung der Teilcheninhaltsstorre verwendet wird, daJS die transmittierte Strahlung (5) zur Zählung und Klassifizierung der Teilchen alleine und bei der Feststellung der Teilcheninaltsstoffe als Referenzstrahlung detektiert wird, und daß die von den Teilchen und Teilcheninhaltsstoffen gestreute Strahlung (64) zur Feststellung und Unterscheidung der Teilcheninhaltsstoffe nachewiesen wird.
2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, bei der eiii Laserstrahl auf aus einer Strömungsdüse hydrodynamisch fokussierte Teilchen trifft und ein Detektor die transmittierte Strahlung aufnirmnt, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (11) aus einem Vieldetektorsystem (11) gebildet ist, mit dem sowohl die transmittierte als auch in verschiedene Winkelbereiche (x gestreute Laserlichtstrahlung (5 bzw. 64) aufnehmbar ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Vieldetektorsystem (11) aus nebeneinander angeordneten Photodioden (13 bis 63) oder aus konzentrisch um einen Kern (65) angeordneten, ringförmigen Lichtleitern (67) besteht, die mit Photomultipliern in Verbindung stehen.