DE2441454A1

DE2441454A1 - Verfahren zur herstellung eines heilmittels fuer leukaemie

Info

Publication number: DE2441454A1
Application number: DE2441454A
Authority: DE
Inventors: Kazuyoshi Doi; Morio Kuboyama; Tsutomu Kudo; Taro Nagasawa; Kazuhiro Nagata; Joji Ono; Minoru Saito; Eiji Takahashi
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1973-08-30
Filing date: 1974-08-29
Publication date: 1975-03-27
Also published as: DE2441454C3; CH604723A5; FR2242109A1; SE7410972L; JPS5048108A; CA1041010A; SE430123B; GB1461335A; US4054648A; DE2441454B2; JPS5221570B2; FR2242109B1

Description

Patentanwälte

DlpL-lng. R. B E ETZ β·η-g. K. LAMPRECHT

ZJ

lpllng.

br.-!ng. R. B E E T

22, SUinedotwtr. l·

-i-t, 039-23.129-° ·. 29. 8.· 1974

MORINAGA MILK INDUSTRY CO., LTD., Tokio (Japan)

Verfahren zur Herstellung eines Heilmittels für Leukämie

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines ηβμεη Heilmittels für Leukämie aus Mutterkuchen bzw. Plazenta, das kranken (dis-diff erentiated) leukämisehen Zellen ihre normale Punktion wiedergibt und dementsprechend das autonome Wachstum bösartiger Zellen inhibiert.

Es haben sich bereits viele Veröffentlichungen mit Methoden zum Extrahieren einer physiologisch oder pharmakologisch aktiven Substanz oder mit dem Reinigen des Plazentaextrakts auseinandergesetzt. Darunter befinden sich insbesondere solche, die einen Antigeschwür- oder Antikrebseffekt geltend machen. Jedoch ist die Herstellung eines Plazentaextrakts mit einem therapeutischen Effekt für Leukämie bisher nicht bekannt geworden.

Hieda ("REIZOTAIBAN IiO SEIKAGAKU TO IRYOKOIiA" bzw. "The bio-chemistry and therapeutic effect of frozen placenta", Kinbara Shoten, 19&5) berichtete vom Vorliegen einer Substanz in der Plazenta des Menschen, die gegen Cirrhose wirksam ist. Kimura (HIROSHI?.1A IGAKU, Bd. 22, 1969, S.1136) und Säitö (Clinical Report, Bd. 3, 1969, S.543) beschrieben einen Antigeschwüreffekt eines Plazentapräparäts* Ferner berichtete Byong Ho·Chin (Abstract of Papers of' the 9th International -

Ο39-(Ι.Ί-1 -18-3) -Bo-Be

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Cancer Congress 1966, S. 467) von einem Anti-Ehrlich-Sarkom-.mittel und einem Anti-H-F-Sarkommittel aus Plazenta des Menschen.

Pur Hiedas Präparat gegen Cirrhose wurde folgendermaßen vorgegangen.

Es wurde eine frische Plazenta mit Wasser gewaschen, bei 2 bis 4 C einige Tage lang stehengelassen, danach zerkleinert und 60 Minuten lang gekocht. Die Zubereitung wurde mit einem Fünftel ihres Volumens mit 1n HCl bis zu einem pH von 1,8 versetzt und mit 2 g Pepsin bei 38 ⁰C 20 Stunden lang zersetzt bzw. aufgeschlossen. Das aufgeschlossene flüssige Medium wurde mit einer Geschwindigkeit von 3000 Umdrehungen/Min. 15 Min. lang zentrifugiert und in eine überstehende Phase und einen niederschlag aufgetrennt. Die überstehende Phase wurde durch ein Ionenaustauscherharz zur Herabsetzung ihrer Azidität auf einen pH-Y/ert von 4,4 bis 4»δ geleitet und ihr Volumen wurde derart eingestellt, daß jeweils 100 g (Feuchtgewicht) Plazenta einem Volumen von 100 ml entsprachen. Diese Zubereitung wurde als Lösung A bezeichnet. Ferner wurde der niederschlag mit konzentrierter Salzsäure durch lOstündiges Erhitzen hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde danach mit Aktivkohle entfernt, wobei die überschüssige flüchtige Säure durch Verdampfen im Wasserbad entfernt wurde, und danach einer zweiten Entfärbung unterworfen. Die Azidität der Lösung wurde gleichfalls mit einem Ionenaustauscherharz auf einen pH-Wert von 4,4 bis 4,6 herabgesetzt. Das Volumen des Eluats wurde derart eingestellt, daß jeweils 100 g (Feuchtgewicht) Plazenta einem Volumen von 25 ml entsprachen. Diese'Zubereitung wurde als Lösung B bezeichnet. Die Lösungen A und B wurden gemischt und die Azidität des Gemischs wurde auf einen pH-Wert von 6,1 bis 6,4 eingestellt. Hach einem Kochen und einer Reinigung durch Filtration wurde die Zubereitung in Ampullen abgefüllt und für InjektLonszwecke sterilisiert. Das Präparat stellte eine transparente

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-3- 244U54

gelbe Lösung mit einem spezifischen Gev/icht von 1,0090 "bis 1,0132, einem pH-V/ert von 6,1 bis 6,4 und einer Trockenmasse von 73,6 bis 82,3 mg/ml dar und verhielt sich beim SuIf osalicylsauretest negativ. Der Aschegehalt, der Gesamtstickstoffgehalt und der Aminostickstoffgehalt betrugen 8,0 bis 9,3 mg/ml, 9,13 bis 11,21 mg/ml bzw. 8,56 bis 10,24 mg/ml. Für den Extrakt wurde eine lipotrope -Aktivität, eine Vergrößerung der Gewebeatmung der Leber, eine Anregung der Schilddrüse und des Grundumsatzes kastrierter Tiere und eine Therapie der Cirrhose bei Menschen und Versuchstieren geltend gemacht.

Boyong Ho Chin stellte eine Plazentaemulsion her und zentrifugierte sie zur Gewinnung der überstehenden Phase. Bei der Zugabe von Alkohol kam es zu einer Ausfällung, die einer Fraktionierung durch Papierelektrophorese unterworfen wurde· Die resultierende Fraktion wurde gegen Wasser dialysiert und das Dialysat und die nicht dialysierbare Fraktion wurden danach einer Ausfällung mit Azeton unterworfen. Für den !■liederschlag wurde, eine inhibierende Y/irkung auf das Wachstum des Ehrlich-Sarkoms und des ίϊ-F-Sarkoms behauptet.

Ls ist zulässig festzustellen, daß für die auf diese V/eise hergestellten Plazentaextrakte, die vorstehend beschrieben wurden und alle anderen Plazentaextrakte kein therapeutischer Effekt gegen Leukämie beansprucht wurde, wie er sich aus der folgenden Beschreibung ergibt.

Andererseits gehören Carbazilchinon (Arakawa, M. et al., Gann, 3d. 61, 1970, S. 485), Cytosinarabinosid (Talley, K. et al., 31ood, 3d. 21, 1963, S. 352), Daunomycin (Tan, C. et al., Cancer, 3d. 20, I967, S. 333), Adriamycin (Di Marco, A. et al., Cancer Chemotherapy Reports, Bd. 53, 1969, S. 33), L-Asparaginase (Kidd, G.G. et al., Journal of Experimental Medicine,Bd, 98, 1953, S. 565) ^u bekannten antileukämisehen Mitteln, die aus natürlichen Quellen bzw. I.laterialien extrahiert werden, bei

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— A —

denen es sich nicht um Plazenta handelt, oder die auf chemischem Wege hergestellt werden. Jedoch zeigen alle antileukämischen Mittel, soweit sie bekannt sind und verwendet v/erden, keine spezifische Wirkung gegenüber leukämischen Zellen, sondern bringen nach klinischen Beobachtungen verschiedene Nebenwirkungen mit sich, z.B. Leukopenie, Thrombocytopenie, Anämie, Hämorrhagie, Erbrechen, Diarrhöe, Pieber, krankhafte Veränderungen der Niere und der Leber und Gelbsucht. Daher sollten parallel zur therapeutischen Verabreichung dieser Mittel einige Hilfsmaßnahmen ergriffen werden, um derartige unvermeidbare Komplikationen zu verhindern. Bemerkenswerte therapeutische Ergebnisse sind danach nicht erzielt worden, da sich ernste Komplikationen aus Nebenwirkungen ergaben. So besteht die Chemotherapie der Leukämie gegenwärtig ausschließlich darin, eine Remission mit folglich längerer Lebensdauer, verbunden mit einer Vergiftung des Patienten (host toxicity) herbeizuführen, was keine vollständige Heilung bedeutet.

Unter der Voraussetzung, daß die antileukämischen Mittel, soweit sie bisher bekannt sind, bezüglich ihres inhibierenden Effekts gegen leukämische Zellen nicht spezifisch sind, v/urden umfangreiche Untersuchungen zur Ermittlung eines neuen antileukämischen Mittels durchgeführt, das nicht nur selektiv das Wachstum leukämischer Zellen inhibieren kann, wobei normale Zellen intakt gelassen werden, sondern auch die abnorme Punktion bösartiger Zellen korrigieren kann. Schließlich wurde festgestellt, daß der erfindungsgemäß speziell hergestellte Plazentaextrakt eine ausgezeichnete antileukämische Wirkung ohne irgendwelche möglichen Nebenwirkungen zeigte. Der Wirkstoff wird nachstehend als D-Paktor bezeichnet.

Die Methode zur Herstellung des antileukämischen D-Paktors gemäß der Erfindung besteht in den folgenden Stufen:

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(A) Zerkleinern der Plazenta mit Wasser oder verdünnter physiologischer Salzlösung zur Herstellung einer Emulsion und Zugeben eines Gemischs aus wässeriger Essigsäure und Salzsäure zur Emulsion zur Einstellung der Azidität auf einen Wert von 0,5 "bis 2,0 n;

(B) Erhitzen der angesäuerten Emulsion;

(C) Entfernen von unlöslichem Protein durch Zentrifugieren nach dem Abkühlen und nach dem Neutralisieren mit einer Alkalilösung Zentrifugieren der Emulsion zur Entfernung von unlöslichem Material und Sammeln der klaren überstehenden Phase;

(D) Konzentrieren der überstehenden Phase und Dialysieren der resultierenden konzentrierten Flüssigkeit durch eine Dialysemembran oder Filtrieren mit einem Membranfilter zur Herstellung eines dialysierten flüssigen Mediums oder Filtrats;

(E) Durchführen einer Säulenchromatographie unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranen (Sephadex). mit dem dialysierten flüssigen Medium bzw. Filtrat nach dem Konzentrieren zur Herstellung einer Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,82 mit Hilfe eines mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrans mit einem Fraktionierbereich für Peptide und Kugelproteine mit Molekulargewichten von 1000 bis 5000 (Sephadex G-25), einer Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 "bis 1,24 mit Hilfe eines mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrans mit einem Fraktionierbereich für Peptide und Kugelproteine mit Molekulargewichten unterhalb 15OO (Sephadex G-15) bzw. einer Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 his 1,25 mit Hilfe eines mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrans mit einem Fraktionierbereich für Peptide und Kugelproteine mit Molekulargewichten unterhalb 700 (Sephadex G-10) und des Endprodukts; und

(F) Lyophilisieren der Fraktion.

Nachstehend werden die Zeichnungen kurz erläutert.

Figuren 1 bis 3 zeigen Säulenchromatogramme konzentrierter Extrakte der Plazenta des Menschen, die gemäß der Erfindung

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mit Sephadex G-25_f G-15 bzw. G-10 hergestellt wurden.

Figur 4 zeigt das UV-Absorptionsspektrum der Fraktion 2, die mit Sephadex G-25 aus dem Plazentaextrakt erhalten wurde.

Figur 5 zeigt das IR-Absorptionsspektrum der Fraktion 2, die mit Sephadex G-25 aus dem Plazentaextrakt erhalten wurde.

Figur 6 zeigt den wachsiumsinhibierenden Effekt des D-Faktors auf die Zellentwicklung (cell line) sowohl bei lymphoider Leukämie der !.laus als auch bei normalen Hausnieren.

Figur 7 zeigt den wachstumsinhibierenden Effekt des D-Faktors auf myelogene leukämische Zellen der Maus.

nachstehend wird das Verfahren gemäß der Erfindung Schritt für Schritt näher beschrieben.

(1) Herstellung einer Plazentaemulsion und Ansäuern der Emulsion.

Die Plazenta, die gemäß der Erfindung verwendet wird, stammt vom Menschen oder von anderen Säugetieren, wobei die vom Rind oder Schwein, frisch oder gefroren, leicht handzuhaben und als Ausgangsmaterial auch wirtschaftlich ist. Die Plazenta wir"d mit einer ausreichenden Menge von mehrmals destilliertem Wasser gewaschen. Bei gefrorenem Material soll zuvor aufgetaut werden. Es v/ird steriles Wasser oder Salzlösung in äquivalenter Menge zum Feucht- 'gewicht des Materials zugegeben. Danach wird die Plazenta in Stücke zerkleinert und mit einem Gemisch aus v/ässeriger Essigsäure (20 bis 30%) und Salzsäure (1 bis 2Q?o) in einem Mischungsverhältnis von 25:75 bis 75s25 gemahlen, so daß die Azidität der Emulsion im Bereich von 0,5 bis 2,0 η liegen kann. Durch das Ansäuern sollen sowohl die Proteine denaturiert und unlöslich gemacht werden als auch das Zytoplasma und das Bindegewebe löslich gemacht werden.

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Essigsäure und Salzsäure sullen bevorzugt gegenüber Salpetersäure und Schwefelsäure vewendet v/erden, da die beiden zuletzt genannten Säuren zur Zersetzung, Nitrierung, Dehydratation oder Entaminierung des Proteins und des Zuckers in der Emulsion und zu Schwierigkeiten bei der Extraktion des D-Faktors führen können. Phosphorsäure wird gleichfalls nicht bevorzugt, da sie nicht nur zu einer langsameren Extraktion des D-Fak'tors führt, sondern auch die Aktivität des Paktors je Volumeneinheit der .gereinigten Fraktion (nachstehend als Extrakt bezeichnet) herabsetzt.

Der optimale Bereich der Azidität wurde experimentell als 0,5 bis 2,0 η auf Basis der folgenden Beispiele für denExtraktiocsgrad bzw. -wirkungsgrad und die Aktivität des resultierenden D-Faktors ermittelt.

Beispiel 1

Es wurden insgesamt 13 Proben von Fraktionen mit dem D-Paktor hergestellt, wobei die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 9 mit der Ausnahme befolgt wurde, daß die Azidität im Bereich von 0,1 bis 2,5 η variiert wurde.

Der Exbraktionsgrad wird nach der folgenden Formel berechnet:

Trockengewicht der

D-F akt or-Fraktion

Extrakt ionsgrad = ■—— χ 100.

Feuchtgewicht der verwendeten Plazenta

Die Aktivität der D-Faktor-Fraktion wurde auf biologischem ",Vege durch die Z eil entwic klung bei lymphoider Leukämie L5178Y der !.laus bestimmt (Fischer, G.A., Annals of the Hew York Academy of Science, Bd. 76, 1958, S. 673). Es wurden 13 verschiedene Testmedien hergestellt, indem man 2 mg von jeweils einer der vorstehend beschriebenen 13 Pro-

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BAD ORIGINAL

ben zu 1 ml RPMI-1640-Medium (Produkt der NISSUI SEHAKU) mit einem Gehalt an 10% Rinderfetalserum zugab; ferner wurde ein Kontrollmedium ohne D-Faktor hergestellt. Das Vergleichsbeispiel wurde in der gleichen Weise mit der Ausnahme durchgeführt, daß der D-Paktor nicht im Medium enthalten war. Es wurden L5178Y-Zellen mit einer Zellkonzentration von 1 χ 10 /ml in das vorstehend angegebene Medium.eingeimpft. Die Kultur wurde wie üblich inkubiert und die Anzahl der Zellen wurde am sechsten Vage mit einem Hämozytometer gezählt. Die Aktivität des D-Faktors wurde durch die Anzahl der Zellen in 1 ml wiedergegeben. Je kleiner die Anzahl der Zellen ist, umso größer ist die Aktivität dee D-Faktors anzunehmen. Es wurde beobachtet, daß eine Azidität von 1,2n beim Extraktionsvorgang zur höchsten Ausbeute des D-Faktors und zur höchsten Aktivität des D-Faktors je Gewichtseinheit des Extrakts führte. Wenn man sowohl den Extraktions grad als auch die Aktivität des D-Faktors bei einer Azidität von 1,2nals 100 ansetzt, betrugen der Extraktionsgrad und die Aktivität des Faktors mehr als 70 bzw. 80 bei Aziditäten im Bereich von 0,5 bis 2,On. Aziditäten außerhalb des Bereiche führten zu einem kleineren Extraktionsgrad und einer kleineren Aktivität des Faktors. Jenseits einer Azidität von 2 η kam es zu einer außerordentlichen Hydrolyse der Plazentaproteine und zu einer Vermehrung der chemischen Spezies unter 5000 Dalton mit einem deutlich größeren Extraktionsgrad, jedoch wurde die tatsächliche bzw. wirksame Aktivität des D-Faktors herabgesetzt. Unter einer Azidität von 0,5 η lief die Hydrolyse nicht wirksam ab und dementsprechend fielen Ausbeute und Aktivität je Gewichtseinheit des Extrakts sichtlich ab. Daher soll die Azidität der Emulsion im Bereich von 0,5 bis 2,0 n, vorzugsweise bei 1,2 η liegen.

Der Bereich des Mischverhältnisses von Essigsäure mit Salzsäure wurde folgendermaßen bestimmt.

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t . ( etc

Beispiel 2 *

■ . ι «

1 I < I Il ' '

Es wurden Zubereitungen des Extrakts unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 9 mit der Ausnahme erhalten, daß das Mischverhältnis der Mittel zum Ansäuern variiert wurde, das man Tabelle 1 entnehmen kann. Die Ergebnisse sind gleichfalls in der Tabelle zusammengestellt. Ein Mischungsverhältnis von Essigsäure zu Salzsäure wie 35$65 lieferte das beste Ergebnis hinsichtlich des Extrakt!onsgrades und der Aktivität des D~Faktorso Je größer der Anteil an Salzsäure war, umso größer war der Extraktionsgrad und umso kleiner die Aktivität des D-Faktors« Die maximale. Aktivität des D-Faktors wurde bei einem Mischungsverhältnis von 35s65 erzielt. Andere Werte des Verhältnisses lieferten eine geringere'Aktivität als das Verhältnis von 35 s 65. Wenn man den'.Extraktionsgrad und die Aktivität beim Verhältnis von 35s65 als 100 ansetzt, fällt das Mischungsverhältnis, das Werte von 70 für den Extraktionsgrad und von 80 für die Aktivität des D-Faktors liefert, in den Bereich von 75s25 und 25s75-

Das Mischungsverhältnis der Mittel zum Ansäuern, das niedrigere Werte, hinsichtlich des Extraktionsgrades und der Aktivität liefert, wird nicht bevorzugt»

Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich, daß das Mischungsverhältnis von Essigsäure und Salzsäure vorzugsweise im Bereich von 25;75 bis 75s25 liegt und optimal 35s65 beträgt.

(2) Erhitzen ■

Es wurde eine angesäuerte Emulsion erhitzt, um einerseits Plazentaproteine zu denaturieren und andererseits das Cytoplasma und das Bindegewebe löslich zu machen. Ein mehrstündiges Erhitzen bei höherer. Temperatur kann zu einem Abbau der Plazenta unter Bildung vonmehr chemischen Spezies bzw. Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht führen, was wiederum die Anzahl der extrahierbaren Substanzen erhöht, jedoch die Aktivität des D-Faktors je Gewichte-. einheit des ExtrakJ^ir^^g

ORIGINAL INSPECTED'

	SaIz-	T a	- 10 -τ	2441454	Index der Akti vität des D-Faktors
	0 *	Ixtrak- tionggrad (5S)	b e 11 e 1		36
Essig·=· ■säure	5	0,05	Index des Extrafc» tionsgrades	Aktivität dee D-Faktors	36
100 ·_	10	0,05	35	1,0 χ 10⁵	36
95	15	0,05	35	1,0 χ 10⁵	48
■ 90	20	0,07	' 35	1,0 χ 10⁵	60
85	25	0,07	50	7,5 x 10⁴	80
80	30	0,10	50	6,0 χ 10⁴	80
75	35	0,11	71	4,5 x 10⁴	83
70	40	0,13	78	4,5 x 10⁴	85
. 65	45	0,13	92	4,3 x 10⁴	85
60 ,	. 50	0,13	92	4,2 χ 10⁴	83
55	55	0,13	92	4,2 χ 10⁴	92
50 '	60	O₈13	92	4,3 x 10⁴	94
45	. 65	0,14	92	3,9 x 10⁴	100
40,	70	0,14	100	3,8 χ 10⁴	90
35	75	O₉H	100	3,6 χ 10⁴	90
30	80	0,14	100	4,0 χ 10⁴	65
25 ■	85	0,15	100	4,0 χ 10⁴	60
20	90	0,15	107	5,5 x 10⁴	36
15	95	0,15	107	6,0 χ 10⁴	36
10	100	0,15	107	1,0 χ 10⁵	30
. ⁵		0,15	107	1,0 χ 10⁵	—
■ P	107	1,2 χ 10⁵
	' Vergleichsversuch (Medium ohne D-Faktor)	8,5-x 10⁵

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Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um die optimalen Bedingungen des Erhitzens zu bestimmen. Es wurden insgesamt 9 Zubereitungen von Plazentaextrakt nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 9 mit der Ausnahme erhalten, daß die Erhitzungstemperatur im Bereich von 55 bis 95 ⁰C variiert wurde, indem jeweils um 5 ⁰C nach 40minütigem Erhitzen erhöht wurde. Es wurden der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Paktors jeder Zubereitung in-der.gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.. Die Kombination der Erhitzungsbedingungen von 80 ⁰C und 40 Minuten lieferte die besten Ergebnisse für den^eExtraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors. Wenn man den Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors bei 80 ⁰C und 40 1,-Iinuten mit 100 ansetzt, lieferten Kombinationen von Temperaturen im Bereich von 75 bis 90 ⁰C und einer Erhitzungsdauer von 40 Minuten einen Wert von mehr als 70 für den Extraktionsgrad und mehr als 80 für die Aktivität des D-Paktors. Ein Erhitzen bei anderen Tempera turen als im Bereich von 75 bis 90 ⁰C führte zu weniger günstigen Ergebnissen bezüglich beider Parameter.

Tabelle 2

Erhitzungs temperatur	Extraktions grad *(^c/o)*	In dex des Extrak tionsgrades	Aktivität des D-Faktors	χ TO⁴	Index der Aktivität des D-Faktors
55	0,02 ·	15	5,0	χ 10⁴	70
60	0,02	15	5,0	χ 10⁴	70
65	0,04	30	4,1	χ 10⁴	85
70	0,08	60	4,2	χ 10⁴	83
75	0,12	92	3,8	χ 10⁴	92
80	0,13	100	3,5	χ 10⁴	100
85	0,14	107	3,8	χ 10⁴	92
90	0,15	115	4,3	χ 10⁴	81
95	0,18	138	4,7	χ 10⁵	74
Vergleichsversuch (Medium ohne D-Faktor)		8,7	—

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Ftrner wurden insgesamt 7 Zubereitungen des Extrakts in der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 9 bei einer Erhitzungstemperatur von 80 ⁰C mit der Ausnahme erhalten, daß die Erhitzungsdauer im Bereich von 10 bis 70 Minuten jeweils mit einer Verlängerung um 10 Minuten variiert wurde. Der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Paktors wurden in der gleichen Weise wie vorstehend angegeben ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

• Tabelle 3

Erhitzungs- Extraktions- Index Aktivität Index dauer (Min.) grad (%) des Extrak- des der Aktivität

tionsgrades D-Paktors des D-Paktors

10	0,01	7	1,0 χ	ΙΟ*	35
20	0,05	36	5,0 χ	10⁴	70
30	0,12	86	3,8 χ	10⁴	92
40 ·	0,14	100	3,5 x	10⁴	100
50	0,15	107	3,6 χ	10⁴	97
60	0,15	107	3,6 χ	10⁴	97
70	0,17	121	4,5 χ	10⁴	77

Vergleichsbeispiel _p r „ _ΛΓ5

(Τ.ΤοΛ-ΐιιιη nhnp TWI? η Ir+η τΛ ^Ö»^{D Χ IU}

(Medium ohne D-Paktor)

Wie man sieht, liefert die Kombination der Erhitsungsbedingungen von 80. ⁰C und 40 Minuten die besten Ergebnisse bezüglich des Extraktionsgrades und der Aktivität des D-Paktors.

Wenn man den Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Paktors bei den vorstehend angeführten optimalen Bedingungen als 100 ansetzt, liefern Kombinationen von Erhitzungsdauern im Bereich von 30 bis 60 Minuten mit einer Temperatur von 80 ⁰C

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Werte von mehr als 70 für den Extraktionsgrad und von mehr als 80 für die Aktivität des D-Faktors. Andere Erhitzungsbedingungen als die der angegebenen Kombinationen waren nicht günstig.

(3) Entfernung der Proteinsubstanz und Einstellung des pH-Wertes

Ein Teil des Plazentaproteins wurde durch Erhitzen im sauren Medium unlöslich gemacht. Die unlösliche Proteinsubstanz wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Phase wurde mit einer alkalischen Lösung neutralisiert, vorzugsweise wässerigem Natriumhydroxid oder Kaiiumhydroxid. Eine maximale Entfernung der Proteinsubstanz wurde durch Zentrifugieren im sauren pH-3ereich erzielt, da einige Proteine beim Neutralisieren löslich werden, was eine Entfernung der Proteine verzögert. Beim Neutralisieren der überstehenden Phase können einige unlösliche Stoffe ausfallen, die danach entfernt v/erden sollten.

Im allgemeinen sollen Extrakte aus lebendem Material im Autoklaven zur Inaktivierung aller Kranlcheitserreger einschließlich Viren behandelt werden. Daher ist die erfindurigsgemäße Zubereitung für eine Behandlung im Autoklaven nach Neutralisation vorgesehen. Der D-Faktor ist derart wärmestabil, daß der Extrakt bei 110 ⁰C 15 Minuten lang • oder bei 120 ⁰C 10 Minuten lang unter einem Dampfdruck von 1,0 bis 1,5 kg/cm sterilisiert werden kann, wobei es sich um den gleichen Wert wie bei der Sterilisation von Mikrobenkulturmedien handelt. - .

(4) Konzentration; Dialyse oder Filtration

Nach der Behandlung im Autoklaven wurde die Zubereitung zur Entfernung angefallener unlöslicher Substanzen zentrifugiert und die überstehende Phase wurde gesammelt. Ohne Behandlung im Autoklaven war es nicht erforderlich, erneut zu klären.

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Die klare Lösung wurde bis auf 1/10 bis 1/30 des Volumens der ursprünglichen Lösung unter reduziertem Druck konzentriert,

Das Konzentrat wurde gegen 3fach destilliertes Wasser in einem übTichen Vorgang dialysiert oder durch ein Membranfilter zur Entfernung chemischer Spezies mit höherem Molekulargewicht filtriert. Die Dialyse des Konzentrats wurde in . einem üblichen Zelluloserohr durchgeführt und die dialysierte Flüssigkeit wurde gesammelt. Die Filtration des Konzentrats wurde mit einem Membranfilter, z.B. einem Sartorius-CSartorius GmbH) oder Holo-fibre-50-Filter (Dow Chemical Co.) durchgeführt und das Filtrat wurde gesammelt.

(5) Konzentrieren und Chromatographie mit Sephadex

Das dialysierte flüssige Medium bzw. das Filtrat wurden auf 1/100 bis 1/200 bzw. auf 1/5 bis 1/10 des Volumens der ursprünglichen Lösung unter reduziertem Druck konzentriert. Dag Konzentrat wurde einer Chromatographie mit Sephadex G-25, G-15 oder G-10 zur Gewinnung einer Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor unterworfen. An der Sephadex-Säule wurde das Gleichgewicht mit verdünnter (1:100), mit Phosphat gepufferter Salzlösung, die kein Calcium und Magnesium enthielt, mit 3fach destilliertem Wasser eingestellt. Das Konzentrat wurde auf die Säule geschichtet bzw. gegeben und danach mit dem gleichen Puffer mit einer Rate von 5 bis 10 ml je 10 Minuten eluiert. Die Fraktionen mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,80 bei Sephadex G-25, 0,35 bis 1,24 bei Sephadex G-15 bzw. 0,35 bis 1,25 bei Sephadex G-10 wurden gesammelt.

Die Größe der zu verwendenden Säule hängt vom Volumen des Konzentrats ab, ist jedoch von dessen Konzentration unabhängig· Die Größe der Sephadex-Säule soll das 10-bis ·. 20-fache des Volumens des Konzentrats zur Abtrennung einer

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Fraktion rait einem Gehalt an D-Faktor betragen. Die Fraktion, die durch Sephadex-Säulenchromatographie abgetrennt wurde, wird genau durch den Verteilungskoeffizienten (Kd) nachstehend definiert. Der Verteilungskoeffizient (Kd) wird' nach der folgenden Formel berechnet!

Ve ' - Vo Ve - Vo

Vi a Wr

Ve: Volumen, das bis zur Eluierung des gelösten Stoffs

abfließt.
Vo: Lösungsmittelvolumen außerhalb bzw. ohne die Gelteilchen.

Vi: Lösungsmittelvolumen in den Gelteilchen, a : Gewicht der trockenen Gelteilchen.

V/r: Gewicht des Lösungsmittels, das pro Gewichtseinheit trockener Gelteilchen festgehalten wird.

Der Verteilungskoeffizient wurde als Index des gelösten Stoffs verwendet, um die ihn enthaltende Fraktion zu definieren, die aus der Sephadex-Säule eluiert -wurde, unabhängig von der Größe der Säule und der Eluierungsrate (Hiroshi Moriya, "Gel Filtration Method", Hirokawa-shoten, 1971). Da das Molekulargewicht des D-Faktors relativ klein ist, wurde Sephadex G-25, G-15 oder G-10 zur Abtrennung verwendet. Die Verwendung von Sephadex G-50 oder einer Qualität mit höherem Vernetzungsgrad führte nicht zur Gewinnung einer Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor, wie in Beispiel 3 beschrieben wird.

Beispiel 3

Der konzentrierte Plazentaextrakt (Gesamtfeststoffgehalt 20%), der wie in Beispiel 9 hergestellt wurde, wurde einer Chromatographie mit Sephadex G-25, G-15 bzw. G-10 unter den in Tabelle

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wiedergegebenen Bedingungen unterworfen. Die optischen Dichten der Fraktionen dee Eluats bei 280 bzw. 260 nra wurden mit einem Spektrophotometer bestimmt. Mit Sephadex G-25 wurden die folgenden Fraktionen mit den folgenden Kd-Werten erhalten: 1 mit 0,03 biß 0,94, 2 mit 0,95 bis 1,82, 3 mit 1,83 bis 2,55 und 4 mit 2,56 bis 3»04. Mit Sephadex G-15 wurden die folgenden Fraktionen mit den folgenden Kd-Werten erhalten: 1 mit 0,06 bis 0,34, 2 mit 0,35 bis 1,25, 3 mit 1,26 bis 1,85 und 4 mit 1,86 bis 3,3. Mit Sephadex G-1Q wurden die folgenden Fraktionen mit den folgenden Kd-Werten erhalten: 1 mit 0,06 bis 0,34, 2 mit 0,35 bis 1,25, 3 mit 1,26 bis 1,85 und 4 mit 1,86 bis 3_f3. Der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors wurden an den 12 Fraktionen entsprechend der Arbeitsweise bestimmt, die in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Die Figuren 1, 2 und 3 zeigen Chromatograoime des Plazentaextrakts, der mit Sephadex G-25, G-15 bzw. G-10 erhalten würde. In jeder Figur gibt die Abszisse die optischen Dichten (OD) des abfließenden Mediums und die Ordinate die Rohrzahlen und die Kd-V/erte wieder. Eine ausgezogene Kurve gibt die OD bei 260 nm und eine gestrichelte Kurve die OD bei 280 nm v/ieder. Die Fraktion 2 jeder Sephadex-Säule zeigte einen kräftigen wachstumsinhibierenden Effekt auf die Zellentwicklung bei lymphoider Leukämie der Maus. Keine der anderen Fraktionen zeigte einen derartigen Effekt. Wie man den Figuren 1 bis 3 und Tabelle 5 entnehmen kann, wurde der D-Faktor ausschließlich aus der Fraktion 2 bei jeder Sephadex-Säulenchromatographie gewonnen.

Daraus folgt, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in wirksamer Weise der D-Faktor oder eine Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor erhalten werden können.

Einige physikalisch-chemischen Eigenschaften der Fraktion 2 werden nachstehend beschrieben. Das Absorptionsmaximum im

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UV-Bereich lag bei 258 um. Pur das Molekulargewicht wurde ein Wert von unter 5000 Dalton berechnet. Das IR-Absorptionsspektrum der gefriergetrockneten Zubereitung der Fraktion in einer KBr-Scheibenprobe ist in Figur 5 wiedergegeben, aus der eine Peptidbindung, eine Phosphatesterbindung und ein Amidorest entnommen werden können. Dementsprechend können Iiukleinsäuren, Peptide und Zucker im Extrakt vorliegen. Andere Eigenschaften der Fraktion 2, die durch Sephadex-Säulenchromatographie isoliert wurde, sind in Tabelle 6 zusammengestellt. · \

	Tabelle 4	Sephadex G-15	Sephadex G-10
		66	76
	Sephadex G-25	2,5 x 40.	2,5 x 40
Sephadex- gewich.t (g)	86	6 verdünnte (1:100) mit Phosphat gepufferte Salzlösung	6 verdünnte (1:100) mit Phosphat gepufferte Salzlösung
Säule 0 (cm) χ Länge (cm)	2,5 x 90	5	4,5
eingesetzte Probe (ml) Eluat	20 verdünnte (1:100) mit Phosphat gepufferte Salzlösung	Ul	4,5
Eluierungs- rate (ml/10 min	.) 7
Eluierungs- wert (ml/Rohr)	7

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Tabelle 5

Sephadex G-25

Sephadex G-15

Sephadex G-10

Vertex- Extrak- Aktivi- Vertei- Extrak- Aktivi- ■ Vertei- Extrak- Aktivi-

Praktion lungs- tions- tat des lungs- tlons- tat des lungs- tions- ' tat des

Ur. koeffi- grad {%) D-Paktors koeffi- grad (59) D-Paktors koeffi- grad {%) D-Paktors

zient zient zient

°6°94 °'⁰⁰⁹

0,005 1,0 χ 10

0,003 1,0 χ

co co cn

°'¹³° ³»⁴

°»^{082 8}»⁵ ^{0>009 1}»°

°»°⁹⁶

°»^{090 7}»^{2 x}

^0>004

-1*85

,8 χ

^0>003

Vergleichsversuch

5

,5 x 10^ Vergleichsversuch 8,5 x 10^ Vergleichsversuch 8,6 χ

- 19 Tabelle 6

Kopf

Sephadex G-25 Sephadex G-15 Sephadex G-10

Protein-Peptid
(mg/ml)

7,20 6,80 6,30 säurelöslich säurelöslich säurelöslich

(Lowry-Polin-:Jethode) 7,19

säureunlöslich

0,01 6,78

säureunlös-r lieh

0,02

6,26

säureunlöslich

0,04

Kohlehydrat (mg/ml)
Phenol-Schwefelsäure
(berechnet als
Glukose)

1,00 1,38

1,24

"ucIeinsäure
RibonucIeinsäure
(mg/ml)
(Orcinol-i.Iethode)

Des oxyrib onuc1e insäure (rag/ml) (Indol-LIethode)

3,12

1,92 3,81

2,03

3,56

1,84

Organi- 70 % Äthanol löslich

γ.. Äthyläther unlöslich

mittel Chloroform unlöslich

Aceton unlöslich

löslich unlöslich unlöslich unlöslich

oulfosalicylsäure-Reaktion

Biuret-Reaktion
H inhydrin-R e akt i on
Molisch-Test

Pulverfarbe

hellgelb hellgelb

hellgelb

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(6) Behandlung des Extrakte

Die Fraktion mit dem D-Faktor (Fraktion 2), die auf diese Weise hergestellt wurde, wurde in sterilisierte Ampullen abgefüllt, nachdem sie durch ein aseptisches Membranfilter einer Porengröße von weniger als 0,2 Mikron filtriert worden war, und gefriergetrocknet.

■ Ferner wurden Plazentaextrakte nach den Arbeitsv/eisen von Hieda und Boyong Ho Chin hergestellt, wobei die Extrakte lyophilisiert und ihre Wirkung auf leukämische Zellen wie in Beispiel 1 untersucht wurde. Sie zeigten keinen wachstumsinhibierenden Effekt bei bösartigen Zellen.

Danach wurde die den D-Faktor enthaltende Fraktion, die nach der Arbeitsweise gemäß der Erfindung hergestellt worden war, folgendermaßen getestet.

Beispiel 4

V/irkung des D-Faktors auf die Wiedergewinnung der normalen Funktion erythroblastischer leukämischer Zellen (T-3-C1-1) in vitro.

Hormale erythroblastische Zellen können Hämoglobin synthetisieren. Die ermittelte Zellenentwicklung bei erythroblastischer Leukämie der Maus (T-3-C1-1) ist durch ihr Unvermögen gekennzeichnet, Hämoglobin infolge zellulärer Veränderungen erythroblastischer Zellen zu synthetisieren. Wenn demgemäß der D-Faktor wieder zur Hämoglobinsynthese bei T-3-C1-1 führen kann, ist anzunehmen, daß er die normale Funktion leukämischen Zellen wiedergeben kann.

Der Stamm T-3-C1-1 wurde von Ikawa hergestellt (Gann, Bd. 57, 1966, S. 641; ibid., Bd. 58, 1967, S. 155; Proceedings of the Japan Academy, Bd. 47, 1971, S. 220), der ihn nach der folgenden Arbeitsweise erhielt. .

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Friend-Virus (von G. Friend gefundener Leukämie-Virus der Maus) wurde intraperitoneal in DDD-Mäuse injiziert, um einen Fokus in. der Milz hervor zurufen= Die Milz der getöteten Tiere wurde entfernt und die Zellen des Gewebes wurden in einer Salzlösung dispergiert. Die Milzzellensuspension wurde in Mäuse subkutan injiziert, um ein Neoplasma zu bilden. Die auf diese Weise gebildeten neoplasmatisclien Zellen wurden wieder intraperitoneal in Mäuse zur Bildung einer aszitisöhen Form injiziert, aus der ein Klon (T-3-C1-1) in vitro gewonnen wurde. Zu einem Grundmedium (basal medium) mit HAM-F-12 und 20 % Kälberserum, wurden 2 mg D-Faktor je ml des Mediums zugegeben, hergestellt nach der Arbeitsweise des Beispiels 9. Als Kontrollmedium diente ein Grundmedium"ohne D-Faktor. Sie wurden mit T-3-C1-1-Zellen In üblicher Weise inokuliert. Die Inkubation dieser Kulturen währte 4 Tage· Die Aktivität der Aminolävulinsäure-Synthetase der Zellen wurde in dieser Zeit bestimmt. Die enzymatische Aktivität v/ird als Index der Veränderung (differentiation) angesehen, während es sich bei der Reaktion des Enzyms, der Aminolävulinsäure-Synthetase, um die die Rate begrenzende Stufe der folgenden Hämoglobinsynthese handelt.

In der Vergleichskultur betrug die Enzymaktivität nur 10,5 Picomol/30 Min./mg Protein. In der untersuchten Kultur betrug sie 67,8 Picomol/30 Min./mg Protein, Das Ergebnis zeigt klar, daß der D-Faktor die enzymatische Aktivität vergrößert und auf der anderen Seite zur Differentiation der leukämischen Zellen beiträgt. ·

Beispiel 5

Im folgenden wird ein Tierversuch zur Ermittlung der Wirkung des P-Faktors auf leukämische Zellen beschrieben.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 4 wurden T-3-C1-1-. Zellen in 2 verschiedenen Medien mit einer Zellkonzentration

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von 5 x 10 je ml suspendiert. Den Mäusen, von Gruppen (Varsuchsgruppen und Vergleichsgruppen) mit jeweils 10 Tieren wurde intraperitoneal 1 ml Suspension injiziert. Den Tieren wurde reichlich Trockenfutter (ITihon Clea) verabreicht; sie wurden in Käfigen'bei konstanter Feuchtigkeit und Temperatur gehalten. Das Überleben der Versuchstiere wurde jeden Tag in beiden Gruppen zur Ermittlung der Wirkung des D-Paktors überwacht. Als Ergebnis wurde· festgestellt, daß die Tiere bis zu durchschnittlich 60 Tagen in der Versuchsgruppe überlebten, während der Durchschnitt in der Vergleichsgruppe 34 Tage betrug. Dadurch wurde klar gezeigt, daß der D-Paktor bösartigen leukämischen Zellen in vivo entgegenwirken konnte.

Beispiel 6

Wirkung des D-Paktors auf die Wiedergewinnung der normalen Punktion lymphoider leukämischer Zellen der Maus in vitro.

Lymphoide leukämische Zellen der Maus (L5178Y) bilden eine charakteristische Kolonie in einem Medium aus RPMI 1640-Medium (HISSUI SEIYAIiU CO.), 10 % fetalem Rinderserum und Bacto-Agar (Difco Laboratories) wie es bei anderen Tumorzellen im allgemeinen der Fall ist. Wenn daher-die leukämisohsn Zellen keine charakteristische Kolonie im Medium mit dem D-Paktor zeigen, kann daraus auf anderem Wege geschlossen werden, daß der D-Paktor eine Wiedergewinnung der normalen Punktion derartiger leukämischer Zellen eingeleitet hat. Es wurden 2 Arten von Versuchsmedien hergestellt, die o,5 mg bzw. 2,0 mg D-Paktor je ml des vorstehend beschriebenen weichen Agar-Mediums enthielten. Das Vergleichsmedium enthielt keinen D-Paktor. Jedes Medium wurde auf 5 Petrischalen verteilt; es wurden L5178Y-Zellen in einer Zellkonzentration -von 10 in jede Schale.inokuliert. Diese insgesamt 15 Schalen wurden in üblicher Weise inkubiert. Am 12« Tag wurdendie gesamten Kolonial jeder Schale gezählt. Die kompakten und aufgelockerten Kolonien wurden unter einem Mikroskop geringer Vergrößerung zur Untersuchung der Wirkung des D-Paktors

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auf die Wiedergewinnung der normalen Punktion der I5178Y-Zellen auf dem Wege dieser Kolonietypenanalyse eingeteilt.

Unter kompakten Kolonien v/erden solche verstanden, bei denen alle Zellen dichtaneinanderkleben; unter den aufgelockerten kolonien werden solche verstanden, bei denen die Zellen im pheripheren Bereich der Kolonie im Agar dispergiert sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben. Die gesamte Anzahl der Kolonien im D-Paktor-haltigen Medium war sichtlich kleiner als die des Vergleichsmediums. Auch übertraf die Häufigkeit' der aufgelockerten Kolonien in jedem behandelten Medium die im Vergleichsmedium«, Daraus ergibt sich klarj daß der D-Paktor au einer normalen Punktion der Lymphosyten führt, und zwar zu einer lokomotiven Aktivität der L517QY-Zeilen« Der D-Paktor beeinflußt die Y/iedergewinnung der normalen Punktion lymphoider leukämischer Zellen der .Maus.

Beispiel 7

Die inhibierende "wirkung des D-Paktors in vitro auf das V; ache turn lymphoider leukämischer Zellen der Maus (L5178Y) und auf normale Zellen (C3H2K).

In diesem Versuch wurde gezeigt, daß der D-Faktor eine Wachstumsinhibierende Wirkung auf leukämische Zellen, jedoch

nicht auf normale Zellen ausübt.

Es wurden L517BY-Zellen in einer Zellkonzentration von 1 χ 10⁴/.-nl in zwei R?;.n 1640-Medien mit einem Zusatz von 10 % fetalem Rinderserum inokuliert, von denen das eine 2 mg/ml D-Paktor (hergestellt nach Beispiel 10) und das andere keinen D-Paktor enthielt. Die Medien wurden wie üblich inkubiert und das Zählen der Zellen wurde unter Verwendung eines Hämozytometers unter einem Mikroskop am 2. bis 8» Tage durchgeführt, um zu ermitteln, ob irgendeine wachstumsinhibierende

BAD ORIGINAL

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Wirkung des D-Faktors zu beobachten war.

Als Vergleichssystem wurden normale Zellen (C3H2K), die in vitro aus normalen Mäusenieren eingesetzt wurden, in einer Zellkonzentration von 7 x 10 /ml in zwei Eagle MEM-Medien (NISSUI SEIYAKU) mit einem Zusatz von 10% Kälberserum inokuliert, von denen das eine D-Faktor in einer Menge von 2 mg/ml und das andere keinen D-Faktor enthielt. Die Kulturen wurden wie üblich inkubiert. Nachdem die Zellen vom Boden durch Trypsinisation vom 1. bis zum 7· Tag nach der Inkubation abgelöst worden waren, wurden die Zellzahlen mit einem Hämozytometer wie vorstehend beschrieben gezählt, um die wachstumsinhibierende Wirkung des D-Faktors auf normale Zellen zu untersuchen.

Das Ergebnis ist in Figur 6 dargestellt, wobei die Abszisse die Zellzahlen je ml der Mediumlösung und die Ordinate die Kulturdauer in Tagen wiedergeben; offene Kreise gelten für die Vergleichsgruppe und geschlossene Kreise für die Versuchsgruppej die ausgezogenen Kurven gelten für die Zählung der L5178Y-Zeilen und die gestrichelten Kurven für die Zählung der C3H2K-Zellen.

Wie man Figur 6 entnehmen kann, übt der D-Faktor eine spezifische wachstumsinhibierende Wirkung auf leukämische Zellen aus.

Beispiel 8

Die inhibierende Wirkung des D-Faktors in vitro auf das Wachstum myelogener leukämischer Zellen der Maus (M 1-C1-34)

IÄ 1-Cl-34-Zellen wurden von Ischikawa (Journal of Cell Physiology, Bd. 74, 1969, S. 223) hergestellt, der sie folgendermaßen erhielt. Myelogene Zellen einer leukämischen !.laus, die spontan Leukämie entwickelte, wurden intravenös in eine normale I.Iaus des gleichen Stamms injiziert. Wach 2 V/ochen wurden myelogene leukämische Zellen aus hyper-

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- 25 -r. . .

trophen Lymphknoten des Tieres gesammelt. Das Kulturmedium wurde hergestellt, indem man 1,3 g Aminosäure/Vitaminmediumpulver (KISSUI SEIYAIiU) in 1 Liter Eagle-Medium löste und 15 % Pferdeserum zur Mischung zugab. Die myelogenen Zellen wurden in einer Zellkonzentration von 2 χ 10 in das vorstehende Medium in einer Petrischale inokuliert (d: 60 m/m). Sie wurden wie üblich 5 Tage langinkubiert, wobei zwischendurch geschüttelt wurde. Es wurden nur Zellen, die im Medium suspendiert waren, gesammelt (nachstehend mit M 1 bezeichnet).

Ausgehend von M 1-Zeilen wurden M 1-C1-34-Zeilen als Klon nach der Y/eiehagarrnethode erhalten, bei der ein doppelschichtiges EM-Agarmedium mit einem Gehalt an 20 % Pferdeserum und 0,33 % Agar in der Deckschicht und 0*5 % in der Bodenschicht verwendet wurde.

Das Testmedium für M 1-Cl-34~Zellen wurde hergestellt, indem man 0,85 g Aminosäure/Vitaminmediumpulver in 1 Liter Eagle MEM löste und 10 % Kälberserum zugab. Die M 1-Cl-34-Zellen wurden in einer Zellkonzentration von 2 χ 10 je ml in 2 Portionen des vorstehend beschriebenen Mediums inokuliert, von denen die eine D-Paktor in einer Menge von 2 mg/ml (hergestellt nach Beispiel 11) und die andere keinen D-Paktor enthielt, die als Vergleich zur Ermittlung'diente, ob eine wachstumsinhibierende Wirkung auf myelogene leukämische Zellen der Maus beobachtet werden konnte. Die Portionen wurden in üblicher Weise inkubiert, wobei die-Zellzählung vom 1. bis 10_e Tage unter Verwendung eines Hämocytometers unter einem Mikroskop durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt, wobei die'Abszisse die Zellzahl je ml und die Ordinate die Kulturdauer in Tagen wiedergibt; offene Kreise bezeichnen die Vergleichsgruppe und geschlos-· sene Kreise die Versuchsgruppe.

Wie man Figur 7 entnehmen kann, war zu beobachten, daß die Zellzahl vom Beginn der Inkubation abfiel, was anzeigte, daß die M 1-Cl-34-Zellen im D-Faktor-haltigen Medium nicht

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wachsen konnten. Auf der anderen Seite zeigten die M 1-C1-34-Zellen ein aktives Wachstum im Medium ohne D-Faktor. Danach ist es evident, daß der D-Faktor das Wachstum myelogener leukämischer Zellen inhibieren kann.

Beispiel 9

Es wurden 400 g Plazenta des Menschen mit einer ausreichenden Menge mehrmals destillierten Wassers gewaschen, in Stücke zerkleinert und mit 500 ml Wasser zu einer Emulsion vermählen. Zur Emulsion wurde eine Mischung aus 20 proz. Essigsäure und 10 proz. HCl im Verhältnis 35:65 "bis zu einer Azidität von 1,2 η zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde bei 80 ⁰C 40 Minuten" lang erhitzt und nach dem Abkühlen mit 3000 Umdrehungen/Min. 20 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende Phase au sammeln. Die gesammelte überstehende Phase wurde im Autoklaven bei 110 ⁰C 20 Minuten lang be-*· handölt, nachdem der pH-Wert auf 7 mit 1 η NaOH eingestellt worden war; nach dem Abkühlen wurde mit 10 000 Umdrehungen/Min. 30 Minuten lang zur Entfernung unlöslichen Materials zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde auf 1/20 des Volumens im Vakuum konzentriert und einer Dialyse in einem Zelluloserohr (Vleking Co.) gegen 3-fach destilliertes Wasser des 10-fachen Volumens des Konzentrats unterworfen. Die Dialyse wurde zweimal v/iederholt und das dialysierte flüssige Medium wurde gesammelt. Das dialysierte flüssige Medium wurde auf 1/200 des Volumens im Vakuum konzentriert und einer Chromatographie in einer Säule (2,5 x 90 cm) mit Sephadex G-25 unterworfen, wobei die Säule mit einer verdünnten (1:100) Phosphatpuffer-Salzlösung, die kein Calcium und LIagnesium enthielt, in einer Rate von 7 ml/12 Min. eluiert wurde. Die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,80 wurde gesammelt. Die Fraktion wurde lyophilisiert und lieferte etwa 450 mg D-Faktor als lichtgelbes Pulver.

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	- 27 - ·., ■ . Tabelle 7	. Anzahl koinpak- " ter Kolonien	•	■	Mittel	0 0 1 1 0
		52 37 47 43 45	- Anzahl aufge lockerter Kolonien -		0,4
kation ~_1;>		Mittel 44,8		Mittel	2 I6 . 8 6 4
Vergleichs- versuch		23 27 28 24 33	Mittel		7,2
	entra- Anzahl der Kolonien	Mittel 27,0	1 3 0 2 0
Versuch (L-Faktor- halti^es 0, Medium)		0 0 2 1 1	1,2
	52 .57 0 40 ' 44 • 45*	0 Mittel 0,8
Versuch (D-Paktor- haltiges Medium) 2,	Mittel 49,2
	25 43 5mg/ml 36 30 37
	Mittel 34,2
' 1 3. 0mg/ml 2 3 1
Mittel 2,

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Beispiel 10

Es wurden 300 g Plazenta des Menschen mit einer reichlichen Menge mehrmals destillierten V/assers gewaschen, in Stücke zerkleinert, mit 400 ml einer verdünnten (1:100) Salzlösung versetzt und zu einer Emulsion vermählen. Zur Emulsion wurde eine Mischung aus 20 proz. Essigsäure und 15 proz. Salzsäure im Verhältnis 50:50 bis zu einer Azidität von 1 η zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde bei 75 ⁰C 60 Minuten lang erhitzt und nach dem Abkühlen mit 3000 Umdrehungen/ivlin, 20 Minuten lang zum Sammeln der überstehenden Phase zentrifugiert. Die gesammelte überstehende Phase wurde im Autoklaven bei 120 ⁰C 10 Minuten lang behandelt und nach dem Abkühlen bei 5000 Umdrehungen/Min. 30 Minuten lang zur Entfernung unlöslichen Materials zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde auf 1/10 des Volumens im Vakuum konzentriert und einer Filtration unter reduziertem Druck mit einem Sartorius-Ivlembranfilter (Sartrious GmbH) zum Sammeln des Filtrats unterworfen. Das FiItrat wurde, nachdem es auf 1/10 des Volumens im Vakuum konzentriert worden war, einer Chromatographie mit einer Säule (2,5 x 40 cm) mit Sephadex G-15 unterworfen, wobei die Säule mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 9 mit einer Rate von 5 ml je 10 Minuten eluiert v/urde. Die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,24 wurde gesammelt. Sie wurde lyophilisiert und lieferte etwa 300 mg D-Faktor in Form eines lichtgelben Pulvers.

Beispiel 11

Es wurden 500 £ gefrorene Rinderplazenta aufgetaut, mit einer ausreichenden ..ienge mehrfach destillierten T/assers gewaschen, zu Stücken zerkleinert und mit 500 ml mehrfach destilliertem Wasser zu einer Emulsion zermahlen. Zu der E.nulcion v/urde eine .lischung aus 25 proz. Essigsäure und 15 proz. salzsäure im Verhältnis 70:30 bis zu einer Azidität von

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1,2 η zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde bei 80 ⁰C 40 Minuten lang erhitzt und nach dem Abkühlen mit 3000 Umdrehungen/Min. 30 Minuten lang zum Sammeln der überstehenden Phase zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde nach einer lieutralisation mit 2 η NaOH bis zum pH 6,5 in einem Autoklaven bei .110 ⁰C 15 Minuten lang zur Entfernung unlöslichen Materials behandelt. Die überstehende Phase wurde, nachdem sie auf 1/20 des Volumens im Vakuum konzentriert worden war, durch ein Holofibre 50-FiIter (Dow Chemical Co.) zum Sammeln des Piltrats filtriert. Das Filtrat wurde, nachdem es auf 1/10 des Volumens im Vakuum konzentriert v/orden war, einer Chromatographie mit einer Säule (2,5 x 40 cm) mit Sephadex G-10 unterworfen, wobei die Säule mit dem gleichen Puffer wie in r* Beispiel 9-mit einer Rate von 4,5' ml je 10 Minuten eluiert wurde. Die Fraktion mit einemVerteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,25 wurde gesammelt und lyophilisiert, wobei etwa 500 mg D-Faktor in Form eines lichtgelben Pulvers erhalten wurden.

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Claims

2UU54

- 30 Patentansprüche

^J Verfahren zur Herstellung eines Heilmittels für Leukämie, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufen

(A) Plazenta mit Wasser oder verdünnter physiologischer Salzlösung mahlt, eine Emulsion herstellt und eine Mischung aus wässeriger Essigsäure und Salzsäure zur Emulsion zugibt und bis 'zu einer Azidität von 0,5 bis 2,0 η ansäuert,

(B) die angesäuerte Emulsion erhitzt,

(C) nach-dem Abkühlen unlösliches Protein durch Zentrifugieren entfernt und danach nach einer Neutralisation mit einer alkalischen Lösung die Emulsion zentrifugiert und unlösliches Material entfernt und eine klare überstehende Phase sammelt,

(D) die überstehende Phase konzentriert und das resultierende konzentrierte flüssige Medium durch eine Dialysemembran dialysiert oder durch ein Membranfilter filtriert und ein dialysiertes flüssiges Medium oder FiItrat erhält,

(E) das dialysierte flüssige Medium bzw. das IPiltrat nach einem Konzentrieren einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex unterwirft und Fraktionen mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,82 mit Sephadex

' G-25, 0,35 bis 1,24 mit Sephadex G-15 bzw. 0,35 bis 1,25

mit Sephadex G-10 erhält und
(P) die Fraktionen lyophilisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mischung zum Ansäuern der Emulsion eine Mischung aus 10-bis 30prozentiger Essigsäure und 10-bis 20prozentiger Salzsäure im Verhältnis von 25:75 bis 75:25 zugibt.

3· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch .gekennzeichnet, daß man bei 75 bis 90 C 30 bis 60 Minuten ' lang erhitzt.

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