DE69917403T2

DE69917403T2 - Glukose-sensor

Info

Publication number: DE69917403T2
Application number: DE69917403T
Authority: DE
Inventors: Keiko Nara-shi Yugawa; Toshihiko Hirakata-shi Yoshioka; Shiro Hirakata-shi Nankai; Junko Onsen-gun Iwata; Shoji Matsuyama-shi Miyazaki; Hideyuki Matsuyama-shi Baba; Seiji Tsuruga-shi Takeshima
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Toyobo Co Ltd
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2004-10-28
Also published as: DE69917403T8; JP2000171428A; CN1116604C; CN1250161A; EP0992589A2; DE69917403D1; JP3694424B2; EP0992589B1; EP0992589A3; US6773564B1

Description

Erfindungsbereich
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Glucose-Sensor, welcher die schnelle und vereinfachte Analyse einer bestimmten, in einer Probe enthaltenen Verbindung mit hoher Genauigkeit ermöglicht. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Stabilisierung von Glucose-Dehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolochinolinchinon ist, und eine Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung, welche durch die Stabilisierungsmethode erhalten wurde.
Stand der Technik
Herkömmlicherweise wurden eine breite Palette an Biosensoren als Systeme vorgeschlagen, welche die einfache Quantifizierung einer bestimmten, in einer Probenlösung enthaltenen Verbindung ermöglichen, ohne Verdünnung oder Bewegen der Probenlösung zu erfordern. Es folgt ein bekanntes Beispiel für einen derartigen Biosensor (offengelegte japanische Patentveröffentlichung Hei 2-062 952).
Der hier nach dem Stand der Technik beschriebene Biosensor wird hergestellt, in dem unter Verwendung bekannter Siebdruckverfahren oder dergleichen ein Elektrodensystem einschließlich einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode auf einer elektrisch isolierten Trägerplatte gebildet wird und anschließend direkt auf diesem Elektrodensystem eine Enzymreaktionsschicht, welche ein hydrophiles Polymer, eine Oxidoreduktase und einen Elektronenakzeptor enthält, gebildet wird.
Bei der tropfenweisen Zugabe einer das Substrat enthaltenen Probenlösung auf die Enzymreaktionsschicht des so hergestellten Biosensors löst sich die Enzymreaktionsschicht in der Probenlösung und das Substrat in der Probenlösung wird durch das Enzym oxidiert. Gleichzeitig wird der Elektronenakzeptor reduziert. Nachdem die Enzymreaktion abgeschlossen ist, wird der reduzierte Elektronenakzeptor elektrochemisch reoxidiert. Die Konzentration an Substrat in der Probenlösung kann basierend auf dem Oxidationsstrom, welcher durch die Reoxidationsreaktion entsteht, bestimmt werden.
Im Prinzip ermöglicht der oben beschriebene Biosensor die Messung verschiedener Materialien, sofern ein geeignetes Enzym gewählt wird, welches mit dem Substrat des Analyten korrespondiert.
Wenn zum Beispiel eine Glucose-Oxidase als Enzym gewählt wird, kann ein Glucose-Sensor zur Messung der Glucosekonzentration in einer Probenlösung erhalten werden.
Der Biosensor mit der oben beschriebenen Struktur nimmt das Enzym normalerweise in trockenem Zustand auf. Das Enzym ist jedoch zersetzungsempfindlich, wenn es an Luft langer Zeit Wasser ausgesetzt wird, da es im Wesentlichen aus Proteinen zusammengesetzt ist, welche leicht abgebaut werden. In Extremfällen ist das Enzym der Gefahr ausgesetzt, die Enzymaktivität zu verlieren.
Daher kann die Langzeitaufbewahrung von Sensoren nach ihrer Herstellung in einem Verlust an Enzymaktivität und einer Verarmung an zur Reaktion mit dem Substrat notwendigem Enzym führen. Dies kann zu einem nicht kommensurablen Sensoransprechstrom bezogen auf die Substratkonzentration führen.
Im Allgemeinen kann die Einführung einer Probenlösung mit 0% Substrat ein gewisses Maß an Sensoransprechstrom erzeugen (im Folgenden als „Nullwert" bezeichnet). Ein Grund für einen derartigen Nullwert kann die Induktion einer Elektrodenreaktion aufgrund einer Akkumulierung von in der Probenlösung enthaltenen Ionen sein, welche die Reaktionsschicht auf der Oberfläche des auf der Trägerplatte gebildeten Elektrodensystems lösen. Ein großer Nullwert kann als Grund für die Verschlechterung der Korrelation zwischen Ansprechstrom und Substratkonzentration dienen, was eine präzise quantitative Analyse des Substrats unmöglich macht.
Daher ist die Aufrechterhaltung einer Umgebung, in welcher das Enzym seine Enzymaktivität über lange Zeit in der Nachbarschaft des Enzyms beibehalten kann, der Schlüssel zu einer Versorgung mit einem Biosensor, der ausgezeichnete Lagerungsstabilität aufweist und einen niedrigen Nullwert erzeugt. Es ist auch wichtig, eine Umgebung rund um die Oberfläche des Elektrodensystems auf der Trägerplatte aufrechtzuerhalten, welche einen minimalen und vernachlässigbaren Nullwert erzeugt. Es ist ebenfalls notwendig, eine glatte Übertragung von sowohl Elektronen wie auch Substrat während der Enzymreaktion zu verwirklichen, um eine Sensorantwort zu fördern.
Eine herkömmliche Gegenmaßnahme zur Lösung der oben genannten Probleme besteht im Zusatz eines Additivs wie Phosphorsäure in die Reaktionsschicht.
Um einen Glucose-Hochleistungssensor herzustellen, wurde andererseits herkömmlicherweise Glucose-Dehydrogenase verwendet, deren Coenzym Pyrrolochinolinchinon ist (im Folgenden mit „PQQ-GDH" abgekürzt). Wenn PQQ-GDH als Enzym verwendet wurde, hat der resultierende Glucose-Sensor inhärent die Eigenschaft, vollständig frei von jedwedem gegensätzlichem Einfluss durch den im Blut gelöste Sauerstoff oder dergleichen auf die Enzymreaktion zu sein, da Sauerstoff keine Rolle bei der katalytischen Wirkung von PQQ-GDH spielt. Daher sind von derartigen Glucose-Sensoren erhaltene Messwerte auch frei von Veränderungen aufgrund des Sauerstoffpartialdrucks in der Probenlösung. Das bedeutet, dass die Verwendung von PQQ-GDH als Enzym einen Hochleistungssensor ergibt.
Die Verwendung von PQQ-GDH als Enzym hat jedoch den Nachteil, dass auch der Zusatz eines Additivs in der Reaktionsschicht wie Phosphorsäure dem resultierenden Biosensor nicht zu einem ausreichenden Absinken des Nullwertes und zu einer ausreichend hohen Lagerungsstabilität verhilft.
Darstellung der Erfindung
In Anbetracht der oben genannten Probleme, ist es eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Glucose-Hochleistungssensor mit hoher Lagerungsstabilität und niedrigem Nullwert bereitzustellen. Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind die Bereitstellung eines Verfahrens zur Stabilisierung von PQQ-GDH und eine Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung, welche durch dieses Verfahren zur Stabilisierung erhalten wird.
Der erfindungsgemäße Glucose-Sensor umfasst eine elektrisch isolierende Trägerplatte, ein Elektrodensystem, welches mindestens eine auf der Trägerplatte gebildete Arbeitselektrode und Gegenelektrode umfasst, sowie eine Reaktionsschicht, welche in Kontakt mit oder in der Nähe des genannten Elektrodensystems gebildet wird und mindestens PQQ-GDH enthält, wobei die Reaktionsschicht weiterhin mindestens ein Additiv enthält, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phthalsäure, einem Phthalat, Maleinsäure, einem Maleat, Bernsteinsäure, einem Succinat, Triethanolamin, einem Triethanolaminsalz, Zitronensäure, einem Citrat, Dimethylglutarsäure, 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, einem 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäuresalz, Tris-(hydroxymethyl)-glycin, einem Tris-(hydroxymethyl)-glycinsalz, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, einem Tris-(hydroxymethyl)-methylaminsalz und Imidazol.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Enzym mit dem Additiv beschichtet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Stabilisierung von Glucose-Dehydrogenase zur Verwendung in Glucose-Sensoren, wobei mindestens ein Additiv zur PQQ-GDH gegeben wird, wobei das Additiv ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phthalsäure, einem Phthalat, Maleinsäure, einem Maleat, Bernsteinsäure, einem Succinat, Triethanolamin, einem Triethanolaminsalz, Zitronensäure, einem Citrat, Dimethylglutarsäure, 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, einem 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäuresalz, Tris-(hydroxymethyl)-glycin, einem Tris-(hydroxymethyl)-glycinsalz, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, einem Tris-(hydroxymethyl)-methylaminsalz und Imidazol.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung zur Verwendung in Glucose-Sensoren, wobei die Zusammensetzung PQQ-GDH und mindestens ein Additiv enthält, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phthalsäure, einem Phthalat, Maleinsäure, einem Maleat, Bernsteinsäure, einem Succinat, Triethanolamin, einem Triethanolaminsalz, Zitronensäure, einem Citrat, Dimethylglutarsäure, 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, einem 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäuresalz, Tris-(hydroxymethyl)-glycin, einem Tris-(hydroxymethyl)-glycinsalz, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, einem Tris-(hydroxymethyl)-methylaminsalz und Imidazol.
Während die neuen Merkmale der Erfindung insbesondere in den angehängten Ansprüchen dargelegt werden, wird die Erfindung, sowohl was ihren Aufbau wie auch ihren Inhalt angeht, zusammen mit anderen ihrer Gegenstände und Merkmale besser aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenhang mit den Abbildungen verstanden und geschätzt werden.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Aufsichten der Zeichnung
1 ist eine schematische den Glucose-Sensor abbildende Draufsicht gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung, bei der die Reaktionsschicht weggelassen wurde.
2 ist eine Längsschnittdarstellung, welche die wesentlichen Teile des in 1 gezeigten Glucose-Sensors abbildet.
3 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
4 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
5 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
6 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
7 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 6 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
8 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 7 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
9 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 8 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
10 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 9 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
11 zeigt die Ansprechcharakteristik eines Glucose-Sensors gemäß Beispiel 10 der vorliegenden Erfindung und eines Glucose-Sensors gemäß Vergleichsbeispiel 1.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie oben aufgeführt, enthält der endungsgemäße Glucose-Sensor weiterhin ein Additiv wie Phthalsäure in der Reaktionsschicht, welche PQQ-GDH als Enzym enthält.
Wird die Reaktionsschicht mittels Auftropfen und Trocknen einer wässrigen Lösungsmischung aus PQQ-GDH mit dem Additiv wie, zum Beispiel, Kaliumhydrogenphthalat gebildet, so wird die Oberfläche des PQQ-GDH-Enzyms mit dem Additiv Kaliumhydrogenphthalat beschichtet. Eine derartige Beschichtung schützt das Enzym vor jedweden Veränderungen der Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Feuchtigkeit oder elektrische Ladung. Auf diese Weise kann das Enzym über lange Zeit eine stabile Enzymaktivität aufrechterhalten.
Weiterhin wird das Additiv bei der Einführung einer Probenlösung in den Sensor in der Probenlösung gelöst und ionisiert. Das ionisierte Additiv beeinflusst seinerseits vorher in der Probenlösung existierende Ionen und die bei der Lösung der Reaktionsschicht in der Probenlösung gebildeten Ionen. Auf diese Weise können diese Ionen nicht auf der Oberfläche des Elektrodensystems auf der Trägerplatte verbleiben, was zu einer Minimierung des Nullwertes beiträgt.
Die Gegenwart derartiger Additive in der Reaktionsschicht ist auch technisch vorteilhaft, insofern sie die Lösung der Reaktionsschicht in Wasser fördern, welche die direkte Auflösung der Reaktionsschicht in der Probenlösung bei der Zugabe der Probenlösung zu der Reaktionsschicht erleichtert, und so einen glatten Verlauf sowohl der Enzymreaktion wie auch der Elektrodenreaktion ermöglichen.
Das Additiv, welches die oben genannten Wirkungen aufweist, kann zum Beispiel Phthalsäure, ein Phthalat wie Kaliumhydrogenphthalat Maleinsäure, ein Maleat wie Natriummaleat, Bernsteinsäure, ein Succinat wie Natriumsuccinat, Triethanolamin, ein Triethanolaminsalz wie Triethanolamin-Hydrochlorid, Zitronensäure, ein Citrat wie Monokaliumcitrat, Calciumcitrat, Trikaliumcitrat, Trinatriumcitrat, Trilithiumcitrat, Diammoniumhydrogencitrat, Dinatriumhydrogencitrat, Natriumcitrat, Diammoniumcitrat, Kaliumdihydrogencitrat, Natriumdihydrogencitrat, Dinatriumcitrat oder Magnesiumcitrat, Dimethylglutarsäure, 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, ein 2-(N-Morpholino)-ethansulfonat, Tris-(hydroxymethyl)-glycin, ein Tris-(hydroxymethyl)-glycinsalz, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, ein Tris-(hydroxymethyl)-methylaminsalz wie Tris-(hydroxymethyl)-methylamin-Hydrochlorid und Imidazol sein.
Insbesondere erzeugt die Verwendung von Kaliumhydrogenphthalat als Additiv einen Glucose-Sensor mit ausgezeichneter Lagerungsstabilität und hervorragender Ansprechcharakteristik mit sehr niedrigem Nullwert.
Alle oben als Beispiel genannten Additive sind Verbindungen, welche als Puffer wirken können. Bei der Verwendung können sie gegebenenfalls unter Verwendung einer Säure wie Salzsäure oder Essigsäure oder einer Lauge wie Natrium- oder Kaliumhydroxid auf einen gewünschten pH-Wert eingestellt werden. Ein bevorzugter pH-Wertbereich liegt zwischen 5,0 und 8,5. Diese Additive können zur Verwendung in anderen geeigneten Pufferlösung gelöst sein.
Der Anteil an Additiv kann in einem Bereich von 5 bis 80 μM pro 250 bis 10.000 U/ml PQQ-GDH (U = units) betragen. Da ein Überschuss an Additiv die spezifische Aktivität des Enzym vermindert, beträgt die Menge an Additiv bezogen auf Stabilität und Nullwert bevorzugt zwischen 10 und 50 μM.
Die Reaktionsschicht kann weiterhin einen Elektronenakzeptor enthalten, welcher bei der Enzymreaktion reduziert wird. Für diesen Zweck verwendbare Elektronenakzeptoren können zum Beispiel das Hexacyanoferrat(III)-Ion, p-Benzochinon oder ein Derivat davon, Phenazin Methosulfat, Methylenblau, Ferrocen oder ein Derivat davon und dergleichen sein.
Die Reaktionsschicht kann weiterhin ein hydrophiles Polymer enthalten. Die Gegenwart eines hydrophilen Polymers in der Reaktionsschicht verhindert die Trennung oder Zersetzung der Reaktionsschicht von der Oberfläche des Elektrodensystems. Das hydrophile Polymer hat auch eine vorbeugende Wirkung auf Rissbildung auf der Oberfläche der Reaktionsschicht, und verbessert so die Zuverlässigkeit des resultierenden Biosensors.
Bevorzugte Beispiele für hydrophile Polymere für diesen Zweck umfassen Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyamine wie Polylysin, Polystyrolsulfonate, Gelatine und ihre Derivate, ein Polymer aus Acrylsäure und seinem Acrylat, einem Polymer aus Methacrylsäure und Methacrylate, Stärke und ihre Derivate, ein Polymer aus Maleinsäureanhydrid und einem Maleat, Agarosegel und seine Derivate.
Die Reaktionsschicht kann zusätzlich zu der Stelle auf dem Elektrodensystem, welches auf der elektrisch isolierenden Basisplatte gebildet wurde, an verschiedenen Stellen des Biosensors lokalisiert sein, sofern die Wirkungen der vorliegenden Erfindung dadurch nicht verloren gehen. Zum Beispiel kann die Reaktionsschicht irgendwo auf dem Biosensor außer auf dem Elektrodensystem auf der Trägerplatte lokalisiert sein. Der erfindungsgemäße Biosensor kann weiterhin ein Deckelelement umfassen. Das Deckelelement ist mit der Trägerplatte verbunden um zwischen dem Deckelelement und der Trägerplatte einen Weg für die Versorgung mit Probenlösung zu bilden, um das Elektrodensystem mit Probenlösung zu versorgen. Die Reaktionsschicht kann auf der Seite des Deckelelements lokalisiert sein, welche der Probenlösung ausgesetzt ist.
Für die Messung des Oxidationsstroms gibt es zwei Verfahren: eines ist ein Zweielektrodensystem, welches nur eine Arbeits- und eine Gegenelektrode umfasst, und das andere ein Dreielektrodensystem, welches zusätzlich zu den beiden Elektroden eine Referenzelektrode umfasst. Letztere erleichtert eine genauere und sorgfältigere Messung.
Wie bereits erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Stabilisierung von Glucose-Dehydrogenase zur Verwendung in Glucose-Sensoren durch Zugabe eines der oben beispielhaft erwähnten Additive zu PQQ-GDH. Die vorliegende Erfindung schränkt das Verfahren der Zugabe nicht auf ein bestimmtes ein, sondern es kann jedwedes Verfahren angewandt werden, sofern es die Wirkung der vorliegenden Erfindung nicht schädigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung zur Verwendung in Glucose-Sensoren, welche aus PQQ-GDH und dem Additiv zusammengesetzt ist.
Die erfindungsgemäße, stabilisierte Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung kann weiterhin zusätzlich zu dem oben genannten Additiv andere Stabilisatoren in einer Menge enthalten, welche die Wirkung der vorliegenden Erfindung nicht verschlechtern.
Für diesen Zweck verwendbare Beispiele von Stabilisatoren umfassen Metallsalze, Proteine, Aminosäuren, Zucker, organische Säuren, Tenside usw.
Metallsalze können zum Beispiel Halogenide oder Halogenverbindungen von Calcium, Strontium oder Mangan oder deren Sulfate oder Nitrate sein.
Bevorzugte Proteine sind solche, die keine gegensätzliche Wirkung auf die Enzymaktivität ausüben. Beispiele für derartige Proteine sind Rinderserumalbumin (BSA), Ei-Albumin und Gelatine.
Verwendbare Aminosäuren sind zum Beispiel Glycylglycin und Polylysin, und weiterhin im Allgemeinen Aminosäuren wie Lysin, Histidin und Glutaminsäure. Vor allem ist eine hohe Wasserlöslichkeit der Aminosäure bevorzugt.
Als Zucker kann jede Art von Zucker verwendet werden, zum Beispiel Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide. Ihre Derivate sind ebenfalls anwendbar. Spezifischere Beispiele sind Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Xylose, Saccharose, Lactose, Maltose, Trehalose, Maltotriose, Maltosylcyclodextrin, α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin, γ-Cyclodextrin, Dextrin, Amylose, Glycogen, Stärke, Inulin, Glucosamin, Inosit, Mannit, Sorbit, Ribit und Deoxyglucose als Beispiele genannt werden.
Beispiele für organische Säuren umfassen α-Ketoglutarsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Cholsäure und Deoxycholsäure.
Bevorzugte Tenside sind nichtionische Tenside.
Unter anderem können auch Borsäure, Borax, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Ammoniumsulfat, Glycerin, Ficoll, EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) EGTA, DTT (Dithiothreitol) DTE (Dithioerythritol), GSH (Glutathion) oder 2-Mercaptoethanol verwendet werden.
Eine bevorzugte Menge an diesen Stabilisatoren liegt im Bereich von 0,0001 bis 1,0 Gewichtsteilen pro 1,0 Gewichtsteil Glucose-Dehydrogenase.
Die Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung von PQQ-GDH, gegebenenfalls, mit dem oben genannten Stabilisator zusätzlich zum erfindungsgemäßen Additiv ist kostengünstig und kann seine Aktivität ohne gegensätzlichen Einfluss auf die intrinsischen Eigenschaften des Enzyms beibehalten.
Das Coenzym Pyrrolochinolinchinon, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann aus jedweder Quelle stammen.
Nun werden die Messverfahren der Aktivität von der PQQ-GDH der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Das verwendete Reagenz ist eine Reagenzlösungsmischung aus 50 mM PIPES-Pufferlösung, 0,2 mM PMS (pH 6,5), 0,2 mM NTB, 30,6 mM Glucose und 0,19% Triton X-100.
Nach dem Erhitzen von 3 ml der Reagenzlösungsmischung bei 37°C für etwa 5 Minuten, wurde 0,1 ml PQQ-GDH-Lösung zu der erhitzten Reagenzlösungsmischung gegeben und die resultierende Lösung wurde vorsichtig gerührt.
Anschließend wurde die Extinktion der so erhaltene Lösung unter Verwendung eines Spektrometers bei einer kontrollierten Temperatur von 37°C vermessen und die Extinktion wurde 5 Minuten lang aufgezeichnet. Als Kontrolllösung wurde Wasser verwendet. Dann wurden die Veränderungen der Extinktion pro Minute aus dem linearen Teil der aufgezeichneten Spektraldaten berechnet. Es wurde ein Doppelblindtest durch Messung der Extinktion der Reagenzlösungsmischung, welche nur mit destilliertem Wasser anstelle von PQQ-GDH-Lösung versetzt wurde, durchgeführt. Die Menge an Enzym, welche pro Minute ½ μM Diformazan, gemessen nach dem oben beschriebenen Verfahren, produzierte, wurde als 1 Einheit definiert.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung mittels konkreter Beispiele genauer beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiele
1 ist eine schematische Draufsicht eines Biosensors gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung, bei der die Reaktionsschicht weggelassen wurde.
Wie in der Abbildung gezeigt, wird eine Silberpaste mittels bekannter Siebdruckverfahren auf eine elektrisch isolierende Trägerplatte 1, bestehend aus Polyethylenterephthalat, aufgebracht, um die Zuleitungen 2 und 3 zu bilden. Dann wird eine leitfähige Kohlenstoffpaste mit Harzbindemittel auf die Trägerplatte 1 aufgebracht, um die Arbeitselektrode 4 zu bilden. Die Arbeitselektrode 4 ist in Kontakt mit der Zuleitung 2. Die Trägerplatte 1 wird weiterhin mittels Auftragung einer isolierenden Paste mit einer isolierenden Schicht 6 versehen. Die isolierende Schicht 6 umgibt die Peripherie der Arbeitselektrode 4, um die freie Fläche der Arbeitselektrode 4 konstant zu halten. Anschließend wird durch Auftragung der gleichen leitfähigen Kohlenstoffpaste mit Harzbinder wie oben eine ringförmige Gegenelektrode 5 so gebildet, dass sie in Kontakt mit der Zuleitung 3 ist.
2 ist eine Längsschnittdarstellung, welche die wesentlichen Teile des in 1 gezeigten Biosensors abbildet. Auf der in 1 gezeigten Trägerplatte 1 wird eine hydrophile Polymerschicht 7 aus Carboxymethylcellulose gebildet, auf welche weiterhin die Reaktionsschicht 8, bestehend aus PQQ-GDH und Additiv, gebildet wird.
Beispiel 1
Eine wässrige Natriumsalzlösung mit 0,5 Gew.-% des hydrophilen Polymers Carboxymethylcellulose (im Folgenden mit „CMC" abgekürzt) wurde auf das Elektrodensystem auf der Basisplatte 1 in 1 getropft und 10 min einem Warmlufttrockner bei 50°C getrocknet, um die CMC-Schicht 7 zu bilden. Anschließend wurde eine Lösungsmischung, in welcher 5.000 U PQQ-GDH, 20 μM Kaliumhydrogenphthalat und 50 μM Kaliumhexacyanoferrat in 1 ml Wasser gelöst sind, auf die CMC-Schicht 7 getropft und getrocknet, um die Reaktionsschicht 8 zu bilden. Auf diese Weise wurde der Glucose-Sensor aus Beispiel 1 hergestellt.
Anschließend wurden wässrige Lösungen mit verschiedenen Glucosekonzentrationen als Probenlösungen hergestellt. Jede der so hergestellten Probenlösungen wurde auf die Reaktionsschicht 8 getropft. Beim Aufbringen der Glucoseprobenlösung auf die Reaktionsschicht wurde in der Probenlösung enthaltene Glucose von dem in der Reaktionsschicht 8 anwesenden PQQ-GDH oxidiert. Gleichzeitig wurde Kaliumhexacyanoferrat(III) in der Reaktionsschicht zu Kaliumhexacyanoferrat(II) reduziert.
Eine Minute nach dem Auftropfen der Probenlösung wurde eine Spannung von +0,5 V auf die Arbeitselektrode 4 unter Verwendung der Gegenelektrode 5 als Referenz angelegt, um das Kaliumhexacyanoferrat(II) zu reoxidieren. Fünf Sekunden nach dem Anlegen der Spannung wurde der Stromfluss über Arbeits- und Gegenelektrode 4 und 5 gemessen.
Auf gleiche Weise wie oben beschrieben, wurden Stromwerte von allen Probenlösungen mit verschiedenen Glucosekonzentrationen erhalten. Schließlich wurde ein Diagramm erstellt, welches die Ansprechcharakteristik des Glucosesensors auf die Probenlösungen zeigt, in dem die Glucosekonzentration auf die x-Achse und der Stromwert auf die y-Achse aufgetragen wurden. Die Ergebnisse sind in 3 wiedergegeben.
Auf die gleiche Weise wie oben beschrieben wurde ein identischer Biosensor hergestellt und 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert, um ein Diagramm zu erhalten, welches die Ansprechcharakteristik nach sechsmonatiger Lagerung zeigt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in 3 wiedergegeben.
Wie aus 3 deutlich ersichtlich, weisen die Biosensoren aus Beispiel 1 einen extrem niedrigen Nullwert auf. Außerdem ist eine deutliche lineare Korrelation zwischen der Glucosekonzentration und dem Stromwert festzustellen.
Die Sensor-Ansprechcharakteristik 6 Monate nach der Herstellung, in der Abbildung „Ex. 1-2", ist verglichen mit der direkt nach der Herstellung, in der Abbildung „Ex. 1-1", beinahe unverändert. Dies lässt darauf schließen, dass die Biosensoren aus Beispiel 1 eine gute Lagerungsstabilität aufweisen.
Vergleichsbeispiel 1
Es wurde ein anderer Biosensor auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, dass anstelle von Kaliumhydrogenphthalat Kaliumphosphat verwendet wurde. Anschließend wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 Diagramme mit der Sensoransprechcharakteristik direkt nach der Herstellung, in der Abbildung „Com. Ex. 1-1", und nach 6 Monten Lagerung, in der Abbildung „Com. Ex. 1-2", erstellt. Die Ergebnisse sind in 3 wiedergegeben.
Wie aus 3 ersichtlich, erzeugt der Glucose-Sensor aus Vergleichsbeispiel 1 einen hohen Nullwert. Der Ansprechstromwert des Sensors ist höher als der tatsächliche Stromwert, der die Glucosekonzentration wiederspiegelt, wenn die Glucosekonzentration in der Probenlösung niedriger als 110 mg/dl ist. Wenn die Glucosekonzentration in der Probenlösung höher ist als 110 mg/dl beträgt, ist der Ansprechstromwert in den Glucose-Sensoren aus Vergleichsbeispiel 1 kleiner als in denen aus Beispiel 1. Die lineare Korrelation zwischen Glucosekonzentration und Stromwert direkt nach der Herstellung ist ebenfalls geringer.
Die lineare Korrelation nimmt nach 6 Monaten Lagerung verglichen mit der direkt nach der Herstellung noch weiter ab. Also weist der Glucose-Sensor des Vergleichsbeispiels 1 schwache Lagerungseigenschaften auf.
Vergleichsbeispiel 2
Es wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 ein weiterer Glucose-Sensor hergestellt, mit der Ausnahme, dass Kaliumhydrogenphthalat weggelassen wurde. Anschließend wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 Diagramme mit der Sensoransprechcharakteristik direkt nach der Herstellung und nach 6 Monten Lagerung erstellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass der Sensor aus Vergleichsbeispiel 2 einen überraschend hohen Nullwert produziert und nur geringe Anstiege der Stromwerte als Antwort auf eine Steigerung der Substratkonzentration aufweist. Das Enzym verlor seine Enzymaktivität nach sechsmonatiger Lagerung des Sensors und es gab praktisch keine Veränderung bei den Stromwerten als Antwort auf gestiegene Substratkonzentrationen.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird ein Glucose-Sensor auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die CMC-Schicht 7 auf dem Elektrodensystem weggelassen wurde. Anschließend wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 Diagramme mit der Sensoransprechcharakteristik direkt nach der Herstellung und nach 6 Monten Lagerung erstellt.
Die Ergebnisse zeigen eine gewisse Korrelation zwischen der Glucosekonzentration und dem Stromwert mit befriedigender Linearität. Der Sensor weist einen niedrigen Nullwert auf. Darüber hinaus war die Sensoransprechcharakteristik nach sechsmonatiger Lagerung nach der Produktion annähernd unverändert im Vergleich zu der direkt nach der Herstellung. Dies weist auf eine befriedigende Lagerungsstabilität des Sensors aus Beispiel 2 hin.
Beispiele 3 bis 10
In diesen Beispielen wurden Glucose-Sensoren auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, unter Verwendung von Maleinsäure (Beispiel 3), Bernsteinsäure (Beispiel 4), Triethanolamin (Beispiel 5), Natriumdihydrogencitrat (Beispiel 6), Dimethylglutarsäure (Beispiel 7), 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (Beispiel 8), Tris-(hydroxyethyl)-glycin (Beispiel 9) oder Tris-(hydroxymethyl)-methylamin (Beispiel 10) anstelle von Kaliumhydrogenphthalat. Anschließend wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 Diagramme mit der Sensoransprechcharakteristik direkt nach der Herstellung, in den Abbildungen „Ex. 3-1 bis Ex. 10-1", und nach 6 Monten Lagerung, in den Abbildungen „Ex. 3-2 bis 10-2", erstellt. Die aus diesen Sensoren erhaltenen Ergebnisse sind in den 4 bis 11 wiedergegeben.
4 bis 11 zeigen sehr niedrige Nullwerte und eine gewisse Korrelation zwischen der Glucosekonzentration und dem Stromwert. Die Sensoren waren sehr empfindlich und wiesen eine befriedigende Linearität auf. Darüber hinaus waren die Sensoransprechcharakteristika nach sechsmonatiger Lagerung annähernd unverändert gegenüber denen direkt nach der Herstellung. Dies weist auf eine befriedigende Lagerungsstabilität der Sensoren aus den Beispielen 3 bis 10 hin.
Beispiele 11 bis 18
In diesen Beispielen wurden Glucose-Sensoren auf die gleiche Weise wie in den Beispielen 3 bis 10 unter Auslassung der CMC-Schicht 7 auf dem Elektrodensystem hergestellt. Anschließend wurden auf gleichartige Weise Diagramme der Ansprechcharakteristik direkt nach der Herstellung und nach sechsmonatiger Lagerung erstellt.
Die Ergebnisse weisen auf eine gewisse Korrelation zwischen der Glucosekonzentration und dem Stromwert mit befriedigender Linearität hin. Auch der Nullwert war für alle Sensoren sehr niedrig. Darüber hinaus waren die Sensoransprechcharakteristika nach sechsmonatiger Lagerung annähernd unverändert gegenüber denen direkt nach der Herstellung. Dies weist auf eine befriedigende Lagerungsstabilität der Sensoren aus den Beispielen 11 bis 18 hin.
Beispiel 19
In diesem Beispiel wurden 10 U/ml der erfindungsgemäßen PQQ-GDH in verschiedenen Additiven (20 mM), wobei jedes 1 mM Calciumchlorid enthielt, gelöst (im Folgenden als Pufferlösung bezeichnet) und 3 Tage bei 37°C gelagert, um die verbliebene Enzymaktivität zu untersuchen (genauer gesagt, das Verhältnis von verbliebener Enzymaktivität von PQQ-GDH zu der direkt nach der Lösung in jeder der Pufferlösungen). Bei Verwendung von Kaliumphosphat als Pufferlösung wurde Calciumchlorid weggelassen.
Tabelle 1 gibt die restliche Enzymaktivität von in verschiedenen Pufferlösungen gelöstem PQQ-GDH wieder.
Tabelle 1
Tabelle 1 weist darauf hin, dass alle erfindungsgemäßen Additive eine bessere Stabilität als die herkömmliche Kaliumphosphatpufferlösung und Tris-Hydrochloridpufferlösung aufweisen, welche weit verbreitet als Additive eingesetzt werden.
Beispiel 20
In diesem Beispiel wurde erfindungsgemäße PQQ-GDH in verschiedenen Additiven mit 1 mM Calciumchlorid zusätzlich zu BSA (welches im Folgenden als Pufferlösung bezeichnet wird) gelöst. Das Mischungsverhältnis von BSA betrug 0,3 Gewichtsteile auf 1 Gewichtsteil PQQ-GDH. Die so hergestellte Lösung wurde lyophilisiert (= gefriergetrocknet) und bei 37°C 1 Woche lang gelagert, um die verbliebene Enzymaktivität zu untersuchen (genauer gesagt, das Verhältnis von verbliebener Enzymaktivität von PQQ-GDH im Vergleich zu der direkt nach der Lösung in der jeweiligen Pufferlösung). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt, dass alle erfindungsgemäßen Additive der herkömmlich verwendeten Kaliumphosphatpufferlösung und der Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung bezogen auf die Sicherung einer stabilen Aktivität der mittels Gefriertrocknungsmethoden hergestellten Enzymzusammensetzung überlegen sind.
Wie oben diskutiert, bietet die vorliegende Erfindung einen Glucose-Hochleistungssensor, welcher lange Lagerungszeiten aushält und einen niedrigen Nullwert aufweist. Die vorliegende Erfindung kann auch eine Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung gebunden an Pyrrolochinolinchinon als Coenzym zur Verwendung in Glucose-Sensoren bereitstellen, wobei die Zusammensetzung stabiler ist als die herkömmliche Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung.

Claims

Glucose-Sensor, umfassend: eine elektrisch isolierende Trägerplatte, ein Elektrodensystem, umfassend mindestens eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, welche auf der genannten Trägerplatte gebildet werden, und eine Reaktionsschicht, welche in Kontakt mit oder in der Nähe des genannten Elektrodensystems gebildet wird und mindestens Glucose-Dehydrogenase enthält, deren Coenzym Pyrrolochinolinchinon ist, wobei die genannte Reaktionsschicht weiterhin mindestens ein Additiv enthält, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phthalsäure, einem Phthalat, Maleinsäure, einem Maleat, Bernsteinsäure, einem Succinat, Triethanolamin, einem Triethanolaminsalz, Zitronensäure, einem Citrat, Dimethylglutarsäure, 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, einem 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäuresalz, Tris-(hydroxymethyl)-glycin, einem Tris-(hydroxymethyl)-glycinsalz, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, einem Tris-(hydroxymethyl)-methylaminsalz, und Imidazol.
Glucose-Sensor gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Glucose-Dehydrogenase mit dem genannten Additiv beschichtet ist.
Verfahren zur Stabilisierung von Glucose-Dehydrogenase zur Verwendung in Glucose-Sensoren, in welchen mindestens ein Additiv zu der Glucose-Dehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolochinolinchinon ist, gegeben wird, wobei genanntes Additiv ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phthalsäure, ei nem Phthalat, Maleinsäure, einem Maleat, Bernsteinsäure, einem Succinat, Triethanolamin, einem Triethanolaminsalz, Zitronensäure, einem Citrat, Dimethylglutarsäure, 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, einem 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäuresalz, Tris-(hydroxymethyl)-glycin, einem Tris-(hydroxymethyl)-glycinsalz, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, einem Tris-(hydroxymethyl)-methylaminsalz und Imidazol.
Glucose-Dehydrogenasezusammensetzung zur Verwendung in Glucose-Sensoren, wobei die genannte Zusammensetzung eine Glucose-Dehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolochinolinchinon ist, und mindestens ein Additiv enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phthalsäure, einem Phthalat, Maleinsäure, einem Maleat, Bernsteinsäure, einem Succinat, Triethanolamin, einem Triethanolaminsalz, Zitronensäure, einem Citrat, Dimethylglutarsäure, 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, einem 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäuresalz, Tris-(hydroxymethyl)-glycin, einem Tris-(hydroxymethyl)-glycinsalz, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, einem Tris-(hydroxymethyl)-methylaminsalz und Imidazol.