DE1910715A1

DE1910715A1 - Antimikrobielle Faktoren und deren Verwendung

Info

Publication number: DE1910715A1
Application number: DE19691910715
Authority: DE
Inventors: Berberich Norbert John; Cook Elton Strauss
Original assignee: Stanley Drug Products Inc
Current assignee: Stanley Drug Products Inc
Priority date: 1968-03-04
Filing date: 1969-03-03
Publication date: 1969-10-09
Also published as: NL6903238A; JPS5512412B1; GB1262147A; FR2003203A1

Description

1310715

DR. WALTER NlELSCH

Patentanwalt

2 Hamburg 70 28. Feb. 1959

SdiloßstraBe 112 Postfach 10914 Fernruf: 652 97 07

Stanley Drug Products, Inc., Portland _t Oregon

(Vereinigte Staaten von Nordamerika)

Antimikrobielle Paktoren und deren Verwendung

Diese Erfindung bezieht sich auf Substanzen, die antimikrobielle Aktivität besitzen und auf Verfahren, um diese Paktoren zu erhalten·. Nahezu bis jetzt herrschte die Ansicht, daß normale Haut und Schleimhautoberflächen undurchdringliche Barrieren für den Durchtritt der meisten Mikroorganismen bilden wurden* Jedoch ist es jetzt bekannt, daß verschiedene Körpergewebe häufig einer Ansammlung von Mikroorganismen ausgesetzt sind* Man muß daher die Fähigkeit der Bakterien sich zu vermehren feststellen, wenn sie in die Gewebe durchgedrungen sind. Es gibt experimentelle Peststellungen, daß in gesunden Säugern die Gewebe selbst Mittel oder antimikrobiel-Ie Paktoren enthalten, die eine Vermehrung verhindern oder das Überleben der Mikroorganismen selbst.

Studien an normalen menschlichen Geweben zeigen, daß solche Gewebe verschiedene Substanzen enthalten, die antimikrobiologische Wirkungen besitsen«, Untersuchungen dieser Art sind in unseren Laboratorien über 25 Jahre lang durchgeführt worden. Diese Arbeiten haben ergeben, daß in tierischen Geweben nicht spezifische Materialien anwesend sind. Extrakte aus Rindergehirn und der Rindermilz sind seit langem - wie auch andere Organe und Gewebe - für Forschungsuntersuchungen verwendet worden.

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Nutini und Lynch berichten in Nature, Band 156, 194-5, Seite 419 und im Journal of Bacteriology, Band 52, 1946, Seite 681, daß rohe Extrakte aus Rindergehirn, wenn diese prophylaktisch in vivo verabreicht wurden, ganz ausgezeichnete Schutzgrade bei der Maus gegen Staphylokokkeninfektionen erzielten. Der gleiche Extrakt wurde auch als gut therapeutisch wirksam festgestellt. Wenn der Extrakt in vitro benutzt wurde, wurde berichtet, daß er die gelbe B Varietät (virulent) in eine avirulente weiße R Type umwandelte.

Selbst solche Arbeiten mit Antistaphylokokkenfalcboren sind im Gehirn und in der Milz von Säugern seit über 20 Jahren durchgeführt worden, aber unsere Kenntnis in diesem Gebiet ist unbefriedigend geblieben. Tatsächlich ist das ganze Gebiet der Grundmechanismen der Virulenz, Pathogenität und die eng im Zusammenhang stehenden Aspekte der Wirts -Parasiten Beziehungen bei Staphylokokken und ähnlichen Infektionen, wie Streptokokken-Infektionen,noch größtenteils unverständlich und zeigt eine riesige Varietät von Problemen. Viele von diesen sind bis jetzt spekulativ oder teleologisch geblieben. Selbst die Fähigkeit der alkoholisch niedergeschlagenen Extrakte des Rindergehirns bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Staphylokokkeninfektionen ist· bestätigt worden, jedoch verschiedene andere Materialien, diein dem rohen Extrakt zusammen mit den aktiven Hauptbestandteilen anwesend sind, verhindern ihren breiten Gebrauch.

Viele Versuche sind durchgeführt worrden, um die rohen Extrakte zu fraktionieren und den aktiven Hauptbestandteil zu isolieren. Direkte oder indirekte Lösungsmittelextraktionsmethoden sind benutzt worden, aber die Ergebnisse sind widersprechend und die doppelte Durchführung der Arbeit ist sehr schwierig. Da Äther, Chloroform, Pyridin und Phenol als Lösungsmittel häufig benutzt wurden, besitzt die Lösungsmittelextraktion den Nachteil, daß verschiedene benötigte

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Lösungsmittel später Toxizitätspr-oblernc aufwerfen. In der Vergangenheit sind die Fraktionen mit toxischan Mengen des Lösungsmittels verunreinigt gewesene Aus diesem Grunde ist die Lösungsmittelextraktion nur teilweise erfolgreich gewesen,* Die Methoden sind auch im einzelnen allzu sy sterne.;, „sch und fraglich, um kommerzielle -Verwendbarkeit zu besitzen.

Viel Arbeit bei der Isolierung des aktiven Hauptbestandteiles aus tierischen Zeilgewebsextrakten wurde für die Verwendung von Jonenaustauscherharzen geleistet. Diese Arbeitsweise hat jedoch nur zu einem begrenzten Erfolg geführt. Einer der Nachteile der Jonenaustauscherharze beruht darauf, daß ihre Verwendbarkeit primär auf Unterschieden in elektrischen Ladungen der zu trennenden Substanzen beruht, jedoch erscheint ein hoher Trennungsauflösungsgrad bei der Anwendung von Gewebeextrakten nicht zu erreichen zu sein. Aktive Fraktionen konnten abgetrennt werden, aber eine weitere Reinigung war noch erforderlich. Jedoch die Entfernung von in den Fraktionen vorhandenen Substanzen ist schwierig gewesen. Einige anwesende Bestandteile in den Fraktionen müssen für die Experimentaltiere als gesundheitsschädlich angesehen werden und sie scheinen die antimikrobielle Aktivität der Fraktion zu maskieren. Hieraus ist ersichtlich, daß aufgrund der Komplexität der Gehirn- und Milzextrakte aktive Fraktionen nicht aus diesen mit einem genügenden Präzisionsgrad isoliert worden sind, um die Öffentlichkeit damit zu beliefern.

Rohe Gehirn- oder Milz-Alkoholextrakte, obwohl als wirksam beschrieben, sind nicht vollständig als aktive Wirkstoffe mit antimikrobieller Aktivität brauchbar. Wenn sie benutzt v/erden, sind große Dosen erforderlich, zum Beispiel mehr als 500 mg. Zusätzlich sind Schwankungen zwischen den Ansätzen an Gehirnextrakten festgestellt worden. Aufgrund ihrer komplexen chemischen Nr.tur schwanken die Ergebnisse von Wirt zu Wirt. Aus diesem Grunde sind sie nicht genügend sicher für die Verabreichung. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein · ■

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BAD OWGiNAL

_ 4- —

ungewöhnlich konzentrierter und damit weniger chemisch komplexer antimikrobieller Faktor, wobei der Faktor Z enthalten ist, aus dem Alkoholextrakt aus Säugergehirn oder Säugermilz durch Gelfiltration des rohen Extraktes erhalten. Der Faktor ist besonders gegen Kokken- und Bazillen -Infelc~ tionen wirksam.

Es ist angenommen worden in Bezug auf Jonenaustauscherharze, daß diese Materialien Fraktionen auf der Basis ihrer Ladungen selektiv auswählen. Gelfiltrationsharze verwenden ein vollständig verschiedenes Prinzip der Trennung. Im Prinzip arbeiten sie als Molekularsiebe; dies bedeutet, sie gestatten den Durchtritt von Materialien durch ein Harzbett auf der Basis ihrer Molekulargewichte. Im Prinzip kann gesagt werden, daß die Gelfiltrationsharze wie Siebe in umgekehrter Weise arbeiten. Die größeren Moleküle werden von der Gelbasis ausgeschlossen und gehen durch diese unverzüglich durch, wäh- ' rend die kleineren Teilchen durch das Gel festgehalten und in der Reihenfolge gemäß ihren abfallenden Molekulargewichten abgegeben werden. Da die Gele nicht ionischer Natur sind, können sie für alle Materialien, gleich ob sie kationisch, anionisch oder nichtionisch sind, verwendet werden.

Die Gelfiltration ist eine bekannte Methode für die Fraktionierung von Substanzen in wäßrigen Losungen. Sie wird bei jeder Temperatur, Zimmertemperaturen und mit jedem der leicht erhältlichen Gele durchgeführt. Diese Gele bestehen aus hydrophilen Ketten, die vernetzt sind. Sie sind frei von ionischen Gruppen und der polare Charakter hängt meist mit dem hohen Gehalt an Hydroxylgruppen zusammen. Trotzdem die Gele was- " serunlöslich sind, besitzen die Gele ein beträchtliches Schwellungsvermögen. Makromoleküle werden von der Gelphase vollständig ausgeschlossen und gehen ohne Retention hindurch. Jedoch Substanzen von niedrigem oder mittlerem Molekulargewicht durchdringen die Gelteilchen in einem Ausmaß, welches in den meisten Fällen durch ihre Molekularabmessungen und den

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Vornetzungsgrad des Gels bestimmt wird. Das am häufigsten verwendete Gel ist ein Dextrangel, welches durch Vernetzen von Dextran in solcher Weise hergestellt ist, daß die PoIysaccharidketten ein makromolekulares Netzwerk von großer Stabilität bilden. Andere hydrophile Gele sind erhältlich, die zum Beispiel von Stärke und Polyvinylalkohol stammen_β

Gegenstand der Erfindung ist ein antimikrobieller Faktor Z, wobei dieser Faktor eine neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 2000 ist und aus von Säugern stammenden Gehirn- und Milz-Alkoholextrakten durch Gelfiltration vorliegt und die Fraktion unlöslich in Wasser, löslich in angesäuertem V/asser ist und im wesentlichen ein Galactocorebrosid in seiner Zusammensetzung darstellt.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform ist der Faktor Z aus der Fraktionierung durch Gelfiltration eines Ablaufes aus der Elution von Holz- oder Knochenkohle durch angesäuertes Wasser des Alkoholextraktes stammend, wobei der Faktor Z im wäßrigen Elubant aus dem Gelfiltrationsharz mit einem pH-Wert in einem Bereich von 4- bis 5 in dem Elutionsabschnitt durch eine pH-Kurve bestimmt worden ist.

Eine speziellere Ausführungsform umfaßt den Faktor gemäß der vorstehend genannten Ausführungsform, wobei der Ablauf das Eluat ist, welches von der Elution der Holz- oder Knochenkohle stammt.

Eine weitere Ausführungsform beinhaltet den Faktor gemäß der genannten speziellen Ausführungsform, wobei der Ablauf ein wioderaufgelöster Rückstand ist, der aus dem Holz- oder Knachonkohle-Eluat bei einem neutralen pH-Wert ausgefällt wurde.

Die Erfindung betrifft auch den Faktor gemäß der zuletzt genannten Ausführungsform im Gemisch mit einem flüssigen

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BAD

pharmazeutischen Verdünnungsmittel zur Verwendung als injizierbare Flüssigkeit.

Die Erfindung umfaßt auch den Paktor in zur Trockne eingeengter Form und mit einem festen pharmazeutischen Verdün- . nungsmittel vermischt, zur.Verwendung als Tablette,

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des Faktors in pharmazeutisch wirksamen Dosen als Linderungsmittel für Säuger zur Herabsetzung der Beschwerden bei Kokkenoder Bazilleninfektionen.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Isolierung des antimikrobiellen Faktors Z, dadurch gekennzeichnet, daß man rohe Alkoholextrakte aus dem Gehirn oder der Milz von Säugern einer Gelfiltration unterwirft und den Faktor, hauptsächlich aus Glactocerebrosid bestehend, als neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 2000 isoliert.

Eine speziolle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß der rohe Alkoholexträct mit einem Absorbens zwecks Beladung mit den antimikrobiellen Fektoren behandelt wird und das beladene Absorbens mit angesäuertem Wp.sser zv/ecks Entladung ausgewaschen und der saure Ablauf der G'elfiltration unterworfen wird.

Eine speziellere Ausführungsform der vorstehenden Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Absorbens Aktivkohle oder oin amorphes Silikat eingesetzt wird.

Eine weitere spezielle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das beladene Absorbens zur Entfernung von wasserlöslichen Verunreinigungen mit Wasser gewaschen und dann das beladene Absorbens mit einem

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fettlösenden organischen Lösungsmittel zur Entfernung unerwünschter Fette behandelt und danach das beladene Absorbens durch Zugabe von angesäuertem Wasser entladen wird.

Eine weitere spezielle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das zur Entladung des belaäenen Absorbens verwendete angesäuerte Wasser vor der Gelfiltration so lange mit Alkali versetzt wird, bis der antimikrobielle Faktor vollständig ausgefällt ist.

Der Alkoholextrakt, gewöhnlich als roher Gehirnextrakt bezeichnet, dient als Basis zum Vergleich und seine Herstellung soll nun erläutert werden.

Arbeitsweise A

Der benutzte rohe Rindergehirnextrakt wurde aus frisch.erhaltenem Gehirn eines örtlichen Schlachthofes hergestellt. Nach Entfernen der einhüllenden Hirnhaut (Pia Mater) wurde es von anhängenden Blutgerinnseln durch Waschen befreit und in einem Fleischzerkleinerer homogenisiert. Es wurde dann mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 kg Gehirn : 1 1 destilliertem Wasser vermischt und 20 bis 24· Stunden im Kälteraum (2~4° C) gelagert. Am Ende dieses Abschnittes wurde der wäßrige Extrakt unter leichtem Druck durch Käsefiltertuch filtriert. Zur vollständigen Extraktion wurde der Rückstand bei 2500 Umdrehungen/Min. 20 Minuten zentrifugiert. Der wäßrige Extrakt wurde dann durch Zugabe von ausreichenden Mengen 95#igem Äthylalkohol (etwa 3 Liter Extrakt : 16 Liter 95#igem Alkohol) deproteinisiert, wodurch eine Lösung mit zuletzt einer Konzentration von 80$ Alkohol erhalten wurde. Diese Lösung wurde sorgfältig gemischt durch Schütteln in sich wiederholenden Zeitabständen über einen Zeitraum von 25 Stunden bei Raumtemperatur. Es wurde dann mittels Vakuum filtriert durch ein Whatmann-Filter Nr. 1 und der Alkohol unter Anlegen von Vakuum bei 50 bis 55° C abdestilliert. Das alkoholfreie Konzentrat wurde dann mit Gelite (Filterhilfsmittel auf

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Kieselgurbasis) vermischt und auf 70 bis 80° C erhitzt und durch eine Celite-Filterschicht filtriert. Das Filtrat wurde im Eisschrank aufbewahrt und die Filtration durch Celite-Schichten solange fortgesetzt, bis ein klares, goldfarbiges Produkt erhalten wurde. Der pH-Wert dieses Extraktes wurde auf 7>0 eingestellt,durch Seitz-Filtration sterilisiert und unter Einfrieren in sterilen Serumfla'schen aufbewahrt. Die zu verabreichenden Vclumenmengen an die Versuchstiere wurden bestimmt, indem das Trockengewicht Jedes Ansatzes ermittelt · wurde.

Die rohen Zellgewebeextrakte, gemäß der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise erhalten, bestehen aus einer komplexen Mischung aus biologischen Materialien. Als solche sind sie nicht ein vollständig befriedigendes Ausgangsmaterial für die Art des hierin empfohlenen Fraktionierverfahrens. Es wurde* deshalb entschieden, eine reinere Fraktion zu benutzen. Vorzugsweise wurde der rohe Extrakt durch ein Bett, welches hauptsächlich aus Absorbentien wie Holz- oder Knochenkohle oder amorphem Silikat bestand, durchgegeben, wobei die aktiven Inhaltsstoffe am Absorbens verblieben. Die aktiven Inhaltsstoffe wurden dann mit angesäuertem Wasser eluiert und den Ablauf ließ man durch ein Gelfiltrationsharz durch-' sickern.

Holz- oder Knochenkohle sind in der Vergangenheit benutzt worden, um Verunreinigungen aus rohen Gewebeextrakten zu entfernen» Wenn diese Materialien jeäoch in vivo getestet wurden, wurde festgestellt, daß die Holz- oder Knochenkohlenfiltrate keine antimikrobielle Aktivität im Vergleich zum Ausgangsmaterial besaßen. Hierbei ist die Tatsache übersehen worden, daß diese aktive, gereinigtere Fraktion als Rückstand an der Kohle festgehalten worden war. Um dies zu verdeutlichen, wird das folgende Arbeitsverfahren für die Herstellung des Kohleablaufes aus rohem Gehirn oder roher Milz, wobei die Arbeitsweise ebenfalls unabhängig von Temperatur und Druck ist,

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wiedergegeben;

Arbeitsweise B

Ein Volumen roher Gewebeextrakt wurde in einen Erlenmeyerkolben gegeben und 1/10 Teil Aktivkohle (Norite A) hinzugefügt» Die Mischung" wurde dann gut durchgerührt und in eine Schüttelmaschine eingespannt und für 15 Minuten mit 220 Ausschlägen pro Minute geschüttelt. Die erhaltene Suspension wurde dann unter Vakuumanwendung filtriert, um den flüssigen Anteil abzutrennen. Dann wurde der Aktivkohlekuchen mit dem halben Volumen Wasser ausgewaschen, um so viel als möglich des wasserlöslichen Materials zu entfernen. Die dritte Behandlungsstufe beinhaltet das Waschen der Aktivkohle mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, um unerwünschte Fettstoffe zu entfernen. Zu diesem Zweck wurde ein Gemisch Äthylalkohol-Diäthyläther (1:1) verwendet. Hiervon wurde ein Volumen dieses Gemisches durch den Aktivkohlekuchen gegeben und durch Anlegen von Vakuum abgesaugt. Wenn an der Aktivkohle durch den Geruch kein organisches Lösungsmittel mehr festgestellt werden konnte, wurde die Aktivkohle allmählich mit einem Volumen N/50 HCl und mit einem halben Volumen N/10 HCl gewaschen. In der Endstufe wurde die Aktivkohle mit einem Volumen Wasser nachgewaschen_e

Um sicherzustellen, die Fraktion der vorliegenden Erfindung von dem Aktivkohle-Ablauf zu erhalten, wurde die Gelfiltration dieser Stufe angeschlossen. Jedoch wurde im Laufe der Isolierung von Fraktionen mit aktiven Faktoren eine wünschenswerte Zwischenstufe festgestellt. Da der pH-Wert von einigen Fraktionen zu niedrig für eine Einbringung in die Tiere war, wurde der pH-Wert auf Neutralität eingestellt. Hierbei wurde festgestellt, daß zu diesem Zeitpunkt ein bräunlich flockiger Niederschlag bei der Annäherung des pH an 7_}0 erschien. Beim sauren pH ist diese Fraktion eine farblose, klare Lösung und besitzt einen Geruch, der dem Schwefelwasserstoff ähnlich ist. Venn die Lösung den Neutralpunkt erreicht, erscheint ein gelber flockiger

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Wiederschlag und der Geruch wechselt vollständig. Bei einem Versuch, alles unlösliche.Material zu entfernen, wurde ein Überschuß an Natriumhydroxyd hinzugefügt. Die unlösliche Substanz wurde durch Zentrifugieren entfernt, mit Äthanol-Äthergemisch (9:1) gewaschen und nachzentrifugiert. Die Ausbeute an dieser Substanz war sehr klein im Vergleich zum Ausgangsmaterial, annähernd etwa 1 Prozent. Ein Teil dieses Materials wurde für in vivo-Versuche benutzt, um festzustellen, ob es eine Antistaphylokokken-Aktivität besitzen würde. Die Probe aus einem rohen Milzextrakt hergestellt, wurde an eine Gruppe weiblicher C3H/HeJ Mäuse mit einem Altersbereich von 19 bis 21 Wochen verabreicht. Um das Material zu lösen wurde es in N/10 HCl gebracht und die Tiere erhielten jedes 0,1 ml, wobei dies 1,0 mg des festen Materials entsprach. Die Verabreichung wurde für eine Dreitagesperiode fortgesetzt, während sie am 4-, Tag eine Impfung von 0,5 ml einer (62$ Lichtdurchlässigkeit) Original-Mikroorganismen-Suspension erhielten. Die folgenden Ergebnisse wurden festgestellt.

Tabelle 1

Getestete Fraktion Zahl der Prozentzahl der Sterblich-

Tiere keit in Stunden nach der Impfung

24- 48 72 96 120

unbehandelt (Kontrolle) 10 50 70 80 80 80 behandelt 10 0 0 0 0 0

Das Material wurde nachgetestet, um seine Aktivität zu bestimmen. Bei dieser Versuchsreihe wurden nämlich C3H/HeJ männliche Mäuse im Alter von 24- bis 26 Wochen mit der Probe, wie schon vorstehend beschrieben, behandelt. Sie wurden mit einer Original-Mikroorganismen-Suspension (60$ Lichtdurchlässigkeit) subkutan beimpft. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe zeigt Tabelle 2,

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ORIGINAL INSPECTED

	Tabelle	2	Prozentzahl dor Sterblich keit in Stunden nach der Impfung	72	96 120
Getestete Fraktion	Zahl der Tiere		• 24- 4-8	80 20	80 80 20 20
			50 70 0 20
Kontrolle behandelt	10 10

Aus den vorstehenden Ergebnissen kann geschlossen werden, daß wir nun ein viel besser geeignetes Material für die letzte Fertigungsstufe des aktiven Faktors erhalten hatten. Es behielt die gleiche Aktivität wie das Rohmaterial und es besaß viele der Charakteristiken, um identifizierbar mit den bisher untersuchten Substanzen zu sein.

Bei der Durchführung dieser Studien wurden Boontucky und schweizer Albinomäuse, beide männlich und weiblich, ständig benutzt mit Ausnahme von einigen wenigen Experimenten für Vergleichszwecke. Die Tiere waren zwischen 10 und 30 Wochen alt und besaßen ein Durchschnittsgewicht von 20 bis 25 g. Diese Tiere wurden meistens mit der Rockland-Diät aufgezogen und gehalten.

Alle Studien, beides in vivo und in vitro, wurden unter Verwendung eines penicillinresistenten Stammes Staphylococcus aureus Original durchgeführt, der erstmalig von einer akuten Tonsillitis isoliert worden war und in unseren Laboratorien seit Jahren gezüchtet worden ist. Jedoch wurden auch äquivalente Ergebnisse erhalten, wenn Bazillen wie Salmonella typhi benutzt wurden. Der Staphylococcus aureus Stamm wurde.in der lyophilisierten Form aufbewahrt und bei 0° C gelagert. Die lyophilisierte Probe wurde erst auf sterilen Difco SA 110 Schalen kultiviert und dann in Schrägstellung auf das gleiche Medium überführt. Diese Schrägansätze wurden nach 24- Stunden Wachstum unter Abkühlung aufbewahrt (annähernd 1° C wie die Ausgangskultur). Die Behandlung bestand in einer subkutanen

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Injektion der Tiere. Die Endstufe in dem Verfahren verdeutlicht der folgende Abschnitt.

Arbeitsweise C

30 g Dextrangel (Sephadex G-25 von der Firma Pharmacia, Uppsala (Schweden)) wurde durch die Standardbehandlung mit Natriumchlorid aktiviert und chloridfrei gewaschen. Nachdem die Säule ihr Gleichgewicht erreicht hatte, wurde eine kleine Filterpapierscheibe auf die obere Fläche des Harzbettes aufgelegt und die Probe eingeführt. Die Konzentration der Probe wurde immer bei 10 mg/pro ml in N/10 HCl aufrechterhalten und das Volumen reichte von 15 bis 25 ml in Abhängigkeit von der Höhe des Harzbettes. Die Probe ließ man durch das Harz hindurchsickern und nachdem diese vollständig im Hr.rzbett vorlag, wurde mit destilliertem Wasser eluiert. Wenn die Elution beendet war,-wurde die Säule mit 2#iger HCl ausgewaschen, um jegliches gefärbte Material zu entfernen, welches in der Säule verblieben war und schließlich mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Danach war die Säule wieder zum Gebrauch bereit.

Im früheren Abschnitt der Arbeit mit dem Dextrangelharz (Sephadex) wurde das Zusammensetzungsverhältnis in dem Elutionsabschnitt mittels der pH-Kurve bestimmt, was schwierig durchzuführen war« Es wurde jedoch gefunden,' daß, sobald man die Durchflußgeschwindigkeit beherrschte, dieses Problem nicht mehr " · existierte. Es wurde festgestellt, daß die langsamere Elutionszeit eine beträchlich größere Wiederauflösung der Materialien ergab, eine Tatsache, die große Bedeutung für die Isolationsstudien besitzt. Das gewünschte Verhältnis sollte ein Volumen Wasser zu 5 bis 15 Volumina des Harzes pro Stunde betragen bis die Elution vollständig erfolgt ist, wie dies durch den pH angezeigt ist.

Bei der Elution wurde das Viertel des Porenvolumens mit diesen Fraktionen erhalten, wenn der pH-Bereich zwischen 4 und 5 lag.

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Die Molekulargewichte dieser Materialien lagen in dem Bereich von 1OOO bis 2000. Es wurde festgestellt, daß dies die aktive Fraktion war, wie dies aus ihren Eigenschaften sich ergibt,

Untersuchungen in vivo mit der Fraktion, die von der GeIfiltration erhalten wurde, zeigte einen scharfen Schnitt in der Trennung des aktiven Materials von dem Rest der anwesenden Substanzen. Die Resultate waren aus verschiedenen Gründen ganz ausgezeichnet. Zuerst wurden die Materialien mit einem Dosierungsspiegelwert von nicht mehr als 1 mg erprobt, wobei der erreichte Schutz bei den Tieren von 100% bis 8C$ reichte. Diese Angaben geben die Ergebnisse wieder, die mit Materialien erhalten worden waren, die wiederholt aus Hirn beziehungsweise Milz isoliert worden waren. Die Tiere, die überlebten, zeigten in vielen Fällen keinerlei Zeichen von Infektion, selbst bei so früher, wie einer 2 Tage Nachimpfung und in einigen Fällen, in denen sich Läsionen von der Infektion ergeben hatten, heilten diese innerhalb von 5 bis 6 Tagen vollständig aus. Die äußerst aktive Fraktion dieser Erfindung ist das wäßrige Elutant aus dem Gelfiltrationsharz mit einem pH-Bereich von 4—5> in dem Elutionsabschnitt durch eine pH-Kurve bestimmt. Das Konzentrat ist eine neutrale Fraktion, die unlöslich in Wasser, aber löslich in angesäuertem V/asser ist. Es ist hauptsächlich Galactocerebrosid in der Zusammensetzung und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 1.500.

Der Faktor Z besitzt, wie bereits nachgewiesen, ungewöhnliche prophylaktische Werte und vermindert die Zwischenfälle aus schädlichen Effekten von Kokkeninfektionen. Es wird empfohlen, daß der Faktor periodisch oral eingenommen werden kann als Tablette, etwa wöchentlich oder monatlich in einer Menge von 100 bis 500 mg Dosen, vorzugsweise 150 bis 250 mg Dosen. Besonders vor Zeitabschnitten, in denen die Kontaktgefahr mit Staphylokokken- oder Streptokokkeninfektionen erhöht ist, wie vor der Einlieferung in ein Hospital, können Injektionen verabreicht werden. Es ist möglich den Faktor mit Wasser,

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Pflanzenöl, Monoglycerid- oder Diglycerid-Trägern für Injektionszwecke zu kombinieren. Natriumchlorid kann Verwendung finden, um die Lösung isotonisch einzustellen. Zusätzlich kann das Wasser entfernt werden, wenn es erforderlich ist, durch Abdestillation unter vermindertem Druck bei etwa 40° C, wobei das getrocknete Material einen Festkörper bildet, der zur Herstellung von Tabletten geeignet ist. Geeignete Farbmittel, Gleitmittel und Bindemittel können zusammen mit festem pharmazeutischem Trägerstoff verarbeitet werden, um Tabletten oder Kapseln zu bilden. Geeignete Träger sind Stärke, Milchzucker, Fruchtzucker und andere feste pharmazeutische Verdünnungsmit" tel.

Tabelle 3 zeigt eine Zusammenstellung einer Anzahl von prophylaktischen Behandlungen, die mit verschiedenen Proben des Faktors Z, der nach der vorliegenden Erfindung erhalten worden ist, durchgeführt worden sind. In diesen Versuchsreihen wurden alle Behandlungen - wie schon früher beschrieben - ausgeführt und beides, Behandlung und Beimpfung wurden subkutan durchgeführt. Die Gesamtdosierung pro Tier betrug in den meisten Fällen 0,3 mg, jedoch in anderen Fällen war sie niedriger, nämlich bei 0,2 mg pro Tier.

Tabelle 3

getestete % Lichtdurch- Zahl derProzentzahl der Sterblichkeit Fraktion lässigkeit der'Tiere . in Tagen nach der Impfung

Organismen- ' - - " suspension .

Kontrolle	62
Aktiv+	62
Kontrolle	60
Aktiv zk~-	60
Kontrolle	55
Aktiv+¹¹	55
Akt i viU'	55

	1	2	3	4·	5
10	60	60	60	70	70
10	0	0	0	0	0
10	70	90	90	90	90
10	10	10	10	10	10
10	60	80	80	80	90
10	0	O	10	10	10
10	0	10	10	10	10

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■ύέ. hergestellt aus rohem Hdrnextrakt + hergestellt aus rohem Malzextrakt " Gesamtdosis 0,2 mg

Es ist ersichtlich aus den vorstehenden Ausführungen, daß durch diese Erfindung ein sehr wirksames Verfahren zum Herabsetzen der Schädigungen von Kokkeninfektionen bei Säugern aufgefunden worden ist. Dies wird durchgeführt, indem man den Säuger durch periodische Verabreichung mit dem beschriebenen Faktor versorgt· Die Herstellung der Fraktion gemäß der praktischen Ausführung der Erfindung wird nun im folgenden noch erläutert werden und verdeutlicht alle Stufen in einem einzigen Beispiel.

Arbeitsweise D

Roher Milzextrakt (100 ml mit 1300 mg Extraktsubstanz) wird mit 10 g Aktivkohle durchgerührt und filtriert. Das Filträt wird weggeworfen. Die Aktivkohle wird viermal mit je 25 ml einer Mischung Diäthyläther : Alkohol 1 : 1 ausgewaschen. Die Auswaschlösung wird weggeworfen. Die Aktivkohle wird dann mit 150 ml 0,1 N HCl gewaschen und filtriert. Die Aktivkohle wird weggeworfen. Zu dem Filtrat wird ein Überschuß an Natriumhydroxydlösung gegeben bis die Ausfällung vollständig ist. Die Suspension wird zentrifugiert und das Überstehende weggeworfen. Der Rückstand wird mit Diäthyläther-Äthanolgemisch 1 : 1 gewaschen und die Auswaschlösung weggeworfen. Der Rückstand wird in einem Exsikkator getrocknet. Die Ausbeute an dieser Stelle beträgt 70 bis 100 mg oder 5 bis 7#> aber das Material ist in etwa 1/40 der Konzentration des Origiralrohextraktes angereichert (etwa 40-fache Konzentration der Aktivität bezogen auf das Gewicht). Weitere Reinigung wird erzielt durch Auflösen von 250 mg dieses Materials in 1N HCl, wobei eine Konzentration von 25 mg pro ml erhalten wird. Man läßt diese Lösung durch eine Säule mit der Abmessung 12 mm χ 33 cm mit Dextrangel (Sephadex G-25) durchlaufen. Die Säule wird mit Wasser eluiert und die Fraktionen werden in einem

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Fraktionssammler aufgefangen. Der pH der Fraktionen wird bestimmt und das aktive Material befindet sich in den Fraktionen mit einem pH-Bereich von 4,5 bis 4,6. Die Ausbeute beträgt etwa 15 mg aus 250 mg teilweise gereinigtem Material oder aus etwa 3900 mg Rohextrakt in einer Gesamtausbeute von etwa 0,4$. Dieses Material ist aktiv mit etwa 1/10 der Dosierung der vorhergehenden Fraktion und äquivalent zu einer etwa 400-fachen Gesamterhöhung der Aktivität auf der Gewichtsbasis.

In Tabelle 4 werden Resultate wiedergegeben, wenn Tiere mit einer Suspension von Staphylococcus aureus (60$ Lichtdurch— lässigkeit) nach einer Behandlung mit Fraktionen behandelt, worden sind, die gemäß Arbeitsweise D erhalten worden sind.

Quelle 'Totaldcsis der mg, Fraktionen

Tabelle 4

Zahl der Prozentzahl der Sterblich-Mäuse keit in Tagen nach der Impfung

	0	,3	10	1	2	3 .	4	5
Kontrolle			10	60	60	60	70	70
Milz ·	0	,3	10	0	0	0	0	0
Kontrolle			10	70	90	90	90	90
Milz	0	,2	10	0	10	10	10	10
Kontrolle	0	,2	10	60	80	80	80	90
Milz			10	0	0	10	10	10
Gehirn		0	10	10	10	10

Somit ist ein antimikrobieller Faktor aus rohen Gewebeextrakten isoliert worden, der hoch aktiv ist und die letalen Effekte

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unterdrückt , die von Staphylokokken-Infektionen, von Kokken und Bazillen sich ergeben. Der antimikrobielle Faktor dieser Erfindung zeigte sich bei einigen hundert Tieren als sehr aktiv bei extrem niedrigen Behandlungsdosierungen und zeigte keine toxischen Effekte bei den Tieren. Ein vorläufiges Experiment in der Zellgewebeatmung unter Verwendung einer normalen Mäuseleber zeigte keine toxischen Effekte als ein Ergebnis der Inkubation der Zellgewebe in einem Medium, das dieses Material enthielt, wenn CO₂ gemessen wurde. Weil nur eine solch kleine Menge des Materials benötigt wurde, um den Tieren einen Schutz zu verleihen, wurde gefunden, daß unser Faktor Z tatsächlich eine reine chemische Verbindung ist', nämlich das Galactocere=- brosid und es ist in relativ hoher Reinheit erhalten worden. Variationen und Modifikationen in dem Verfahren und bei den Verwendungen werden dem Fachmann auf dem Gebiet möglich erscheinen. So können die Extraktionen und Filtrationen bei Zimmertemperatur durchgeführt werden und Druckanwendung ist möglich. Solche Abwandlungen sollen mit in den Schutzumfang dieser Erfindung fallen.

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Claims

DR. WALTER NIELSCH Patentanwalt 2 Hamburg 70 ?ft Feb 1969 SAloBstrdBe 112. Postfach 10914 tO'' ' Fernruf: 652 97 07 patentansprüche .

1.) Antimikrobieller Faktor Z, wobei dieser Faktor eine neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 2000 ist und aus von Säugern stammenden Gehirn- und Milz-Alkoholextrakten durch Gelfiltration vorliegt und die Fraktion unlöslich in Wasser, löslich in angesäuertem Wasser ist und im wesentlichen ein Galactocerebrosid in seiner Zusammensetzung darstellt..

2.) Faktor Z gemäß Anspruch 1, aus der Fraktionierung durch Gelfiltration eines Ablaufes aus der Elution von Holzoder Knochenkohle durch angesäuertes Wasser des Alkoholextraktes stammend, wobei der Faktor Z im wäßrigen Elutant aus dem Gelfiltrationsharz mit einem pH-Wert in · einem Bereich von 4- bis 5 in dem Elutionsabschnitt durch eine pH-Kurve bestimmt worden ist.

3.) Faktor gemäß Anspruch 2, worin der Ablauf das Eluat ist, welches von der Elution der Holz- oder Knochenkohle stammt,

4-.) Faktor gemäß Anspruch 2, worin der Ablauf ein wiederaufgelöster Rückstand ist, der aus dem Holz- oder Knochenkohle-Eluat bei einem neutralen pH-Wert ausgefällt wurde,

5.) Faktor gemäß Anspruch 4 im Gemisch mit einem flüssigen pharmazeutischen Verdünnungsmittel zur Verwendung als injizierbare Flüssigkeit.

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6.) Faktor gemäß Anspruch 4- in zur Trockne eingeengter Form und mit einem festen pharmazeutischen Verdünnungsmittel vermischt, zur Verwendung als Tablette.

7.) Verwendung des Faktors gemäß Anspruch 4- in pharmazeutisch wirksamen Dosen als Linderungsmittel für Säuger zur Herabsetzung der Beschwerden bei Kokken- oder Bazilleninfektionen.

8.) Verfahren zur Isolierung des antimikrobiellen Faktors Z, dadurch gekennzeichnet, daß man rohe Alkoholextrakte aus dem Gehirn oder der Milz von Säugern einer Gelfiltration unterwirft und den Faktor,hauptsächlich aus Galactocerebrosid bestehend, als neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 2000 isoliert.

9.) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der rohe Alkoholextrakt mit einem Absorbens zwecks Beladung mit den antimikrobiellen Faktoren behandelt wird und das beladene Absorbens mit angesäuertem Wasser zwecks Entladung ausgewaschen und der saure Ablauf der Gelfiltration unterworfen wird.

10.) Verfahren nach Anspruch 8 oder 9» dadurch gekennzeichnet, daß als Absorbens Aktivkohle oder ein amorphes Silikat eingesetzt wird.

11.) Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das beladene Absorbens zur Entfernung von wasserlöslichen Verunreinigungen mit Wasser gewaschen wird und dann das beladene Absorbens mit einem fettlösenden organischen Lösungsmittel zur Entfernung unerwünschter Fette behandelt wird und dann das beladene Absorbens mit angesäuertem Wasser entladen wird.

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12.) Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Entladung des beladenen Absorbens verwendete angesäuerte Wasser vor der Gelfiltration so lange mit Alkali· ^ersetzt wird, bis der antimikrobielle Faktor vollständig ausgefällt vorliegt.

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