DE2645993A1

DE2645993A1 - Mittel gegen myeloische leukaemie und sein herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE2645993A1
Application number: DE19762645993
Authority: DE
Inventors: Morio Kuboyama; Kazuhiro Nagata; Katsuhiro Ogasa; Minoru Saito
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1975-10-17
Filing date: 1976-10-12
Publication date: 1977-04-28
Also published as: JPS5330781B2; DE2645993C2; FR2327793A1; FR2327793B1; JPS5251009A; GB1535063A; US4100022A

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel gegen myeloische Leukämie sowie sein Herstellungsverfahren. Das erfindungsgemäße Mittel wirkt gegenüber schlechtdifferenzierten, myeloischen leukämischen Zellen im Sinne einer Wiederherstellung normaler Funktionen; seine Herstellung erfolgt erfindungsgemäß in einem Humanserumalbumin enthaltenden Medium aus einer Kulturflüssigkeit, die durch Kultivieren von durch Trypsinbehandlung individuell isolierten menschlichen Amnionzellen erhalten wurde, oder aus durch mindestens einmaliges Subkultivieren von isolierten Zellen in einem Kälberserum oder Rinderfetalserum enthaltenden Medium erhaltenen menschlichen Amnionzellen.

039-(M-l-24-4)-PSBk

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Die myelogene, sog. myeloische Leukämie stellt eine Erkrankung dar, die durch übermäßige Proliferation myeloischer Zellen und ihrer Zeilvorlaufer im Knochenmark gekennzeichnet ist. Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie wirkt gegen leukämische Zellen, die aufgrund von Störungen im Knochenmark gebildet werden, wobei die normale Funktion der Zellen wiederhergestellt wird.

Die medizinische Forschung zur Behandlung der Leukämie richtete ihr Augenmerk bisher hauptsächlich auf gegenüber leukämischen Zellen cytotoxische Wirkungen? in jüngster Zeit steht allerdings die Wiederherstellung normaler Funktionen bei disdifferenzierten leukämischen Zellen, d.h. die Entwicklung von Mitteln zur Decarcinogenese in Krebszellen, im Vordergrund. (_vgi_# chemistry and Biology, 13, Nr. 6 (1975) 380 - 82).

Zur Herstellung von Mitteln zur Erzielung einer derartigen Decarcinogenese sind das Verfahren nach Ichikawa et al zur Kultivierung fetaler Säugerzellen (Journal of Cellular Physiology, χ4 (1969) 223j J6_ (1970) 1975, und Gann, j54 (1973) 257) sowie das Verfahren nach Sachs et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America χθ (1973) 3^3) angegeben worden.

Das Verfahren von Ichikawa et al. wird wie folgt durchgeführt:

Ein Mäusefetus wird unter aseptischen Bedingungen ausgenommen und ebenfalls unter aseptischen Bedingungen mit der Schere zerschnitten; zur Isolierung der Fetal-

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zellen wird anschließend eine trypsinhaltige Pufferlösung zugesetzt. Die isolierten Zellen werden in eine Schale gegeben, worauf zur Kultivierung und Erzielung von Primärkulturzellen ein Kulturmedium zugesetzt wird. Als derartiges Medium wird mit 10 Vol.-Ji Pferde- oder Kälberserum versetztes Eagle-MEM-Medium verwendet. Die unter Bildung einer Monoschicht gewachsenen Zellen werden mit Trypsin von der Glasoberfläche der Schale abgelöst und auf demselben Medium zur Erzielung von Sekundärkulturzellen nochmals kultiviert. In beiden Fällen wird die Kultivierung in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß, das 5 % Kohlendioxid enthält, bei 37 ⁰C und einer Feuchte von 100 % 3 - 5 Tage vorgenommen.

Es wird angenommen, daß sich in der Sekundärzellen-Kulturflüssigkeit eine Substanz befindet, die zur Wiederherstellung normaler Funktionen gegenüber schlechtdifferenzierten myelogenen Leukämiezellen von Mäusen in der Lage ist, die zur Differenzierung und Reifung von Granulocyten oder Makrophagen führt. Man weiß, daß diese Substanz ein nichtdialysierbares hochmolekulares Protein darstellt, das durch 30 min langes Erwärmen auf 70 ⁰C oder durch 2 h lange Behandlung mit einer 0,4 mg/ml Trypsin enthaltenden Lösung bei 37 ⁰C inaktiviert werden kann.

Das Verfahren von Sachs et al. wird wie folgt durchgeführt:

Als Kulturzellinie von Mäuse-Fetalzellen (Swiss-Mäuse) vorliegende El-Zellen werden in mit 10 % Pferdeserum versetztem Eagle-MEM-Medium dispergiert und in eine Kunststoffschale gebracht; nach 3-4 Tage dauernder Kultivierung bei 37 ⁰C zur Erzeugung einer Monoschicht

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von Zellen wird das Medium entfernt und mit phosphatgepufferter Dulbecco-SalzlÖsung (im folgenden als PBS® abgekürzt) drei- bis viermal gewaschen; danach wird nicht mit Serum versetztes Eagle-MEM-Medium zugegeben und 3-4 Tage bei 37 ⁰C weiterkultiviert. Es ist bekannt, daß die so erhaltene Kulturflüssigkeit eine Substanz enthält, die zur Wiederherstellung normaler Funktionen bei schlecht-differenzierten myelogenen Leukämiezellen von Mäusen zur Differenzierung und Reifung von Granulocyten und Ma rophagen in der Lage ist. Der Wirkstoff wird durch Ultrafiltration mit Diaflo-Membranen, Säulenehromatcg^Efhie an Hydroxylapatit, an DEAE-Cellulose sowie anschließend an Sephadex-G-150 in der angegebenen Reihenfolge zu einem elektrophoretisch einheitlichen Protein gereinigt. Es ist bekannt, daß diese Substanz ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 68.000 darstellt, das kein Cystin, Cystein, keine Hexosamine und Zucker enthält und durch Pronasebehandlung inaktiviert wird.

Die genannten herkömmlichen Verfahren weisen jedoch folgende Nachteile auf:

Das Verfahren nach Ichikawa et al. hat den Nachteil, daß die Wirkung der KuItürflüssigkeit auf die Wiederherstellung normaler Punktionen bei schlecht-differenzierten leukämischen Zellen je nach Art des dem Medium zugesetzten Tierserums bzw. je nach Ansatz des von derselben Tierart stammenden Serums um etwa den Faktor 4 schwankt (vgl. Experimental Research £0 (1975) 20).

Das Verfahren nach Sachs et al. ist vom Ergebnis

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her nur dann spezifisch, wenn als Reinkultur vorliegende El-Zellen eingesetzt werden. Aufgrund von Untersuchungen der Erfinder an verschiedenen in Reinkultur vorliegenden Zellen wurden allerdings in derartigen Kulturflüssigkeiten im Gegensatz von der von Sachs et al. vertretenen Auffassung keinerlei Substanzen mit einer die normale Funktion von Zellen wiederherstellenden Wirkung aufgefunden.

In jüngster Zeit berichteten Maeda et al., daß eine Kulturflüssigkeit mit einer Substanz, die bei schlechtdifferenzierten leukämischen Zellen in hoher Konzentration eine die normale Funktion wiederherstellende Wirkung aufweist, durch Kultivieren tierischer Fetalzellen in einem zur Verbesserung der herkömmlichen Verfahren anstelle von Säugerserum mit Rinderserumalbumin versetzten Medium erhältlich sind (vgl. The description of the 34th General Meeting of the Cancer Society of Japan, p. 127, 1975). Ichikawa et al. berichteten ferner, daß eine Kulturflüssigkeit derselben Wirksamkeit durch Kultivieren menschlicher Fetalzellen in einem mit Kälberserum versetzten Medium erhalten werden kann (vgl. Gann. j54, 3 (1973) 257 - 63). Diese Verfahren verwenden allerdings tierische und nicht menschliche Zellen oder menschliche Fetalzellen und Serum oder Serumalbumin von Tieren und nicht von Menschen. Bei der Verabreichung von Medikamenten, die eine nach diesem Verfahren erhaltene Kulturflüssigkeit enthalten, an Menschen treten entsprechend aufgrund der Anwesenheit von tierischem Serum oder Serumalbumin Antigen-Antikörper-Reaktionen auf, so daß derartige Medikamente nicht praktisch verwendbar sind. Es ist ferner aus ethischer bzw. moralischer Sicht sowie im Hinblick auf die

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öffentliche Meinung abträglich, hierfür menschliche Fetalzellen zu verwenden. Die genannten herkömmlichen Verfahren können entsprechend nicht industriell angewandt werden. Dementsprechend liegen bisher keine Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie vor, die eine Zellkultur enthalten, die bedenkenlos an Menschen verabreicht werden kann.

Der Erfindung liegen Untersuchungen zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung der myeloischen Leukämie zugrunde, das keine Antigen-Antikörper-Reaktion hervorruft, die bei den bisherigen Verfahren das bei weitem gravierendste Problem darstelltj dabei wurde festgestellt, daß eine durch Kultivieren menschlicher Amnionzellen erhaltene Kulturflüssigkeit, die bisher noch nie zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung der myeloischen Leukämie herangezogen worden war und in einem Humanserumalbumin enthaltenden Medium leicht zugänglich ist, eine die normalen Punktionen wiederherstellende Wirkung gegenüber schlecht-differenzierten myelogenen leukämischen Zellen aufweist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel gegen myeloische Leukämie und sein Herstellungsverfahren anzugeben, nach dem das Mittel leicht und in hoher Konzentration zugänglich ist, das nicht zum Auftreten von Antigen-Antikörper-Reaktionen bei der Verabreichung an Menschen führt und bei myelogenen leukämischen Zellen in spezifischer Weise auf die Wiederherstellung normaler Funktionen hin wirkt.

Das erfindungsgemäße Mittel zur Behandlung der myeloischen

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Leukämie wird gemäß der Erfindung nach folgendem Verfahren hergestellt;

(1) Vorkultivieren menschlicher Amnionzellen, die durch Trypsinbehandlung aus menschlichem Amnion oder durch mindestens einmaliges Subkultivieren isolierter Amnionzellen in einem Kälberserum oder Rinderfetalserum enthaltenden Medium erhalten wurden, während 1-5 Tagen zur Erzeugung einer Monoschicht,

(2) Entfernen des Mediums,,

(3) Zusatz eines 0,5 - 20 mg/ml menschliches Serumalbumin enthaltenden Mediums,

(4) Kultivieren während 3-6 Tagen,

(5) Dialysieren gegen verdünnten Puffer oder Wasser und

(6) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kulturflüssigkeit unter aseptischen Bedingungen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand einer bevorzugten Ausführungsweise näher erläutert«

1» Herstellung der Amnionzellen

Das erfindungsgemäß verwendete Amnion wird von der' Placenta einer Frau gewonnen, die in normaler Weise oder durch Kaiserschnitt von einem Kind entbunden worden war; das Amnion wird in eine 0,3 % (G/V) Penicillin enthalten-

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de sterilisierte Hanks-Lösung eingebracht und bis zum Beginn der Herstellung des Mittels bei 4 ⁰C aufbewahrt. Ein von einer Placenta einer Prau gewonnenes Amnion, die normal entbunden wurde, ist mit einer antiseptischen Lösung zur Sterilisation beim Durchtritt des Kindes während des Geburtsvorgangs kontaminiert, so daß dabei die Gefahr besteht, daß die Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels hierdurch ungünstig beeinflußt wird; es ist entsprechend wünschenswert, ein von der Placenta einer Frau gewonnenes Amnion einzusetzen, die wenn möglich durch Kaiserschnitt entbunden wurde. Das von der Placenta abgeschnittene Amnion wird wünschenswerterweise zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels so rasch wie möglieh verwendet« Auch bei Aufbewahrung bei niedrigen Temperaturen sterben die Amnionzellen innerhalb 2k- h nach der Gewinnung ab. Das erhaltene Amnion wird unter aseptischen Bedingungen mit einer sterilisierten PBS -Lösung and ■ einem sterilisierten Eagle-MEM-Medium (Hersteller MIssui Seiyaku Company, Japan) je zweimal gewaschen, zu Stücken von etwa 5 χ 5 cm zerschnitten, in eine Schale gebracht, dreimal mit Eagle-MEM-Medium gewaschen, unter aseptischen Bedingungen mit einer Schere zerschnitten, mit einer wäßrigen, 0,25 Gew.-% Trypsin enthaltenden Lösung versetzt und unter aseptischen Bedingungen bei Raumtemperatur 30 - 60 min zur enzymatischen Behandlung gerührt.

Anschließend wird ein 10 - 20 % Kälber- oder Rinderfetalserum enthaltendes Eagle-MEM-Medium der durch Trypsin abgebauten Lösung zur Verhinderung einer weiteren Trypsinelnwirkung zugesetzt und das Gemisch durch ein rostfreies Stahlsieb von 0,1 - 0,l8 mm (80 - 150 mesh) zur Entfernung

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der Zellbestandteile unter aseptischen Bedingungen hindurchpassiert .

2. Primärkultur

Die so erhaltene Suspension von Amnionzellen wird unter aseptischen Bedingungen bei 1000 U/min 10 min zur Zellgewinnung zentrifugiert, die anschließend im gleichen sterilisierten Eagle-MEM-Medium suspendiert werden. Ein Teil der Suspension wird entnommen und darin die Anzahl lebensfähiger Zellen nach dem nachstehend beschriebenen Eosin-Färbeverfahren ermittelt; die Amnionzellen werden darauf in einem sterilisierten Eagle-MEM-Medium im Bereich von jeweils 5 χ 10 - 10' pro 10 ml Medium eingeimpft. Eine Eosin-Lösung von in PBS® mit einer Konzentration von 0,5 % (G/V) gelöstem Eosin-Y-Pulver und die Zellsuspension werden im. gleichen Mengenverhältnis gemischt. Ein Tropfen des Gemischs wird auf ein Hämacytometer getropft und mikroskopisch untersucht. Auf diese Weise wird die Anzahl lebensfähiger Zellen durch Ermittlung der rotgefärbten Zellen als tote Zellen und der nicht gefärbten Zellen als lebende Zellen bestimmt.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren zum Vorkultivieren oder der Bildung der Monoschicht eingesetzte Medium wird durch Zusatz von 10 - 20 % Kälberserum (innerhalb einer Woche nach Geburt) oder Rinderfetalserum zu einem (im folgenden als EM-Medium bezeichneten) Medium herge stellt, das durch Zusatz von MEM-Aminosäure-Vitaminmedium (Hersteller. Nissui Seiyaku Company, Japan) zu Eagle-MEM-Medium in der Weise hergestellt wurde, daß der Aminosäuregehalt und der Vitamingehalt zweifach höher liegen als die

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Menge an Eagle-MEM-Medium.

Obgleich zur Kultur der isolierten Amnionzellen Schalen verwendet werden können, ist die Verwendung eines größeren Zellkulturgefäßes (Hersteller Sterilin Company) zur Erzeugung größerer Mengen des erfindungsgemäßen Mittels wünschenswert. Dieser Reaktor ist mit einem spiralförmigen Kunststoffilm versehen, an dem die Zellen innerhalb eines Zylinders haften.

Die wie oben isolierten menschlichen Amnionzellen werden in ein Medium von 10 ml pro Schale eingeimpft und in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß bei yj ⁰C und 100 fo relativer Feuchte kultiviert. Nach 3-4 Tagen wird das Medium zur Entfernung aufschwimmender abgestorbener Zellen und Erythrocyten gegen ein frisches Medium ausgetauscht. Die Zellen werden unter denselben Bedingungen noch einige Tage weiterkultiviert, bis sie an der Bodenfläche der Schalen unter Bildung einer Monoschicht anhaften.-Auf diese Weise werden Primärkulturzellen erhalten. Die Primärkulturzellen können zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels herangezogen werden.

3. Subkultur

Nach Erhalt der Primärkulturzellen wird das Medium entfernt, worauf die Zellen mit PBS® -Lösung gewaschen und von der Bodenfläche der Schale durch Zusatz einer 0,05 gew.-^igen wäßrigen Trypsinlösung abgelöst werden. An den Zellen wird in derselben Weise wie oben nach dem

Eosin-Färbeverfahren die Anzahl lebender Zellen bestimmt; es wird mit EM-Medium auf eine Zellkonzentration von je-

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C f.

wells etwa 5 x ICr <·«·/ 10 pro ml verdünnt; die Zellen werden anschließend zusammen mit EM-Medium, das mit Kälberserum oder Rinderfetalserum versetzt ist, in eine Kunststoffschale gebracht und darin in derselben Weise kultiviert, worauf Sekundärkulturzellen erhalten werden. Die Sekundärkulturzellen können zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels verwendet werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es wünschenswert, das Mittel unter Verwendung von sekundären menschlichen Amnionzellen herzustellen, die in der angegebenen Weise mindestens einmal nach einem herkömmlichen Verfahren subkultiviert wurden. Die Subkulturschritte werden zur Erzielung von Amnionzellen durchgeführt, die keine unnötigen Bestandteile wie abgestorbene Zellen und Erythrocyten enthalten. Wenn die Menge der sekundären menschlichen Amnionzellen ferner so gering ist, daß sie nicht in großer Menge kultiviert werden können, werden eine oder mehrere Subkulturen zur Erhöhung der Zellzahl wiederholt, wobei die Zellen der tertiären und weiteren Kulturen zur Herstellung des Mittels verwendet werden können. In einem derartigen Fall wird allerdings die Zellvermehrung allmählich mit zunehmender Wiederholung der Subkultivierung unterdrückt; dabei wurde festgestellt, daß aus morphologisch veränderten und immer weiter vermehrten Zellen keine Substanz mehr gewonnen werden kann, die eine die normalen Zellfunktionen bei schleeht-differenzierten leukämischen Zellen wiederherstellende Wirkung aufweist; die Subkultivierung ist entsprechend auf etwa 15 Wiederholungen begrenzt.

4. Vorkultur

Die oben beschriebenen isolierten oder subkultivierten

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menschlichen Aranionzellen werden in ein mit demselben Serum wie oben versetztes EM-Medium in einer Menge von

f. 7

jeweils 5 χ 10 <*-- 10' pro 10 ml Medium eingeimpft und in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 1-5 Tage bei 37 ⁰C kultiviert, wobei die Zellen an der Bodenfläche der Schale haften. Anschließend wird das Medium entfernt, worauf die Zellen zur vollständigen Entfernung des Serums zur Beendigung der Vorkultur dreimal mit PBS® -Lösung gewaschen werden. Die Vorkultur wird dabei mit der Absicht durchgeführt, daß die menschlichen Amnionzellen an der Bodenfläche der Schale haften, wobei nicht angestrebt ist, eine Kulturflüssigkeit zu erhalten. Die Vorkulturzeit wurde durch den nachstehend beschriebenen Test 1 bestimmt.

Test 1

Von Ichikawa et al. aus dem Knochenmark von SL-Mäusen mit spontaner myeloblastischer Leukämie reinjcultivierte Ml-Zellen stellen eine Zellinie dar, die myeloblastische leukämische Zellen enthält, die ihre Vermehrung in Medium unter gewöhnlichen Kulturbedingungen wiederholen, da sie sich in ihrem undifferenzierten Zustand befinden. Wenn sich allerdings die Ml-Zellen bei Zusatz eines Mittels, das im Sinne einer Wiederherstellung der normalen Funktionen myelogener Zellen gegenüber leukämischen Zellen (Ml-Zellen) wirkt, und anschließende Zellkultur zu Granulocyten oder Makrophagen mit Mobilität und Phagocytosewirkung differenzieren, ist das entsprechende Mittel zur Behandlung der myeloischen Leukämie wirksam.

Von den Erfindern wurde die Phagocytosewirkung von Ml-Zellen untersucht, die mit dem erfindungsgemäßen Produkt bzw. dem Produkt aus der erfindungsgemäßen Kulti-

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vierung versetzt worden waren. Dabei wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 fünf Probenarten hergestellt, die ^Lch darin unterschieden, daß 0, I₃ j>, 5 und 7 Tage vorkultiviert wurde.

Die Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels auf die Phagocytosewirkung wurde an diesen Proben wie folgt bestimmt:

Zunächst wurde ein Medium durch Zusatz von 10 % Kälberserum zu EM-Medium hergestellt. Je 5 ml der Testmedien, die durch Zusatz von jedem der oben beschriebenen Proben zu dem Medium zu einer Konzentration von 25 Vol.-$ hergestellt worden waren, sowie das nicht mit der Probe versetzte Medium (Kontrollversuch 1) wurden mit Ml-Zellen in einer Konzentration von jeweils 5 χ 10^ geimpft und in Kunststoffschalen von β cm Durchmesser in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 3 Tage bei yj ⁰C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen mit einem Gummiwischer gesammelt, worauf in jedem Medium die Zahl lebensfähiger Zellen nach dem oben beschriebenen Eosin-Färbeverfahren bestimmt wurde. Nach der Abtrennung des Mediums durch Zentrifugieren wurden die von jeder Probe gewonnenen Zellen getrennt in 2 ml EM-Medium suspendiert, das keinen Serumzusatz enthielt und mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrollatex mit einem Partikeldurchmesser von 1 ,um in einem Verhältnis von 1 Tropfen auf 20 ml Medium versetzt worden war. Nach 4-stündigem Stehenlassen bei 37 ⁰C wurden die Zellen zum Auswaschen von nicht durch die Zellen phagocytierten Teilchen und auf der Zelloberfläche anhaftender Partikel mit PBS® gewaschen. Anschließend wurde ein Tropfen der Zellsuspension auf ein Hämocytometer' aufgetropft und ferner ein Tropfen der Eosin-Lösung zugesetzt; die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen und die Zahl der Polystyrollatex-Partikel

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enthaltenden Zellen wurde mikroskopisch ermittelt. Der Prozentsatz der Polystyrollatex-Partikel enthaltenden Zellen bezogen auf die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen liefert bei der Berechnung entsprechend die Phagocytosewirkung der Zellen zum Vergleich der Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Dauer des Vorkultivierens Phagocytosewirkung

(Tage) (ß)

0 19,2

1 68,8

3 67,7

5 60,0

7 56,3

Kontrollversuch 1 0,4

Bei der Probe, bei der keine Vorkultur durchgeführt wurde, haften fast keine Zellen an der Bodenfläche der Schale, sondern bleiben in der Kulturflüssigkeit suspendiert; sie weisen ferner nur geringe Phagocytosewirkung auf. Bei der Probe, die über mehr als 5 Tage vorkultiviert und ferner K Tage in einem mit Serumalbumin versetzten Medium weiterkultiviert war, wurde, obgleich kaum eine Verringerung der Phagocytosewirkung festgestellt wurde, beobachtet, daß sich die Zellen von der Bodenfläche der Schale ablösten und eine Suspension bildeten, wobei eine Zellzerstörung auftrat und die intra-

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cellulären Bestandteile in die Kulturflüssigkeit hinein eluiert wurden, weshalb die Probe zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels ungeeignet war.

Aus den oben angeführten Testergebnissen geht hervor, daß eine Dauer von 1 Tag für das Vorkultivieren aus reichend ist; falls, sich jedoch eine Monoschicht nur schwierig bildet, kann die Vorkultivierung bis zu 5 Tage lang durchgeführt werden.

5. Kultivieren .

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird EM-Medium, das Humanserumälbumin in einer Menge von 0,5 - 20 mg/ml enthält, zu menschlichen Amnionzellen zugegeben, deren Vorkultivierung wie oben beschrieben beendet ist und die eine Monoschicht bilden; die menschlichen Amnionzellen werden in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 2-6 Tage bei 37 ⁰C kultiviert, wobei eine Kulturflüssigkeit erhalten wird. Die Menge an dem Medium zugesetztem Humanserumalbumin sowie die Dauer der Kultivierung- in Tagen wurden anhand der Tests 2 und 3 ermittelt. ;

Test 2

Es wurden sieben Arten von Proben in derselben Weise wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied hergestellt, daß die Menge an dem Medium zugesetztem Humanserumalbumin 0 mg (Kontrollversuch 2), 0,25 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 20 mg und 40 mg pro ml Medium betrug. Die Phagocytosewirkung derMl-Zellen wurde an diesen Proben nach denselben Verfahren wie in Test 1 gemessen, wobei die Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels in Abhängigkeit von

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der zugesetzten Menge an Serumalbumin untersucht wurde.

Daneben wurde als Kontrollversuch 1 eine Probe verwendet, die nicht mit der in derselben Weise wie bei Kontrollversuch 1 von Test 1 hergestellten Kulturflüssig keit versetzt war. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2	0,8
	6,0
Menge an Humanserumalbumin Phagocytosewirkung (mg/ml) {%)	10,5
Kontrollversuch 1	56,2
0 (Kontrollvers.2)	56,5
0,25	72,7
0,5	65,7
1,0	48,5
5,0
20,0
40,0

Bei dem Kontrollversuch 1 und einer Probe (Kontrollversuch 2), die ohne Zusatz von Serumalbumin kultiviert wurde, wurde keine Phagocytosewirkung festgestellt. Ferner ergab sich, daß eine unter Zusatz von 0,25 mg/ml Humanserumalbumin kultivierte Probe eine niedrige Phagocytosewirkung aufwies. In einer mit 40 mg/ml kultivierten Probe waren die Zellen zerstört und die Zellinhaltsstoffe ausgetreten; derartige Verhältnisse sind zur Präparation des erfindungsgemäßen Mittels entsprechend

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nicht günstig. Beim erfindungsgemäßen Verfahren beträgt
die günstige Menge an dem Medium zugesetztem Serumalbumin entsprechend 0,5 - 20 mg pro ml Medium.

Test 3

Es wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 sechs Arten von Proben mit dem Unterschied hergestellt, daß die Amnionzellen nach einer Vorkultivierung von 1, 2, 3, 5, 6 und 8 Tagen kultiviert wurden. Die Phagocytosewirkung von Ml-Zellen wurde an diesen Proben nach denselben Verfahren wie in Test 1 zur Bestimmung der Wirksamkeit des Mittels
untersucht.

Daneben wurde eine in derselben Weise wie in Kontroll versuch 1 von Test 1 hergestellte und nicht mit der Kultur flüssigkeit versetzte Probe als Kontrollversuch 1 verwendet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt.

	Tabelle 3	Phagocytosewirkung (*)
Dauer des Kultivierens (Tage)		9,6 42,1 67,3 66,8 69,4 63,6 0,6
1 2 3 5 6 8 Kontrollversuch 1

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Eine nur 1 Tag lang kultivierte Probe weist nur niedrige Phagocytosewirkung auf. Auf der anderen Seite zeigen durch 8-tägiges Kultivieren erhaltene Proben zwar eine hohe Phagocytoseaktivität, jedoch zugleich auch den Befund, daß sich menschliche Amnionzellen von der Bodenfläche der Schale als Schicht ablösen und zerstört werden; es ist daher nicht günstig, die Kulturflüssigkeit von derartigen Proben zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels einzusetzen.

Die geeignete Kulturdauer beträgt erfindungsgemäß entsprechend etwa 2-6 Tage; zur Verkürzung der Kultur dauer ist eine Kultivierungszeit von 3 Tagen besonders günstig.

6. Dialyse und Filtration

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die wie oben beschrieben hergestellte Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Bestandteile des Mediums gegen PBS® dialysiert, keimfrei filtriert und unter aseptischen Bedingungen zur direkten Verwendung als flüssiges Mittel in Gefäße abgefüllt. Das durch Dialyse der KuItürflüssigkeit gegen verdünntes PBS^e erhaltene dialysierte Kulturmedium kann keimfrei filtriert und zur Gewinnung eines pulverförmigen Mittels weiter unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert werden. Die KuItürflüssigkeit kann ferner auch ultrafiltriert werden, wobei eine Fraktion mit einem Protein von 30.000 100.000 Molekulargewicht als Hauptbestandteil erhalten wird; die Fraktion kann zur Verwendung als flüssiges Mit-

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tel keimfrei filtriert oder zur Verwendung als Mittel in Pulverform gefriergetrocknet werden. Das pulverförmige Mittel wird zur Verwendung für Injektionszwecke geeigneterweise in sterilem Wasser, sterilisierter physiologischer Salzlösung, Dextroselösung o.dgl. gelöst. Das erfindungsgemäße flüssige Mittel kann ferner auch in der vorliegenden Form selbst zur Injektion verwendet werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte Mittel wird den Patienten i.v. in einer Dosierung von 13 - 640 mg/kg Körpergewicht pro Tag durch Injektion verabreicht; die Dosierung beruht dabei auf den in Test 5 angegebenen Ergebnissen von Tierversuchen an Mäusen.

7. Wirksame Menge Test 4

Es wurde geprüft, ob Mäuse, die mit dem erfindungsgemäßen, nach dem erfindungsgemäßen' Verfahren erhaltenen Mittel behandelt worden waren, nach der Transplantation von Ml-Zellen an myeloischer Leukämie erkranken oder nicht.

Durch Zusatz der in derselben Weise wie in Beispiel 1 erhaltenen KulturflUssigkeit in einer Menge von 6,25 Vol.-12,5 Vol.-/» und 25 VoI.-^ zu EM-Medium wurden drei Arten von Medien hergestellt, ferner ein nicht mit der Kulturflüssigkeit versetztes EM-Medium (Kontrollversuch). Auf jede der vier Arten von Medien wurden Ml-Zellen in einer Menge von 3 χ ICP/tnl Medium eingeimpft und in einem Kohlen dioxidgefäß 3 Tage bei 37 °C kultiviert. Nach der KuIti-

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vierung wurde ein Teil der Ml-Zellen zur Untersuchung der Phagocytosewirkung in derselben Weise wie in Test 1 entnommen. Die verbliebenen Ml-Zellen wurden zweimal mit PBS® gewaschen, worauf die Zahl der lebensfähigen Zellen nach dem oben beschriebenen Eosin-Färbeverfahren ermittelt wurde; anschließend wurden die Zellen in einer Menge von 1 χ 10-Vmli 1 ^x 10 /ml und 1 χ 10^/ml zur Herstellung von Ml-Zeilsuspensionen in PBS® suspendiert.

44 β Wochen alte SL-Mäuse wurden in 11 Gruppen von jeweils 4 Mäusen aufgeteilt; jeder Maus vrurde 0,1 ml der obigen Ml-Zellsuspension einmal über die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden 1 Monat mit Wasser und Nahrung (Hersteller Nippon Kurea Company, Japan), die frei zur Verfügung stand, aufgezogen. Zur Untersuchung der decarcinogenen Wirkung des Mittels auf Ml-Zellen wurden die Mäuse im Anschluß daran zerlegt, um festzustellen, ob ein Ausbrechen myeloischer Leukämie am Zustand der Vergrößerung der Lymphknoten und der Milz festgestellt werden konnte.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 angegeben.

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Tabelle 4

Menge an dem
Medium zugesetzter Kulturflüssigkeit

Phago- Menge transcytose- plantierter wirkung Zellen

Anzahl an Leukämie erkrankter Tiere/ Gesamtzahl der Tiere

0 (Kontrolle) 0,4

6,25 18,2

12,5 39,4

25,0 68,1

1O₁ 10

lo

¹⁰

4/4 4/4 2/4

4/4 2/4 0/4

1/4 0/4 0/4

1/4 0/4

Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, nimmt die Anzahl der an Leukämie erkrankten Tiere mit steigender Konzentration des einem Ml-Zellen-Kulturmedium zugesetzten Mittels ab. Insbesondere wenn die Kulturflüssigkeit in einer Konzentration > 12,5 % zugesetzt wird, fällt die Anzahl der erkrankten Tiere im Vergleich mit dem Kontrollversuch bemerkenswert ab.

Daraus geht hervor, daß die Funktion der Ml-Zellen durch ihre Kultivierung in einem mit dem erfindungsgemaßen Mittel in einer Menge > 12,5 % versetztem Medium normalisiert wurde.

Zur Untersuchung der Wirkung in Fällen, in denen das erfindungsgemäße Mittel an SL-Mäusen durch Injektion verabreicht wurde, die durch vorherige Transplantation von

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Ml-Zellen an myeloischer Leukämie litten, wurden ferner die im folgenden angegebenen Tierversuche durchgeführt.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Mittel enthält hochmolekulare Proteinej wenn dieses Mittel infolgedessen Tieren injiziert wird, kommt es zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion, so daß das Mittel nicht wiederholt verabreicht und die Wirkung entsprechend nicht geprüft werden kann. Aus diesem Grund wurden in derselben Weise wie gemäß der Erfindung Mittel für Tierversuche unter Verwendung von Zellen und Serumalbumin derselben Tierart hergestellt, die in den Versuchen verwendet wurde, worauf die Tiere damit getestet wurden. Das für dieses Experiment herangezogene Mittel wurde entsprechend durch Kultivieren von Mäusefetalzellen in einem mit Mäuseserumalbumin versetzten Medium hergestellt und Mäusen zur Bestimmung der akuten Toxizität sowie der zu verabreichenden wirksamen Dosis injiziert.

Da sich das in dieser Weise aus Mäusefetalzellen erhaltene Mittel für die entsprechenden Tierversuche hinsichtlich der Phagocytosewirkung aufgrund desselben Tests wie in Test 1 als dem erfindungsgemäß erhaltenen Mittel äquivalent erwies, wird angenommen, daß die aus den Tierversuchen in dieser Weise erhaltene akute Toxizität und wirksame Dosis*auf das zur Behandlung von Menschen vorgesehene erfindungsgemäße Mittel übertragen werden können und entsprechend gleiche Werte gelten.

Test 5

3 SL-Mäusen wurden am 14. Tag der Trächtigkeit 2.6 Feten unter aseptischen Bedingungen entnommen und unter asepti-

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sehen Bedingungen mit der Schere zerschnitten; anschließend wurden 60 ml einer wäßrigen Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,25 Gew.-^ zugesetzt, worauf zur Isolierung der Fetalzellen etwa 15 min bei 37 ⁰C enzymatisch behandelt wurde. Die Fetalzellen in einer Konzentration von 2 χ 10 wurden in jeweils 30 Schalen von 10 cm Durchmesser mit 10 ml sterilisiertem EM-Medium geimpft, das in einer Konzentration von 10 % mit Kälberserum versetzt worden war (Hersteller MBL Company, Lot No. 53²I-O), und in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß 6 Tage kultiviert, wobei das Medium zur Erzeugung einer Monoschicht primärer Fetalzellen jeden zweiten Tag ersetzt wurde. Danach wurde das Medium abgetrennt und 1,5 ml einer wäßrigen, 0,05 gew.-^igen Trypsinlösung pro Platte zugegeben, worauf die Monoschicht zur Ablösung der Zellen 15 min bei 37 ⁰C enzymatisch behandelt wurde. Die abgelösten Zellen wurden in je 35 Kulturschalen von 15 cm Durchmesser, die 22,5 ml desselben Mediums wie oben enthielten, in einer Menge von 2,25 χ 10 pro Platte eingeimpft und unter denselben Bedingungen 48 h kultiviert. Anschließend wurde das Medium in jeder Schale entfernt, worauf die Zellen dreimal mit PBS® gewaschen wurden. Anschließend wurden jeder Schale 22,5 ml EM-Medium zugesetzt, in dem Mäuseserumalbumin (Fraktion V, Hersteller Sigma Company) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst war, worauf 4 Tage in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß bei 37 ⁰C kultiviert wurde; von den 35 Platten wurden etwa 780 ml einer Kulturflüssigkeit erhalten, die einen Proteingehalt von 1,8 mg/ml aufwies.

Die Kulturflüssigkeit wurde unter Verwendung von Diaflo-Membranen (Typ XM-IOO, Hersteller Amicon Company) ultrafiltriert, wobei eine Fraktion mit einem Molekulargewicht unter'lOO.OOO erhalten wurde. Diese Fraktion

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wurde unter Verwendung von Aboor-Membranen (Typ HFA-300, Hersteller Bioengineering Company) ultrafiltriert, worauf eine Fraktion mit einem Molekulargewicht über 50.000 erhalten wurde; nach der Gefriertrocknung ergab die Fraktion etwa 600 ml eines weißen, pulverförmigen Mittels für Tierversuche .

Das so erhaltene Mittel wurde zu einer Konzentration von 10 % in PBS" gelöst und auf seine akute Toxizität durch intraperitoneale Verabreichung nach dem Verfahren von Lichfield und Wilcoxon (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics £0 (1949) 99) geprüft.

Die akute Toxizität (LDc₀) des Mittels ergab sich so zu 3.200 mg/kg.

Aufgrund der so erhaltenen akuten Toxizität wurden folgende Versuche zu Ermittlung der wirksamen Menge durchgeführt :

42 6 Wochen alten SL-Mäusen wurden jeweils 1 χ 10 Ml-Zellen intraperitoneal injiziert. Die Mäuse wurden in sieben Gruppen zu je 6 Mäusen aufgeteilt. Die 6 Mäuse der ersten Gruppe erhielten kontinuierlich 5 Tage vom folgenden Tag ab 0,5 ml sterilisierte physiologische Salzlösung pro Tag und Maus intraperitoneal injiziert; die Mäuse der zweiten Gruppe erhielten 0,5 ml einer 0,001 gew.-^igen wäßrigen Lösung von Mitomycin C injiziert, das bisher als Mittel zur Behandlung von Leukämie eingesetzt wird (die Darreichungsmenge wurde im Tierversuch unter Verwendung von Leukämiezellen L 1210 als wirksam angesehen); die Mäuse der dritten bis siebenten Gruppe erhielten 0,5 ml der wäßrigen Lösung des oben beschriebenen Mittels für Tierversuche in einer Menge von 1/500, I/250, 1/50, 1/5

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bzw. 1/5 der akuttoxischen Menge injiziert. Die Mäuse wurden dabei jeweils mit Wasser und frei zur Verfügung stehendem Futter aufgezogen. Im Anschluß daran wurde die mittlere Überlebensdauer in Tagen für jede Gruppe von Mäusen berechnet und der Index jeder Gruppe für 100 mittlere Überlebenstage der Kontrollgruppe daraus berechnet, um so die prozentuale Lebensdauerverlängerung zu bestimmen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

Testgruppe Nr.

Art des verabreichten Medikaments

Verabreichte mitt- Prozen-Menge (mg/kg lere tuale Körpergewicht Über- Lebensund Tag) lebens-dauer-

dauer verlänge-(Tage) rung

1 2

5 6

Physiologische Salzlösung (Kontrolle)

Mitomycin C

Mittel für Tierversuche

0,26 (1/20 LD₅₀) 57

1070 (1/5 LD₅₀) 57 640 (1/5 Li)₅₀) 49 64 .(1/50 LD₅₀₎ 50 12,8 (1/250 LD₉₀)49 6,4 (1/500 LD₅₀) 39

100

109

109 144 147 144 115

Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, zeigt die mit Mitomycin C als im Handel erhältlichem Mittel zur Behandlung von Leukämie behandelte Gruppe eine gegenüber der Kontrollgruppe um etwa 10 % verlängerte Lebenszeit.

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Im Gegensatz dazu liegt die prozentuale Verlängerung der Lebenszeit bei den Gruppen, die mit dem Mittel für Tierversuche behandelt wurden, das nach demselben Verfahren wie gemäß der Erfindung hergestellt war, insbesondere bei der vierten bis sechsten Gruppe, bemerkenswert höher. ,

Daraus geht hervor, daß die vierte bis sechste Gruppe eine 1,2-fach höhere Steigerung der prozentualen Lebensdauer als die mit Mitomycin C behandelte zweite Gruppe aufweist.

Die den Tieren der vierten biß sechsten Gruppe verabreichte Menge des Mittels für Tierversuche, d.h. 1J5 - 640 mg/kg Körpergewicht und Tag, ist entsprechend eine wirksame Menge.

Bei den vorstehenden Tests 1-4 wurde ferner ein Mittel durch Impfen vorkultivierter menschlicher Amnionzellen in ein Medium in einer Konzentration von 1 χ ICr/ml hergestellt und getestet. Wenn die Mittel durch Impfen der Zellen in anderen Konzentrationen hergestellt wurden, wurden dieselben Ergebnisse wie in den Tests 1-4 erzielt.

Beispiel 1

Aus den Plaoenten von drei durch Kaiserschnitt von ihrem Kind entbundenen Frauen wurde jeweils das Amnion herausgeschnitten und in sterilisierter Hanks-Flüssigkeit, die Penicillin in einer Konzentration von 0,3 % (G/V) enthielt* etwa 6 h bei 4 ⁰C aufbewahrt. Die Atnnionen wurden je zweimal mit sterilisierter PBS® -Lösung und Eagle-MEM-Medium gewaschen, zu Stücken von etwa 5 x 5 cm zerschnit-

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ten, in eine Schale gebracht, dreimal mit sterilisiertem EM-Medium gewaschen und unter aseptischen Bedingungen mit der Schere zerschnitten; anschließend wurden 120 ml einer wäßrigen Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,25 % (G/V) zugegeben, worauf zur Isolierung der Zellen etwa j50 min bei 37 °c enzymatisch behandelt wurde. Zu der trypsinbehandelten Suspension wurde 10 % Kälberserum (Lot No. 5340, Hersteller MBL Company) enthaltendes EM-Medium zugesetzt, worauf die Suspension zur Abtrennung der Zellmasse unter aseptischen Bedingungen durch Edelstahlsiebe von 0,l8 und 0,1 mm (80 und 150 mesh) passiert wurde.

Die suspendierten menschlichen Amnionzellen wurden in einer Konzentration von 1 χ ΙΌ' Zellen auf 30 Kunststoffschalen von 10 cm Durchmesser geimpft, die 10 ml mit 10 % Kälberserum versetztes sterilisiertes EM-Medium enthielten, und zur Erzeugung einer Monoschicht primärer menschlicher Amnionzellen in einem Kohlendioxidgefäß 10 Tage bei 37 ⁰C kultiviert, wobei das Medium jeden 3. Tag ersetzt wurde. Nach der Abtrennung des Mediums wurden 1*5 ml einer 0,05 $igen (G/V) wäßrigen Trypsinlösung pro Platte zugesetzt und die Monoschicht zur Ablösung der Zellen l5 min bei 37 ⁰C enzymatisch behandelt. Die abgelösten Zellen wurden in einer Menge von jeweils 2,25 χ 10^ auf 35 Kulturschalen von 15 cm Durchmesser geimpft, die 22,5 ml des oben beschriebenen Mediums enthielten, und unter den beschriebenen Bedingungen 3 Tage kultiviert; nach der Entfernung des Mediums wurde die kultivierte Monoschicht dreimal mit PBS® gewaschen.

Anschließend wurden 22,5 ml EM-Medium, das menschli-

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ches Serumalbumin (Fraktion V, Hersteller Sigma Company) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst enthielt, pro Platte zugegeben, worauf 4 Tage in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß bei 37 ⁰C kultiviert wurde; danach x^urden aus den 35 Schalen 78O ml KuItürflüssigkeit erhalten, die 1,8 mg Protein/ml enthielt.

Die Kulturflüssigkeit wurde zur Entfernung der Mediumsbestandteile gegen PBS® dialysiert. Die obige Kulturflüssigkeit wurde im Anschluß daran unter Verwendung eines Millipore-Filtriergeräts (Hersteller Japan Millipore Ltd.)* das mit einem 0,45-,um-Membranfilter (Typ TM-4, Hersteller Toyo Filter Paper Company) versehen und 15 min im Autoklaven bei 120 ⁰C sterilisiert worden war, unter aseptischen Bedingungen mit Hilfe einer Vakuumpumpe steril filtriert. Je 350 ml des aseptischen Filtrats wurden in eine sterilisierte 500-ml-Glasflasche für !»-Infusion gegeben und verschlossen, worauf zwei flüssige Mittel zur Infusion erhalten wurden.

Beispiel 2

In derselben Weise wie in Beispiel 1 mit Trypsin behandelte und abgelöste sekundäre menschliche Amnionzellen wurden auf sterilisiertes EM-Medium geimpft, das

10 % Kälberserum enthielt, wobei die Menge 8 χ 10 Zellen/8 1 Medium betrug. Die Kulturflüssigkeit wurde in einer Menge von 1,6 1 pro Gefäß in 5 große Zellkulturgefäße (Hersteller Sterilin Company) eingebracht .und im Anschluß daran unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 3 Tage unter Rotation der zylindrischen Gefäße

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mit 2 U/h vorkultiviert; nach der Entfernung des Mediums wurde die Vorkultur dreimal mit 400 ml PBS® gewaschen, pro Kulturgefäß mit 18 1 sterilisiertem EM-Medium versetzt, in dem Humanserumalbumin (Fraktion V, Hersteller Sigma Company) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst war, und 4 Tage bei 37 ⁰C in einem Kohlendioxid-Kulturgefäß kultiviert, worauf aus fünf großen Zellkulturgefäßen insgesamt 9 1 Kulturflüssigkeit gewonnen wurden, die einen Proteingehalt von 2,0 mg/ml aufwies. Die KuItürflüssigkeit wurde in einen Beutel aus Dialysiermembran eingebracht und in einen mit 100 1 50-fach verdünnter PBS® -Lösung gefüllten Metallgefäß unter Kühlung auf 4 ⁰C 12 h dialysiert, worauf anschließend in derselben Weise 12 h gegen 100 1 8,7-fach verdünnter PBS® -Lö sung dialysiert wurde; das dialysierte Kulturmedium wurde schließlich gefriergetrocknet, worauf 21 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. 20,6 g des Pulvers wurden in 1.000 ml bidestilliertem Wasser gelöst und in derselben Weise wie in Beispiel l keimfrei filtriert, anschließend unter, aseptischen Bedingungen auf 20 Ampullen aufgeteilt und verschlossen. Jede Ampulle enthielt 50 ml injizierbares Mittel, das gegenüber physiologischer Salzlösung isotonisch war.

Beispiel 3

In derselben Weise wie in Beispiel 1 erhaltene sekundäre menschliche Amnionzellen wurden zu tertiären menschlichen Amnionzellen weiter subkultiviert, die darauf in acht großen Zellkulturgefäßen in derselben Weise wie in Beispiel 2 kultiviert wurden, wodurch etwa 14 1 Kulturflüssigkeit erhalten wurden. Die KuIturflüssig-

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keit wurde ..in derselben Weise wie in Beispiel l dialysiert mit dem Unterschied, daß 30-fach verdünntes PBS® bzw. 8-fach verdünntes PB^ verwendet wurde. Das so erhaltene dialysierte Kulturmedium wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 keimfrei filtriert sowie ferner unter aseptischen Bedingungen in herkömmlicher Weise lyophilisiert, worauf etwa 33*2 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. 1,0 kg dieses Pulvers wurden unter aseptischen Bedingungen auf 33 Ampullen aufgeteilt und verschlossen. Zur Verwendung wurde das Mittel in 50 ml sterilem, bides tilliertem Wasser gelöst.

Beispiel

Etwa 14 1 einer Kulturflüssigkeit von menschlichen Amnionzellen, die in derselben Weise wie in Beispiel 3 erhalten war, wurden unter Verwendung von Diaflo-Membranen (Typ XM-100, Hersteller Amicon Company) zur Abtrennung einer Fraktion mit einem Molekulargewicht unter 100.000 ultrafiltriert, worauf die Fraktion mit Abcor-Membranen (Typ HFA-300, Hersteller Bio-engineering Company) nochmals ultrafiltriert und zugleich aufkonzentriert wurdej dabei wurden etwa 300 ml einer Fraktion mit einem Molekulargewicht über 50.000 erhalten. Die so erhaltene Fraktion wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 keimfrei filtriert, worauf je 12 ml des Filtrats unter aseptischen Bedingungen in 25 Ampullen eingebracht und unter aseptischen Bedingungen gefriergetrocknet wurden, worauf die Ampullen verschlossen wurden. Jede Ampulle enthielt 640 mg des weißen Pulvers. Zur Verwendung wurde das Mittel in 20 ml sterilisierter PBÖ® -Lösung gelöst.

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Claims

Ansprüche

fi\ Mittel zur Behandlung der rayeloischen Leukämie, erhalten durch

(1) Vorkultivieren menschlicher Amnionzellen, die durch Trypsinbehandlung aus menschlichem Amnion oder durch mindestens einmaliges Subkultivieren isolierter Amnionzellen in einem Kälber- oder Rinderfetalserum enthaltenden Medium erhalten wurden, während 1-5 Tagen zur Erzeugung einer Monoschicht,

(2) Entfernen des Mediums,

(5) Zusatz eines 0,5 - 20 mg/ml Humanserumalbumin enthaltenden Mediums,

(4)" Kultivieren während J5 - β Tagen,

(5) Dialysieren gegen verdünnten Puffer oder Wasser und

(6) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kulturflüssigkeit.
2. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

(1) Vorkultivieren menschlicher Amnionzellen, die durch Trypsinbehandlung aus menschlichem Amnion oder durch mindestens einmaliges Subkultivieren

709S1-7/0ÖU

ORIGINAL

isolierter Amnionzellen in einem Kälber- oder Rinderfetalserum enthaltenden Medium erhalten wurden, während 1-5 Tagen zur Erzeugung einer Monoschicht,

(2) Entfernen des Mediums,

(3) Zusatz eines 0,5 - 20 mg/ml Humanserumalbumin enthaltenden Mediums,

(4) Kultivieren während 3-6 Tagen,

(5) Dialysieren gegen verdünnten Puffer oder Wasser und

(6) Sterilfiltrieren der so erhaltenen dialysierten Kulturflüssigkeit.
3. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Mittel nach Anspruch 1, ggf. zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfs- und Trägerstoffen, als Wirkstoff enthalten.

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