DE1903162A1

DE1903162A1 - Gaerungsverfahren zur Herstellung von Aminosaeuren

Info

Publication number: DE1903162A1
Application number: DE19691903162
Authority: DE
Inventors: Naslund Lars A; Lottleton Col Douros John D; William Lahl
Original assignee: Exxon Research and Engineering Co
Current assignee: ExxonMobil Technology and Engineering Co
Priority date: 1968-01-25
Filing date: 1969-01-23
Publication date: 1969-08-28
Also published as: CH506620A; NL6901218A; BE727371A; FR2000751A1; GB1230365A; US3562110A

Description

Gärungsverfahren zur Herstellung von Aminosäuren·

Die vorliegende Erfindung betrifft ein biosynthetlsches Gärungsverfahren zur Herstellung von hohen Konzentrationen an extracellulären Aminosäuren sowie die Verwendung der zu» rückbleibenden Zellen als Nahrungsmittel für Menschen und Tiere. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung einer Beschickung aus n-aliphatisehen Kohlenwasserstoffen mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, insbesondere von C₁₁ bis C-jQ n-Paraff inen, als Hauptkohlenstoff quelle eines solchen Gärungsverfahrene. Gemäß vorliegender Erfindung werden C₁₁ bis C-Q η-Paraffine mit einem Mikroorganismus unter Gärungsbedingungen in Gegenwart von Cellulose.in Berührung gebracht, wobei man extracelluläre Aminosäuren in hohen Ausbeuten erhält. Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.

Bisher erforderte die Herstellung von Aminosäuren wie tyein, Glutamin^* isoleucin, Valin und dgl. auf. mikrobiologischem Wege die Verwendung von teuren Kohlehydrat-Substraten und Precureoren, die der Gärbrühe zuzusetzen waren. Die Aus-

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BADORtQiNAl.

beuten an extracellulären Aminosäuren waren niedrig und die. Geschwindigkeit der Produktansammlung sehr niedrig.

Ein weiteres, erfolgversprechenderes Verfahren zur biologischen Synthese von extracellulären Aminosäuren und als Nahrungsmittel geeignetem Protein besteht darin, daß man Mikroorganiemen auf Petroleuir.substraten züchtet. Eine derartige Gärung findet gewöhnlich in einem wässrigen Bad statt, welches eine Kohlenwasserstoffbeschickung, den zu züchtenden Mikroorganismus, ein wässriges Wachstumsmedium, Sauerstoff, Stickstoff und andere unerlässliche Nährstoffe enthält. Bei diesem Verfahren können Kohlenwasserstoffe eingesetzt werden, die in den erforderlichen Mengen beliebig vorhanden und weniger teuer als Kohlehydrate sind. Εε ist ferner bekannt, bei Gärungsverfahren verschiedene biologische Katalysatoren einzusetzen. Das erfindun^sgemäße biosynthetische Verfahren kann auf die Biosynthese aller Mikroorganismen angewandt werden, die auf Beschickungen aus n-aliphatischen Kohlenwasserstoffen mit 1 bia 3ß Kohlenstoffatomen, insbesondere 11 bis 30 Kohlenstoffatomen, die aus entsprechenden Erdölfraktionen stammen, wachsen·

Während das erfindungsgemäße Verfahren mit zahlreichen bakteriellen Mikroorganismen durchgeführt werben kann, seien einige Mikroorganismen genannt, die zur Kohlenwasserstoff-Aesimilierung besonders geeignet sind. Diese Mikroorganismen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt, zusammen mit den entsprechenden Nummern, unter welchen sie bei der American Type Culture Collection, 212 V Street, Northwest, Washington 7, D.C. hinterlegt sind.

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BAD ORfQINAt Tabelle I

Klasse

Gruppe Familie

Stamm

Protophyta-

Schizomycetea-PteudomonadaIeι

«ο co u>

Peeudomonadaceae Pseudomonas

—Eubacteriales- -MicrococcaceaQi

-Micrococcue-
-Sarcina

-Brevibacteriaceae-Brevibacteri

-Achromobaeteracea—Alcaligens-

Corynebacteriaceai

-Cellumonas-

Specles

Liguetri-

Pseudomalle i-—Orvilla

No. ATCC

-15522 -I5523

Cerifleans-

■14987

-QKBl Natick

•InsectiphilJuni—15528

Healii 15527

Sp 15525

15526

-Coniynebacterium

St>-

-15529

—Arthrobactej>

HPausometabolum-l5530

— Simpleii 6946

Sp 19140

i-Actinomy ce tales -Mycobacteriaceae

•Actirtomycetaceae

Mycobacterium-Nocardia

■Rhodehrous

-Sp-

CD O CO

Der Mikrococcus cerifleans (1^987)» der durch Dr. R. Ε· Kallio et al, Journal of Bacteriology, Bd. 78, Nr. 3, S. ^l-14-48 (September 1959) isoliert und identifiziert wurde, ist besonders geeignet. Er wird wie folgt identifiziert: Morphologie

Die Zellen sind klein, kugelig, Neigung zu elliptischer Form bei alten Kulturen und Medien mit hohem Stickstoffgehalt.

Zellen aus definierten Medien sftzen einen Durchmesser von durchschnittlich 0,5 bis 1,5 Mikron, während bei Zellen aus komplexen Medien die Durchmesser bei durchschnittlich 1,0 bis 2,0 Mikron liegen. Die Zellen liegen einzeln oder in Klumpen vor. Es werden keine immotilen, metachromatischen Granuli und pseuanophilIsche Granulf beobachtet.

Die Bakterien sind gram-negativ. Kolonien auf definiertem Agar sind klein (1 mm), rund konvex, mit unversehrtem Rand. Kolonien auf näh·* Nähragar sind größer (2 bis 5 mm), veraehrt mucoid, im allgemeinen rund*

Innerhalb einer Species kann es viele verschiedene Stänae geben, die sowohl aus Var-ianten wie auch natürlichen und induzierten Mutanten bestehen« _:

Morphologie und Waeheturaseigenechaften der anderen, vorstehend aufgeführten Organismen sind dem U,S· Patent 3 035 zu entnehmen.

Die bein erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Medien enthalten eine wässrige Mineralsalzlösung und über· schlissigen Sauerstoff. Sauerstoff wird dem Medium oder der Görbrühe in beliebiger Form, in welcher er durch den Mikroorganismus leicht assimiliert werden kann, zugesetzt. Die Sauerstoffzufuhr kann auch durch sauerstoffhaltige Verbin« düngen erfolgen, soweit diese das Zellwachstum des Mikroorganismus und die Umwandlung der oxydierten Kohlenwasserstoffbeechickung in Zellen des Mikroorganismus nicht nachteilig beeinflussen. Der Sauerstoff kann in Form eines eauerstoff-

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SAD ORiSfNAL

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haltigen Gases, z.B. Luft bei Normal- oder erhöhtem Druck zugeführt werden, oder in Form von mit Sauerstoff angereichterter Luft, in welcher die Sauerstoffkonzentration bis zu 70 bis 90 i» betragen kann. Im allgemeinen werden etwa 0,1 bis 10, vorzugsweise etwa 0,8 bis 2,5 Volumenteile Luft pro Volumenteil Flüssigkeit im Gärgefäß zugeführt .

Für das biologische Wachstum ist ferner Stickstoff erforderlich. Als Stickstoffquelle kann eine organische oder anorganische stickstoffhaltige Verbindung dienen, die Stickstoff in einer Form freisetzt, in der er vom wachsenden Mikroorganismus verwertet werden kann. Geeignete organische Stickstoffverbindungen sind z.B. Proteine, säurehydrolysierte Proteine, enzym-hydrolysierte Proteine, Aminosäuren, Hefeextrakt, Asparagin und Harnstoff. Geeignet« anorganische Stickstoffverbindungen sind Ammoniak, Ammoniumhydroxyd, Salpetersäure oder deren Salze, z.B. AoDoniunphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und saures Ammoniumpyrophosphat. Eine bequem« und befriedigende Methode zur Sticketoffzufuhr stellt die Verwendung von Asmoniumhydroxyd, Anmoniumphosphat oder saurem Anmoniumphosphat dar, die entweder ale Salze zugesetzt oder in situ in wässrigen Gärmedium gebildet werden können, indem auui durch die Phosphorsäure enthaltende Gärbrühe Ammoniakgas leitet oder wässriges Ammoniak einspritzt, so dafl saures Amnoniunphoephat entsteht»

Auf diese Weise wird der gewünschte pH-Bereich aufrecht erfckltta und der erforderliche Stickstoff bereitgestellt. Der gewünschte pH-Bereioh liegt zwischen 5,0 und 8,5, B.B. bei etwa 7,0. Ammoniumhydroxyd kann dem Medium in Mengen von etwa 0,08 bis 0,20, vorzugsweise etwa 0₉1 bis 0,15~g Stickstoff pro g getrockneter gebildeter Zellen zugesetzt werden. Dies entspricht etwa 0,01 bis etwa 1,0, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,15 Gew.-54 Stickstoff, bezogen auf die gesamte Gärbrühe.

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BAD £Ä

Außer Sauerstoff und Stickstoff müssen auch bestimmte Mengen einepiger mineralischer Nährstoffe im Medium vorliegen, damit der Mikroorganismus entsprechend wachsen kann und die Assimilierung der, oxydierten Kohlenwasserstoffs durch die Zellen des Mikroorganismus einen Maximalwert erreicht. Kalium, MAtrium, Eisen, Magnesium, Kalzium, Mangan, Phosphor und ander-e Nährstoffe werden daher dem wässrigen Gärmedium zugegeben. Diese Stoffe können auf beliebige Weise zugesetzt werden, jedoch vorzugsweise in Form ihrer wasserlöslichen Salze.

Kalium kann in Form des Chlorids, Phosphate, Sulfats, Zitrats, Acetats und Nitrats zugegeben werden. Eisen kann als Sulfat oder Phosphat eingesetzt werden. Die Hauptphosphormenge wird gewöhnlich in Form von Ammoniumphosphat zugesetzt. Ammoniumphoephat und saures Ammoniumphosphat dienen sowohl als . Stickstoff- wi· auch als Phosphorquelle.

Eine zufriedenstellende Zusammensetzung eines insbesondere für Bakterien, ist bei Beginn der Fermentation folgende:

Konzentration

Komponente	Allgemeiner Bereich	Üblicher Bereich	Bevorzugter Bereich
C₁₁-Co₀ n-alipha-
tischer Kohlen wasserstoff	4-120	5-/80	10-50
Cellulose^x	2-60	2,5-40	5-25
K₂HPO₄	0,5-15	1-10	2-8
(NH₄J₂HPO₄	5-15	7-13	a-12
Ka₂SO₄	0,1-1,0	0,2-0,9	0,3-0,8
FeSO₄ · 7 H₂O	0,002-0,5	0,005-0,04	0,01-0,03
MgSO₄ · 7 HgO	0,1-0,7	0,2-0,6	0,3-0,5
MnSO₄ . 7 H₂O	0,002-0,05	0,005-0,04	0,01-0,03
HaCl	0,002-0,05	0,005-0,04	0,01-0,03
Wasser X. jm _ ^ m * ____	Best auf _ · __ _ · _ _ rm λ μ jm .	100 Gew.-Ji	\_ M _ m0 «k ._ «k _ _

Cellulose vorzugsweise in Streifen von etwa 3 bis 50 mm Breit· und 12 bis 150 mm Länge, Geeignete Streifen sind 6 mm breit

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BADORIGfNAL

und 25 mm lang.

Weitere, fakultativ zu verwendende mineralische Nährstoff« die in Spuren eingesetzt werden können, sind:

Konzentration (m£/l)

	H₂O	Allgemeiner	Üblicher	Bevorzugter
	• H₂O	Bereich	Bereich	Bereich
Komponente		0-0,4	0-0,3	0-0,2
ZnSO₄ ·		0-0,06	0-0,05	0-0,04
Na_?Mo0₄	5 H₂O	0-1,2	0-1,1	0-1,2
CoCl₂	6 H₂O	0-0,08	0-0,07	0_r0,06
H₃BO₃	6 H₂O	0-0,3	0-1,25	0-0,2
CuSO₄ ·	0-0,14	0-0,13	0-0,12
CaCl₂ ·	0-0,01	0-0,008	0-0,006
KiCl₂ .

Sowohl die essentiellen wie auch die fakultativen Nähr» stoffe können auch in Fora anderer Salze oder Säuren als der oben angegebenen verwendet werden.

Ein befriedigendes Medium wird wie folgt hergestellt: P--Medium

g/l Leitungswasser

(NH₄J₂HPO₄ 10

5 0,5

Hierzu werden 10 ooe pro 1 einer wie folgt hergestellt ten Sälslösung A zugegeben! '

g/l '

Salzlösung A destilliertes wasser >

*7H₂O 40

₄H₂O 2

MnSO₄·4Η₂0 2

NaCi 909835/10S0 2

Das beschriebene !--Medium besitzt einen pH-Wert von 7,8. Es kann variiert werden durch Zusatz des Phosphors in Form von Phosphorsäure.

Die Temperatur des Synthesebades kann zwischen etwa 20 und etwa 55⁰C variiert werden, je nach dem jeweiligen Mikroorganismus, doch liegen bei Bakterien die bevorzugten Temperaturen zwischen etwa and etwa 45⁰C, z.B. bei ca. 35°C. Der pH-Wert liegt vorzugsweise zwischen 5,5 und 8,5, z.B. bei ca. 7,0,

Die Kohlenstoffquelle, vorzugsweise die einzige Kohlenetoffquelle, let im erfindungsgemäßefj Verfahren ein n-aliphatischer Kohlenwasserstoff. Die n-aliphatische Kohlenwas* serstoffbeschickung enthält 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatone, vorzugsweise 11 bis 30 Kohlenstoffatome im Molekül. Eine geeigneteparaffinieche Beschickung besitzt beispielsweise folgende Zueanffieneetzungs

Oeradkettige Paraffine ■ Gemisch (Substrat A) -

^ci3	1,6
^C14	4,8
^CX5	323
^C16	29,8
^C17	22,6
^C18	8,1
^C19	0,8
	100,0

#it weisiger ale 0,01 Ji Aromaten.

Die Aufarbeitung der Zellen und der angesammelten Aasinosäuren in der Gärbrtihe kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die Zellen können zunächst von der Oärbrühe abgetrennt wer· den durch Zentrifugieren, durch Verwendung von CyeIonen oder Hydroclonen, durch Eindampfen, Piltration (z.B. Mikroporen· filtration, Dialyse, umgekehrte Osmose), Ausflockung, Absetzen

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BAD

und Dekantieren (z.B. durch Zusatz von Ausflockungsmitteln, Coagulantien oder Filterhilfsmitteln oder durch Änderung von pH oder Temperatur) oder eine sonstige Trennmethode, oder durch Kombination,solcher Methoden. Die abgetrennten Zellen können dann durch Sprühtrocknung, Tromrreltrockmmg, Gefriertrocknung, Vakuumtrocknung, Ofentrocknung oder dgl. getrocknet werden, wobei man ein Endprodukt mit.äußerst hohem Proteingehalt erhält, das feeine für Menschen oder Tiere,schädlichen Verunreinigungen enthält.

Die in der Brühe angesammelten, extracellulären Aminosäuren können durc-h fraktioniert© Kristallisation oder Eindampfen, Sprühtrocknung, Trommeltrocknung, Gefriertrocknung, Vakuumtrocknung, Ofentrocknung oder dgl. gewonnen werden. Auch kann man die Aminosäuren auf Ionenaustauscherharzen adsorbieren und aneohlldSend selektiv eluieren.

AIa Cellulose verwendet ean vorzugsweise Streifen aus Celluloseacetat oder Celluloseeäcke, die hergestellt werden, indem man Holspülpe mit Essigsäure, Essigsäureanhydrid und Schwefelsäure als Katalysator behandelt. Die Cellulose ist voll aeetylicrt (drei Acetatgruppen pro Glucoseeinheit), und gleichzeitig verursacht die Schwefelsäure einen Abbau des Cellulosepolytaers, so daß das Produkt nur etwa 200 bis 300 Glueoeeeinheiten pro Polymerkette enthält· das Celluloseacetat wird dann durch Zusats von wasser partiell hydrolysiert, bis raan durchschnittlich 2 bis 2,5 Äcetatgroppen pro Glucoseeinheit erhält· Das so erhaltene Produkt ist thermoplastisch·

Wie bereits erwähnt, wird überraschenderweise geraäS vorliegender Erfindung durch die Zugabe von Cellulose in Form von Streifen oder dgl. die Erzeu ung extracellulärer Aminosäuren merklich erhöht»

Die Erfindung sei anhand der beiliegenden Zeichnung näher erläutert. In der ZeAchrung ist ein Behälter oder Kolben 10 dargestellt, der mit ,einem·.-von zwei Löchern durchbohrten Stopfen, 1 verschlossen-ist. Ein Glasrohr 3 erstreckt sich durch

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den Stopfen" 1} an seinem oberen End*· befindet sich ein Dispo-Stöpsel 2_f und am unteren Ende ein Cellulosesack k. In dem ■--.-Cellulosesack 4 befindet sich eine konzentrierte P.-Salzlösung 5, und der Sack seinerseits befindet sich in Kochsalzlösung;, plus Substrat A 6,

Beispiel 1

In der in der Zeichnung dargestellten Vorrichtung wurde eine sterile aerobe Gärung durchgeführt. In den Cellulosesack wurden 20 ml eines sterilen 5* Konzentrats des P^-Mediums gegeben. 80 ml einer sterilen, 0,85#igen Kochsalzlösung, die 2,0 ml Substrat A enthielt, wurden in den Kolben gegeben. Die Salzlösung wurde mit einer/i l$igen Inoculum von Kikrococcus cerlficans ATCC Nr. 3Λ98?, das Zk Stunden lang auf Substrat A gezüchtet worden war, inoculiert. Die Gärung wurde auf einer Schüttelmaschiae mit 300 U.p,M„ bei 30⁰C 72 Stunden lang durchgeführt· Periodisch wurden Profeen entnommen, aus denen Bakterienzellen und andere Verunreinigungen abzentrifugiert wurden; äasm wurde di© Menge an extracellulären Aminosäuren ins klaren Zenfcrifugst nach den nachfolgend angegebenen Methoden feestimst. Kachweisaethoden sind in Mlkrobiological Assay of the Vitaain B-Ko!fipl#x and Amino Acids (1952), E. C, Barton Wright, Fltnan Publishing Corp._s M©w York/ N.Y., 2_e Auflage, beechrieben, Ferner wurde mit dem Technicon Auto Analyzer, gearbeitet, einem automatischen Analysiersystem auf der Basis lonenaustauech-Chroinetographiej, entwickelt von Spademan^ Moore und Stein,

Die Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle ΪΙ &u entnehmeni

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BAD ORIGINAL.

CO
O
(O
00

• Herstellung extracellul&rer Aminosäuren mit Mikrocoocm Cerlflcane (14987) Gärungsbedingungen

Inoculum M, cerifleans (ml) Substrat A (ml) 2,0 Celluloee-Saek '.. J^a Dauer (Tage) "3

Alanin

AlIo-Isoleucin

Arginin

Asparaginsäure Cysteinsäure Glutaminsäure

Cystin

Glycin

Histidin

Isoleucin

Leucin

1,0 0 1	t	,1,0 2.0 nein 1	1,0 2,0 ja	1,0 ■ 2,0 nein 2	1,0 2,0 ,1a 2	1,0 2,0 nein 3	1,0 2,0 ja. 3	I	1903
		•17	3720	78	2850	49 .	4610
		720	P	760		840	I
	18	1520	87	780	60	1810
	21	4120	109	2540	68	4610
		260		210		260
	24	7090	123	5640	87	8260
		P		P		P
	29	3070	144	2030	78	3160
		1300	- P	970	P	2680
		1370	P	450	P	1830
*' \*	7	2910	34	870	P	2390




\

Inoculum H« eerifleans (ml) Substrat A (ml) Cellulose-Saek Dauer (Tag·)	2,	0 0 la	_f ■	1	tO 0 Ja 3	/	1,0 2,0 nein	" 1,0 2,0 Ja	1,0 2,0 nein 2,	1,0 2,0 ja ... 2	2660	1,0 2,0 nein 3	1,0 2,0 3 :..■	I
■ , ^ . , ■ . ' , . .	4	V	)	, /	I	) r		mg/1	Aminosäuren	P			ta
Lysin						3650	■' ·ρ· ^:·	440	P	3970	' Ϊ
Methionin						80	P	3640	P	P
Meth.-SuIfoxid						440	25	4680	10	920
Ornithin						5100	?■	950		2120
Phenylalanin	*	'S,·« ' ■	25	5440	124	1850	268	3790
Prolin	4	.4 ·, ^:		1240		1240		1800
Serin			19	4260	94	100	80	3250
Threonin			*:■■?:/■*	2140	34	1230	P	235Ο
Tyrosin			•, , ■■ ■;··'	590	P	33890	"■■■Ζ.	920
Valin	' Λ		10	2350	50	P	2490
Gesamt, mg/l	(	(	182	51370	902	700	5206O

P » Spuren

Beispiel 2

Weitere aerobe Gärungen wurden mit Cellulosestreifen durch« geführt. Drei sterile Gärungen erfolgten in Gärkolben von 500 ml Inhalt, aie 100 ml des P^-Mediums, 2,0 ml Substrat A und I₉Og Csllulosestrelfen (6 χ 25 mm) enthielten. Das Medium wurde mit 1% Inoculum von Mlkrococcus cerlficans ATCC Nr* 14987 inoculiert» Dl© Gärungen erfolgten auf Schütte!« maschinen mit 300 U.p.M· "bei 30⁰C. Nach 1, 2 be?· 3 Tagen wurden die Kolben von der Schüttelmaschine entfernt und wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet und untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle JXX zusammengefaßts

	Total	Tabelle	III	2-tägige	3-tägige Gärung
	1-tägige	mg/1	mg/1
Aminosäure	mg/1	758	564
Allo-isoleucla	868	36IO	2710
Alanin	2555	869	389
Arginin	854	3758	1860
Asparaginsäure	2932	905	562
S-Amino8äuren	202	4635	3116
Glutaminsäure	4619	4733	2783
Glycin	1914	1286	374
Leucin	1056	II52	977
Histidin	1321	907	246
Iaoleucin	662	1444	1577
Ornithin	2398	5735	3235
Phenylalanin	4071	924	360
Prolin	731	I690	1090
Serin	1332	523	124
Ty roe in	243	1243	533
Valin	13^5	34172	20540
27103

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Claims

Patentansprüche

1_β. Gärungsverfahren zur Herstellung extracelluiärer Aminosäur&n_t dadurch gekennzeichnet, daß man eine Erdölkohlenwasserstofffraktion in einer ßärbrühe einsetzt, die ein wässriges, anorganisch®» Salze enthaltendes Wachstumsmedium, sauerstoffhaltiges Ges₉ und einen in Gegenwart von Cellulose und unter Fermente ti on» bedingungen zum Wachstum auf der Kohlenwasser, stoff fraktion befähigten Bakterien-Organiansui enthält« .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daS dieKohlenwasserstofffraktion im wesentlichen aus Nor· malparafflnen mit 11 bis 30 Kohlenstoffatomen besteht.
3e Verfahren nach Anspruch 2_t dadurch gekennzeichnet, daß die Köhlenwasßerstoffr&lction aus Hormalparaffinen mit 1-3 bis 19 Kohlenstoffatom» bestehtg wobei die Fraktion mit 15 bis 1? Kohlenstoffatomen siehr als 80 Gew«-£ ausmacht«
b» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, &&S oan die Cellulose in Form von Streifen aus Celluloseace» tat o&er Celluloeesäcken einsetzt^ wobei das Cellulosemateriai durch Behandlung τοη Holapülpe »it Säure hergestellt wurde»
5· Verfahren naoh Anspruch 4, dadurch gekennzeiehnet, daS sftia voll »eetylierte Cellulose verwendete
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß saan als Mikroorganismue. Mikrococcus cerificani ATCC Nr, 1^987 verwendet,den pH-Wert las Bereich von 5,0 bis 8,5 und dl· Temperatur im Bereich swischen etwa 25 und ^5°C Mit» ·

Pur Esso Research and Engineering

Company

Linden, New Jersey, V.St.A·

0S835/10S®

r- ■'*''.·· Hechtsanwalt

BADORfGINAL