DE2642855A1 - Differentielle bestimmung von creatin-phosphokinase-isoenzymen - Google Patents
Differentielle bestimmung von creatin-phosphokinase-isoenzymenInfo
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Description
"Differentielle Bestimmung von Creatin-Phosphokinase-Isoenzymen"
■Priorität: 26. September 1975, V.St.A., Nr. 616 933
Die Erfindung "betrifft ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung
der Konzentration der Creatin-Phosphokinase-Isoenzyme
im Serum und insbesondere des Isoenzyms, das bei der Diagnose von Myokardinfarkten von besonderer Bedeutung ist.
In der klinischen Praxis spielt die Aktivitätsbestimmung von verschiedenen Serumenzymen für Diagnose und Therapie eine große
Rolle. Eine Zusammenfassung darüber findet sich in "Geigy, Wissenschaftliche
Tabellen", 7. Auflage, Basel 1970, S. 580-596 und in
R. Richterich, "Clinical Chemistry", Basel und New York 1969-
7098i5/i04l
Die Bestimmung der Creatin-Phosphokinase spielt bei der Diagnose
von Herz- und Muskelleiden eine wichtige Rolle. Es sind
eine Reihe von entsprechenden Bestimmungsverfahren bekannt. Derartige Verfahren sind teilweise in den genannten "Wissenschaftlichen
Tabellen" und auf den Seiten 310-313 des genannten
Buchs von Richterich abgehandelt. In den letzten Jahren wurde erkannt, daß die Cxeatin-Phosphokinase (CPK) in~Form von mindestens
drei Isoenzymen vorkommt. Diese Isoenzyme werden als CPK-MM, CPK-MB und CPK-BB bezeichnet. Eine Zusammenfassung darüber
findet sich im Artikel von Roberts und Mitarb., in "The American Journal of Cardiology", Bd. 33 (1974), S.650-654 und
im Artikel von Roe und Mitarb. "Journal of Laboratory and
Clinical Medicine", Bd.80 (1972), S.577-590.
Aus der neueren Literatur, vgl." beispielsweise Roberts und Mitarb.,
a.a.O., geht hervor, daß die undifferenzierte CPK-Aktivität im Serum keine definitive Aussage über Myokardschäden zuläßt,
sondern daß es vielmehr notwendig ist, die CPK-MB-Konzentration
zu bestimmen.
Die Standardverfahren zur Bestimmung von CPK, die beispielsweise in den vorgenannten "Wissenschaftlichen Tabellen" und im
Buch von Richterich genannt sind, erlauben keine Differenzierung der einzelnen Isoenzyme. Diese Verfahren ergeben jeweils einen
Wert für "CPK", der in Wirklichkeit beispielsweise den Wert für CPK-MM allein oder in verschiedenen Kombinationen mit den anderen
beiden Enzymen wiedergibt. Zur Bestimmung von CPK-MB selbst mußte man sich bisher relativ komplizierter und zeitraubender Verfahren
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bedienen. Beispielsweise werden gemäß Roberts und Mitarb., a.a.O.
die Isoenzyme durch Celluloseacetat-Elektrophorese aufgetrennt.
Die von den verschiedenen Teilen der Celluloseacetatstreifen
gewonnenen Isoenzyme werden anschließend nach einem Fluoreszenzverfahren
bestimmt. Gemäß Roe und Mitarb., a.a.O. wird ein ähnliches Verfahren vorgeschlagen, bei dem zunächst eine Agargel-Elektrophorese
und anschließend eine fluorimetrische Bestimmung durchgeführt wird.
sAufgabe der Erfindung ist es, ein rasches, einfaches und direktes
Verfahren zur Bestimmung von CPK-MB im Serum zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß wird die Konzentration des CPK-MB-Isoenzyms in
einer zu untersuchenden Flüssigkeit, wie Serum, festgestellt,
indem man zunächst die CPK-Aktivität bestimmt, wobei die CPK vor der AktivitätsbeStimmung durch Zusatz eines aktivierenden, nicht
zur Gruppe von 1,4-Dimercapto-2,3-dihydroxybutan und Mercaptο-äthanol
gehörenden Thiols zur. Flüssigkeit aktiviert worden ist, und anschließend eine ähnliche Bestimmung durchführt, bei der
vor der Bestimmung der CPK-Aktivität ein CPK-MB-Aktivator aus
und Mercaptοäthanol
der Gruppe 1,4—Dimercapto-2,3-dihydroxybutan/bzw. deren Gemische
zugesetzt wird. In der ersten Stufe ist das CPK-MM-Isoenzym für
den erhaltenen Aktivitätswert verantwortlich, während in der zweiten Stufe sowohl die CPK-MM- und CPK-MB-Isoenzyme einen
Beitrag zum erhaltenen Aktivitätswert leisten. Demgemäß stellt die arithmetische Differenz der erhaltenen Aktivitätswerte ein
direktes Maß für die gesuchte CPK-MB-Konzentration dar.
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Der zwischen der ersten und der zweiten Stufe beobachtete
Aktivitätsanstieg' ist auf das CPK-MB-Isoenzym zurückzuführen
und liefert somit den gesuchten Wert.
Die AktivitätsbeStimmung in beiden Stufen besteht darin, die
enzymati sehe Aktivität von CPK bei der Katalyse der ATP/ADP-Umwandlung
festzustellen.
Bekanntlich wird die wichtige biochemische Reaktion der folgenden Gleichung
Creatin + ATP -^- Creatinphosphat + ADP (I)
reversibel durch CPK in der Weise katalysiert, daß die Vorwärtsreaktion,
bei der ATP in ADP umgewandelt wird, beim pH-Wert 9 begünstigt ist, während die Rückreaktion bei der ADP zu ATP umgewandelt
wird, beim pH-Wert 7 bevorzugt ist. Die Reaktion von rechts nach links, d.h. die Rückreaktion,verlauft etwa zehnmal
schneller als die Vorwärtsreaktion, so daß die erstgenannte Reaktion im allgemeinen bevorzugt wird und weitgehend Anwendung
findet. Die Erfindung läßt sich gedoch auf beide Teilreaktionen
und somit auf die verschiedenen in der Literatur beschriebenen (viele davon sind bei Riehterich a.a.O. angeführt) anwenden.
Nähere Angaben über bevorzugte Bestimmungsverfahren-finden sich
nachstehend.
CPK wird bereits bei relativ kurzzeitiger Lagerung von Serum oder Plasma inaktiviert. Es ist deshalb eine allgemein anerkannte
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PraxiSjbei der CPK-BeStimmung CPK durch Zusatz eines Thiols
zu reaktivieren. Dazu eignen sich beliebige der nachstehend . angeführten Thiole.
Eine erste Gruppe von derartigen Aktivatoren besteht aus Cystein, Glutathion, Mercaptoessigsäure, Thiodiglykolsäure, 2-Aminoäthylisothiouroniumbromid
und dergl. Erfindungsgemäß wird Glutathion bevorzugt.
Eine zweite Gruppe von Aktivatoren umfaßt die drei Isomeren von
1,4-Dimercapto-2,3-dihydroxybutan und 2-Mercaptoäthanol. Die
letztgenannte Verbindung wird im allgemeinen einfach als Mercaptoäthanol
bezeichnet. Von der erstgenannten Verbindung existieren wie bei der Weinsäure, drei opti.sche Isomere. Die beiden
handelsüblichen Isomeren werden·· auch als Dithiothreit und Di-thioerythrit
bezeichnet. Davon ist das erstere auch als "Clelands Reagenz" bekannt, während das letztere gelegentlich als "Cleland's
Other Reagent" bezeichnet wird. Erfindungsgemäß wird Dithiothreit (Abkürzung DTT) bevorzugt. Dithioerythrit wird mit DTE abgekürzt.
Die Aktivatoren der vorgenannten zweiten Gruppe sind als CPK-Aktivatoren
bekannt. Es ist jedoch nicht bekannt, daß diese Verbindungen auch spezifische CPK-MB-Aktivatoren sind und somit im
erfindungsgemäßen different!eilen .Bestimmungsverfahren eingesetzt
werden können. Beispiele für Literatursteilen, die die
Verwendung dieser Verbindungen als CPK-Aktivatoren beschreiben sind:
?0981 5/1Ö4S
Kontinen und Mitarb., Clin.Chim.Acta, Bd. 40 (1972), S. 133;
Miyada und Mitarb., Clin.Chim. Acta, Bd. 58 (1975), S. 97-99; Bishop und Mitarb., Clinical Chem., Bd. 17 (1971), S. 548-550;
Dalal und Mitarb., Clinical Chem., Bd. 18 (1972), S.330-334; und
Warren, Clinical Chem., Bd. 18 (1972), S.473-475.
Es wird angenommen, daß eine charakteristische Eigenschaft der
CPK-MB-Thiolaktivatoren der vorgenannten zweiten Gruppe eine wichtige Rolle für ihre Wirksamkeit spielt, nämlich der stark
„negative Wert des Qxidations-Reduktionspotentials. Dieses Redoxpotential
liegt unter -0,31 V. Im folgenden sind die Redoxpotential e einiger dieser Verbindungen angegeben:
| Aktxvator | Redoxpotential, V | Gruppe |
| Thiodiglykolsäure | -0,14 | 1. |
| Cystein | -0,21 | 1. |
| Glutathion | -0,25 | 1. |
| Mercaptoessigsaure | -0,30 | 1. |
| 2-Mercaptoäthanol | -0,32 | 2. |
| DTE | -0,33 | 2. |
| DTT | -0,33 | 2. |
Ferner wurde festgestellt, daß die als CPK-MB-Aktivatoren
wirkenden Thiole, d.h. die Verbindungen der vorstehend genannten zweiten Gruppe, nicht nur ein Redoxpotential unter -0,31 V aufweisen,
sondern auch vicinale Hydroxythiole sind, die also die Mercapto-und Hydroxygruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen
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-t-a
aufweisen. ■
Nachstehend wird die Erfindung anhand eines Beispiels erläutert. Eine wäßrige Lösung der folgenden Zusammensetzung wird
hergestellt:
Adenosinmonophosphat (AMP) 9,1 x 10~* m
_p Creatinphosphat 1,8 χ 10 m
Adenosindipho sphat (ADP) 1,1 χ 10"^ m
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 333 IU*/Liter
(G-6-PDH)
Hexokinase (HK) 1000 IU/Liter
.Glucose 1,4-5 χ 10~2 m
Piperazin-N,N'-bis-(2-äthansulfonsäure), 5 x 10" m
Natriumsalζ
Glutathion 8,7 χ 10"^ m
Nicotinamid-adei
phosphat (NADP)
phosphat (NADP)
_ Μ Nicotinamid-adenin-dinucleotid- 3^ s. Λ0 m
Der pH-Wert der Lösung beträgt 6,8.
* IU bedeutet internationale Einheiten.
Dieses Verfahren stellt nur eine Ausführungsform iron "vielen
möglichen dar und beruht auf der·eingangs erwähnten Reaktionsgleichung
/1/, die von rechts nach links abläuft. Die Bestimmung verläuft somi-fc nach folgenden Reaktionsgleichungen:
ATP + Glucose G-6-P + ADP /27
70981 5/1ÖU
G-6-P + NADP jfADPH + 6-Phosphogluconat /37
Das gebildete KADPH (reduziertes HADP) absorbiert bei 340 nm
lind wird somit zweckmäßigerweise zur Messung der CPK-Aktivität
in der Probe herangezogen. Die Verwendbarkeit der NADP-HADPH-Reaktion
wird allgemein im Buch von Richterich a.a.O. erläutert. Dieses Verfahren wird von Eao und Mitarb., Clinical
Research, Bd. 22 (1974), S. 68? A und Bd. 23, (1975), S. 203 A
beschrieben. Es stellt eine Modifiaktion des Verfahrens von Rosalki dar; vgl. Proc. Assoc. Clin. Bi ο ehem., Bd. 4- (1966), S.
und J. Lab. Clin. Med., Bd. 69 (1967).
Aus der vorstehenden Beschreibung geht hervor, daß die vorgelegte Testlösung einen CPK-Aktivator der ersten Gruppe, nämlich
Glutathion, enthält. Demgemäß dient diese Testlösung beim Vermischen mit Serum im wesentlichen zur Messung der CPK-MM-Konzentration.
Dies wird durchgeführt, indem man'3,0 ml Testlösung
auf vorzugsweise 300C (die Reaktion läuft aber auch im Temperaturbereich
von 22 bis 37°C gut ab) bringt, 50^1 Serum oder
eine andere zu bestimmende Flüssigkeit zusetzt, die Absorption so lange aufzeichnet, bis die Reaktion linear wird (im allgemeinen
etwa 5 Minuten) und den Ausdruck A A/min (Δ A-), wobei
bestimmt. c
A die Absorption bedeutet,/Zur Ermittlung von Umrechnungsfaktoren,
die zu einer Umrechnung der abgelesenen Werte zu absoluten Werten benötigt weTden, können ETormalseren verwendet werden, wie
dem Fachmann geläufig ist; vgl. auch Eao und Mitarb, und Rosalki, a.a.O. In'diesem speziellen Beispiel ergibt sich bei einem
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Lichtweg von 1 cm und 3O0C der Wert für CPK in IU/ml aus dem
.Ausdruck Λ Α.. χ 9800.
Dieses gesamte Vorgehen wird nach Zusatz eines Aktivators der zweiten Gruppe, nämlich 1,4-Dimercapto-2,3-dihydiOxybutan oder
Mercaptoäthanol bzw. eines Gemisches dieser Verbindungen zum
Serum wiederholt. Dabei geht man wie bei der vorstehend erläuterten CPK-MM-BeStimmung vor. Die Anwesenheit eines Aktivators
der ersten Gruppe, wie Glutathion in diesem speziellen Beispiel, behindert das Verfahren nicht, so daß die gleiche
Testlösung eingesetzt werden kann-und keine getrennte Testlösung
..ohne einen Gehalt an Glutathion oder einer entsprechenden Verbindung
hergestellt werden muß. Der anschließend ermittelte CPK-Vert schließt die MM- und MB-Isoenzyme ein, so daß sich der CPK-MB-Vert
.erfindungsgemäß ergibt, indem man den ohne Zusatz eines
Aktivators der zweiten Gruppe ermittelten Wert' von dem Vert abzieht,
der bei Zusatz eines derartigen Aktivators erhalten worden ist.
Es wurde festgestellt, daß zur Erreichung zuverlässiger Ergebnisse
der Aktivator der zweiten Gruppe mit dem Serum vorgemischt werden sollte. Es sollte mindestens ein Zeitraum von
1 oder 2 Minuten verstreichen, bevor der Rest der Bestimmung vorgenommen wird. Eine derartige Vormischung ist zur CPK-MM-•
Bestimmung, bei der ein Aktivator der ersten Gruppe eingesetzt wird, nicht erforderlich. Im letztgenannten Fall kann der Aktivator
gegebenenfalls vorher zugemischt oder einfach der Test-
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lösung zugesetzt werden. Wesentlich ist nur, daß dieser Aktivator vorhanden ist.
Beim speziellen Ausführungsbeispiel wird anschließend 1 ml
des Serums mit 10 ^l einer 1 m wäßrigen DTT-Lösung versetzt
und durch vorsichtiges Kippen vermischt. 50 ^l des so behandelten
Serums werden anschließend zur bereits erläuterten CPK-BeStimmung verwendet. Die gemäß diesen Verfahrensschritten
erhaltenen Werte werden einfach voneinander subtrahiert. Die Differenz ergibt die CPK-MB-Konzentration.
Wie bereits erwähnt, läßt sich die Erfindung ganz allgemein anwenden, sofern die ATP/ADP-Umwandlung in Gegenwart von Creatin
in einer der beiden Eichtungen beteiligt ist. Beispielsweise kann gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel das Thiol der zweiten
Gruppe in dem Verfahren gemäß Wiesmann und Mitarb., Enzymologica biologica et clinica, Bd. 7 (1966), S.266, eingesetzt werden.
Gemäß diesem Verfahren von Wiesmann und Mitarb, läuft die Reaktion
der Gleichung /Ϊ/ von links nach rechts ab. Als Aktivator
der ersten Gruppe wird Cystein verwendet. Ferner wird ein anderes Enzymsystem eingesetzt, das zu einer Dehydrierung von
KADPH führt, so daß die bei 366 nm gemessene Absorption abnimmt.
Gemäß diesem zweiten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird das Verfahren der vorgenannten Literaturstelle durchgeführt. Zunächst wird wie angegeben Cystein verwendet.
Anschließend wird das Serum mit einem Aktivator der zweiten
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Gruppe, wie Mercaptoäthanol, DTE oder DTT, vorbehandelt. Dieser
Aktivator wird in der im ersten Ausführungsbeispiel angegebenen
Konzentration angewendet. ..Dl,e^iiii£,er.gnz der beiden CPK-Werte
entspricht der CEK-MB-Konzenti-ßäfeicKa d^er Serumprobe.
Die relativen Verhältnisse von Serum und Aktivator der zweiten Gruppe können stark variieren. Es können die in der Literatur
für Thiolaktivatoren allgemein angegebenen Konzentrationen zur Anwendung kommen. Vorzugsweise beträgt die Konzentration des
. Thiolaktivators im Serum 0,002 bis 0,05 2^ und insbesondere 0,01 m,
wie sich aus den vorstehenden Beispielen ergibt. Unter einer Konzentration von 0,01 m sind 0,01 Grammol pro Liter zu ver-
• stehen.
^09815/1043
ORIGINAL INSPECTED
Claims (3)
1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von CPK-MB-Isoenzym.
(Creatin-Phosphokinase-MB-I so enzym) in einer zu untersuchenden Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet,
daß man
zunächst die CPK-Aktivität in der Flüssigkeit unter Anwendung der ATP/ADP-Umwandlung bestimmt, wobei die CPK durch Einverleibung
eines aktivierenden, nicht zur Gruppe von 1,4—Dimercapto-2,3-dihydroxybutan
und Mercaptoäthanol gehörenden Thiols in die zu bestimmende Flüssigkeit im Verlauf der Aktivitätsbestimmung aktiviert wird,
getrennt davon nach Zusatz eines CPK-MB-Aktivators aus der
Gruppe 1,4-Dimercapto-2,3-dihydroxybutan und-Mercaptoäthanol
bzw. deren Gemische zu der genannten Flüssigkeit eine entsprechende
Aktivitätsbestimmung durchführt und die CPK-MB-Konzentration als arithmetische Differenz der beiden
Bestimmungsstufen ermittelt*
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als CPK-MB-Aktivator das DTT-Isomere
von 1 ^-Dimercapto-^^-dihydroxybutan verwendet.
3. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von CPK-MB-Isoenzym
in einer zu untersuchenden Flüssigkeit, dadurch
gekennz eichnet, daß man
709815/1043
ORIGINAL INSPECTED
-ar- *
zunächst die CPK-Aktivität in dieser Flüssigkeit unter Anwendung
der ATP/ADP-Umwandlung in Gegenwart von Creatin "bestimmt, wobei
die CPK durch. Einverleibung eines ersten aktivierenden Thiols mit einem Redoxpotential von mehr als -0,37I V in die zu untersuchende
Flüssigkeit im Verlauf der AktivitätsbeStimmung aktiviert
wird,
getrennt davon nach Zusatz eines zweiten aktivierenden Thiols mit einem Redoxpotential von weniger als -0,31 V zu dieser
Flüssigkeit eine entsprechende AktivitätsbeStimmung durchführt
die CPK-MB-Konzentration als arithmetische Differenz der gemäß
den beiden Verfahrens stuf en erhaltenen Aktivitäten ermittelt.
4-. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man als zweites Thiol ein vicinales Hydroxythiol verwendet.
5- Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch g e kennz
eichnet, daß man als Flüssigkeit Serum verwendet
7 0 ü 815/1043
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