DE2922643C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Zählung und Klassi­ fizierung von in einem Flüssigkeit suspendierten Teilchen unter Verwendung von Laserlicht und Nachweis transmittierter und/oder emittierter Strahlung, in der die Teilchen mittels einer Strömungsdüse hydrodynamisch fokussiert werden, wozu die Strömungsdüse in einer Kapillar­ düse endet, die einen Strömungsfaden mit kreisrundem Quer­ schnitt und mit entlang einer Achse des Strömungsfadens aus­ gerichteten Teilchen erzeugt, und wobei die Strömungsdüse von einem Mantelrohr umgeben ist, durch welches eine Mantelströ­ mung für den Strömungsfaden der Teilchen ausgebildet wird.

Die Zählung und Aufnahme der Größenverteilung von Zellen und Partikeln bei gleichzeitiger Aufschlüsselung nach bestimmten Zellqualitäten ist problematisch. So sieht ein unter der Be­ zeichnung Coulter-Prinzip bekanntes Verfahren vor, eine elektro­ nische Messung des Zellvolumens über Widerstandsänderung einer Elektrolytflüssigkeit beim Durchtritt der Zellen durch eine Öffnung in einer Trennwand vorzunehmen. Optische Durchflußver­ fahren versuchen entweder über Fluoreszenzmessungen mit einer Anfärbung der Partikel und Differenzierung nach Fluoreszenzin­ tensitäten, eine Streulichtmessung mit einer Streuung einer ko­ härenten Lichtquelle an Partikeln oder über eine Messung der Absorption der Gesamtzelle auf Objektträgern dieses Problem zu lösen. Bei allen diesen optischen Verfahren ist jedoch das Meßvolumen größer als die zu messende Zelle bzw. Teilchen.

Bei der Messung nach dem Coulter-Prinzip ist der Meßwert ab­ hängig von der Geometrie der Durchflußöffnung und von der Lage der Durchtrittsachse in der Durchflußöffnung. Es sind keine weiteren Aussagen über die Partikel möglich. Außerdem besteht die Gefahr der Verstopfung der Meßöffnung; der maximale Zell­ durchmesser ist auf 50% der Meßöffnung beschränkt. Das Ergeb­ nis ist eine geringe Zählrate, die noch abhängig von der Teil­ chengröße ist.

Die Fluoreszenzmessungen haben den Nachteil, daß der Meßwert abhängig von Färbungsprozessen ist, d. h. verschiedene Meßserien sind nicht direkt miteinander vergleichbar und Fluoreszenzfär­ bungen spezieller Zellqualitäten sind oft gar nicht herstellbar. Bei der Streulichtmessung sind zur Aufnahme einer Größenver­ teilung gleichzeitig Messungen in mehreren Raumwinkeln not­ wendig. Dies führt dazu, daß nur Größenverteilungen bis maxi­ mal ca. 10 µm aus Streudaten herleitbar sind. Bei diesen beiden Meßverfahren ist außerdem die optische Qualität des Suspensions­ strahls, die Teilchen liegen in Suspensionen vor, nicht optimal an den Brechungsindex angepaßt. Die Absorptionsmessungen gelingen bisher nur mit einem Meßfeld, das größer als der Zellquerschnitt ist. Die Zellen werden dabei auf Objektträger aufgebracht, was eine geringe Zähl- und Analysengeschwindigkeit nach sich zieht, da der Objektträger u. a. mechanisch bewegt werden muß.

Es ist daher bei einer Vorrichtung der eingangs erwähnten Art vorgeschlagen worden (DE-OS 25 43 310), die optische Analyse von Zellen und Partikeln in einem in Luft befindlichen Flüs­ sigkeitsstrahl zur Partikel- und Zelltrennung bzw. Anreiche­ rung durchzuführen. Die Zellen und Partikel werden dabei mit Hilfe einer hydrodynamischen Fokussierung vereinzelt und ent­ lang der zentralen Strömungsachse ausgerichtet. So orientiert, verlassen sie die Düse mit einem kreisrunden Querschnitt der Flüssigkeitssäule. Der in die Luft austretende Flüssigkeits­ strahl zerfällt nach kurzer Distanz in einzelne Flüssigkeits­ tröpfchen, die einzelne Partikel bzw. Zellen enthalten. Ent­ sprechend der optischen Information, die von den Zellen bzw. Partikeln während des Durchgangs durch das Meßvolumen, das im ungestörten Bereich des Flüssigkeitsstrahles liegt, gewonnen worden ist, werden sie in verschiedene Richtungen abgelenkt und sortiert. Bei einer Variante dieses Systems liegt das Meß­ volumen nicht im Bereich der stromauf liegenden strömungsfreien Küvette. Dabei ist es unerheblich, ob eine weitere Mantelflüs­ sigkeit zur Kompensation des Druckabfalls eingesetzt wird. Bei allen experimentellen und kommerziellen Durchflußzytometrie­ sortierern handelt es sich um Ausführungen, bei denen der Flüs­ sigkeitsstrahl in Luft einen kreisrunden Querschnitt hat.

Die optische Abbildung der sich im Flüssigkeitsstrahl befindli­ chen Zellen bzw. Partikeln ist durch die als Zylinderlinse wir­ kende Flüssigkeit in der Ebene senkrecht zur Flußrichtung je­ doch verzerrt. Damit wird eine ebene Abbildung des Zentrums der Flüssigkeitssäule unmöglich. Weiterhin werden durch die Brechungs- und Reflexionseigenschaft des Übergangs vom optisch dichteren Medium (Flüssigkeit) zum optisch dünneren Medium (Luft), die Polarisationseigenschaften des durch diese Grenzflächen hindurch­ laufenden Lichtes verändert. Dieses scheint mit der Zunahme von polarisationsoptischen Untersuchungen an immunkompetenten Zellen von besonderer Bedeutung für die Zukunft zu sein. Die Analyse von Streulicht ist nur in der Richtung parallel zur Strömungsrichtung möglich.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht nunmehr darin, die e. g. Vorrichtung so auszugestalten, daß mit ihr ein Flüssigkeitsstrahl derart erzeugbar ist, daß die in ihm be­ findlichen Zellen bzw. Partikeln unverzerrt und ohne Reflexions- und Polarisationseffekte optisch abgebildet werden können.

Die Lösung dieser Aufgabe ist in den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruches 1 aufgezeigt. Eine vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung ist in den Merkmalen des Anspruches 2 beschrie­ ben.

Die wesentlichen Vorteile der Erfindung bestehen darin, daß auf­ grund ebener Übergangsflächen zwischen verschiedenen Brechungsin­ dices der Einsatz axialsymmetrischer Optiken für eine hochaufge­ löste Abbildung möglich wird. Weiterhin bildet die Flüssigkeits­ säule ihre eigenen "Fenster" aus, die keiner Verschmutzung unter­ liegen.

Der Einsatz von ebenen Flüssigkeitsluftgrenzflächen ermöglicht den Einsatz von axialsymmetrischen Optiken mit hoher numerischer Apertur. Dieses ist bei der Untersuchung von Absorptionen, Streu­ licht und Fluoreszenz von besonderem Vorteil. Die Polarisations­ eigenschaften von transmittiertem bzw. emittiertem Licht, werden bei dem senkrechten Durchgang durch ebene Flächen nicht verändert. Erstmals sind hochauflösende Abbildungen, evtl. auch holographi­ sche Analysen, der sich im Flüssigkeitsstrahl befindlichen Parti­ kel prinzipiell möglich.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbei­ spiels mittels der schematischen Fig. 1 und 2 näher erläutert, wobei die Fig. 2 lediglich ein Detail der Fig. 1 zeigt.

In der vorgeschlagenen Strömungsdüsenkonfiguration (siehe Fig. 1), wird, wie bereits in der OS 25 43 310 beschrieben, ebenfalls eine konzentrische hydrodynamische Fokussierung und Vereinzelung der Zellen und Partikel auf einem Strömungsfaden 4 entlang einer Strö­ mungsachse 10 mit Hilfe eines Mantelstromes 11 durchgeführt, wo­ bei die Zellen durch die Zuführung 14 (Verdünnungsflüssigkeit durch Öffnung 15) in die Strömungsdüse 13 gepreßt werden, die in eine Kapillardüse 2 mit Austrittsende 1 von kreisförmigem Querschnitt endet und der Mantelstrom 11 außerhalb der Strömungsdüse 13 in das Gehäuse 12 eingeführt wird. Der Mantelstrom 11 umgibt den Strömungsfaden 4 erst ab dem Austrittsende 1 der Kapillardüse 2.

Die die Strömungsdüse 2, 13 ummantelnde Mantelflüssigkeit 11 fließt in gleicher Richtung (Achse 10), nimmt den aus Flüssig­ keit und Suspensionen gebildeten Strahl 4 auf und transportiert diesen weiter. Bereits an dieser Stelle 1 des Strömungssystems sind die Partikel bzw. Zellen, wie für die Messung benötigt, ver­ einzelt und ausgerichtet. Die Strömungskammer 12 in der die Man­ telflüssigkeit 11 und der Zentralstrahl 4 nun verlaufen, ver­ jüngt sich weiter stromabwärts noch einmal, jedoch nicht zu einem runden, sondern zu einem quadratischen oder rechteckigen Querschnitt. Nach einer kurzen Laufzeit in dieser einen quadra­ tischen oder rechteckigen Flüssigkeitsquerschnitt erzwingenden Düse 3 tritt der quadratische oder rechteckige Flüssigkeitsstrahl 5 in Luft aus. In Luft behält der Flüssigkeitsstrahl 5 auf einer Läng von ca. 15 mm seine z. B. quadratische Form bei, bevor er in einen angenähert runden Querschnitt übergeht und dort in Tröpf­ chen zerfällt. Innerhalb des Bereiches mit annähernd quadrati­ schem Flüssigkeitsquerschnitt ist die Oberfläche 7 der gebildeten Flüssigkeitsflächen von ausgezeichneter optischer Qualität.

Ein senkrecht durch z. B. die Fläche 7 hindurchtretender Laser­ strahl 6 zeigt keinerlei Verzerrungen. Die forcierte Bildung von gleichmäßigen Tröpfchen gelingt ähnlich wie bei herkömmli­ chen zylinderischen Flüssigkeitsquerschnitten. Die transmit­ tierende oder emittierende Strahlung 9 wird von einem Detektor 8 aufgenommen und in bekannter Weise ausgewertet.

Die Detailfigur 2 zeigt das Austrittsende 1 der Kapillardüse 2 mit dem von dieser Probe 14 und der Verdünnungs­ lösung bzw. der (Puffer 15) gebildeten Teilchenstrahl 4 von kreis­ förmigem Querschnitt entlang der Achse 10 im Gehäuse 12. Konzen­ trisch zu dieser Achse 10 ist die weitere Strömungsdüse 3 am Gehäuse angeordnet. Sie steht mit ihrer Öffnung von kreisför­ migem Querschnitt vor dem Austrittsende 1 und fängt sowohl den Strömungsfaden als auch die Mantelflüssigkeit 11 ein. Der kreis­ förmige Querschnitt dieser Düse 3 geht stetig in den quadratischen oder rechteckigen Querschnitt über, so daß der aus ihr austre­ tende Strömungsfaden 5 quadratischen oder rechteckigen Quer­ schnitt erhält.

Claims (2)

1. Vorrichtung zur Zählung und Klassifizierung von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen un­ ter Verwendung von Laserlicht und Nachweis transmittierter und/oder emittierter Strahlung, in der die Teilchen mittels einer Strömungsdüse hydrodynamisch fokussiert werden, wozu die Strömungsdüse in einer Kapillardüse endet, die einen Strömungsfaden mit kreisrundem Querschnitt und mit entlang einer Achse des Strömungsfadens ausgerichteten Teilchen er­ zeugt, und wobei die Strömungsdüse von einem Mantelrohr um­ geben ist, durch welches eine Mantelströmung für den Strömungs­ faden der Teilchen ausgebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Austrittsöffnung des Mantel­ rohres (12) als weitere Strömungsdüse (3) ausgebildet ist, die einen quadratischen oder rechteckigen Austrittsquerschnitt aufweist, und den aus dem Austrittsende (1) und der Kapillar­ düse (2) austretenden und von Mantelflüssigkeit umschlossenen Strömungsfaden (4) in einen Strömungsfaden (5) aus Suspension (14, 15) und Mantelflüssigkeit von quadratischem oder recht­ eckigen Querschnitt umformt und daß der zur Messung dienende Laserstrahl (6) den aus der weiteren Strömungsdüse (3) frei austretenden Strömungsfaden (5) senkrecht zu einer Begren­ zungsfläche (7) durchstrahlt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Strömungsdüse (3) konzentrisch zur Strömungsachse (10) des Strömungsfadens (4) ausgerichtet ist, daß diese Strömungs­ düse (3) von dem Strömungsfaden (4) und der Mantelströmung (11) durchquert wird, und daß die weitere Strömungsdüse (3) stetig von einem runden Öffnungsquerschnitt auf den quadratischen oder rechteckigen Querschnitt übergeht.