DE2629568C3 - Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und DerivatenInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten
durch Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln an Ionenaustauschern das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man die Chromatographie an basischen Ionenaustauschern mit gepufferten Lösungsmitteln
durchführt, in denen nichtionische Detergentien gelöst sind.
Es ist bereits bekannt, daß Peptide gleichen oder ähnlichen Molekulargewichts, die sich in ihrer Basi/.ität
oder Azidität unterscheiden, an Ionenaustauschern getrennt werden können. Diese Methode versagt
jedoch, wenn die unterschiedlichen Peptide miteinander Komplexe bilden, die während der Ionenaustauscherchromatographie
erhalten bleiben. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, hat man im Elutionsmittel
dissoziierende Bedingungen zu wählen. Bisher hat man zu diesem Zweck in den zur Elution verwandten Puffern
z. B. entweder Harnstoff oder Harnstoffderivate in hohen Konzentrationen (5 M —9 M) aufgelöst oder man
hat in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln gearbeitet. So wurde z. B. Insulin an dem
Ionenaustauscher Amberlite® IRC in Phosphatpuffer mit 5 M — 8 M Harnstoff Chromatographien (R. D. CoIe,
J. Biol. Chem. 235,2294 [I960]). Aus der GB-PS 8 81 855
und auch aus Diabetes 21, Suppl. 2 (1972), S. 649 - 656 ist
die Verwendung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise Äthanol, bekannt.
Extreme pH-Werte, die ebenfalls dissoziierend wirken, sind wegen der Empfindlichkeit der Peptide gegen
solche Bedingungen nicht anwendbar. Die bisher bekannten Verfahren hatten aber verschiedene Nachteile.
So ist die Isolierung der Substanzen aus harnstoffhaltigen Puffern schwierig und zeitraubend;
ferner können im Harnstoff Verunreinigungen enthalten sein, die mit Peptiden wie Insulin reagieren. Bei der
Verwendung von Äthanol als organisches Lösungsmittel bereitet die Wiederverwendbarkeit des Ionenaustauschers
Schwierigkeiten, zum anderen ist die Ionenaustauscherchromatographie mit einem hohen Verlust an
Peptid, z. B. Insulin verbunden. Schließlich besteht die Gefahr des Denaturierens der höhermolekularen
Peptide in organischen Lösungsmitteln wie das für Insulin in 60%igem Alkohol bei pH 7 bekannt ist.
Überraschenderweise wurden nun gefunden, daß diese Schwierigkeiten durch die Verwendung von
nichtionischen Detergentien zur Dissoziation der Peptide umgangen werden können.
Die Wiederverwendbarkeit der Austauscher bereitet keine Schwierigkeiten. Eine Denaturierung der Peptide
ist nicht zu beobachten, die Isolierung ist einfach und erfolgt durch Fällung der Peptide mit geeigneten
Fällungsmitteln und eventueller anschließender Kristallisation. Die Ausbeuten sind deutlich größer als bei der
Verwendung von organischen Lösungsmitteln als dissoziierendes Agens.
Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich auf Insuline aller Spezies, auch Humaninsulin, Insulinanaloge
z. B. Des-Phe-Bl-Insulin und Insulinderivate z. B.
Insulin-B-Kettensulfonat.
Diese Verbindungen können sowohl in verhältnismäßig unreinem Zustand als auch in vorgereinigter Form
ίο (z.B. durch Gelchromatographie) eingesetzt werden.
Insulin ist nach mehrfacher Kristallisation und auch nach Gelchromatographie noch mit Insulin-ähnlichen
Begleitstoffen sehr ähnlichen Molekulargewichte* verunreinigt,
die sich bei passend gewähltem pH in ihrem Ladungszustand untereinander und vom Insulin unterscheiden,
aber mit Insulin Komplexe bilden. Beispiele solcher Substanzen sind: Desamidoinsuline, Arginin-
und Diarginininsulin, Insulin-äthylester. Sie sind weder durch Gelchromatographie, noch durch lonenaustau-Scherchromatographie
in nicht dissoziierend wirkenden Elutionsmitteln von Insulin abtrennbar.
Geeignete Ionenaustauscher für die Reinigung von Insulin und Insulinanalogen sind die Handelsprodukte
Dowex l.QAE-Sephadex, Biogel DM, DEAE-Sephadex,
Amberlyst A 21 und A 29, DEAE-Sepharose CL 6B, DEAE-Cellulose. Besonders gut eignen sich für die
Reinigung von Insulin, Insulinanalogen und Insulinderivaten basische Ionenaustauscher auf Dextranbasis wie
DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex.
Der Ionenaustauscherprozeß wird in einem gepufferten, wäßrigen Lösungsmittel durchgeführt, in dem
nichtionische Detergentien aufgelöst sind.
Als solche seien beispielsweise genannt:
Als solche seien beispielsweise genannt:
Palmitylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Stearylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Oleylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Nonylphenolpolyglykoläther
Stearylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Oleylsorbitanpolyäthylenglykoläther,
Nonylphenolpolyglykoläther
(10-30 MOL Äthylenoxid/Mol Nonylphenol),
Polymerisationsprodukte aus Propylenoxid und
Polymerisationsprodukte aus Propylenoxid und
Äthylenoxid (10- 80% Äthylenoxidanteil),
Fettalkoholpolyglykoläther und Polyglykol-
Fettalkoholpolyglykoläther und Polyglykol-
äther von synthetischen Fettalkoholen.
Von besonderem Vorteil sind Fettalkoholpolyglykoläther, da sie gut wirksam sind, leicht zu handhaben sind
und keine UV-Absorption im Bereich der Absorption von aromatische Gruppen enthaltenden Peptiden
zeigen, was die Erkennung der Peptide im Eluat erleichtert. Außerdem sind diese Verbindungen biologisch
voll abbaubar, was ihre Verwendung im Hinblick auf die Umweltbelastung problemlos erscheinen läßt.
Die Elutionsmittel enthalten immer eine Puffersubstanz, um den pH-Wert des Elutionsmittels zu regeln.
Vorzugsweise wird bei einem konstanten pH-Wert gearbeitet. Bei Verwendung eines Anionenaustauschers
kann man pH-Werte zwischen 5,5 und 10 vorzugsweise
zwischen 6 und 9 verwenden. Geeignete Puffersubstanzen sind iiteraturbekannt.
Die Temperatur der lonenaustauscherchromatographie muß konstant gehalten werden und liegt zwischen 0 und 5O0C vorzugsweise zwischen 15 und 30°C.
Die Temperatur der lonenaustauscherchromatographie muß konstant gehalten werden und liegt zwischen 0 und 5O0C vorzugsweise zwischen 15 und 30°C.
Die zur Elution verwandten Lösungen enthalten außer den Puffersubstanzen und nichtionischen Detergentien
noch einen Elektrolyten, vorzugsweise ein Neutralsalz wie NaCI in Konzentrationen zwischen 0,01
M und 0,5 M vorzugsweise zwischen 0,05 M und 0,3 M oder man eluiert mit einem Elektrolytgradienten durch
kontinuierliches Zumischen eines elektrolythaltigen
Puffers zu dem Elutionspuffer ohne Elektrolyt, der
ansonsten die gleiche Zusammensetzung hat, in der Weise, daß die Konzentration des verwendeten
Elektrolyten in Abhängigkeit des Elutionsvolumens steigt, und zwar vorzugsweise in linearer Abhängigkeit.
Die Endkonzentration an Elektrolyt liegt zwischen 0,1 M und 1 M, vorzugsweise zwischen 0,3 M und 0,8 M.
Die erfindungsgemäße Reinigung von Peptiden wird an den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht.
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
1% Genapol® SE 150
1% Genapol® SE 150
(Fettaikoholpolyglykoläther)
Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
Ein Teil des obigen Puffers wird mit 0,5 Moi/1 NaCI
versetzt. 450 g DEAE-Sephadex® A 25 werden in obigem Puffer gequollen und die Suspension anschließend
in eine Säule von 0 5 cm und der Länge 100 cm gefüllt Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht
gebracht. 5 g Insulin, das aus Citratpuffer kristallisiert wurde, werden in 75 ml des obigen Puffers (ohne NaCl)
gelöst. Der End-pH beträgt 8,3. Die klare Lösung wird auf die Säule gegeben und bei 25° C mit einer
Geschwindigkeit von 320 ml/Std. mit obigem Puffer (pH 7,0) eluiert, wobei ein linearer NaCl-Gradient in der
Weise angelegt wird, daß die NaCl-Konzentration im Eluat bei Durchlauf von 5,5 1 Puffer von 0 auf 0,33 M
steigt. Fraktionen von 22 ml werden gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm
gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (von 0,1 M-0,24 M NaCl) (1540 ml) wird
gesammelt und mit 70 ml l°/oiger ZnCb-Lösung versetzt. Das amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert
und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden Citratpuffer kristallisiert.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 3,76 g (75,2%).
1%iger ZnCl2-Lösung versetzt. Das amorph ausgefallene
Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltenden
Citratpuffer kristallisiert
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 185 mg (61,6%).
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung ίο hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 2% Genapol® SE 150(siehe Beispiel 1)
Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt
Anteile dieses Puffers werden mit 0,05 Mol/l, 0,1 Mol/l, 0,2 Mol/l und 0,3 Mol/l NaCI versetzt
450 g DEAE-Sephadex® A 25 werden im obigen Puffer mit 0,05 M NaCl gequollen und die Suspension
anschließend in eine Säule von 0 5 cm und der Länge 100 cm gefüllt. Die Säule wird mit dem Puffer ins
Gleichgewicht gebracht
5 g Insulin (siehe Beispiel 2) werden in 100 ml des obigen Puffers (0,05 M NaCl) gelöst (End-pH: 8,4), auf
die Säule aufgetragen und bei 25°C mit einer Geschwindigkeit von 290 ml/Std. eluiert Es werden
Fraktionen von 28 ml gesammelt. Nach Durchlauf von 1,82 I des Puffers mit 0,05 M NaCl werden 4,761 Puffer
mit 0,1 M NaCI, 2,24 1 mit 0,2 M NaCl und schließlich 5,31
mit 0,3 M NaCl aufgegeben. Die UV-Extinktion des Eluats wird kontinuierlich gemessen und aufgezeichnet.
Die Hauptmenge des Insulins wird hier nach Aufgabe
des Puffers mit 0,3 M NaCl eluiert. Der zentrale Teil des Insulinpeaks wird gesammelt (820 ml) und mit 37 ml
l%iger ZnCl2-Lösung versetzt. Der amorphe Niederschlag
wird abzentrifugiert und das Insulin sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton enthaltendem
Citratpuffer kristallisiert.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 2,84 g (56,8%).
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 2,84 g (56,8%).
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung
hergestellt: 45 hergestellt:
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
0,12MNaCl
1 % Genapol® ZDM 110 (Polyglykolether von
geradkettigen, synthetischen Fettalkoholen
(durchschnittliches Molekulargewicht 190)
mit 11 Mol Äthylenoxid/Mol Fettalkohol)
geradkettigen, synthetischen Fettalkoholen
(durchschnittliches Molekulargewicht 190)
mit 11 Mol Äthylenoxid/Mol Fettalkohol)
Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
13 g QAE-Sephadex® A 25 werden in obigen Puffer
gequollen und die Suspension wird in eine Säule von 0 1,5 cm und der Länge 30 cm gefüllt. Die Säule wird
mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht. 300 mg Insulin, das nach der Kristallisation noch durch
Gelchromatographie an Sephadex G 50 in an sich bekannter Weise von höhermolekularen Bestandteilen
weitgehend befreit worden war, werden in 15 ml des obigen Puffers gelöst (End-pH: 8,2). Die klare Lösung
wird auf die Säule gegeben und bei 250C mit einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std. mit dem obigen Puffer
(pH 7) eluiert. Fraktionen von 7 ml werden gesammelt. Im Eluat wird kontinuierlich die UV-Extinktion bei
278 nm gemessen und aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks (620 ml) wird gesammelt und mit 28 ml
0,1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 5% Genapol® SE 100(Fettalkohol-
polyglykoläther)
so Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
so Der pH-Wert wird mit HCl auf 7,0 eingestellt.
Ein Teil dieses Puffers wird mit 0,5 Mol/l NaCI versetzt
13 g DEAE Sephadex® A 25 werden im obigen Puffer
gequollen (ohne NaCl) und die Suspension anschließend in eine Säule von 0 1,5 cm und der Länge 30 cm gefüllt.
Die Säule wird mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht. 300 mg Insulin (siehe Beispiel 2) werden in
15 ml des obigen F'uffers (ohne NaCl) gelöst (End-pH:
8,3). Die klare Lösung wird auf die Säule aufgetragen und bei 25°C mit einer Geschwindigkeit von 48 ml/Std.
eluiert, wobei ein linearer NaCl-Gradient in der Weise angelegt wird, daß die NaCl-Konzentration im Eluat bei
Durchlauf von 500 ml Puffer von 0 auf 0,5 M ansteigt. Es werden Fraktionen von 7 ml gesammelt. Im Eluat wird
kontinuierlich die UV-Extinktion bei 278 nm gemessen ui:w aufgezeichnet. Der zentrale Teil des Insulinpeaks
(von 0,09M-0,22M NaCI) (100ml) wird gesammelt
und mit 4,6 ml l°/oiger ZnCb-Lösung versetzt Das
amorph ausgefällte Insulin wird abzentrifugiert und sodann in an sich bekannter Weise aus einem Aceton
enthaltenden Citratpuffer kristallisiert.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 160 mg (533%).
Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von 1% Arkopal® N 100 (Nonylphenolpolyglykoiäther mit 10
Mol Äthylenoxid/Mol Nonylphenol) als Detergent.
Die kontinuierliche UV-Messung muß wegen der Eigenabsorption des Arkopal N 100 als Differenzmessung
durchgeführt werden.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 214 mg (713%).
Wie Beispiel 4 nur unter Verwendung von 2% Arkopal® N 300 (Nonylphenolpolyglykoiäther mit
30 Mol Äthylenoxid/Mol Nonylphenol) als Detergent und von QAE-Sephadex® A 25 als Ionenaustauscher.
Die Ausbeute an reinem Insulin beträgt 156 mg (52%).
Die kontinuierliche UV-Messung muß wegen der Eigenabsorption des Arkopal N 300 als Differenzmessung
durchgeführt werden.
Die in den Beispielen verwandten Detergentien sind Handelswaren der Firma Hoechst AG.
Die in den Beispielen verwandten Ionenaustauscher sind. Handelswaren der Firma Pharmacia Fine Chemicals.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten durch Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln an Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographie an basischen Ionenaustauschern mit gepufferten Lösungsmitteln durchführt, in denen nichtionische Detergentien gelöst sind.
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