DE2631047B2

DE2631047B2 - Verfahren zum herstellen von biologischen proteinen mikroorganismen der art prototheca

Info

Publication number: DE2631047B2
Application number: DE19762631047
Authority: DE
Inventors: Ludwig Rom; Zaffaroni Pasquale Mentana; Formiconi Lamberto Monterotondo; Rom; Senni Antonio Rom; Degen (Italien)
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: Anic SpA
Priority date: 1975-07-10
Filing date: 1976-07-09
Publication date: 1977-10-20
Also published as: DE2631047A1; LU75347A1; SU708997A3; AU1556476A; FR2317355A1; ZA763893B; BE843992A; ATA508976A; CH629372A5; IT1039758B; DK311676A; DK141760B; SE7607909L; GB1522756A; NL7607713A; AT354966B; AU507816B2; DE2631047C3; NL175433C; FR2317355B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von biologischen Proteinen durch die Wirkung von Mikroorganismen der Art Prototheca, die aliphatische Alkohole mit niederem Molekulargewicht oxidieren.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren angewandten Mikroorganismen gehören zur Gruppe Prototheca.

Die Erfindung betrifft auch Proteinprodukte, die abgeleitet sind von Mikroorganismen, die als Nahrungszusatz für Menschen und Tiere angewandt werden können.

In der Literatur sind zahlreiche (Fermentations)-Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen angegeben, die proteinische Substanzen liefern. Es sind z. B. Verfahren zur Züchtung von Hefen auf Kohlenhydraten angegeben wie sie in Melasse enthalten sind, Sulfitbädern von Papiermühlen und n-Alkanfraktionen von leichtem Benzin. Ähnliche Verfahren sind auch zur Erzeugung von Biomassen mit Hilfe von Bakterien beschrieben.

Während des Fortschreitens des auf die Bildung von Hefen und Bakterien gerichteten Wachstums (Fermentation) tritt ein beachtlicher Wärmestau (heat-build up) auf, aufgrund der Oxidation des Substrates, der umso stärker ist, je niedriger der Oxidationsgrad des Substrates selbst ist.

Die Anwendung teilweise oxidierter Substrate verringert den Sauerstoffverbrauch und die Wärmeentwicklung. Ferner werden die Kühlkosten wesentlich verringert durch die Anwendung von Mikroorganismen, die bei hohen Temperaturen wachsen.

Bei vielen Verfahren zur Bildung von Biomassen kann eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln erforderlich werden, um unerwünschte Substratrückstände oder schädliche Verbindungen, wie hochmolekulare Kohlenwasserstoffe oder polycyclische Kohlenwasserstoffe und ähnliches, zu entfernen.

Alkohole stellen Substrate dar, die sehr gut geeignet sind zur Bildung von Bioproteinen. Sie sind wasserlöslieh, bereits teilweise oxidiert und werden in großtechnischem Maßstab in hoher Reinheit hergestellt. Von den aliphatischen Alkoholen werden in erster Linie Metha

35

5°

60

65

nol und Äthanol angewandt.

Wirtschaftliche Überlegungen machen es erforderlich, daß die Substrate für die Bildung von Bioproteinen billig sind.

Im Vergleich mit Abfallprodukten sind die Kosten für Äthanol verhältnismäßig hoch. Es ist daher erforderlich, daß das Substrat vollständig ausgenutzt wird.

Es ist Aufgabe der Erfindung, Stämme von heterotrophen Algen von der Art Prototheca zu züchten, die Äthanol als Substrat verwerten. Bei der Verwendung von Äthanol als Substrat werden zahlreiche Nachteile anderer Substrate vermieden. Natürlich ist Äthanol leicht zugänglich und kann als Nährstoff rngewandt werden. Es treten keine Toxizitätsprobleme auf, da es in hoher Reinheit hergestellt wird, und außerdem ist Äthanol flüchtig, und möglicherweise noch vorhandene Reste können leicht während des Trocknens der Zellen entfernt werden. Ferner tritt kein Problem bezüglich der Verteilung des Substrats in dem Nährmedium auf. wie bei Polysacchariden und Kohlenwasserstoffen.

Die erfindungsgemäß angewandten Stämme besitzen darüber hinaus den Vorteil, daß sie bei Temperaturen bis zu 40⁰C, vorzugsweise bei 33 bis 37°C bei einem weiten pH-Bereich (pH 1,0 bis 8,0), vorzugsweise pH 3,0 bis 5,0 wachsen, eine Tatsache, die die Gefahr einer bakteriellen Infektion während des Wachstums verringert. Viele Mikroorganismen wachsen nicht in alkoholhaltigen Substraten, andere wachsen nur dann, wenn die Konzentrationen niedrig sind. Die erfindungsgemäß angewandten Stämme wachsen im Gegensatz dazu auch bei hohen Konzentrationen gut, und nur Konzentrationen über 4% hemmen das Wachstum.

Die erfindungsgemäßen Prototheca-Stämme wurden isoliert und ausgewählt aus Erdproben, die entnommen worden sind bei Harcourt, Nigeria, und werden bezeichnet durch die Nummern 855 A, 855 B und 855 C. Die Kultur- und physiologischen Charakteristika sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle 1
Züchtungs- und physiologische Charakteristika

A. Züchtungscharakteristika

Festes Medium (24 h)(Pepton-Glukose):
Durchmesser der Kolonien: 2 bis 3 mm,
brüchig, grob, opak, ohne Pigmente

Flüssiges Medium (24 h)(Pepton-Glukose):
Sediment, dünner Film

B. Charakteristika des Vegetationszyklus
Bildung von 2 bis 8 Aplanosporen (Endosporen)
Nach dem Aufbrechen der Mutterzelle wiederholen die Aplanosporen den Zyklus, und einige bilden Hypnosporen (»ruhende Zellen«)

C. Charakteristika der vegetativen Zellen
Spheroid oder ellipsoid mit einer Größe von 15 bis 25 χ 20 bis 30 μΐη. Bildung von Aggregaten. Kern und Vorratsvakuolen (storage granules) gut sichtbar.

D. Geschlecht

Es wurde kein Sexualzyklus beobachtet.

E. Physiologische Eigenschaft

1) Ausnutzung verschiedener Kohlensloffquellen
a. fermentative Verwertung (zum Wachstum) Glukose sauer,

ohne Gas,
langsam

Galaktose negativ

Sucrose negativ

Maltose

Lactose

Raffinose

Melibiose

inulin

Stärke

«-Methyl-D-glukosid

negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ

Tabelle Il

855 A

P. Zopfii

b. assimilative Verwertung von Kohlenstoffquellen

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

negativ

positiv

2) Verwertung verschiedener Stickstoffquellen Ammonium, Nitrat und Harnstoff

3) Wachstumsfaktoren
erfordert Thiamin

4) Wachstum bei unterschiedlichen Temperaturen C negativ

bis 42° C positiv

54°C negativ

Arnold und Ahearn (Mycologia, Band 64, Seite 265, 1972) haben vor einiger Zeit einen Schlüssel zur Klassifizierung von Prototheca vorgeschlagen, nachdem die erfindungsgemäßen Stämme zur Gruppe der P. Zopfii-Arten gehören.

Die mit den Symbolen 855 A, B und C bezeichneten Stämme unterscheiden sich jedoch gegenüber der Standardbeschreibung von P. Zopfii und gegenüber den in den Sammlungen vorhandenen Stämmen (wie von Prof. Liferri, Pavia erhalten, siehe Tabelle II).

D-Glukose

D-Galaktose

Sucrose

Fructose

Maltose

Lactose

Raffinose

Melibiose

Inulin

lösliche Stärke

Λ-Methyl-D-glukosid

L-Sorbose

Salicin

Arbutin

Cellobiose

Trealose

Melizilose

D-Xylose

D-Arabinose

L-Arabinose

D-Ribose

L-Rhamnose

Methanol

Äthanol

n-Propanol

Iso-propanol

n-Butanol

tert.-Butanol

Cyclohexanol

Glycerin

Erythrit

Ribit

Dulcit

D-Mannit

Sorbit

Inosit

DL-Milchsäure

Bernsteinsäure

Citronensäure

n-Paraffin

P. Zopfii
(Literatur)

D-Galaktose
Lo-Penianol
Wachstum bei 42^C

negativ positiv positiv
negativ negativ positiv
positiv negativ —

Der Stamm 855 A (wilder Typ) kann so als stabile und definierte Variante der Spezies P. Zopfii angesehen werden. Es wird der Name Prototheca Zopfii, Var. Harcourt, vorgeschlagen, bei der in Tabelle I angegebenen Slandardbeschreibung. Der Stamm wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn hinterlegt und erhielt die Nummer CB 5 26 S. 75.

Die Zellen von Prototheca Zopfii, Var. Harcourt 855 A, wie sie erfindungsgemäß zur Bildung von Bioproteinen angewandt werden, werden in Kulturmedien gezüchtet, die bis zu 4% Äthanol als Kohlenstoffquelie, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wachstumsfaktoren enthalten. Thiamin kann als solches oder in Form von Maiswasser oder Melasse oder Hefeextrakt zugesetzt werden. Das Äthanol als Kohlenstoffquelle kann auf einmal vor der Fermentation (Wachstum) oder in kleinen Anteilen während der Fermentation zugesetzt werden. Es ist jedoch bevorzugt, Äthanol kontinuierlich während der fortschreitenden Fermentation zuzusetzen, um eine vollständigere Verwertung zu ermöglichen.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 40° C, vorzugsweise 30 bis 38°C bei einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 8, vorzugsweise von 3,0 bis 5,0 durchgeführt.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird eine Ausbeute von 60 bis 70% (g trockene Biomasse/g Äthanol) erhalten bei einer Zellkonzentration in der Kultur von 20 bis 60 g/l.

Ein außergewöhnlicher Vorteil dieses Verfahrens ist die Anwendung von heterotrophen Algen von der Art Prototheca. Aufgrund ihrer Größe sind sie natürlich leicht gewinnbar.

Bei ansatzweisem Arbeiten werden die Zellen gewonnen durch Sedimentation oder Filtration nach vollständiger Fermentation. Das gleiche Verfahren wird angewandt, um die Biomasse bei kontinuierlichen Verfahren zu gewinnen.

Die auf diese Weise erhaltene und getrocknete Biomasse enthält ungefähr 50 bis 60% rohe Proteine zusammen mit Polysacchariden, Lipiden und Nucleinsäuren.

Erfindungsgemäß ist es möglich, Biomassen mit hohen Proteingehalten herzustellen durch Züchtung von heterotrophen Algen der Art Prototheca in einem einfachen Kulturmedium, das Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

(NH₄J₂SO₄	■ H₂O	5 g/l
NaH₂PO₄		10 g/l
KH₂PO₄	H₂O	10 g/l
MgSO₄ ■ 7	H₂O	0,2 g/l
FeSO₄ · 7	2 mg/1

ZnSO₄ · 7 H>O 2 mg/1
CaCI₂ 2 mg/1
Hefeextrakt 500 mg/1
Lösung von Spurenelementen 1 ml

Die Lösung der Spurenelemente bestand aus:

CuSO₄ · 5 H,O

HjBO₃

MnSO₄ ■ H₂O

KJ

CaCI₂ · 6 H₂O

MoOj

5 mg/1
500 mg/1
500 mg/1
10 mg/1
10 mg/1
10 mg/1

Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,0 wurde das Medium in Mengen von jeweils 100-ml in 500-ml-Kolben gegeben und nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei H6°C wurde 1% Äthanol (Vol./Vol.) zugegeben. Die Kolben wurden dann mit einer 3 Tage alten Kultur (30°C) des Stammes 855 A von einer Schräge beimpft, ^₀ enthaltend das gleiche Medium und 2% Agar-Agar, und anschließend unter Rühren (Orbital-Rührer) bei 220UpM bei 30⁰C inkubiert. Nach 24 Stunden langer Inkubation wurden weitere 2% Äthanol zugegeben.

Die Ausbeute an trockenen Zellen nach 33 Stunden 2s langer Inkubation betrug 18,7 g/l.

Beispiel 2

Es wurde eine Fermentation bei 40°C durchgeführt, wobei die anderen Bedingungen des Beispiek 1 nicht yo verändert wurden. Die Ausbeute an trockenen Zellen nach 48 Stunden langer Inkubation betrug 13,5 g/l.

Beispiel 3

Es wurde ein Kulturmedium wie in Beispiel 1 hergestellt, das jedoch anstelle von Hefeextrakt 1,5 g/l Maiswasser (C. S. L.) enthielt. Die Ausbeute, als Trockengewicht, nach 34 Stunden langer Fermentation unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen bei 35°C betrug 17,5 g/l.

Beispiel 4

In kleine Laborfermenter, die mit einem Turbinenrührer und 4 (antisloshing) Prallplatten versehen waren und ein Volumen von 16 1 besaßen, wurden 10 I des Mediums 4s entsprechend Beispiel 1 gegeben, mit dem einzigen Unterschied, daß die Konzentration an Phosphatsalzen 2 g/l anstelle von 10 g/l betrug. Nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei 116°C wurden die Fermenter mit 10% einer 21 Stunden alten Kultur von dem Stamm so 855 A in einem Kolben mit dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 von 35° C beimpft. Die Züchtung wurde bei 35°C unter Rühren mit 1000 UpM und einer Belüftung von 0,5 V0I./V0I. χ min. durchgeführt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Soda während der ganzen ss Fermentationszeit auf 4,0 gehalten. Äthanol wurde zu Beginn (1 Vol.-%) und nach 24 Stunden (2 Vol.-%) zugegeben.

Nach 43 Stunden langer Fermentation wurden die Zellen auf Papier abfiltriert und nach dem Waschen mit Wasser bei 90⁰C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an trockenen Zellen betrug 50,5 g/l, enthaltend 52,56% rohe Proteine (N χ 6,25) und 4,73% Lipide.

Beispiel 5

Ein Laborfermenter mit einem Volumen von 20 1, enthaltend 12 1 des in Beispiel 4 angewandten Kulturmediums, wurde, wie in diesem Beispiel angegeben, beimpft und 24 Stunden unter Rühren (800 UpM) bei 35°C inkubiert unter Einleiten von 0,5 Vol./ Vol. χ min. Luft.

Zwei Laborferriienter der in Beispiel 4 beschriebenen Art, enthaltend jeweils 10 1 des gleichen Kulturmediums und' 1% Äthanol, wurden mit jeweils 1,5 1 dieser Vorkultur beimpft. Die Fermenter wurden mit 1000 UpM gerührt und mit 0,5 V0I./V0I. x min. belüftet. Die Fermentationstemperatur eines Fermenters bein.·;. 30⁰C, die des anderen 35^CC. Um den pH-Wert auf dem gewünschten Wert (ungefähr 4) zu halten, wurde ein Gemisch angewandt, bestehend aus 32%igem wäßrigem Ammoniak und 95%igem Äthanol im Verhältnis 20 : 80. Durch Zugabe dieses Gemisches wurde nicht nur der pH-Wert auf einem optimalen Wert fur das Wachstum gehalten, sondern auch die Kohlenstoffquel-Ie automatisch zugegeben.

Nach 20 Stunden langer Inkubation betrug die Konzentration an Biomasse 20,6 g/l (30°C) bzw. 21.3 g/l

(35° C).

Die Rührgeschwindigkeit wurde dann auf 1500 UpM erhöht und mit 0,75 Vol./Vol. χ min belüftet. Nach weiteren 25 Stunden betrugen die Konzentrationen an Biomasse 53,2 g/l (30°C) bzw. 58,1 g/l (35⁰C).

Mit 2 I der 35°C-Kultur wurde ein dritter Fermenter der gleichen Art, enthaltend 10 1 des gleichen Kulturmediums beimpft und ebenfalls bei 35°C unter Rühren mit 1500UpM und einer Luftzufuhr von 0,75 Vol./ Vol. χ min inkubiert. Nach 8 Stundenlanger Inkubation erhöhte sich die Konzentration an Biomasse von 10,3 g/l auf 33,1 g/l.

Beispiel 6

In einem 16-1-Fermenler, der mit einem Turbinenrührer und 4 (antisloshing) Prallplatten versehen war und 7 I Medium enthielt, wurde eine Kultur des Stammes 855 A entsprechend Beispiel 4 hergestellt.

Für die kontinuierliche Fermentation wurde ein Nährmedium (Einspeislösung) hergestellt in der folgenden Zusammensetzung:

Na₂HPO₄ · H:O	2,0 g/l
KH^PO₄	2,0 g/l
(N H₄J₂SO₄	5,0 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0.2 g/l
FeSO₄ ■ 7 H₂O	22 mg/1
ZnSO₄ · 7 H₂O	20 mg/1
CaCl₂	20 mg/1
Lösung von Spuren
elementen	2 ml/1
Hefeextrakt	0,5 g/l
Äthanol (Su)	37,6 g/l

Das Medium (ohne Äthanol) wurde auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und 30 Minuten bei 116⁰C sterilisiert.

Mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit (D = μ) von 0,190 h-¹. 2000 UpM und einer Belüftung von 1,5 Vol./ Vol. χ min erhielt man die folgenden Ergebnisse:

S = Konzentration von Äthanol

in der Kultur 0,067 g/l
X = Konzentration von Biomasse

in der Kultur 25,12 g/l

YMib = Ausbeule (g Biomasse/g Substrat) 0,66

P = Produktivität 4,8 g/l χ h

Die Biomasse wurde abzentrifugiert und nach Waschen mit Wasser wurde sie im Vakuumofen

getrocknet. Die Zusammensetzung der Biomasse ist in Tabelle IH angegeben.

Tabelle III

Analysedaten der Biomasse von
Var. Harcourt855 A

6,25)

Feuchtigkeit

Aschen

N (Kjeldahl)

Rohe Proteine (N

Protein (Biuret) ;

Rohe Lipide

Fettsäuren

Lösliche Kohlenhydrate

Rohe Fasern

RNS

DNS

Elementaranalyse:

C = 46,10%
H = 6,71%
N = 8,32%

Prozentuale Zusammensetzung der Fettsäuren:
n-C_H 1,38%

n-Ci6 29,12%

Prototheca Zopfii,

0,60% 7,04% 8,45% 52,62% 45,70%

4,82%

3,08% 11,96%

2,50% 15,17%

0,42% n-Cu,:!·)

n-Ci8

n-Ci8: 1

n-Cu : 2

*) Doppelbindungen

0,90% 4,44% 28,46% 35,70%

Prozentuale Zusammensetzung der Aminosäuren (g/100 g trockener Biomasse)

1,88

0,779

5,11

3,03

1,73

1,56

4,85

3,13

1,98

2,26

2,11

0,83

1,12

Lysin

Histidin

Arginin

Aspartinsäure Threonin

Serin

Glutaminsäure Prolin

Glycin

Alanin

Valin

Methionin

Isoleucin

Leucin

Tyrosin

Phenylalanin Tryptophan

2,95 1,32 1,55 0,23

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von biologischen Proteinen durch Mikroorganismen der Art Proto- s theca, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Kulturmedium gewachsen sind, das Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Kulturmedium gewachsen ι ο sind, in dem Äthanol in einer Menge bis zu 4 Gew.-% enthalten ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur von 15 bis 40⁰C, vorzugsweise 30 bis is 38°C, durchführt,

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einem pH-Wert zwischen 1 und 8, vorzugsweise zwischen 3 und 5 durchführt.

5. Verwendung der Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Bioproteinen.