DE112018006568T5

DE112018006568T5 - Krankheitserregerreduzierte Thrombozytenzusammensetzungen und verwandte Verfahren

Info

Publication number: DE112018006568T5
Application number: DE112018006568.5T
Authority: DE
Inventors: Steven Charlebois; Sreedhar Thirumala
Original assignee: Sexton Biotechnologies Inc Ges Nach Den Gesetzen Des Staates Delaware; Sexton Biotechnologies Inc Gesellschaft Nach Den Gesetzen Des Staates Delaware
Current assignee: SEXTON BIOTECHNOLOGIES, INC. (GESELLSCHAFT NAC, US
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-12-03
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: WO2019126494A1; JP2021506931A; JP2024026645A; GB2583674B8; GB202011207D0; DE112018006568B4; GB2583674B; GB2583674A; CN111770777A; US20190269808A1

Abstract

Angegeben sind Verfahren zur Behandlung von Thrombozytenzusammensetzungen (z.B. Thrombozytenkonzentrate und/oder Thrombozytenlysate) mit Elektronenstrahlung, wobei sich die Zusammensetzungen während der Bestrahlung mit der Elektronenstrahl-Bestrahlung in einem gefrorenen Zustand befinden. Die Verfahren können unter Verwendung von Elektronenstrahl-Bestrahlung in Dosen durchgeführt werden, die den Erregergehalt der Zusammensetzungen wirksam reduzieren und gleichzeitig die höchst vorteilhaften Bioaktivitäten der Zusammensetzungen beibehalten. Offengelegt werden auch Zusammensetzungen, die mit den Verfahren hergestellt werden können, sowie Verfahren und Zusammensetzungen, die die Verwendung der mit Elektronenstrahlung behandelten Materialien beinhalten.

Description

QUERVERWEISE AUF VERWANDTE ANWENDUNGEN
Dieser Antrag beansprucht die Vorteile der US Provisional Application Nr. 62/608,498 , 5, eingereicht am 20. Dezember 2017, die hiermit durch Verweis aufgenommen wird.
HINTERGRUND
Aspekte der vorliegenden Offenbarung beziehen sich im Allgemeinen auf Prozesse, die wirksam zur Reduzierung von Krankheitserregern in Thrombozytenzusammensetzungen wie Thrombozyten oder Thrombozytenlysaten sind, und insbesondere auf Verfahren, die die Bestrahlung solcher Zusammensetzungen unter Bedingungen beinhalten, die wirksam sind, um Krankheitserreger zu reduzieren, während nützliche biologische Aktivitäten erhalten bleiben.
Als weiterer Hintergrund, in zunehmendem Maße werden biologische Materialien für den Einsatz in Forschung und medizinischen Anwendungen verwendet oder erforscht. Biologische Materialien sind in vielen Anwendungen wünschenswert, weil sie zahlreiche bioaktive Faktoren enthalten, die bei der Unterstützung von Zellwachstum vorteilhaft sind und die kann therapeutisch sein können, wenn sie Patienten verabreicht werden. Biologische Materialien bergen aber auch Risiken in der Anwendung, weil sie Krankheitserreger, zum Beispiel Viren, enthalten können, die von einem menschlichen oder anderen tierischen Spender für das Material stammen.
Es wurden zahlreiche Techniken zur Behandlung biologischer Materialien erforscht, um deren Gehalt an Krankheitserregern zu reduzieren. Eine Schwierigkeit besteht darin, dass die Techniken nicht nur den Erregergehalt reduzieren, sondern auch die gewünschten biologischen Aktivitäten der Materialien abbauen können. Daher besteht Bedarf an Verfahren zur Reduzierung von Krankheitserregern in biologischen Materialien, wie z.B. Thrombozytenzusammensetzungen, die bequem durchgeführt werden können, die das Niveau der Krankheitserreger wirksam reduzieren und die ein behandeltes Material liefern, das vorteilhafte biologische Aktivität beibehält. Die Aspekte der vorliegenden Offenbarung sind auf diese Bedürfnisse ausgerichtet.
ZUSAMMENFASSUNG
In bestimmten Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Herstellung krankheitserregerreduzierter Zusammensetzungen bereit, die die Bestrahlung einer Zusammensetzung, die ein Thrombozytenkonzentrat oder ein Thrombozytenlysat enthält, im gefrorenen Zustand mit einem Elektronenstrahl („Elektronenstrahl“) einschließen. Die Verfahren können die Anwendung der Elektronenstrahl-Bestrahlung in Dosen umfassen, die wirksam sind, um die Menge an Krankheitserregern in der Zusammensetzung zu reduzieren, während gleichzeitig die Mengen an bioaktiven Faktoren, z.B. bioaktiven Wachstumsfaktoren, in der Zusammensetzung erhalten bleiben. Die Verfahren können unter Verwendung einer Bestrahlung mit Elektronenstrahlen bei einer Dosis durchgeführt werden, die wirksam ist, um mindestens eine 3-Log-Reduktion der Viren in die Zusammensetzung unter Beibehaltung eines wesentlichen Prozentsatzes, zum Beispiel von mehr als 50%, von einem oder mehreren Wachstumsfaktoren der Zusammensetzung. Der eine oder die mehreren Wachstumsfaktoren können FGFb, EGF, PDGF-AB, PDGF-BB und/oder TGF-ß umfassen. In bestimmten Ausführungsformen können die Verfahren auch die Anwendung von Kühlung auf die gefrorene Zusammensetzung während der Bestrahlung umfassen. Die gefrorene Zusammensetzung kann zu Beginn der Bestrahlung bei einer Temperatur unter etwa -20° C, vorzugsweise unter etwa - 40° C, sein, und in einigen Ausführungsformen kann sie bei solchen Temperaturen während der Bestrahlung gehalten werden.
In anderen Aspekten liefert die vorliegende Offenbarung krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat-Zusammensetzungen. Die krankheitserregerreduzierten Thrombozytenlysat-Zusammensetzungen können Elektronenstrahl-behandelte Zusammensetzungen sein und können ein Wachstumsfaktorprofil aufweisen, das FGFb mit einem Gehalt von mindestens 50 pg/ml, EGF mit einem Gehalt von mindestens 1000 pg/ml, PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens 10 ng/ml, PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens 1 ng/ml, und/oder TGF-ß mit einem Gehalt von mindestens 20 ng/ml einschließt. Die Zusammensetzungen können messbare Gehalte an Elektronenstrahl-induzierten Proteinmodifikationen aufweisen. Beispielsweise können die Zusammensetzungen einen Gehalt an Fragmenten eines bestimmten Proteins und/oder einen Gehalt an Aggregaten eines bestimmten Proteins, z.B. wenn es sich bei dem bestimmten Protein um Albumin handelt, aufweisen, der höher ist als derjenige, der in der entsprechenden Zusammensetzung auftritt, ohne dass sie einer Elektronenstrahlung ausgesetzt wurde.
In anderer Hinsicht bietet die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Kultivierung von Zellen, die die Kultivierung von Zellen in Gegenwart einer krankheitserregerreduzierten Thrombozytenlysat-Zusammensetzung, wie oben oder an anderer Stelle hier beschrieben, umfassen. Unter weiteren Aspekten hierin können solche kultivierten Zellen Patienten in Verfahren zur medizinischen Behandlung verabreicht werden.
In Bezug auf noch weitere Aspekte stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Behandlung von Patienten, die die Verabreichung einer Thrombozytenzusammensetzung (z.B. eines Thrombozytenlysats) an einen Patienten, wie oben oder an anderer Stelle hier beschrieben, einschließen, bereit.
Zusätzliche Aspekte der vorliegenden Offenbarung sowie deren Merkmale und Vorteile werden für den Durchschnittsfachmann aus den Beschreibungen hierin ersichtlich sein.
Figurenliste

1 zeigt eine schematische Ansicht einer Ausführungsform eines Verfahrens zur Bestrahlung einer Thrombozytenzusammensetzung mit Elektronenstrahlung.
2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer verpackten krankheitserregerreduzierten Thrombozytenzusammensetzung gemäß der vorliegenden Offenbarung.
3 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Flüssigkeitsabgabevorrichtung zur Abgabe eines Thrombozytenlysats oder einer anderen Thrombozytenzusammensetzung wie hier beschrieben.
4 zeigt einen Vergleich des ASC-Zellwachstums in Medien, die mit HPL ergänzt wurden, das bei verschiedenen Elektronenstrahl-Mindestdosisbereichen verarbeitet wurde. A:
- Zellwachstumsanalyse unter Verwendung von Zell-Zahl B: Zellwachstumsanalyse unter Verwendung des Prozentsatzes der Kontrolle. Die Daten zeigen, dass das ASC-Zellwachstum im minimalen Dosisbereich von 40kGy und darüber signifikant abnahm (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001). Bei den angegebenen Daten handelt es sich um den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten mit verschiedenen HPL-Chargen.
5 zeigt einen Vergleich des BM-MSC-Zellwachstums in Medien, die mit HPL, das in verschiedenen Mindestdosisbereichen verarbeitet wurde, ergänzt wurden. A:
- Zellwachstumsanalyse anhand der Zellzahl B: Zellwachstumsanalyse anhand des Prozentsatzes der Kontrolle. Die Daten zeigen, dass das ASC-Zellwachstum bei einem Mindestdosisbereich von 40kGy und darüber signifikant abnahm (*=p<0,05, **=p<0,001,***=p<0,0002, ****=p<0,0001). Bei den angegebenen Daten handelt es sich um den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten mit verschiedenen HPL-Chargen.
6 zeigt die Konzentrationen von fünf Wachstumsfaktoren (FGFb, EGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF- β1) in Elektronenstrahl-verarbeiteten und Kontroll-HPL-Materialien, wie sie durch ELISA bestimmt wurden. Bei den angegebenen Daten handelt es sich um den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten mit verschiedenen HPL-Chargen.
7 enthält einen Vergleich des ASC-Zellwachstums in Medien, die mit HPL aus elektronenbestrahlten Thrombozyten und elektronenbestrahlten HPL ergänzt wurden. A:
- Zellwachstumsanalyse mit Zell-Zahl B: Zellwachstumsanalyse unter Verwendung des Prozentsatzes der Kontrolle. (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001).
8 enthält einen Vergleich des BM-MSC-Zellwachstums in Medien, die mit HPL aus elektronenbestrahlten Thrombozyten und elektronenbestrahltem HPL ergänzt wurden, mit einer nicht elektronenbestrahlten Kontrolle. A: Zellwachstumsanalyse unter Verwendung der Zellzahl B: Zellwachstumsanalyse unter Verwendung des Prozentsatzes der Kontrolle (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001).
9 zeigt ELISA-Messungen der Konzentrationen von fünf Wachstumsfaktoren (FGFb, EGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF-beta) in HPL, die aus elektronenbestrahlten Thrombozyten und elektronenbestrahltem HPL im Vergleich zu einer nicht elektronenbestrahlten Kontrolle. Bei den angegebenen Daten handelt es sich um den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Auch wenn die vorliegende Erfindung in vielen verschiedenen Formen ausgeführt werden kann, wird zum Zweck der Förderung des Verständnisses der Grundsätze der vorliegenden Erfindung auf folgende Ausführungsformen Bezug genommen, von denen einige in den Zeichnungen abgebildet sind, und es wird eine spezifische Sprache zur Beschreibung derselben verwendet. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass damit keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist. Jegliche Änderungen und weiteren Modifikationen in den beschriebenen Ausführungsformen und alle weiteren Anwendungen der hier beschriebenen Prinzipien der vorliegenden Erfindung werden in Betracht gezogen, wie sie sich für den Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung ergeben würden. Darüber hinaus werden in der nachstehenden ausführlichen Beschreibung zahlreiche Alternativen für verschiedene Merkmale im Zusammenhang mit der Struktur oder Zusammensetzung von Materialien oder mit Ausführungsverfahren angegeben. Es wird davon ausgegangen, dass jede dieser offenbarten Alternativen oder Kombinationen solcher offenbarten Alternativen mit den allgemeineren Merkmalen, die in der obigen Zusammenfassung erörtert oder in der Auflistung bestimmter Ausführungsformen weiter unten ausgeführt werden, kombiniert werden können, um weitere hierin offenbarte Ausführungsformen bereitzustellen.
Wie oben offenbart, beziehen sich bestimmte Aspekte der vorliegenden Offenbarung auf Verfahren zur Herstellung krankheitserregerreduzierter Zusammensetzungen, die die Bestrahlung einer gefrorenen Zusammensetzung enthaltend ein Thrombozytenkonzentrat oder ein Thrombozytenlysat mit Elektronenstrahl („Elektronenstrahl“) Strahlung umfassen, auf Zusammensetzungen, die durch solche Verfahren erhältlich sind, und auf Verfahren zur Verwendung der krankheitserregerreduzierten Zusammensetzungen z.B. in der Zellkultur oder bei der Behandlung von Patienten.
Die mit Elektronenstrahl-Strahlung zu behandelnde Zusammensetzung kann intakte Thrombozyten enthalten, z.B., wie in einer Thrombozytenkonzentratzusammensetzung, oder kann eine Thrombozytenlysatzusammensetzung sein oder ein Gemisch aus Thrombozytenkonzentrat und Thrombozytenlysat enthalten. Diese Zusammensetzungen werden hier manchmal zusammen als „Thrombozyten-Zusammensetzungen“ bezeichnet. Thrombozytenkonzentratzusammensetzungen, die in den angegebenen Verfahren verwendet werden, können auf jede geeignete Art und Weise erhalten werden. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff Thrombozytenkonzentrat auf eine flüssige Zusammensetzung, Thrombozyten mit einem Gehalt von etwa 1 x 10⁹ oder größer aufweist. Der Gehalt der Thrombozyten im Thrombozytenkonzentrat beträgt vorzugsweise mindestens etwa 1 x 10¹⁰ Thrombozyten/ml. Besonders bevorzugt werden Thrombozytenkonzentrate, insbesondere Apherese-Thrombozytenkonzentrat-Einheiten (abgelaufen oder nicht abgelaufen), die eine Konzentration von Thrombozyten im Bereich von etwa 1 x 10⁹ bis etwa 1 × 10¹² Thrombozyten/ml aufweisen. Das Thrombozytenkonzentrat kann aus einer Blutquelle gewonnen werden, wobei die Blutquelle vorzugsweise menschliches Blut ist, wie z.B. menschliches peripheres Vollblut. Wenn das Thrombozytenkonzentrat aus Blut oder anderweitig gewonnen wird, ist es vorzugsweise im Wesentlichen frei von roten Blutkörperchen, d.h. weniger als etwa 1 × 10⁶ rote Blutkörperchen/ml, und vorzugsweise weniger als etwa 1 x 10⁵ rote Blutkörperchen/ml. Das Thrombozytenkonzentrat in einigen Ausführungsformen enthält sowohl Thrombozyten als auch Plasmaproteine und kann durch Thrombozyteneinheiten bereitgestellt werden, die aus peripherem Vollblut von menschlichen Spendern durch Apherese gewonnen werden. Es ist vorgesehen, dass Vollblut von anderen Spezies, zum Beispiel von Säugetieren, auch als Quelle für Thrombozytenkonzentrate verwendet werden kann, die wie hier beschrieben verarbeitet werden. In bestimmten Ausführungsformen können Thrombozyteneinheiten von mehreren verschiedenen menschlichen oder anderen Spendern zu irgendeinem Zeitpunkt während der Verarbeitung zusammengeführt werden, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die wie hier beschrieben verarbeitet werden soll. In der heutigen typischen Praxis hat jede Apherese-Thrombozyteneinheit eines menschlichen Spenders ein Volumen von etwa 100 bis etwa 500 ml, typischerweise etwa 100 bis 400 ml und enthält etwa 100 bis 500×10⁹ Thrombozyten zusammen mit Plasma das mit den Thrombozyten während des Aphereseverfahrens isoliert wurde. Gespendete humane Apherese-Thrombozyteneinheiten haben eine relativ kurze Haltbarkeit für den Einsatz in Gesundheitseinrichtungen, in der Regel etwa fünf Tage.
Thrombozyteneinheiten, die in den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, können kürzlich abgelaufene menschliche Apherese-Thrombozyteneinheiten sein, die von Gesundheitseinrichtungen erhalten wurden, und können optional bei jeder geeigneten Temperatur, z.B. etwa -20° C, eingefroren gelagert werden, bevor sie wie hier beschrieben verwendet werden.
Bei der Herstellung eines Thrombozytenlysats kann der Inhalt der Thrombozyten durch ein geeignetes Verfahren freigesetzt werden. Bei einigen Verfahren werden die Thrombozyten lysiert, indem sie mindestens einem Einfrier-Auftau-Zyklus zur Freisetzung des Thrombozyteninhalts und optional mehreren Einfrier-Auftau-Zyklen (z.B. 2 oder 3 Einfrier-Auftau-Zyklen) unterzogen werden. Bei Verwendung eines Einfrier-Auftau-Zyklus kann das Thrombozytenkonzentrat bei jeder geeigneten Temperatur eingefroren werden. In einigen Aspekten wird das Thrombozytenkonzentrat bei einer Temperatur zwischen etwa -10° C und etwa -80° C eingefroren. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird das Thrombozytenkonzentrat bei etwa -20° C eingefroren. Zur Lyse der Thrombozyten wird das gefrorene Thrombozytenkonzentrat aufgetaut, z.B. in einem 37° C warmen Wasserbad oder durch andere wirksame Mittel, um eine „rohe“ Thrombozytenlysat-Zusammensetzung zu bilden. Das Roh-Thrombozytenlysat enthält die lysierten Thrombozytenmembranen, Wachstumsfaktoren und andere Substanzen, die aus den lysierten Thrombozyten freigesetzt werden. Wenn das Thrombozyten Konzentrat, das aufgetaut wird, Plasma zusammen mit den Thrombozyten enthält, enthält das Thrombozytenlysat auch Plasma, einschließlich der Plasmaproteine darin. Andere Techniken zur Freisetzung der Thrombozyteninhalte, zum Beispiel die Aktivierung mit Thrombin, können auch zur Herstellung eines Thrombozytenlysats für die hier beschriebene Verwendung verwendet werden. Allerdings werden Gefrier-Auftau-Techniken oder andere mechanische Techniken für die Lyse der Thrombozyten als vorteilhaft angesehen, da sie keine Zugabe eines nicht ursprünglichen Proteins (z.B. Thrombin) zum Thrombozytenkonzentrat erfordern, was sowohl die Kosten erhöht als auch dazu führt, dass zumindest ein Teil des Thrombins im nachgeschalteten Verarbeitungsmaterial vorhanden ist. Ein so beschriebenes „rohes“ Thrombozytenlysat kann einer Elektronenstrahl-Behandlung unterzogen werden wie hierin beschrieben. In anderen Ausführungsformen wurde das rohe Thrombozytenlysat jedoch verarbeitet, um Mengen bestimmter Komponenten, insbesondere Fibrinogen, zu entfernen, bevor es der Elektronenstrahl-Behandlung unterzogen wurde.
Das rohe Thrombozytenlysat enthält mehrere Wachstumsfaktoren aus dem Thrombozytenkonzentrat-Ausgangsmaterial. Dazu gehören beispielsweise der Transformierende Wachstumsfaktor Beta 1 (TGF- β1), der Epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGFb), der von Thrombozyten abgeleitete Wachstumsfaktor AB (PDGF-AB) und der von Thrombozyten abgeleitete Wachstumsfaktor BB (PDGF-BB).
In bestimmten Ausführungsformen enthält das rohe Thrombozytenlysat die folgenden Wachstumsfaktoren und deren Mengen (bezogen auf das Volumen des ursprünglichen, unverdünnten Thrombozytenkonzentrats): etwa 20.000 bis etwa 150000 pg/ml TGF- β1, vorzugsweise etwa 70000 bis etwa 120000 pg/ml TGF-P 1; und/oder etwa 100 bis 600 pg/ml EGF, vorzugsweise etwa 200 bis etwa 600 pg/ml EGF; und/oder etwa 5 bis etwa 250 pg/ml FGFb, vorzugsweise etwa 50 bis 200 pg/ml FGFb; und/oder etwa 10 bis etwa 70 ng/ml PDGF-AB, vorzugsweise etwa 40 bis etwa 65 ng/ml PDGF-AB; und/oder etwa 1 bis etwa 20 ng/ml PDGF-BB, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 15 ng/ml PDGF BB; und/oder etwa 400 bis 1100 pg/ml SDF-1α, vorzugsweise etwa 500 bis etwa 1000 pg/ml SDF-1α; und/oder etwa 10 bis etwa 800 pg/ml VEGF, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600 pg/ml VEGF.
In bevorzugter Form enthält das rohe Thrombozytenlysat auch eine oder mehrere Komponenten, die aus dem Plasma im Ausgangsmaterial des Thrombozytenkonzentrats stammen, z.B. Fibrinogen, Globuline, Albumin, Triglyceride, Glukose, Natrium, Calcium und/oder Cholesterin. In bevorzugter Form enthält das Roh-Thrombozytenlysat die folgenden Komponenten und Mengen:

etwa 0,5 bis 2,5 g/dl Globuline, vorzugsweise etwa 1,5 bis 2,5 g/dl Globuline; und/oder etwa 2 bis 5 g/dl Albumin, vorzugsweise etwa 3 bis 4 g/dl Albumin; und/oder
etwa 100 bis 200 mmol/l Natrium, vorzugsweise etwa 120 bis etwa 160 mmol/l Natrium;
etwa 40 bis 200 mg/dl Triglyceride, vorzugsweise etwa 50 bis 120 mg/dl Triglyceride;
etwa 150 bis 300 mg/dl Glukose, vorzugsweise etwa 150 bis 250 mg/dl Glukose; und/oder etwa 5 bis 12 mg/dl Calcium, vorzugsweise etwa 6 bis 10 mg/dl Calcium; und/oder
etwa 1 bis 3,5 Millionen ng/ml Fibrinogen, vorzugsweise etwa 1,5 bis 2,5 Millionen ng/ml Fibrinogen.

Das rohe Thrombozytenlysat kann auch andere bioaktive Substanzen enthalten, z.B. ein oder mehrere Interleukine, Interferone und/oder Tumornekrosefaktoren. Diese Interleukin(e), Interferon(e) und/oder Tumor-Nekrose-Faktor(en) können z.B. ein, einige oder alle Interleukin(IL)-1b, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, Interferon-gamma (IFN-gamma) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) enthalten.
In bestimmten Ausführungsformen wird das rohe Thrombozytenlysat zur Entfernung von Partikeln bearbeitet, z.B. ein- oder mehrmals gefiltert und/oder zentrifugiert. Eine solche Filtration kann z.B. darin bestehen, dass das Roh-Thrombozytenlysat durch einen Sterilfilter geleitet wird.
Wie oben erörtert, wird das Roh-Thrombozytenlysat in einigen der hier vorgestellten Ausführungsformen behandelt, um eine Fraktion davon mit einer im Vergleich zum Roh-Thrombozytenlysat reduzierten Fibrinogenkonzentration zurückzugewinnen. Fibrinogen kann durch jede geeignete Technik entfernt werden, einschließlich z.B. durch Umwandlung in Fibrin, was zur Bildung von festem Gerinnselmaterial führt, das aus einer Thrombozytenlysatflüssigkeit abgetrennt werden kann. Eine solche Umwandlung in Fibrin kann induziert werden durch die Zugabe eines Gerinnungsmittels. In Übereinstimmung mit einigen Formen der Anwendung der offengelegten Verfahren kann ein Gerinnungsmittel, z.B. ein Calciumchloridsalz, dem Rohmaterial zugesetzt werden.
Zur Veranschaulichung kann dem Roh-Thrombozytenlysat ein Calciumchloridsalz in einer Menge zwischen etwa 0,1 g und 2 g pro Liter Roh-Thrombozytenlysat zugesetzt werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden etwa 0,4 g bis etwa 0,75 g eines Calciumchloridsalzes pro Liter Roh-Thrombozytenlysat zugegeben. Das kombinierte Thrombozytenlysat und Calciumchlorid oder ein anderes Gerinnungsmittel können auf einen Schüttler gegeben oder anderweitig gerührt werden, um eine gründliche Durchmischung des Gerinnungsmittels mit dem Konzentrat zu gewährleisten. Die resultierende Mischung kann dann für einen Zeitraum von mindestens etwa 8 Stunden oder mindestens etwa 12 Stunden in bestimmten Ausführungsformen ein festes Gerinnungsmaterial bilden, in der Regel im Bereich von etwa 8 Stunden bis etwa 36 Stunden. Bei einigen Formen besteht zumindest eine überwiegende Menge (über 50%) des resultierenden Gerinnselmaterials und potenziell mindestens 80% oder mindestens 90% des resultierenden Gerinnselmaterials aus einem im Wesentlichen homogenen Gerinnselgel. Ein solches im wesentlichen homogenes Gerinnselgel kann im gesamten Material eine konsistente Gelphase aufweisen, wobei die Flüssigkeit in einer kontinuierlichen Fibrinmatrix eingeschlossen ist. In anderen Formen kann das Gerinnselmaterial als eine Vielzahl von diskreten festen Gerinnselpartikeln auftreten, die in einer flüssigen Phase suspendiert sind.
Nachdem sich das feste Gerinnselmaterial gebildet hat, kann das flüssige Material davon abgetrennt werden. Jede geeignete Technik kann zu diesem Zweck verwendet werden. In bevorzugten Formen, bei denen mindestens eine überwiegende Menge (mehr als 50 Gew.-% und potenziell mindestens 80 oder mindestens 90 Gew.-%) des Gerinnselmaterials aus einem im Wesentlichen homogenen Gerinnselgel besteht, wird das Gerinnselmaterial zwischen zwei oder mehr Oberflächen gepresst, um geronnene Feststoffe von der Flüssigkeit zu trennen. Ein solches Pressen kann die Flüssigkeit aus dem Gelmaterial ausdrücken, während es die Fibrinmatrix des Gels komprimiert und kondensiert. Das Pressen des geronnenen Materials kann in einigen Formen in einem flexiblen Behälter, z.B. einem Plastikbeutel, durchgeführt werden. Das Gerinnungsgel kann z.B. manuell von Hand oder durch erzwungene Anwendung eines Gerätes in einen Bereich (z.B. Ende) des Beutels oder eines anderen flexiblen Behälters gepresst werden, und die aus der festen Fibrinmatrix ausgedrückte Flüssigkeit kann sich in einem anderen Bereich (z.B. Ende) des Beutels oder eines anderen flexiblen Behälters sammeln. Ein zweiter Beutel oder weitere Behälter können mit dem ersten Beutel, in dem das Pressen stattfindet, entweder während oder nach dem Pressen verbunden werden, und das flüssige Material kann in den zweiten Beutel oder andere Behälter überführt werden. In anderen Formen kann sich das Gerinnselgel in einem starren Behälter wie einem Eimer befinden und durch Drücken von Hand oder durch die erzwungene Anwendung eines Gerätes die Flüssigkeit aus der festen Fibrinmatrix ausgedrückt und die Fibrinmatrix komprimiert und kondensiert werden. In anderen Formen, bei denen die Gerinnselmaterial als eine Vielzahl von diskreten festen Gerinnselpartikeln auftritt, die in einer flüssigen Phase suspendiert sind, kann die Zusammensetzung zentrifugiert werden, um die Gerinnselpartikel zu einer festen Masse zu konzentrieren, und die feste Masse kann von der resultierenden flüssigen Phase abgetrennt werden. Es wird davon ausgegangen, dass Kombinationen dieser und/oder anderer Techniken bei der Abtrennung von Gerinnselmaterial aus flüssigem Material bei der Herstellung von Thrombozytenlysaten für die hier beschriebene Verwendung eingesetzt werden können.
Nach der Gerinnung und der Trennung der flüssigen und festen Bestandteile des geronnenen Roh-Thrombozytenlysats weist die abgetrennte Flüssigkeit des Thrombozytenlysats im Vergleich zum Roh-Thrombozytenlysat vor der Gerinnung eine verringerte Fibrinogenkonzentration auf. In bevorzugten Formen hat das Roh-Thrombozytenlysat einen Fibrinogengehalt von mindestens einer Million ng/ml, typischerweise im Bereich von etwa 1.500.000 bis 3.500.000 (1,5 bis 3,5 Millionen) ng/ml, und nach Gerinnung und Abtrennung hat das an Fibrinogen abgereicherte Thrombozytenlysat einen Fibrinogengehalt von weniger als etwa 50.000 ng/ml, vorzugsweise weniger als etwa 20.000 ng/ml und noch bevorzugter weniger als etwa 5.000 ng/ml.
Zur Veranschaulichung: Das an Fibrinogen verarmte Thrombozytenlysat kann einen Fibrinogengehalt im Bereich von etwa 500 ng/ml bis etwa 20.000 ng/ml oder etwa 500 ng/ml bis etwa 10.000 ng/ml oder etwa 500 ng/ml bis 5000 ng/ml aufweisen. Zusätzlich oder alternativ kann das an Fibrinogen abgereicherte Thrombozytenlysat weniger als etwa 5 % des Fibrinogens enthalten, das im rohen Thrombozytenlysat vor der Gerinnung vorhanden ist, vorzugsweise weniger als etwa 2 % und noch bevorzugter weniger als etwa 1%. Außerdem kann das an Fibrinogen abgereicherte Thrombozytenlysat mindestens etwa 70 % des Volumens des rohen Thrombozytenlysats ausmachen, vorzugsweise mindestens etwa 75 %, und typischerweise im Bereich von etwa 75 % bis etwa 90 %.
Das an Fibrinogen abgereicherte Thrombozytenlysat, das nach der Gerinnung des Roh-Thrombozytenlysats und fest-flüssig Trennung gewonnen wird enthält mehrere Wachstumsfaktoren aus dem Roh-Thrombozytenlysat. Dazu können TGF-β1, EGF, FGFb, PDGF-AB und PDGF-BB gehören. In bestimmten Ausführungsformen enthält dieses Fibrinogen-abgereicherte Thrombozytenlysat die folgenden Wachstumsfaktoren und Mengen davon aus dem rohen Thrombozytenlysat:

etwa 20 bis etwa 150 ng/ml TGF- β1, vorzugsweise etwa 25 bis etwa 150 ng/ml TGF- β1; und/oder
etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, vorzugsweise etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml EGF; und/oder
etwa 50 bis etwa 200 pg/ml FGFb, vorzugsweise etwa 75 bis etwa 200 pg/ml FGFb; und/oder
25 etwa 10 bis etwa 50 ng/ml PDGF-AB, vorzugsweise etwa 15 bis etwa 40 ng/ml PDGF-AB; und/oder
etwa 1 bis etwa 15 ng/ml PDGF-BB, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 15 ng/ml PDGF-BB.

In bevorzugten Formen enthält dieses Fibrinogen-abgereicherte Thrombozytenlysat im Ausgangsmaterial des Thrombozytenkonzentrats auch einen oder mehrere aus Plasma gewonnene Bestandteile, darunter z.B. Globuline, Albumin, Triglyceride, Glucose, Natrium und/oder Calcium. Wird ein Calciumchloridsalz zur Gerinnung des rohen Thrombozytenlysats verwendet, so kann das im Fibrinogen abgereicherten Thrombozytenlysat enthaltene Calcium sowohl aus dem rohen Thrombozytenlysat als auch aus dem zugesetzten Calciumsalz stammen. In bestimmten Ausführungsformen enthält dieses abgetrennte flüssige Thrombozytenlysat die folgenden Komponenten und Mengen:

etwa 0,5 bis 2,5 g/dl Globuline, vorzugsweise etwa 1 bis 2 g/dl Globuline; und/oder 5 etwa 2 bis 5 g/dl Albumin, vorzugsweise etwa 3 bis 4 g/dl Albumin; und/oder
etwa 100 bis 200 mmol/L Natrium, vorzugsweise etwa 120 bis etwa 160 mmol/L Natrium; und/oder
etwa 40 bis 70 mg/dl Triglyceride, vorzugsweise etwa 50 bis 65 mg/dl Triglyceride; und/oder 10 etwa 150 bis 300 mg/dl Glukose, vorzugsweise etwa 150 bis 250 mg/dl Glukose.

Wenn ein Calciumchloridsalz als Gerinnungsmittel für das rohe Thrombozytenlysat verwendet wird, kann das an Fibrinogen verarmte Thrombozytenlysat in einigen Formen Calcium mit einem Gehalt von etwa 15 bis 35 mg/dl, vorzugsweise etwa 15 bis 25 mg/dl, enthalten.
In Übereinstimmung mit einigen Herstellungsverfahren wird das an Fibrinogen abgereicherte Thrombozytenlysat durch einen sterilen Filter geleitet, bevor es, wie hier beschrieben, mit Elektronenstrahlen behandelt wird. In bevorzugten Ausführungsformen besteht der Sterilfilter aus einem 0,2 µm Sterilfilter. Zusätzlich oder alternativ kann das Fibrinogen-abgereicherte Thrombozyten-Lysat anderen Behandlungen vor der Elektronenstrahl-Bestrahlung unterzogen werden, einschließlich z.B. Tiefenfiltration und/oder anderen Verfahren zur Reduzierung von Krankheitserregern, die unabhängig zur Elektronenstrahl-Bestrahlung verlaufen können, z.B. ein Verfahren zur Reduzierung von Krankheitserregern durch ein Lösungsmittel-Tensid, bei dem das Thrombozytenlysat mit einem flüssigen Medium behandelt wird, das ein Lösungsmittel und ein Tensid (z.B. ein nichtionisches Tensid) enthält.
In einigen Formen kann die Thrombozytenzusammensetzung (z.B. Thrombozytenlysat), die hier der Elektronenstrahl-Behandlung unterzogen werden soll, einen Gesamtproteingehalt von mindestens etwa 3 g/dl und in einigen Formen im Bereich von etwa 3 bis etwa 6 g/dl aufweisen.
Zu den Krankheitserregern, die in der Thrombozytenzusammensetzung vorhanden sein können, gehören beispielsweise Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen, Parasiten und Prionen. Zu den typischen Viren, die insbesondere in Thrombozytenzusammensetzungen, die aus menschlichen Spenderquellen gewonnen werden, vorhanden sein können, gehören Syphilis, Hepatitis B und C, Human Immunodeficiency Virus 1 und 2, Human T-Cell lymphotropic Virus I und II und West Nil Virus. In Übereinstimmung mit den Ausführungsformen hierin, kann die Elektronenstrahl-Bestrahlung verwendet werden, um eine Elektronenstrahl-Dosis einzusetzen, die wirksam ist, um einen, einige oder alle dieser Erreger in der Thrombozytenzusammensetzung (z.B. Thrombozyten und/oder Thrombozytenlysat) abzutöten.
Wie oben angegeben, wird die Thrombozytenzusammensetzung für die Elektronenstrahl-Behandlung in gefrorenem Zustand bereitgestellt. In vorteilhaften Ausführungsformen kann die Zusammensetzung der gefrorenen Thrombozyten in Form eines Körpers vorliegen, der eine Länge, eine Breite und eine Dicke haben kann, sowie erste und zweite gegenüberliegende Flächen, zwischen denen die Dicke definiert ist. In bevorzugten Ausführungsformen hat der Körper eine maximale Dicke von etwa 5 cm oder weniger, etwa 3 cm oder weniger, oder in einigen Varianten etwa 2 cm oder weniger. Zusätzlich oder alternativ kann der Körper eine durchschnittliche Dicke von etwa 5 cm oder weniger haben, etwa 3 cm oder weniger, oder in einigen Varianten etwa 2 cm oder weniger, jeweils wahlweise mit einer durchschnittlichen Dicke von etwa 0,2 cm oder mehr. Eine vorteilhafte Elektronenstrahl-Bestrahlung kann auch dann erfolgen, wenn der Körper eine im Wesentlichen gleichmäßige Dicke aufweist. So kann der Körper in einigen Ausführungsformen über ein zusammenhängendes Segment des Körpers, das mindestens 70% des Körpers oder mindestens 80% des Körpers ausmacht, eine Dicke von der ersten bis zur zweiten Fläche aufweisen, die um nicht mehr als 30% variiert (d.h. die Dicke der dicksten Stelle ist nicht mehr als 1,3 mal so dick wie die der dünnsten Stelle), oder in einigen Formen um nicht mehr als 20%. In bestimmten Ausführungsformen kann ein solches zusammenhängendes Segment des Körpers aus gefrorenen Thrombozyten eine Dicke aufweisen, die um nicht mehr als 10% variiert. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass andere Anordnungen für die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung in anderen hier beschriebene Ausführungsformen eingesetzt werden können.
Die Thrombozytenzusammensetzung im gefrorenen Zustand, z.B. in Form eines Körpers, wie oben besprochen, kann in einem Behälter, z.B. einem Beutel (z.B. einem Gefrierbeutel) oder einer Schale, die ein geschlossener Behälter sein kann, enthalten sein. Bei einigen Ausführungsformen liegt das Volumen der Thrombozytenzusammensetzung im Behälter bei mindestens etwa 50 ml oder mindestens etwa 100ml und typischerweise im Bereich von etwa 50 ml bis etwa 10 l und weiter typischerweise bei etwa 100 ml bis etwa 5 l. Zur Herstellung dieses Konstrukts kann die Thrombozytenzusammensetzung in flüssigem (nicht gefrorenem) Zustand in den Behälter eingebracht und danach eingefroren werden. Vor dem Einfrieren und insbesondere dann, wenn ein Körper mit einheitlichen Dickeneigenschaften, wie oben beschrieben, gewünscht wird, kann die Flüssigkeit dazu gebracht werden, die Form, die letztendlich für die Zusammensetzung der gefrorenen Thrombozyten gewünscht wird anzunehmen. Bei einem Behälter mit verformbaren Wänden, wie z.B. einem Beutel, können die Wände manipuliert werden, um sie zu verformen und die Thrombozytenzusammensetzung in flüssiger Form in die für die Zusammensetzung im gefrorenen Zustand gewünschte Form zu bringen. Falls notwendig oder gewünscht, können Formen, Gussformen oder andere physikalische Barrieren außerhalb der verformbaren Behälter mit Wänden (z.B. Beutel) verwendet werden, um das Einzwängen und Halten der Thrombozytenzusammensetzung in flüssiger Form in der Form zu erleichtern, die letztendlich für die gefrorene Zusammensetzung gewünscht wird. Sobald der Zusammensetzung in flüssiger Form die gewünschte Form verliehen wurde, kann die Zusammensetzung auf die Form gefroren werden, die der Elektronenstrahl-Bestrahlung ausgesetzt werden soll.
Die Thrombozytenzusammensetzung kann mit jedem geeigneten Mittel von einer flüssigen Zusammensetzung in eine gefrorene Zusammensetzung umgewandelt werden. Dazu gehört beispielsweise, dass die flüssige Thrombozytenzusammensetzung Gefriertemperaturen ausgesetzt wird, z.B. in einem mechanischen Gefrierschrank oder durch Eintauchen in eine kalte Flüssigkeit wie flüssigen Stickstoff.
Die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung kann in einigen Betriebsarten bei Beginn der Elektronenstrahl-Bestrahlung bei einer Temperatur von etwa -20 °C oder darunter liegen. Vorzugsweise wird diese Temperatur bei etwa -40 °C oder darunter liegen, und noch bevorzugter bei etwa -60 °C oder darunter.
Optional kann in diesen oder anderen Fällen die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung zu Beginn der Elektronenstrahl-Bestrahlung bei einer Temperatur von nicht weniger als etwa -200 °C erfolgen. In einigen Ausführungsformen bleibt die Temperatur der gefrorenen Thrombozytenzusammensetzung während der gesamten Dauer der Elektronenstrahl-Bestrahlung innerhalb dieser Temperaturbereiche. Bei solchen Prozessen kann während der Bestrahlung mit dem Elektronenstrahl zwar ein gewisser Temperaturanstieg auftreten, die Temperatur kann jedoch trotzdem innerhalb der angegebenen Bereiche bleiben.
Eine Vielzahl von geeigneten Elektronenstrahl-Sterilisationsapparaten ist im Handel erhältlich und kann bei der Durchführung der hier beschriebenen Verfahren verwendet werden. Eine geeignete solche Apparatur ist im Handel unter dem Handelsnamen Impela® Elektronenstrahlbeschleuniger (lotron Industries, Inc.) erhältlich. Die Elektronenstrahlbestrahlung kann auf konventionelle Weise durchgeführt werden, z.B. indem die gefrorene Thrombozytenlysat-Zusammensetzung in einem Behälter, wie z.B. einem Glas- oder Kunststoffbehälter, einem Elektronenstrahl ausgesetzt wird. Der Behälter mit der gefrorenen Thrombozyten-Zusammensetzung kann z.B. auf ein Förderband gestellt werden, das dann den Elektronenstrahl, der normalerweise ein fokussierter Strahl ist, durchläuft. Bei einigen Formen wird die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung nur ein einziges Mal dem Elektronenstrahl ausgesetzt. Bei anderen Formen wird nach der Behandlung einer ersten Seite der gefrorenen Thrombozytenzusammensetzung (z.B. einer gefrorenen Körperoberfläche, wie oben beschrieben) mit dem Elektronenstrahl, z.B. durch Hindurchführen der Zusammensetzung durch den Elektronenstrahl mit der ersten Seite, die der Strahlquelle am nächsten liegt, die zweite Seite der gefrorenen Thrombozytenzusammensetzung (z.B. eine gefrorene Körperoberfläche wie oben beschrieben) mit dem Elektronenstrahl behandelt, z.B. indem die Zusammensetzung mit der zweiten Seite, die der Strahlquelle am nächsten liegt, erneut durch den Elektronenstrahl geführt wird.
In typischen Anwendungen liegt das Energieniveau des Elektronenstrahls bei etwa 5 bis etwa 15 MeV, typischerweise etwa 8 bis etwa 12 MeV. Die Dauer der Exposition mit dem Strahl ist typischerweise proportional zu den Abmessungen der Zusammensetzung des gefrorenen Thrombozytenlysats und liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 30 Sekunden bis etwa 10 Minuten. Die an die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung abgegebene Strahlendosis liegt typischerweise im Bereich von etwa 10 kGy bis etwa 100 kGy, typischerweise etwa 20 kGy bis etwa 80 kGy und am typischsten etwa 30 kGy bis etwa 70 kGy.
Zusätzlich oder alternativ dazu kann die abgegebene Strahlendosis eine Dosis sein, die wirksam ist, um mindestens eine 3-Log-Reduktion oder mindestens eine 5-Log-Reduktion in der Konzentration eines oder mehrerer Viren zu erreichen. Bei anderen Betrachtungen kann eine wesentliche Gleichmäßigkeit der abgegebenen Dosis im gesamten gefrorenen Thrombozytenlysatprodukt und somit ein niedriges „Max/Min-Verhältnis“ (das Verhältnis der maximalen Dosis, die ein Teil der Zusammensetzung erhält, zu der minimalen Dosis, die von jedem Teil der Komposition erhalten wird), verwendet werden. Bei einigen Formen beträgt das max/min-Dosisverhältnis für die Elektronenstrahl-Bestrahlungsbehandlung der Thrombozytenlysatzusammensetzung etwa 2: 1 oder weniger, bevorzugter etwa 1,5:1 oder weniger und noch bevorzugter etwa 1,3:1 oder weniger.
Während der Bestrahlung mit dem Elektronenstrahl wird in bestimmten Ausführungsformen eine Kühlung der gefrorenen Thrombozytenzusammensetzung angewendet. Dies kann z.B. dadurch erreicht werden, dass die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung oder der sie enthaltende Behälter gegen ein Objekt platziert oder in eine Umgebung gebracht wird, die so kalt wie die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung oder kälter als diese ist. In einer Form kann eine erste Seite eines Beutels oder eines anderen Behälters, der die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung enthält, auf eine Platte oder eine andere Masse aus Trockeneis (gefrorenes Kohlendioxid, bei etwa -78,5 °C) aufgebracht und die gefrorene Thrombozytenzusammensetzung/Trockeneis-Kombination durch den Elektronenstrahl geführt werden, um eine zweite Seite des Behälters gegenüber der ersten Seite zu bestrahlen. Für Prozesse, bei denen eine zweiseitige Behandlung erwünscht ist, kann nach einem solchen ersten Durchgang durch den Elektronenstrahl der Beutel oder andere Behälter umgedreht werden, um die zweite Seite gegen das Trockeneis zu legen, und die gefrorene Thrombozytenlysat/Trockeneis Kombination kann erneut durch den Elektronenstrahl bearbeitet werden, um die erste Seite des Beutels oder anderen Behälters zu bestrahlen. Es wird davon ausgegangen, dass ähnliche Prozesse mit einer anderen kalten Masse als Trockeneis (z.B. einem metallischen Gegenstand, einem keramischen Gegenstand oder einer anderen gefrorenen Substanz) durchgeführt werden können, die bei einer Temperatur gleich oder unter der der gefrorenen Thrombozytenzusammensetzung liegt, zum Beispiel im Bereich von etwa -20°C bis etwa -200° C oder etwa -50° C bis etwa -200° C.
Zusätzlich wird davon ausgegangen, dass die Seite des Behälters, die dem Elektronenstrahl am nächsten liegt (gegenüber der Seite, die dem Trockeneis oder einer anderen kalten Masse gegenüberliegt), in einigen Ausführungsformen direkt dem Elektronenstrahl ausgesetzt werden kann, der von einer beliebigen Menge des Trockeneises oder einer anderen kalten Masse unbedeckt ist. Die Elektronenstrahl-Bearbeitung kann auch mit der gefrorenen Thrombozytenlysatzusammensetzung in einer mechanisch gekühlten gasförmigen Umgebung, z.B. durch Einbeziehung der gesamten oder eines Teils der Elektronenstrahl-Verarbeitungsausrüstung in die mechanisch gekühlte gasförmige Umgebung, durchgeführt werden.
Eine Anordnung für die Elektronenstrahl-Bearbeitung der Thrombozytenzusammensetzung ist schematisch illustriert in 1. Wie gezeigt, ist eine gefrorene Thrombozytenzusammensetzung 100 (z.B. Thrombozytenkonzentrat, Thrombozytenlysat oder eine Mischung daraus) in einem Beutel 110 mit einer ersten Seite 120, einer zweiten Seite 130 und einer maximalen Dicke „T“ zwischen den Seiten 120 und 130 enthalten. Die zweite Seite 130 des Beutels 110 wird gegen ein Volumen von Trockeneis 140 positioniert, das die Thrombozytenzusammensetzung 100 während der Behandlung mit dem Elektronenstrahl abkühlt (negative Wärmeenergie auf die Thrombozytenzusammensetzung 100 überträgt).
Die erste Seite 120 des Beutels steht einer Elektronenstrahlungsquelle 150 gegenüber. Trockeneis 140 und Beutel 110 können sich, falls gewünscht, in einem sekundären Behälter (nicht abgebildet) befinden, der auf einem Förderband (nicht abgebildet) positioniert werden kann, um den Beutel 110 und Trockeneis 140 durch den von der Quelle 150 emittierten Elektronenstrahl zu führen. In einigen Ausführungsformen, wie an anderer Stelle hier besprochen, kann der Beutel 110 von der Quelle 150 auf jeder der Seiten 120 und 130 bestrahlt werden. Dazu kann der Beutel 110 nach einem ersten Durchgang durch den Elektronenstrahl von Quelle 150, umgedreht werden, so dass die zweite Seite 130 der Quelle 150 zugewandt ist und die erste Seite 120 gegen Trockeneis 140 positioniert wird. In dieser Position können der Beutel 110 und das Trockeneis 140 wieder durch den von der Quelle 150 ausgesandten Elektronenstrahl geführt werden.
Es wurde festgestellt, dass signifikante Mengen der biologischen Aktivität der Thrombozytenzusammensetzung durch die hier beschriebene Elektronenstrahl-Bestrahlungsverarbeitung beibehalten werden kann. Insbesondere gefrorenes Thrombozytenlysat und Thrombozytenlysat, das aus gefrorenem Thrombozytenkonzentrat hergestellt wurde, zeigen im Vergleich zu einem entsprechenden Thrombozytenlysat, das nicht dem Elektronenstrahl-Verfahren unterzogen wurde, eine signifikante Fähigkeit, die Proliferation lebensfähiger Zellen in Kultur zu fördern, wie weiter unten in den illustrativen Beispielen 1 und 2 beschrieben wird. Auch gefrorenes Thrombozytenlysat und Thrombozytenlysat, das aus gefrorenem Thrombozytenkonzentrat hergestellt wurde, weisen im Vergleich zu entsprechendem Thrombozytenlysat, das nicht dem Elektronenstrahl-Verfahren unterzogen wurde, signifikante Konzentrationen an Wachstumsfaktoren auf. In einigen Ausführungsformen behält Elektronenstrahl-verarbeitetes gefrorenes Thrombozytenlysat oder das aus Elektronenstrahl-verarbeitetem gefrorenem Thrombozytenkonzentrat hergestellte Thrombozytenlysat mindestens etwa 50% eines Wachstumsfaktors im Vergleich zu einem entsprechenden nicht-Elektronenstrahl-verarbeiteten Thrombozytenlysat. Bei dem mindestens einen Wachstumsfaktor kann es sich z.B. um einen, einen Teil oder die Gesamtheit von TGF-βl, EGF, FGFb, PDGF-AB und PDGF- BB handeln.
In bestimmten Ausführungsformen weist das mit Elektronenstrahl behandelte Thrombozytenlysat oder das aus dem mit Elektronenstrahl behandelten Thrombozytenkonzentrat hergestellte Thrombozytenlysat das folgende Wachstumsfaktorprofil auf:

10 TGF- β1mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, typischerweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, vorzugsweise etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, typischerweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, vorzugsweise etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, typischerweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, vorzugsweise etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, typischerweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, vorzugsweise etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, typischerweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.

Zusätzlich oder alternativ zu dem oben genannten Wachstumsfaktorprofil kann ein mit Elektronenstrahl behandeltes Thrombozytenlysat mindestens die folgenden Prozentsätze des Wachstumsfaktorgehalts im Vergleich zum Wachstumsfaktorgehalt vor der Behandlung mit Elektronenstrahl beibehalten:

TGF- β1: mindestens etwa 60%, und typischerweise im Bereich von etwa 60% bis etwa 90%; und/oder FGFb: mindestens etwa 50%, und typischerweise im Bereich von etwa 50% bis etwa 90%; und/oder
EGF: mindestens etwa 50 % und typischerweise im Bereich von etwa 50 % bis etwa 80 %; und/oder
PDGF-AB: mindestens etwa 50% und typischerweise im Bereich von etwa 50% bis etwa 80%; und/oder
PDGF-BB: mindestens etwa 50%, und typischerweise im Bereich von etwa 50% bis etwa 80%;

Die mit dem Elektronenstrahl behandelte Thrombozytenzusammensetzung kann die oben spezifizierten Mengen an Wachstumsfaktoren und/oder die beibehaltenen Prozentsätze an Wachstumsfaktoren aufweisen, selbst nach der Behandlung mit dem Elektronenstrahl bei einer Wirksamkeit, mit der mindestens eine 3-Log-Reduktion oder mindestens eine 5-Log-Reduktion oder mindestens eine 6-Log-Reduktion eines oder mehrerer Viren in der Thrombozytenzusammensetzung erreicht wird, z.B. von Bovine Virusdiarrhoe-Viren, und/oder sogar nach Behandlung mit einer Dosis von Elektronenstrahlen im Bereich von 20 bis 100 kGy, oder 30 bis 70 kGy. Es wird davon ausgegangen, dass die Offenbarung der Verwendung einer Dosis Elektronenstrahlenstrahlung, die wirksam ist, um eine bestimmte Log-Reduktion bei einem Virus zu erreichen, nicht bedeutet, dass die zu behandelnde Zusammensetzung notwendigerweise ein solches Virus in sich trägt (obwohl sie es kann) oder eine solche Reduktion des Virus erreicht wird (obwohl sie es kann). Diese Verwendung bezieht sich auf die Dosis der angewandten Elektronenstrahl-Bestrahlung, und dass sie wirksam wäre, die spezifizierte Log-Reduktion zu erreichen, wenn das Virus in der gesamten behandelten Zusammensetzung homogen verteilt wäre.
Die hierin mit Elektronenstrahl behandelten Zusammensetzungen oder von ihnen abgeleitete Zusammensetzungen können identifizierende Merkmale haben, die durch die Elektronenstrahl-Bestrahlung induziert werden. Zum Beispiel ist bekannt, dass die Elektronenstrahl-Bestrahlung eine Fragmentierung und/oder Aggregation von Proteinen in biologischen Materialien im Vergleich zu den entsprechenden Materialien verursacht, die nicht der Elektronenstrahl-Bestrahlung ausgesetzt waren. In einigen Formen können die Thrombozytenzusammensetzungen eine Menge an Albumin enthalten (z.B. aus Blutserum, das mit den Thrombozyten gewonnen wurde), und die mit dem Elektronenstrahl behandelten Thrombozytenzusammensetzungen können im Vergleich zu einer entsprechenden Thrombozytenzusammensetzung, die nicht mit dem Elektronenstrahl behandelt wurde, einen erhöhten Gehalt an Albuminfragmenten und/oder Albuminaggregation aufweisen. Außerdem wird erwartet, dass die oben erwähnte Elektronenstrahl-induzierte Verminderung der gemessenen Wachstumsfaktorwerte in Verbindung mit Elektronenstrahl-induzierten Veränderungen der Wachstumsfaktoren auftritt, die dazu führen, dass sie ihre biologische Aktivität verlieren. Dementsprechend können inaktivierte Mengen dieser Wachstumsfaktoren (z.B. aufgrund von Fragmentierung, Aggregation, unsachgemäßer Faltung und/oder anderen Ursachen) ebenfalls als charakterisierendes Merkmal dienen. Dementsprechend kann die Thrombozytenzusammensetzung in einigen Formen die folgenden Elektronenstrahlinaktivierten Mengen der folgenden Wachstumsfaktoren aufweisen:

inaktivierter FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 pg/ml; und/oder
inaktivierter EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml; und/oder
inaktivierter PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 3 ng/ml; und/oder
inaktivierter PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 0,5 ng/ml; und/oder inaktivierter TGF- β mit einem Gehalt von mindestens etwa 0,5 ng/ml.

Nach der Elektronenstrahl-Behandlung kann die krankheitserregerreduzierte Thrombozytenzusammensetzung in bestimmten Ausführungsformen in eine Verpackung oder mehrere Verpackungen eingebracht werden, vorzugsweise nach dem Auftauen der gefrorenen Thrombozytenzusammensetzung zur Bildung einer flüssigen Zusammensetzung. Dies wird vorzugsweise in einer sterilen Transferoperation erreicht. Zu diesem Zweck kann der Beutel oder andere Behälter, in dem sich die Thrombozytenzusammensetzung für die Elektronenstrahl-Behandlung befindet, mit sterilen Konnektoren versehen werden, die eine sterile Verbindung zum Inneren des Beutels/Behälters und den Transfer des Inhalts in einen oder mehrere Verpackungsbehälter wie Beutel, Fläschchen oder Ähnliches ermöglichen. Diese direkte Verpackung nach der Elektronenstrahl-Behandlung, ohne weitere Schritte, die die Zusammensetzung der Elektronenstrahl-Thrombozyten wesentlich verändern, ist besonders anwendbar, wenn die Elektronenstrahl-Bestrahlung auf einem Thrombozytenlysat durchgeführt wird.
Wenn die Elektronenstrahl-Bestrahlung mit einer Zusammensetzung durchgeführt wird, die ein Thrombozytenkonzentrat enthält, wird die resultierende Elektronenstrahl-behandelte Zusammensetzung typischerweise weiteren Bearbeitungsschritten unterzogen, in einigen Fällen Bearbeitungsschritten zur Herstellung eines Thrombozytenlysats aus bestrahlten intakten Thrombozytenzusammensetzung. Zum Beispiel kann das mit Elektronenstrahl behandelte Thrombozytenkonzentrat aufgetaut und dann wie hierin angegeben verarbeitet werden, um eine Thrombozytenlysat-Zusammensetzung herzustellen, die z.B. die oben angegebenen Schritte zur Fibrinogenabreicherung und/oder Filterung einschließt. In dieser Hinsicht kann das Auftauen der elektronenstrahlbehandelten Zusammensetzung, die ein Thrombozytenkonzentrat enthält, zur Lyse intakter Thrombozyten dienen, insbesondere in Fällen, in denen die Thrombozytenzusammensetzung vor der Elektronenstrahl-Bestrahlung im gefrorenen Zustand anderen Prozessen unterzogen wurde, die die Thrombozyten lysieren, wie z.B. vorherige Gefrier-/Auftauprozesse oder Aktivierung mit Thrombin oder anderen Wirkstoffen, wie oben diskutiert. Wie zum Beispiel in den spezifischen Beispielen unten gezeigt wird, enthält das Thrombozytenlysat, das aus dem Elektronenstrahl behandelten Thrombozytenkonzentrat hergestellt wird, vorteilhaft hohe Konzentrationen an Wachstumsfaktoren.
Das Elektronenstrahl-behandelte Thrombozytenlysat oder die Elektronenstrahl-behandelte Thrombozytenkonzentratzusammensetzung oder ein daraus hergestelltes Thrombozytenlysat kann auch anderen Schritten unterzogen werden, einschließlich z.B. einer oder mehrerer zusätzlicher Filtrationen und/oder einer oder mehrerer zusätzlicher Behandlungen zur Reduktion von Krankheitserregern, wie z.B. einer Behandlung zur Reduktion von Krankheitserregern mit einem Lösungsmittel-Tensid, bei der die Zusammensetzung mit einem organischen Lösungsmittel und einem Tensid (z.B. nichtionischen Tensid), gefolgt von der Entfernung des organischen Lösungsmittels und des Tensids (möglicherweise mit Ausnahme von Spurenmengen). Das schließlich verarbeitete Produkt kann dann in Behälter wie Beutel oder Fläschchen verpackt werden, die vorzugsweise eine sterile, versiegelte Umgebung aufrechterhalten, in der sich die Thrombozytenzusammensetzungen befinden.
Eine krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat-Zusammensetzung oder eine andere hierin enthaltene Thrombozyten-Zusammensetzung kann in ihrer vollen Konzentration wie Elektronenstrahl-behandelt verpackt werden, oder sie kann mit Wasser oder einem wässrigen Medium für die Verpackung und spätere Verwendung verdünnt werden, z.B. Verdünnungen auf 90% bis 10% der Originalkonzentration der Thrombozytenzusammensetzung, und solche verdünnten Zusammensetzungen und die sich daraus ergebenden entsprechenden Verringerungen der hier angegebenen Komponentenmengen bilden weitere hier offenbarte Ausführungsformen.
Eine Ausführungsform einer Verpackung ist in 2 dargestellt. In Übereinstimmung mit einigen praktischen Ausführungsformen wird das Elektronenstrahl-behandelte Thrombozytenlysat oder ein anderes Thrombozytenkonzentratzusammensetzung 200 in einer sterilen Medienflasche 210 aufbewahrt. Sterile Medienflaschen können z.B. eine Volumenkapazität im Bereich von 50 ml bis 5000 ml haben. Als Beispiele können 60-ml-, 125-ml-, 250-ml-, 500-ml-, 1000-ml- oder 2000-ml-Flaschen verwendet werden. In einigen Formen wird der Verschluss 220 der sterilen Medienflasche 210 durch Schrumpffolie 230 geschützt. In einigen Formen ist die Flasche 15 in Schrumpffolie verpackt. In bestimmten Ausführungsformen wird die Flasche mit einem Fertigproduktetikett etikettiert 240. Bei einigen Formen wird die Flasche in einen Produktkarton mit Trockeneis gestellt.
In bestimmten Ausführungsformen kann das krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat oder eine andere Thrombozytenzusammensetzung mit anderen Inhaltsstoffen kombiniert werden, um ein Zellkulturmedium zu bilden. Ein solches Zellkulturmedium besteht aus einem Thrombozytenlysat gemäß der vorliegenden Offenbarung, das mit anderen Nährstoffen oder Medien für die Zellkultur gemischt ist, einschließlich z.B. solchen, wie sie in bekannten Zellkulturmedien wie dem Minimum Essential Medium (MEM) oder Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) vorkommen. Ein Zellkulturmedium gemäß der vorliegenden Offenbarung ist so formuliert, dass es Nährstoffe (z. B. Wachstumsfaktoren usw.) liefert, die für das Wachstum oder die Erhaltung von Zellen erforderlich sind, einschließlich zum Beispiel Stamm- und/oder Vorläuferzellen, wie mesenchymale Stammzellen, oder Immunzellen wie T-Zellen oder natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Zellen, die unter Verwendung des hierin enthaltenen krankheitserregerverringerten Thrombozytenlysats oder einer anderen Thrombozytenzusammensetzung oder in einem Kulturmedium für die Zellen kultiviert werden, können in einigen Ausführungsformen medizinisch verwendet werden, indem die Zellen einem Menschen oder einem anderen Tier verabreicht werden, und können vorteilhafte phänotypische und/oder andere Merkmale für solche Verabreichungen haben. Beispielsweise können mesenchymale oder andere Stammzellen dem Patienten zu therapeutischen Zwecken lokal und/oder systemisch in das Gefäßsystem (z.B. durch intravenöse Verabreichung) verabreicht werden. Kultivierte Immunzellen, wie z.B. T-Zellen, können Patienten verabreicht werden um eine Immuntherapie zur Behandlung von Krebs bereitzustellen. In einigen Formen ist die Immuntherapie eine adoptive Zelltransfer-Therapie, bei der patienteneigene Immunzellen - aus ihrem Blut oder direkt aus ihren Tumoren gewonnen - ihren Krebs behandeln sollen. Der Krebs kann ein Melanom, ein Blutkrebs wie Leukämie oder ein Lymphom sein. In einem Anwendungsmodus wird das krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat in der Kultur der Zellen eines Patienten zusammen mit „CAR T-Cell Therapie“, „TCR-Therapie“ oder „TIL-Therapie“ angewendet.
Bei der CAR T-Zell-Therapie werden die T-Zellen eines Patienten aus dem Blut entnommen, z.B. durch Apherese. Die T-Zellen werden dann genetisch so verändert, dass sie ein synthetisches oder künstliches Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren, das als chimärer Antigenrezeptor oder CAR bezeichnet wird. Die CARs auf den T Zellen sind so konzipiert, dass sie an spezifische Proteine auf der Oberfläche von Krebszellen binden. Nachdem die T-Zellen zur Expression eines CAR entwickelt wurden, werden sie im Labor gezüchtet, wobei als oder im Kulturmedium ein krankheitserregerreduziertes Thrombozytenlysat, wie hier beschrieben, verwendet wird, in der Regel so lange, bis über hundert Millionen von ihnen vorhanden sind. Die CAR-T-Zellen werden anschließend in das Gefäßsystem des Patienten infundiert, normalerweise nachdem der Patient eine Chemotherapie und andere Medikamente, die dem Körper vorhandene T-Zellen entziehen, erhalten hat.
Bei der TCR-Therapie werden T-Zellen, die von Patienten entnommen wurden, so bearbeitet, dass sie einen Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren - den so genannten T-Zell-Rezeptor oder TCR. Nachdem die T-Zellen so bearbeitet wurden, dass sie einen TCR exprimieren, werden sie dann gezüchtet, wobei als oder im Kulturmedium ein krankheitserregerreduziertes Thrombozytenlysat, wie hier beschrieben, verwendet wird, in der Regel so lange, bis es über hundert Millionen davon gibt. Die TCR-gestalteten Zellen werden anschließend in das Gefäßsystem des Patienten infundiert, wiederum in der Regel nachdem der Patient eine Chemotherapie und andere Medikamente erhalten hat, die den Körper von den vorhandenen T-Zellen befreien.
Bei der TIL-Therapie werden tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) aus einer Probe des Tumors eines Patienten entnommen und getestet, um diejenigen mit der größten Fähigkeit zur Erkennung der Tumorzellen des Patienten zu identifizieren. Die identifizierten TILs werden dann unter Verwendung eines krankheitserregerreduzierten Thrombozytenlysats, wie hier beschrieben, als oder im Kulturmedium gezüchtet, in der Regel so lange, bis mehr als hundert Millionen von ihnen vorhanden sind. Die TIL-Zellen werden anschließend mit Zytokinen aktiviert und dann in das Gefäßsystem des Patienten infundiert, wiederum in der Regel nachdem der Patient eine Chemotherapie und andere Medikamente erhalten hat, die den Körper an vorhandenen T-Zellen verarmen lassen.
In anderen Ausführungsformen kann das krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat oder eine andere Thrombozytenzusammensetzung als therapeutische Substanz verwendet werden. Beispielsweise kann die Zusammensetzung als therapeutische Substanz für medizinische Behandlungen verwendet werden, auch zur Behandlung von erkranktem oder geschädigtem Gewebe wie Nerven-, Sehnen-, Knochen-, Muskel-, Haut- (z.B. Wundheilung), Bindegewebe, okuläres und/oder kardiovaskuläres (z.B. Herz oder Aorta) Gewebe. Die krankheitserregerreduzierte Thrombozytenzusammensetzung kann allein oder in einer Zusammensetzung mit einer oder mehreren anderen Komponenten an diese oder andere Gewebe abgegeben werden. Die Verabreichung kann durch jedes geeignete Mittel erfolgen, z.B. durch Injektion oder andere chirurgische Implantation oder topische Verabreichung. Bei bestimmten Anwendungen zur Behandlung von Augengewebe wird eine krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat-Zusammensetzung auf die Oberfläche eines Auges (z.B. in Form von Flüssigkeitstropfen), z.B. bei der Behandlung von Augenoberflächendefekten oder - erkrankungen wie der okulären GVHD (okuläre Graft-versus-Host-Disease), von Hornhautgeschwüren, des trockenen Auges (Keratoconjunctivitis Sicca) oder der Reparatur der Hornhaut nach Operationen oder Verletzungen.
In Übereinstimmung mit bestimmten Formen wird die Thrombozytenzusammensetzung der vorliegenden Offenbarung zur Behandlung eines Säugetierpatienten (z. B. Mensch, Hund, Katze, Pferd usw.) verwendet. In bevorzugten Verwendungsmodi ist das Thrombozytenlysat oder eine andere Thrombozytenzusammensetzung in Bezug auf den behandelten Patienten allogen, während in anderen Ausführungsformen das Thrombozytenlysat oder eine andere Thrombozytenzusammensetzung in Bezug auf den behandelten Patienten xenogen sein kann. Beispielsweise kann eine krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat-Zusammensetzung, die aus menschlichen Thrombozyten gewonnen wird, in bestimmten Ausführungsformen verwendet werden, um einen Hund als Patient zu behandeln. Es ist auch vorgesehen, dass eine krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat-Zusammensetzung, die aus Thrombozyten von Hunden gewonnen wird, zur Behandlung eines Hundes als Patient verwendet werden kann, und dass eine krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat-Zusammensetzung, die aus menschlichen Thrombozyten gewonnen wird, zur Behandlung eines Menschen als Patienten verwendet werden kann. In einigen Formen leidet der menschliche Patient an Keratoconjunctivitis Sicca. In Übereinstimmung mit bestimmten erfinderischen Varianten kann ein krankheitserregerreduziertes Thrombozytenlysat zur Behandlung eines an Keratoconjunctivitis Sicca leidenden Hundes als Patienten verwendet werden. Bei dem Patienten kann es sich um jede beliebige Hunderasse handeln. Zu den Rassen, die häufig von Keratoconjunctivitis Sicca betroffen sind, gehören: Cavalier King Charles Spaniel, Bulldogge, Chinesischer Shar Pei. Ihasa apso, Shih tzu, West Highland White Terrier, Mops, Bluthund, Cockerspaniel, Pekingese, Boston Terrier, Zwergschnauzer und Samojeden.
Das krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat kann in einer Flüssigkeitsabgabevorrichtung verpackt werden, die so konfiguriert ist, dass sie das Lysat an das Auge des Patienten abgibt. Bei einigen Formen ist die Flüssigkeitsabgabevorrichtung ein steriler Behälter. 3 illustriert eine Ausführungsform einer Flüssigkeitsabgabevorrichtung. In der abgebildeten Ausführungsform wird das krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat im Gerät 300 gelagert. Gerät 300 hat einen Speicherteil 310 und einen Abgabeteil 320. In der abgebildeten Ausführung kann der Abgabeteil 320 optional mit Deckel 322 abgedeckt werden. Der Abgabeteil 320 kann so konfiguriert werden, dass ein Teil des Thrombozytenlysats oder anderen Thrombozytenzusammensetzung (z.B. einzelne Tropfen) abgegeben wird. In einigen Ausführungsformen besteht der Speicherteil 310 aus einem verformbaren Kunststoffmaterial, das von einem Benutzer zusammengedrückt werden kann. Andere geeignete Vorrichtungen zur Abgabe von Flüssigkeiten sind u.a. Augentropfer und Pipetten.
In Übereinstimmung mit anderen Ausführungsformen kann das krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysat oder eine andere Thrombozyten-Zusammensetzung als Salbe formuliert werden. Bei einigen Ausführungsformen wird die Salbe topisch auf eine betroffene Stelle (z.B. auf das Auge eines Patienten) aufgetragen.
Bei noch anderen Anwendungen kann ein hierin enthaltenes krankheitserregerreduziertes Thrombozytenlysat als Kryokonservierungsmittel für Zellen verwendet werden. Bei solchen kryokonservierenden Anwendungen kann die krankheitserregerreduzierte Thrombozytenlysatzusammensetzung in eine Zellsuspensionszusammensetzung eingearbeitet werden, und die Zellsuspensionszusammensetzung kann kryokonserviert werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Bei den Zellen kann es sich um eine Vielzahl von Zellen handeln, einschließlich Stammzellen wie mesenchymale Stammzellen, Vorläuferzellen, Immunzellen oder andere. Die Kryokonservierung kann in einem geeigneten Gefäß, wie z.B. einem Beutel oder einer Ampulle, durchgeführt werden.
Die folgenden spezifischen Beispiele werden angeführt, um ein weiteres Verständnis bestimmter Aspekte der vorliegenden Offenbarung zu fördern. Es wird davon ausgegangen, dass diese Beispiele illustrativen und nicht einschränkenden Charakter haben.
Beispiel 1
Zweck dieses Beispiels war es, die Wirkung verschiedener Bestrahlungsdosen mit Elektronenstrahlen (Elektronenstrahl) auf die Charakterisierung und Funktionalität von humanem Thrombozytenlysat (HPL) als Zellkulturzusatz zu bewerten. Die Elektronenstrahl-Bestrahlung wurde auf vereinigte gefrorene Thrombozyteneinheiten angewendet, die dann in HPL umgewandelt wurden. Das resultierende HPL wurde auf den Gehalt an Wachstumsfaktoren und die Fähigkeit zur Unterstützung des Zellwachstums getestet. Dies wurde mit Wachstumsfaktorwerten und der Fähigkeit zur Unterstützung des Zellwachstums für HPL verglichen, die ebenfalls aus gefrorenen Thrombozyteneinheiten hergestellt worden waren, jedoch ohne jegliche Elektronenstrahl-Behandlung (Kontrollen in den Abbildungen).
VERFAHREN
Elektronenstrahl-Bestrahlung. Insgesamt 120 gefrorene Thrombozyteneinheiten (je ca. 250ml) wurden über Nacht bei 4°C aufgetaut, aufgeschnitten und der Inhalt in einem einzigen 25 l Blut kompatiblen Beutel vereinigt. Aus dem Beutel mit 120 aufgetauten und vereinigten Thrombozyteneinheiten wurden 600 ml flüssige Thrombozyten in einen 1 l Freeze-Pak-Beutel überführt. Die umgepackten Thrombozyteneinheiten wurden dann bei -20°C eingefroren, wobei darauf geachtet wurde, dass die Form des Beutels und der Inhalt so gleichmäßig flach wie möglich waren und eine Dicke von 3 cm hatten. Jede gefrorene 600 ml Thrombozytenprobe wurde auf Trockeneis in einem kalten Versandbehälter verpackt. Die verpackten Einheiten wurden über Nacht zu einer Einrichtung für Elektronenstrahl-Bestrahlung geschickt. Die verpackten Einheiten wurden einem minimal-maximalen Dosisbereich ausgesetzt, der durch die Bestrahlung jeder Seite der 3 cm dicken Beutel erreicht wurde. Tabelle I unten zeigt die in diesem Beispiel ausgewerteten minimal-maximalen Dosisbereiche. Tabelle I

% Dosis Verteilung

<20% >80%

Minimum Dosis Dauer (min) Maximum Dosis

35 1.35 47

40 1.35 54

45 1.35 61

50 1.35 68

55 1.35 74
Vorbereitung von HPL. Mit Elektronenstrahl behandelte Thrombozyteneinheiten wurden in HPL umgewandelt.
Im Allgemeinen wurde der pH-Wert der Thrombozyteneinheiten nach dem Auftauen auf 7,75 +/-0,25 eingestellt. Jedem Beutel wurden 1,0 g/l Calciumchlorid-Dehydrat zugegeben, um die Gerinnung einzuleiten. Die Beutel wurden dann 2 Stunden lang bei 85 U/min bei Raumtemperatur und Luftfeuchtigkeit geschüttelt und dann weitere 24 - 48 Stunden bei 4°C inkubiert. Das geronnene Material wurde vom Beutel getrennt, und die extrahierte Flüssigkeit wurde durch einen sterilisierbaren Filter gefiltert.
Charakterisierung von Wachstumsfaktoren. Wachstumsfaktormessungen der vorbereiteten HPL wurden für FGFb, PDGF-BB, PDGF-AB, EGF und TGF-beta unter Verwendung von ELISA-Kits und einem Mikroplatten-Lesegerät (Synergy Neo2 Plate Reader, BioTek Instruments) durchgeführt. Die Wachstumsfaktoren für jede Behandlung und Kontrolle wurden in dreifacher Ausfertigung analysiert. ELISAs wurden durchgeführt nach Herstellerprotokoll. Vor der Durchführung des ELISA wurde eine Verdünnungsreihe durchgeführt, und für jeden analysierten Wachstumsfaktor wurden geeignete Verdünnungen verwendet.
Überprüfung des Zellwachstums. In Vorbereitung auf den Zellwachstumsnachweis-Assay wurden zuvor kryogenisch gelagerte mesenchymale Stammzellen (MSC) aufgetaut und bei 5000 Zellen/cm2 unter Verwendung geeigneter Zellkulturmedien (DMEM, ergänzt mit 10% HPL und 1% Pen/Strep/Amp). Nachdem man den MSCs erlaubt hatte, sich bis zu 70-80% Konfluenz zu vermehren, wurden Zellen geerntet und für Experimente patziert. Die Zellkulturtests wurden mit Multiwell-Platten durchgeführt. Für jedes Experiment wurden die Zellen in einer 12-Well-Platte bei 20.000 Zellen/Vertiefung mit l ml des Mediums plattiert. Am Tag nach der Aussaat wurde ein Medienwechsel durchgeführt und das Experiment wurde nach fünf Tagen oder wenn eine der Proben 70-80% Konfluenz erreichte, gestoppt. Wenn Zellen nach drei Tagen nach dem ersten Medienwechsel keine 70-80% Konfluenz erreichten, wurde am Tag 4 ein zweiter Medienwechsel durchgeführt.
Um die Zellen zu ernten, wurden die Wells mit 0,5ml PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit 250 µl TrypLE trypsiniert. Nachdem die Zellen abgelöst worden waren, wurden 250µl Medium in jede Vertiefung gegeben, um das TrypLE zu quenchen. Die Proben wurden dann in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 2000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt und die Pellets wurden in 500µl frischem Medium resuspendiert. Die Gesamtzellzahl für jede Kontroll- und Behandlungsvertiefung wurde mit dem Vi-Cell XR Cell Viability Analyzer (Beckman Coulter, USA) ermittelt.
Statistische Analyse. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten dargestellt. Statistische Analysen zwischen den Gruppen wurden mit einem student t-Test und one-way ANOVA durchgeführt. p<0,05 wurde als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied gewertet (*= p<0,05, **= p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001).
ERGEBNISSE
Leistung der Zellkultur. Zur Untersuchung der Auswirkungen von Elektronenstrahl-Bestrahlung auf MSC Wachstum wurde die Zellwachstumsleistung auf zwei verschiedenen MSCs (ASC und BM-MSC) getestet. Die Zellen wurden in Medien kultiviert, die mit 10% HPL und 1% Pen/Strep/Amp präpariert wurden, wie zuvor in diesem Beispiel beschrieben. Die Ergebnisse sind in 4 und 5 dargestellt. 4 zeigt einen Vergleich des ASC-Zellwachstums in Medien, die mit HPL ergänzt wurden, das bei verschiedenen Mindestdosisbereichen behandelt wurde. A: Zellwachstumsanalyse anhand der Zellzahl B: Zellwachstumsanalyse anhand des Prozentsatzes der Kontrolle. Die Daten zeigen, dass das ASC-Zellwachstum bei dem minimalen Dosisbereich von 40kGy und darüber signifikant abnahm (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002,****=p<0.0001). Bei den angegebenen Daten handelt es sich um den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten unterschiedlicher HPL-Chargen. 5 enthält einen Vergleich des Wachstums von BM-MSC-Zellen in Medien, die mit HPL in verschiedenen Mindestdosisbereichen behandelt wurden. A: Zellwachstumsanalyse anhand der Zellzahl B: Zellwachstumsanalyse anhand des Prozentsatzes der Kontrolle. Die Daten zeigen dass das ASC-Zellwachstum im Mindestdosisbereich von 40kGy und darüber signifikant abnahm (*=p<0,05,**=p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001). Die gezeigten Daten sind der Mittelwert von drei unabhängigen Versuche mit verschiedenen HPL-Chargen. Wie gezeigt, begann unter den Bedingungen der vorliegenden Arbeit die Elektronenstrahl-Bestrahlung das ASC-Zellwachstum bei einem Bestrahlungsdosisbereich von 40kGy und darüber negativ zu beeinflussen, und das BM-MSC-Zellwachstum wird bei einem Dosisbereich von 45kGy und darüber beeinflusst.
Wachstumsfaktor-Analyse. 6 zeigt die durch ELISA bestimmten Werte von fünf Wachstumsfaktoren FGFb, EGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF-βl , von denen bekannt ist, dass sie für das Wachstum von MSC-Zellen relevant sind. Bei den angegebenen Daten handelt es sich um den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten mit verschiedenen HPL-Chargen. Wie unter den Bedingungen der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, ist unter den getesteten Wachstumsfaktoren FGFb unter Elektronenstrahl-Bestrahlung am stärksten reduziert.
Morphologie. Es wurden keine nennenswerten Unterschiede in der Morphologie zwischen den als Kontrolle kultivierten Zellen gegenüber mit Elektronenstrahl behandeltem Material festgestellt.
Beispiel 2
Zweck dieses Beispiels war es, die Wirkung von Elektronenstrahl-Bestrahlung (Elektronenstrahl) auf den Wachstumsfaktor-Gehalt von Materialien aus menschlichem BlutThrombozytenlysat (HPL) zu bewerten, die aus Elektronenstrahl-bestrahlten Thrombozyten („Thrombozyten“ in den Abbildungen), oder HPL Elektronenstrahl-bestrahlt nach seiner Herstellung aus Thrombozyten („Lysat“ in den Abbildungen), und die Funktionalität dieser HPL-Materialien als Zellkultur-Ergänzung für das Wachstum von ASCs und MSCs. Diese HPL-Materialien wurden mit einem Thrombozyten-Lysat verglichen, das auf ähnliche Weise aus Thrombozyten hergestellt wurde, jedoch ohne jegliche Elektronenstrahl-Behandlung (Kontrollen in den Abbildungen).
VERFAHREN
Elektronenstrahl-Verarbeitung von Thrombozyten und HPL. Insgesamt 240 gefrorene Thrombozyteneinheiten (ca. 250ml) wurden über Nacht bei 4°C aufgetaut, aufgeschnitten und der Inhalt vereinigt. Das vereinigte Thrombozytenvolumen wurde dann gleichmäßig auf zwei separate sterile Kunststoffbehälter aufgeteilt.
Aus dem ersten Behälter wurden 6,5 l vereinigte flüssige Thrombozyten in je einen 4x25 l Flex-Beutel überführt. Die Thrombozyten aus dem zweiten Behälter wurden sofort wie unten beschrieben zu HPL verarbeitet. Das HPL wurde dann in jeden der 3x25L Flex-Beutel zu je 6,5 Litern übertragen. Ein Volumen von 100 ml HPL wurde separat eingefroren, um als Kontrolle zu dienen. Die umgepackten Thrombozyten aus dem ersten Behälter und das verarbeitete HPL aus dem zweiten Behälter wurden dann bei -20°C eingefroren, wobei darauf geachtet wurde, dass die Form jedes Flex-Beutels mit einer Dicke von 3 cm möglichst gleichmäßig flach war. Alle Proben sowie die Kontrolle wurden auf Trockeneis in einem kalten Versandbehälter verpackt und an eine Einrichtung zur Elektronenstrahl-Verarbeitung verschickt. Die für die Elektronenstrahl-Bearbeitung vorgesehenen Einheiten wurden einem Dosisbereich von 40-54 kGy ausgesetzt, der durch die Anwendung von gerichteter Elektronenstrahl-Strahlung auf eine erste Seite der 3 cm dicken Beutel erreicht wurde, während diese auf Trockeneis ruhten und durch die Elektronenstrahl-Bestrahlung befördert wurden, wobei die Beutel auf dem Trockeneis anschließend umgedreht und dann mit gerichteter Elektronenstrahl-Bestrahlung auf die zweite Seite der 3 cm dicken Beutel bestrahlt wurden, während die Beutel wieder auf dem Trockeneis auflagen und durch die Elektronenstrahl-Bestrahlung befördert wurden. Die Versandkontrolle wurde nicht mit Elektronenstrahl bearbeitet.
Charakterisierung des Wachstumsfaktors. Wachstumsfaktormessungen wurden durchgeführt mit 20 ELISA-Kits und einem Mikroplatten-Lesegerät (Synergy Neo2, BioTek Instruments). Die Wachstumsfaktoren für jede Behandlung und Kontrolle wurden in dreifacher Ausfertigung analysiert. ELISAs wurden nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Vor der Durchführung des ELISA wurde eine Verdünnungsreihe durchgeführt und für jeden analysierten Wachstumsfaktor wurden geeignete Verdünnungen verwendet.
Überprüfung des Zellwachstums. Zur Vorbereitung auf den Zellwachstumsnachweis-Assay wurden zuvor kryogenisch gelagerte ASCs und MSCs aufgetaut und mit 5000 Zellen/cm2 unter Verwendung geeigneter Zellkulturmedien plattiert. Nachdem sich die Zellen bis zu 70-80% Konfluenz vermehren konnten, wurden sie geerntet und für Experimente bereitgestellt. Die Zellkulturtests wurden mit Multiwell-Platten durchgeführt. Für jedes Experiment wurden die Zellen in einer 12-Well-Platte bei 20.000 Zellen/Vertiefung mit 1 ml des Mediums belegt. Am Tag nach der Platzierung wurde ein Medienwechsel durchgeführt und das Experiment wurde nach fünf Tagen oder wenn eine der Proben 70-80% Konfluenz erreichte, abgebrochen. Wenn die Zellen drei Tage nach dem ersten Medienwechsel die 70-80%ige Konfluenz nicht erreichten, wurde am Tag 4 ein zweiter Medienwechsel durchgeführt.
Um die Zellen zu ernten, wurden die Wells mit 0,5ml PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit 250µl TrypLE trypsiniert. Nachdem die Zellen abgelöst worden waren, wurden 250µl Medium in jede Vertiefung gegeben, um das TrypLE zu quenchen. Die Proben wurden dann in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 2000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Medium wurde dann abgesaugt und die Pellets wurden resuspendiert in 500µl frischem Medium. Die Gesamtzellzahlen für jede Kontroll- und Behandlungsvertiefung wurden mit dem Vi-Cell XR Cell Viability Analyzer (Beckman Coulter, USA) ermittelt.
Statistische Analyse. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten dargestellt, mit Ausnahme der Screening-Experimente, die aus einem einzigen Experiment stammen. Statistische Analysen zwischen den Gruppen wurden mit einem student t-Test und einem one-way ANOVA durchgeführt. p<0,05 wurde als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied (*= p<0,05, **= p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001) angesehen.
ERGEBNISSE
Leistung der Zellkultur. Zur Untersuchung der Auswirkungen von Elektronenstrahl-Bestrahlung auf MSC Wachstum wurde die Zellwachstumsleistung an zwei verschiedenen MSCs (ASC und BM-MSC) getestet.
Die Zellen wurden in Medien kultiviert, die mit 10% HPL und 1% Pen/Strep/Amp (DMEM), wie oben in diesem Beispiel beschrieben, vorbereitet wurden. Die Ergebnisse sind in 7 und 8 dargestellt. 7 zeigt einen Vergleich des ASC-Zellwachstums in Medien, die mit HPL aus Elektronenstrahl-bestrahlten Thrombozyten und Elektronenstrahl-bestrahlten HPL ergänzt wurden. A: Zellwachstumsanalyse mit Zellzahl B: Zellwachstum Analyse unter Verwendung des Prozentsatzes der Kontrolle. (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002,****=p<0.0001). 8 enthält einen Vergleich des BM-MSC-Zellwachstums in Medien, die mit HPL aus Elektronenstrahl-bestrahlten Thrombozyten und Elektronenstrahl-bestrahlten HPL ergänzt wurden. A: Zellwachstumsanalyse unter Verwendung der Zellzahl B: Zellwachstumsanalyse unter Verwendung des Prozentsatzes der Kontrolle (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001). Wie gezeigt, im getesteten Minimumdosisbereich (40-54kGy) zeigten sowohl Elektronenstrahl-bestrahlte Thrombozyten als auch HPL eine vorteilhafte Fähigkeit, das Wachstum von ASC- und BM-MSC-Zellen zu unterstützen. Sowohl die Elektronenstrahl-bestrahlten Thrombozyten als auch die HPL wiesen unter den getesteten Bedingungen ein signifikant reduziertes ASC-Zellwachstum im Vergleich zur Kontrolle auf. Bei BM-MSC wurde bei den Elektronenstrahl-bestrahlten Thrombozyten ein kleiner, nicht signifikanter Verlust des BM-MSC-Wachstums im Vergleich zur Kontrolle beobachtet, und es wurde für Elektronenstrahl-HPL eine signifikante Reduktion des Wachstums beobachtet.
Wachstumsfaktor-Analyse. zeigt die Ergebnisse der ELISA-Messungen der Konzentrationen von fünf Wachstumsfaktoren (FGFb, EGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF-beta, von denen bekannt ist, dass sie für das MSC-Wachstum relevant sind. Bei den berichteten Daten handelte es sich um den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten (*=p<0,05, **=p<0,001, ***=p<0,0002, ****=p<0,0001). Wie gezeigt, behielten die mit dem Elektronenstrahl bearbeiteten Materialien vorteilhafte Werte der getesteten Wachstumsfaktoren bei. Unter den getesteten Bedingungen reduzierte die Elektronenstrahl-Bestrahlung die Konzentration von FGFb, sowohl in Thrombozyten als auch in HPL. Ein signifikanter Anstieg der Konzentrationen von EGF, PDGF-BB und TGF-P1 im Vergleich zu Kontrolle wurde auch bei HPL gemessen, das aus Elektronenstrahl-bestrahlten Thrombozyten hergestellt wurde, während bei Elektronenstrahl-bestrahlten HPL eine nichtsignifikante Verringerung der Werte dieser Wachstumsfaktoren beobachtet wurde.
Morphologie. Es wurden keine nennenswerten Unterschiede in der Morphologie zwischen Zellen, die in der Kontrolle kultiviert wurden, und dem mit Elektronenstrahl behandelten Material festgestellt.
Beispiel 3
Zweck dieses Beispiels war die Evaluierung der Inaktivierung geeigneter Testviren in menschlichem Thrombozytenlysat (HPL) mittels Elektronenstrahlung. Das für diese Studie ausgewählte Virus ist in Tabelle 2 aufgeführt. 15 Table 2. Model virus

Virus Family Genom Hülle Größe(nm) Physico-Chemisch

Bovine Viral Diarrhea Flavi RNA Ja 50-70 Medium

Virus (BVDV)
PRÄPARATIVE VERFAHREN
Vorbereitung von Thrombozyteneinheiten und HPL für die Elektronenstrahl-Verarbeitung. Insgesamt 125 gefrorene Thrombozyteneinheiten (je ca. 250ml) wurden über Nacht bei 4°C aufgetaut, aufgeschnitten und die Inhalte in einem einzigen 25L-Blut kompatiblen Beutel vereinigt. Aus dem Beutel mit den vereinigten Thrombozyteneinheiten wurden 3 x 600 ml flüssige Thrombozyten in separate IL-Tiefkühllagerbeutel überführt (Charter Medical, Winston-Salem, NC). Die 3 umgepackten Thrombozyteneinheiten wurden dann bei -20°C eingefroren, wobei darauf geachtet wurde, dass die Form von Beutel und Inhalt möglichst gleichmäßig flach bis zu einer Dicke von 3 cm war. Jede gefrorene 600ml Thrombozytenprobe wurde auf Trockeneis in einem Kühltransportbehälter verpackt. Die verpackten Einheiten wurden über Nacht an eine Einrichtung zur Elektronenstrahlbehandlung verschickt. Thrombozyteneinheiten, die für die Elektronenstrahl-Behandlung vorgesehen waren, wurden einem minimum-maximum Dosisbereich ausgesetzt, der durch die Behandlung jeder Seite der 3 cm dicken Beutel erreicht wurde. Tabelle 3 zeigt die in dieser Studie ausgewerteten minimum-maximum Dosisbereiche. Tabelle 3

3cm dicker Beutel

% Dosis Verteilung

<20% >80%

Min Dosis Dauer (minuten) Max Dosis

35 1.35 47

40 1.35 54

45 1.35 61

50 1.35 68

55 1.35 74
Die verbleibenden vereinigten Thrombozyten wurden zur Vorbereitung von HPL für die Elektronenstrahl-Bearbeitung nach der in Beispiel I oben beschriebenen präparativen Methode verwendet. Wie bei den oben besprochenen vereinigten Thrombozyten wurde HPL in 3 x 600 ml separate 1 l Tieftemperatur-Gefrierbeutel überführt. Die 3 HPL-Einheiten wurden dann bei -20°C eingefroren, wobei sichergestellt wurde, dass die Form von Beutel und Inhalt möglichst gleichmäßig flach bis zu einer Dicke von 3 cm war. Drei Beutel mit gefrorenen, vereinigten Thrombozyten wurden über Nacht auf Trockeneis zu einer Virenverarbeitungsanlage transportiert, wo sie über Nacht bei 4°C aufgetaut, mit einem Virus (BVDV) versetzt und wieder eingefroren wurden, wobei sichergestellt wurde, dass sie in einer flachen, 3 cm dicken Konfiguration bei -80°C eingefroren wurden. Die mit BVDV angereicherten, gefrorenen Thrombozytenproben (insgesamt 2, eine für jeden Dosisbereich) wurden dann auf Trockeneis in einem entsprechenden sekundären Sicherheitsbehälter über Nacht zu einer Einrichtung zur Elektronenstrahl-Verarbeitung versandt. Bei der Ankunft wurden die infizierten, gefrorenen Thrombozyteneinheiten für die Elektronenstrahl-Bearbeitung wieder in wärmeisolierte Kisten mit Trockeneis verpackt. Die 3 cm dicken Thrombozyteneinheiten wurden 2-mal durch die Elektronenstrahl-Bestrahlung geführt, einmal pro Seite. Nach dem ersten Elektronenstrahl-Durchgang wurde die wärmeisolierte Box geöffnet und die Thrombozyteneinheit umgedreht, um die zweite Elektronenstrahl-Behandlung zu erhalten. Nachdem die Elektronenstrahl-Behandlung abgeschlossen war, wurden die behandelten Proben über Nacht auf Trockeneis in einer sekundären Einschlussverpackung zurück zur Virusverarbeitungsanlage geschickt. In der Virusverarbeitungsanlage wurden die Proben aus der Verpackung genommen und über Nacht bei 4°C aufgetaut. Die aufgetauten Thrombozyteneinheiten wurden mittels CaCl2 und Gerinnselabtrennung, wie in Beispiel 1 beschrieben, fibrinogenabgereichert. An fibrinogenabgereicherten Thrombozytenproben wurde eine Restvirusanalyse durchgeführt.
Zusammen mit den oben beschriebenen Thrombozytenproben wurden 3 Beutel mit gefrorenen, an Fibrinogen abgereicherten HPL (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) an die Virusverarbeitungsanlage versandt. Die Verarbeitung der HPL-Proben erfolgte in den gleichen Schritten wie oben für gefrorene Thrombozytenproben beschrieben.
HPL-Beutel wurden aufgetaut, mit Virus infiziert, wieder auf eine Dicke von 3 cm eingefroren und dann zur Elektronenstrahl-Behandlung in die Anlage geschickt. In der Elektronenstrahl-Anlage wurden die HPL-Proben neu verpackt, zwei Durchgängen der Elektronenstrahl-Bestrahlung unterzogen, wie oben für die Thrombozyten beschrieben, neu verpackt und zur Virusverarbeitungsanlage zurückgeschickt, wo die Virusanalyse an den aufgetauten Proben durchgeführt wurde.
TESTS/ERGEBNISSE

Zytotoxische/Interferenztests. Die Proben wurden auf zytotoxische Wirkungen auf Indikatorzellen und auf Interferenz mit der viralen Infektiosität getestet. Zytotoxizitäts- und Interferenztests wurden im Vorfeld von Virusinaktivierungstests durchgeführt. Interferenzergebnisse für Thrombozyten und HPL Proben sind in den Tabellen 4 und 5 zusammengefasst. Table 4. Interferenz positive Kontrollergebnisse für Elektronenstrahl bestrahlte Thrombozyten.

Probe	Probe	Zytotox	Mittel	Interferenz
Interferenz Positiv	N/A	NA	28.11	NA
1	1.OOE+OO	Keine	12.67	Ja
	3.00E+00	Keine	23.00	Keine
	1.OOE+01	Keine	28.67	Keine
	3.00E+01	Keine	28.67	Keine
	1.OOE+02	Keine	27.67	Keine
	3.00E+02	Keine	34.67	Keine

Probe	Probe	Zytotox	Mittel	Interferenz
Interferenz Positiv	N/A	NA	28.11	NA
2	1.OOE+OO	Keine	18.00	Keine
	3.00E+OO	Keine	20.67	Keine
	1.OOE+O1	Keine	28.00	Keine
	3.00E+O1	Keine	29.00	Keine
	1.OOE+02	Keine	27.00	Keine
	3.00E+02	Keine	26.00	Keine

Probe	Probe	Zytotox	Mittel	Interferenz

Interferenz Positiv	N/A	NA	28.11	NA
3	1.OOE+OO	Keine	12.67	Ja
	3.00E+OO	Keine	23.67	Keine
	1.OOE+01	Keine	26.00	Keine
	3.00E+O1	Keine	29.67	Keine
	1.OOE+02	Keine	31.00	Keine
	3.00E+02	Keine	24.67	Keine

Table 5. Interferenz positive Kontrollergebnisse für Elektronenstrahl bestrahlte HPL.

Probe	Probe	Zytotox	Mittel	Interfer
Interferenz Positiv	N/A	NA	28.11	NA
4	1.OOE+OO	Keine	15.00	Keine
	3.00E+OO	Keine	25.67	Keine
	1.00E+O1	Keine	27.00	Keine
	3.00E+O1	Keine	28.67	Keine
	1.OOE+02	Keine	31.00	Keine
	3.00E+02	Keine	33.00	Keine

Probe	Probe	Zytotox	Mittel	Interfer
Interferenz Positiv	N/A	NA	28.11	NA
5	1.OOE+OO	Keine	12.33	Yes
	3.00E+OO	Keine	21.00	None
	1.00E+O1	Keine	24.00	None
	3.00E+O1	Keine	28.00	None
	1.OOE+02	Keine	28.67	None
	3.00E+02	Keine	28.67	None

Probe	Probe	Zytotox	Mittel	Interfer
Interferenz Positiv	N/A	NA	28.11	NA
6	1.OOE+00	Keine	16.67	Keine
	3.00E+OO	Keine	25.00	Keine
	1.OOE+Ol	Keine	28.00	Keine
	3.00E+O1	Keine	37.00	Keine
	1.OOE+02	Keine	31.33	Keine
	3.00E+02	Keine	29.33	Keine

Wie oben beschrieben, wurden an zwei Punkten unabhängige Studien zur Virusdosierung durchgeführt im HPL-Prozess - zu Beginn mit Thrombozyteneinheiten und am Ende des Prozesses mit HPL - und das BVDV-Spiking-Virus. Die Ergebnisse der Virusinaktivierung für Thrombozyten- und HPL-Proben sind in den Tabellen 6 und 7 zusammengefasst. Table 6. Ergebnisse der Virusinaktivierung (BVDV) für Elektronenstrahl-bestrahlte Thrombozyten.

Probe	Titer (log)	95% CL	Probe Volumen (ml)	Total virus	Virale Inaktivierung	95% CL
Belastung	5.41	0.08	600.00	8.19
Beh. Dosis A	<-0.13	0.00	600.00	<2.65	>=5.54	0.0
Beh. Dosis B	<-0.61	0.00	600.00	<2.17	>=6.02	0.0
Versand	4.60	0.06	600.00	7.38	0.81	0.1
Gehalt. Kontr.	4.53	0.07	600.00	7.31	0.88	0.1
Positive Kontr.	6.37	0.10
Negativ	<0.70	0.00

Gehalt. Kontrolle: Assay-Kontrolle, die während der gesamten Versuchsdauer beibehalten wird; Versandkontrolle = Thrombozyten versandt, aber nicht Elektronenstrahl-bestrahlt; Positivkontrolle = mit Virus angereicherte Kulturmedien; Negative Kontrolle = nur Medien Table 7. Ergebnisse der Virusinaktivierung (BVDV) for Elektronenstrahl HPL.

Probe	Titer (log)	95% CL	Probe volumen	Total virus	Virale Inaktiv.	95% CL
Belastung	5.02	0.1	600.00	7.80
Beh. Dosis	4.56	0.0	600.00	7.34	0.46	0.1
Beh. Dosis B	<-0.61	0.0	600.00	<2.17	>=5.63	0.17
Versand	<-0.13	0.0	600.00	<2.65	>=5.15	0.17
Gehalt.	4.12	0.1	600.00	6.89	0.90	0.2
Positive	6.37	0.1
Negativ	<0.70	0.0
Gehalt. Kontrolle: Assay-Kontrolle, die während der gesamten Versuchsdauer beibehalten wird; Versandkontrolle = Thrombozyten versandt, aber nicht Elektronenstrahl-bestrahlt; Positivkontrolle = mit Virus angereicherte Kulturmedien; Negative Kontrolle = nur Medien

Diskussion. Die Werte für die Virusinaktivierung in den Tabellen 6 und 7 sind größer oder gleich einer bestimmten Zahl angegeben. Dies kann so interpretiert werden, dass die Elektronenstrahl-Behandlung in der Lage war ein Minimum des angegebenen Inaktivierungswertes zu inaktivieren. Die Prüfung des infizierten und Elektronenstrahl behandelten Materials wurde an einer repräsentativen Teilprobe von 20 ml des Probenvolumens von 600 ml durchgeführt. Alle Elektronenstrahl-behandelten Proben in dieser Studie, Thrombozyten und HPL, lieferten keine Plaques aus dem getesteten Volumen. Die Untersuchung einer repräsentativen Probe und nicht des gesamten Volumens, selbst wenn keine Plaques nachgewiesen werden, erfordert eine statistische Berechnung zur Berechnung der Virusinaktivierung. Diese Berechnung liefert einen Inaktivierungswert auf der Grundlage des Prozentsatzes der gesamten getesteten Probe und der Wahrscheinlichkeit, dass im verbleibenden ungetesteten Volumen kein Virus nachgewiesen werden kann.
Auflistung bestimmter Ausführungsformen
Im Folgenden werden einige der hier offengelegten Ausführungsformen aufgezählt. Es wird davon ausgegangen, dass diese Auflistung nicht einschränkend ist und dass einzelne Merkmale oder Kombinationen von Merkmalen (z.B. 2, 3 oder 4 Merkmale), wie in der Ausführlichen Beschreibung beschrieben mit den unten aufgeführten Ausführungsformen kombiniert werden können, um zusätzliche offenbarte Ausführungsformen hierin zur Verfügung zu stellen.
Ausführungsform 1. Ein Verfahren zur Herstellung einer krankheitserregerreduzierten Thrombozytenzusammensetzung, umfassend:

Bestrahlung einer gefrorenen Zusammensetzung, die ein Thrombozytenkonzentrat oder ein Thrombozytenlysat enthält, mit Elektronenstrahlung.
Ausführungsform 2. Verfahren der Ausführungsform 1, wobei die Zusammensetzung ein Thrombozytenkonzentrat enthält.
Ausführungsform 3. Verfahren der Ausführungsform 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung ein Thrombozytenlysat umfasst.
Ausführungsform 4. Verfahren der Ausführungsform 2, die nach der Bestrahlung auch die Lyse von Thrombozyten des Thrombozytenkonzentrats zur Bildung eines Thrombozytenlysats umfasst.
Ausführungsform 5. Verfahren der Ausführungsform 1, wobei die Zusammensetzung ein Thrombozytenlysat umfasst und im Wesentlichen frei von nicht lysierten Thrombozyten ist.
Ausführungsform 6. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die 37 Bestrahlung so durchgeführt wird, dass etwa 10 bis etwa 100 kGy Elektronenstrahlung auf die gefrorene Zusammensetzung aufgebracht werden, bevorzugt etwa 30 bis etwa 70 kGy Elektronenstrahlung.
Ausführungsform 7. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei der Elektronenstrahl auf eine erste Seite der gefrorenen Zusammensetzung und auf eine zweite Seite der gefrorenen Zusammensetzung gegenüber der ersten Seite aufgebracht wird, und wobei vorzugsweise die maximale Dicke der gefrorenen Masse zwischen der ersten Seite und der zweiten Seite etwa 5 cm oder weniger beträgt.
Ausführungsform 8. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei während der Bestrahlung die gefrorene Zusammensetzung in einem Behälter enthalten ist und wobei die Elektronenstrahlstrahlung durch den Behälter und in die gefrorene Zusammensetzung eindringt.
Ausführungsform 9. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, bei dem die Zusammensetzung nach der Bestrahlung mindestens 50% eines anfänglichen Niveaus von mindestens einem von FGFb, EGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF-ßl, das in der Zusammensetzung vor der Bestrahlung vorhanden war, beibehält.
Ausführungsform 10. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die Bestrahlung eine Strahlendosis des Elektronenstrahls liefert, die wirksam ist, um mindestens eine 3-Log-Reduktion bei mindestens einem Virus in der Zusammensetzung zu erreichen.
Ausführungsform 11. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die durchschnittliche Dicke der gefrorenen Zusammensetzung im Bereich von 0,5 cm bis 5 cm liegt.
Ausführungsform 12. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei der Elektronenstrahl ein Energieniveau von etwa 5 bis etwa 15 MeV hat.
Ausführungsform 13. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, die auch die Anwendung von Kühlung auf die gefrorene Zusammensetzung während der Bestrahlung umfasst.
Ausführungsform 14. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, bei dem die Anwendung von Kühlung die Übertragung negativer thermischer Energie von Trockeneis auf die gefrorene Zusammensetzung während der Bestrahlung umfasst.
Ausführungsform 15. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, bei dem die Anwendung von Kühlung die Übertragung negativer thermischer Energie aus einer gekühlten gasförmigen Atmosphäre in die gefrorene Zusammensetzung umfasst.
Ausführungsform 16. Verfahren der Ausführungsform 10, bei dem die Anwendung der Kühlung in 38 einem mechanischen Gefrierschrank erfolgt.
Ausführungsform 17. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, bei dem die Elektronenstrahlstrahlung auf eine erste Seite der gefrorenen Zusammensetzung angewendet wird.
Ausführungsform 18. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, bei dem die gefrorene Zusammensetzung eine durchschnittliche Dicke von etwa 3 cm oder weniger aufweist. 30 Ausführungsform 19. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, bei dem die Elektronenstrahlstrahlung auf eine erste Seite der gefrorenen Zusammensetzung in einer Richtung angewendet wird, in der die gefrorene Masse eine durchschnittliche Dicke von etwa 5 cm oder weniger hat.
Ausführungsform 20. Verfahren nach Ausführungsform 19, wobei die durchschnittliche Dicke 3 cm oder weniger beträgt. Die Ausführungsform 21. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die Bestrahlung die Bestrahlung der gefrorenen Zusammensetzung mit Elektronenstrahlstrahlung in einer Dosis erfolgt die wirksam ist, um eine Reduzierung der Konzentration mindestens eines Virus in der Zusammensetzung zu erreichen.
Ausführungsform 22. Verfahren der Ausführungsform 21, wobei die Reduktion mindestens eine 3-Log Reduzierung ist.
Ausführungsform 23. Die Methode der Ausführungsform 21 oder 22, wobei das Virus ein Virus der Bovinen Virusdiarrhöe ist.
Ausführungsform 24. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die Bestrahlung so durchgeführt wird, dass ein Dosisverhältnis von max/min von etwa 2: 1 oder weniger erreicht wird.
Ausführungsform 25. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die gefrorene Zusammensetzung einen Gesamtproteingehalt von mindestens etwa 3 g/dl aufweist.
Ausführungsform 26. Verfahren jeder vorausgehenden Ausführungsform, umfassend, vor dem Bestrahlen das Anpassen eines verformbaren Behälters, der die Zusammensetzung in flüssiger Form enthält, an eine erste Form und Gefrieren der Zusammensetzung mit dem Behälter in der ersten Form, um eine gefrorene Zusammensetzung bereitzustellen.
Ausführungsform 27. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein Volumen von mindestens 50 ml und vorzugsweise im Bereich von 39 etwa 50 ml bis etwa 10 l hat.
Ausführungsform 28. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, das nach der Bestrahlung auch das Auftauen der gefrorenen Zusammensetzung umfasst, um eine flüssige Zusammensetzung zu bilden.
Ausführungsform 29. Verfahren der Ausführungsform 28, das nach dem Auftauen auch das Überführen der flüssigen Zusammensetzung in einen Verpackungsbehälter oder in eine Mehrfachverpackung umfasst.
Ausführungsform 30. Verfahren der Ausführungsform 30, wobei das Übertragen das Übertragen der flüssigen Zusammensetzung auf mehrere Behälter umfasst.
Ausführungsform 31. Verfahren der Ausführungsform 29 oder 30, wobei das Übertragen in einem sterilen Übertragungsvorgang erfolgt.
Ausführungsform 32. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein gefrorenes Thrombozytenlysat ist und wobei nach der Bestrahlung das Thrombozytenlysat:
- TGF- β1mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, besonders bevorzugt etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder
- EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder
- 5 FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, noch bevorzugter etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder
- PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder
- PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, bevorzugterweise etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.
Ausführungsform 33. Verfahren einer beliebigen vorhergehenden Ausführungsform, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein gefrorenes Thrombozytenkonzentrat ist, wobei das Verfahren die Herstellung eines ersten Thrombozytenlysats aus dem Thrombozytenkonzentrat nach der Bestrahlung umfasst, und wobei das erste Thrombozytenlysat
- TGF- β1 mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, besonders bevorzugt etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder
- EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder
- FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, bevorzugterweise etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder
- PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder
- PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, noch bevorzugter etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.
Ausführungsform 34. Mit Elektronenstrahl bestrahlte Thrombozytenzusammensetzung, umfassend:
- eine Zusammensetzung, die ein Thrombozytenkonzentrat oder ein Thrombozytenlysat enthält, wobei die Zusammensetzung in einem gefrorenen Zustand mit Elektronenstrahl bestrahlt worden ist (i) bei einer Dosis, die wirksam ist, um eine Verringerung der Konzentration mindestens eines Virus in der Zusammensetzung zu erreichen und/oder (ii) bei einer Dosis im Bereich von etwa 10 kGy bis etwa 100 kGy.
Ausführungsform 35. Zusammensetzung der Ausführungsform 34, wobei die Reduktion mindestens eine 3-Log-Reduktion ist.
Ausführungsform 36. Zusammensetzung der Ausführungsform 34, wobei die Reduktion mindestens eine 5-Log-Reduktion ist.
Ausführungsform 37. Zusammensetzung, umfassend:
- ein biologisch aktives Thrombozytenlysat mit elektronenstrahlinduzierten Proteinmodifikationen.
Ausführungsform 38. Zusammensetzung einer der Ausführungsformen 34 bis 37, die:
- TGF- β1 mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis
- 5 etwa 150 ng/ml, bevorzugterweise etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder
- EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder
- FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, noch bevorzugter etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder 41
- 10 PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder
- PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, noch bevorzugter etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.
Ausführungsform 39. Verfahren zum Kultivieren von Zellen, umfassend das Kultivieren der Zellen in einem Kulturmedium, das eine Thrombozytenlysat-Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 34 bis 38 enthält oder eine Thrombozytenlysat-Zusammensetzung die nach einem Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 33 hergestellt wurde.
Ausführungsform 40. Verfahren der Ausführungsform 39, wobei die Zellen Immunzellen, vorzugsweise T-Zellen oder NK-Zellen, umfassen.
Ausführungsform 41. Verfahren zur Behandlung eines Patienten, umfassend die Verabreichung an den Patienten von Zellen, die nach einem Verfahren der Ausführungsform 39 oder 40 kultiviert wurden.
Ausführungsform 42. Verfahren zur Behandlung eines Patienten, umfassend die Verabreichung einer Thrombozytenlysat-Zusammensetzung einer der Ausführungsformen 34 bis 38 an den Patienten oder einer Thrombozytenlysat-Zusammensetzung hergestellt unter Verwendung eines Verfahrens einer der Ausführungsformen 1 bis 33.

Die Verwendung der Begriffe „a“ und „an“ und „der“ und ähnliche Verweise im Zusammenhang mit der Beschreibung der Erfindung (insbesondere im Zusammenhang mit den folgenden Ansprüchen) sind so auszulegen, dass sie sowohl den Singular als auch den Plural umfassen, sofern hierin nicht etwas anderes angegeben oder durch den Kontext klar wird. Die Wiedergabe von Wertebereichen soll hier lediglich als Kurzform für die individuelle Bezugnahme auf jeden einzelnen Wert dienen, der in den Bereich fällt, sofern hierin nicht anders angegeben, und jeder einzelne Wert wird in die Beschreibung aufgenommen, so als ob er hierin einzeln rezitiert würde. Alle hier beschriebenen Verfahren können in jeder geeigneten Reihenfolge durchgeführt werden, sofern hierin nicht anders angegeben oder durch den Kontext klar wird. Die Verwendung beliebiger Beispiele oder beispielhafter Formulierungen (z.B. „solche wie“) hierin vorgesehen ist, dient lediglich dazu, die Erfindung besser zu illustrieren, und stellt keine Einschränkung des Erfindungsumfangs dar, sofern nichts anderes angegeben wird. Keine Sprache in der Beschreibung sollte so ausgelegt werden, dass sie irgendein nicht beanspruchtes Element als wesentlich für die Praxis der Erfindung bezeichnet.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Spezifikation zitiert werden, werden hier durch Bezugnahme aufgenommen, so als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung ausdrücklich und individuell durch Bezugnahme aufgenommen werden würde. Darüber hinaus sollen alle hierin genannten Theorien, Wirkungsmechanismen, Beweise oder Erkenntnisse das Verständnis der vorliegenden Erfindung weiter verbessern und sind nicht dazu gedacht, die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise auf solche Theorie, Wirkungsmechanismus, Beweis oder Erkenntnis zu beschränken. Obwohl die Erfindung in den Zeichnungen und der vorstehenden Beschreibung illustriert und detailliert beschrieben wurde, sind diese als illustrativ und nicht einschränkend zu betrachten, wobei davon ausgegangen wird, dass nur ausgewählte Ausführungsformen gezeigt und beschrieben wurden und dass alle Äquivalente, Änderungen und Modifikationen, die dem Geist der Erfindungen, wie sie hier oder durch die folgende Ansprüche sollen geschützt werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 62/608498 [0001]

Claims

Verfahren zur Herstellung einer krankheitserregerreduzierten Thrombozytenzusammensetzung, umfassend: Bestrahlen einer gefrorenen Zusammensetzung, die ein Thrombozytenkonzentrat oder ein Thrombozytenlysat enthält, mit Elektronenstrahlstrahlung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein Thrombozytenkonzentrat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein Thrombozytenlysat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, das nach der Bestrahlung die Lyse von Thrombozyten des Thrombozytenkonzentrats unter Bildung eines Thrombozytenlysats umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein Thrombozytenlysat umfasst und im Wesentlichen frei von nicht lysierten Thrombozyten ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Bestrahlung so durchgeführt wird, dass etwa 10 bis etwa 100 kGy Elektronenstrahlung auf die gefrorene Zusammensetzung angewendet wird, weiter bevorzugt etwa 30 bis etwa 70 kGy Elektronenstrahlung.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektronenstrahlung auf eine erste Seite der gefrorenen Zusammensetzung und auf eine zweite, der ersten Seite gegenüberliegende Seite der gefrorenen Zusammensetzung angewendet wird, und wobei vorzugsweise die maximale Dicke der gefrorenen Masse zwischen der ersten Seite und der zweiten Seite etwa 5 cm oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei während der Bestrahlung die gefrorene Zusammensetzung in einem Behälter enthalten ist und wobei die Elektronenstrahlung durch den Behälter und in die gefrorene Zusammensetzung eindringt.
Verfahren nach einem beliebigen vorhergehenden Anspruch, bei dem die Zusammensetzung nach der Bestrahlung mindestens 50 % eines anfänglichen Niveaus von mindestens einem von FGFb, EGF, PDGF-AB, PDGF-BB und TGF-β1, das in der Zusammensetzung vor der Bestrahlung vorhanden war, beibehält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bestrahlung eine Strahlungsdosis des Elektronenstrahls liefert, die wirksam ist, um mindestens eine 3-Log Reduktion bei mindestens einem Virus in der Zusammensetzung zu erreichen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die durchschnittliche Dicke der gefrorenen Zusammensetzung im Bereich von 0,5 cm bis 5 cm liegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Elektronenstrahlstrahlung ein Energieniveau von etwa 5 bis etwa 15 MeV hat.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das auch die Anwendung von Kühlung auf die gefrorene Zusammensetzung während der Bestrahlung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Anwenden von Kühlung das Übertragen negativer thermischer Energie von Trockeneis oder einer anderen gefrorenen Masse auf die gefrorene Zusammensetzung während der Bestrahlung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Anwendung von Kühlung die Übertragung negativer thermischer Energie aus einer gekühlten gasförmigen Atmosphäre auf die gefrorene Zusammensetzung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Kühlung in einem mechanischen Gefrierschrank erfolgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Elektronenstrahl-Bestrahlung auf eine erste Seite der gefrorenen Zusammensetzung angewandt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gefrorene Zusammensetzung eine durchschnittliche Dicke von etwa 3 cm oder weniger aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Elektronenstrahl-Bestrahlung auf eine erste Seite der gefrorenen Zusammensetzung in einer Richtung angewendet wird, in der die gefrorene Masse eine durchschnittliche Dicke von etwa 5 cm oder weniger aufweist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die durchschnittliche Dicke 3 cm oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Bestrahlung die Bestrahlung der gefrorenen Zusammensetzung mit Elektronenstrahlung in einer Dosis umfasst, die wirksam ist, um eine Reduzierung der Konzentration von mindestens einem Virus in der Zusammensetzung zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Reduktion mindestens eine 3-Log-Reduktion ist.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei das Virus ein Virus der Bovinen Virusdiarrhöe ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bestrahlung so durchgeführt wird, dass ein max/min Dosisverhältnis von etwa 2:1 oder weniger erreicht wird.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gefrorene Zusammensetzung einen Gesamtproteingehalt von mindestens etwa 3 g/dl aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend, vor der Bestrahlung, Anpassen eines verformbaren Behälters, der die Zusammensetzung in flüssiger Form enthält, an eine erste Form, und Einfrieren der Zusammensetzung mit dem Behälter in der ersten Form, um die gefrorene Zusammensetzung bereitzustellen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein Volumen von mindestens 50 ml und vorzugsweise im Bereich von etwa 50 ml bis etwa 10 l hat.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das nach der Bestrahlung auch das Auftauen der gefrorenen Zusammensetzung zur Bildung einer flüssigen Zusammensetzung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 28, das nach dem Auftauen auch das Überführen der flüssigen Zusammensetzung in einen Verpackungsbehälter oder in mehrere Verpackungsbehälter umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Übertragen das Übertragen der flüssigen Zusammensetzung in einen oder mehrere Behälter umfasst.
Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei der Transfer in einem sterilen Transfervorgang erfolgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein gefrorenes Thrombozytenlysat umfasst und wobei nach der Bestrahlung das Thrombozytenlysat aufweist: TGF- β1 mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, besonders bevorzugt etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, bevorzugter etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, noch bevorzugter etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein gefrorenes Thrombozytenkonzentrat umfasst, wobei das Verfahren die Herstellung eines ersten Thrombozyten Lysat aus dem Thrombozytenkonzentrat nach der Bestrahlung umfasst, und wobei das erste Thrombozytenlysat aufweist: TGF- β 1 mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, noch bevorzugter etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, bevorzugter etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, noch bevorzugter etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.
Eine mit Elektronenstrahlen bestrahlte Thrombozytenzusammensetzung, umfassend: eine Zusammensetzung, die ein Thrombozytenkonzentrat oder ein Thrombozytenlysat umfasst, wobei die Zusammensetzung in einem gefrorenen Zustand mit Elektronenstrahlung bestrahlt wurde (i) mit einer Dosis, die wirksam ist, um eine Verringerung der Konzentration mindestens eines Virus in der Zusammensetzung zu erreichen und/oder (ii) mit einer Dosis im Bereich von etwa 10 kGy bis etwa 100 kGy.
Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei die Reduktion mindestens eine 3-Log-Reduktion ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei die Reduktion mindestens eine 5-Log-Reduktion ist.
Eine Zusammensetzung, umfassend: ein biologisch aktives Thrombozytenlysat mit elektronenstrahlinduzierten Proteinmodifikationen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 34 bis 37, die aufweist: TGF- β1mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, noch bevorzugter etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, noch bevorzugter etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis 30 etwa 15 ng/ml, weiter bevorzugt etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen, umfassend das Kultivieren der Zellen in einem Kulturmedium, das eine Thrombozytenlysatzusammensetzung nach einem der Ansprüche 34 bis 38 oder eine unter Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 33 hergestellte Thrombozytenlysatzusammensetzung enthält.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Zellen Immunzellen, vorzugsweise T-Zellen oder NK-Zellen, umfassen.
Verfahren zur Behandlung eines Patienten, umfassend die Verabreichung von Zellen, die nach einem Verfahren nach Anspruch 39 oder 40 kultiviert wurden, an den Patienten.
Verfahren zur Behandlung eines Patienten, umfassend die Verabreichung einer Thrombozytenlysatzusammensetzung nach einem der Ansprüche 34 bis 38 oder einer unter Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 33 hergestellten Thrombozytenlysatzusammensetzung an den Patienten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend auch die Anwendung von Kühlung auf die gefrorene Zusammensetzung während der Bestrahlung.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein gefrorenes Thrombozytenlysat umfasst, und wobei nach der Bestrahlung das Thrombozytenlysat: TGF- βl mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, besonders bevorzugt etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, bevorzugterweise etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, noch bevorzugter etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die gefrorene Zusammensetzung ein gefrorenes Thrombozytenkonzentrat umfasst, wobei das Verfahren die Herstellung eines ersten Thrombozytenlysats aus dem Thrombozytenkonzentrat nach der Bestrahlung umfasst, und wobei das erste Thrombozytenlysat TGF- βl mit einem Gehalt von mindestens etwa 20 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 150 ng/ml, besonders bevorzugt etwa 25 bis etwa 150 ng/ml; und/oder EGF mit einem Gehalt von mindestens etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1000 bis etwa 4000 pg/ml EGF, bevorzugter etwa 2000 bis etwa 3500 pg/ml; und/oder FGFb mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 pg/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis etwa 200 pg/ml, bevorzugterweise etwa 75 bis etwa 200 pg/ml; und/oder PDGF-AB mit einem Gehalt von mindestens etwa 10 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 ng/ml, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 ng/ml; und/oder PDGF-BB mit einem Gehalt von mindestens etwa 1 ng/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 15 ng/ml, noch bevorzugter etwa 2 bis etwa 15 ng/ml.