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Verfahren zur Herstellung von reinen Vitamin-B12-Präparaten mit Hilfe
der chromatographischen Methode Die Erfindung betrifft ein Verfabren zur Herstellung
voll reinen Vitamin-B12- Präparaten mit Hilfe der chromatographischen Methode.
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Bereits seit langerer Zeit wird die Chromatographie verwendet zur
Analyse und Trennung von verschiedenon Stoffen. Man hat auf diese Weise die verschiendenen
Faktoten der Vitamin-B12-Gruppe unterscheiden können, Vor kurzem hat man mit dieser
Methode auch das Vitamin B12 sell>st al> trennen können, Es hat sich gezeigt,
daß diese Methode nicht nur zu analvtischen, sondern auch zu präprativen Zwecken
gecignet ist. Lester Smith e. s., s. Proc, of the Royal Biochem, Soc. 41 (1948)
VIII, wendete diese Nlethode bei der Reinigung von Vitamin-B12-Konzentraten an.
Hierbei wird das Konzentrat in einer verdünnten Ammoniumsulfatlösung aus der Lösung
adsorbiert an Adsorhentien, beispielsweise Aluminiumoxyd. Durch Hinzufügen des Ammoniumsulfates
wird das Vitamin B12 an dem Adsorbeus adsorbiert. Diese in der Chromatographie angewendete
Adsorption nennt man Aussalzadsorption. Ohne das Ammoniumsulfat in der wässerigen
Lösung zeigen viele Adsorbentien keine Affinität zum Vitamin B12, Die Reinigung
des Vitamin B19 Konzentrates nach Lester Smith läßt jedoch viel zu wünschen ührig.
Die Umständlichkeit des Verfahrens hildet hierbei den größten Nachteil. Das Präparat
wird nämlich durch heträchtliche Mengen Ammoniumsulfat verunreinigt und muß von
diesen Verunreinigungen wieder ab-
getrennt werden, Besonders hei
Präparaten. die sich auf der Grenze der Kristallisation Lefinden, ist dies ein großer
Nachteil.
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Es vurde nun gefunden, daß ein überraschend günstiger Effekt bei
der Reinigung von Vitamin-B12 Präparaten erreicht werden kann, indem der Lösung
der zu reinigenden Vitamin-B12-Präparate keine Salze. sondern gewisse organische
Flüssig keiten oder ihre Gemische zugefügt werden. Das Vitamin B12 wird auf diese
Wcise so vollständig gereinigt, daß es direkt als reine, dunkelrote Kristalle gewonnen
werden kann. Die der Lösung beizugebenden organischen Flüssigkeiten solen mit d@n
Lösungsmittel. in dem sich das Vitamin B12 befindet, mischbar sein, und sie müssen
dasselbe aus seiner Lösung präzipitieren können. Man verwendet loei dieser Reinigung
eine solche Kooozentration der organischen Flüssigkeiten im Lösungsmittel. daß das
Vitamin B12 gerade aufgelöst wird. Die das Vitamin B12 begleitenden Verunreinigungen
warden in der Hauptsache niedergeschlagen. Beispiele von organischen Flüssigkeiten,
die sich zu diesem Zwecke eignen. sind Aceton, Dioxan und Diäthylketon. Besonders
die zwei ersterwähuten zeichnen sich durch eine besonders gute Wirkung aus, 1 )as
vorliegende Verfahren ist insbcsondere geeigliet für die letzte Reinigung des Vitamin
B12.
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Dieses ist ist gewöhnlich mit amorphem, weniger löslichen Material
gemischt. das zusammen mit Vitamin 1312. beispielsweise mittels Aceton, aus einer
wässerigen Lösung niedergeschlagen werden kann.
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Nach Chromatographie eines derartigen Vitamin B12 enthaltenden Präparates
mit einem Gemisch von \Vasser und Aceton über gereinigtem Aluminiumoxyd kann das
Vitamin B12 in der Form reiner Kristalle erhalten werden. Chromatographie über Aluminiumoxyd
einer wässerigen Lösung voll stark gereinigtem Vitamin B, 2 ohne Aceton zeigt iil)
erhaupt keinen Effekt, Die ganze Lösung durchläuft die Säule.ohne daß auch nur die
geringste Trennung erfolgt, Es wurde noch gefunden, daß bei anwendung eines Aceton-Wasser-Gemisches
als Eluierungsmittel ein l>esonders günstiges Verhältnis bei etwa 70 volumprozent
Aceton und 30 Volumprozent Wasser liegt: bei Verwendung eines Dioxan-Wasser-Gemisches
liegt das günstigste richtige Verhältnis 1 ei etwa 90 Volumprozent l) ioxan und
to Volumprozem Wasser, Es ist noch festzustellen, daß maii nicht auf Wasser als
Lösungsmittel fiir die Vitamin-B12-Präparate hbeschränkt ist auch andere Lösungsmittel,
beispielsweise Methanol, Äthanol oder Phenol, könnenverwendet werden.
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Beispiel I Eine Säule Voll 20 g neutralem Aluminiumoxyd wird mit
wasserfreiem Aceton vorgespült. Die Bänge der Säule beträgt ungefähr 10 cm. Daraufhin
werden 100 mg eines roteii pulverförmigen Vitamin-B12-Präparates, <las nicht
zur Kristallisation gebracht werden kann und nach mikrobiologischer Eichung 25 +
5 mg Vitamiii B1 enthält, auf tlie Säule gebracht, jetzt spiilt maii gründlich Illit
wasserfreiem Acetoii nach. II Hierbei tritt gar keine Verschiebung der roten Farbe
auf, während in dem Eluat nach Verdampfung kein Trockenrest zurückbleibt, Daraufhin
wird das Eluierungsmittel nach uiid nach ersetzt durch t Gemische von 95% 7o Aceton
und 5% Wasser. 90% Aceton und 10% Wasser usw. (Es sind stets Volumprozent genannt.)
Bei cinem Gemisch von 15 85% Aceton und 15% Wasser tritt ein rotes Band auf. das
sich schr langsam der Säule eutland verschicbt, Außerdem wird rias Band stets breiter,
da si stch iii dieser Konzentration von Aceton in Wasser wenig von dem Vitamin-B12-Konzentrat
löst, 1 stellte sich heraus, daß das Verhältnis 70% Aceton und 300/0 Wasser erst
das richtige war. liii tief dunkelrotes Band mit eiiier Breitt von nur 2 bis 3 cm
verschebt sich nun durch die Säule, Wie sich später ergibt, enthält dieses rote
Band das reine Vitamiit B12. f)as hieraus erhaltenel Praparat liat gemäß mikroh9iologischer
Eichung cine aktivität, die mit einer Menge von 20 t 5 mg Vitamin B12 übereinstimmnt.
Durch Erhöhung der Acetonkonzentration kristallisieren 17 mg des gereinigten Produktes
in großen roten Kristallen aus. und es hat sich auf Grund des Kobalt- und Phosphorgchaltes
bei einer Analyse mit Hilfe von Papierchromatographie und mikrobiologischer Eichung
erwiesen, da diese Kristalle aus reinem Vitamin B12 bestehen.
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Oben in der Säul; ist cin rotes Band hängen geblicben, das sich bei
Eluieren mit cinem Wasser-Aceton-Gemisch mit weniger Aecton nur schr langsam versch
iel<t. NIl t \\isse 1. rli;ilt iiiaii elli Eluat, das eine Vitamin-B12-Aktivität
von t 2 mg zeigt. das cine rote Farbe bestizt und nach Eindampfung ein Ge w lclit
v<i1I 70 ii) liat . 1) es 1 <ri <.t rat crgil <1 keine Kristalle mehr.
11 lierill sind praktisch alle Verunreinigungen des ursprimglich,n Priaparates konzentriert,
B e i s p i e l 1 1 984 mg eines Vitamin-B12-Konzentrates werden m Pulverform auf
eine Adsorptionssäule von 15 g g Aluminiumoxyd mit einer Länge von 9cm gebracht,
die mit wasserfreiem 1 Dioxan vorgespült worden ist.
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Man spült daranfhin mit wasserfreiem Dioxan nach. Daraufhin wendet
niaii als Fluierungemittel ein Gemisch vonm ungefähr 95% Dioxan und 5% Waser an.
Hierbei sickert ciii roter Stoff eiuigermaßen in die Säule ein, verschiebt sich
jedoch darin fast nicht. Bei Verwendung eines @ Gemisches von ungefähr 90% Dioxan
und 10% Wasser tritt eine Verschiebung des roten St Stoffer atif. wobei iiacli ciniger
Zeit das folgende Bild entsteht : als schnellste Fraktion ist ein orangengelbes
Rand sichthar, das ausgezeichnet cinzeln aufgefangen wcrden katin. Diese Fraktion
litt nur sehr geringe mikrobiologische B12-Aktivität und ein Trockengewicht +-on
42 mg. 11 Hinter dieser Fraktion ist eine rote Fraktion sichtbar. zwar n lelit in
der Form cines shcmalen Bandes, doch einigermaßen diffus über einen breiten Teil
der Säule verteilt Nach Elulérung des orangeugelben Bandes wird die rote Fraktion
aufgefangen. 1 )ie.se zeigt eine Vitamin-B12 Aktivität. die mit dem größten Teil
der Aktivi-
tät des ursprünglichen Präparates übereinstimmt.
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Sie läßt sich glatt zur Kristallisation bringen. Di Ausbeute beträgt
123 mg an Vitamin-B12-Kristallen.
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Die nach der Kristallisation übriggebliebene Mutterlange enth. ilt,
73 mg trockenen Stoff, der nicht zur Kristallisation gebracht w erden kann. oben
in der Säule bleibt oin rotes Band zurück, das sich bei Eluieren mit einem Gemisch
mit einem geringen Gehalt an Dioxan nur langsam verschiebt. Diese Fraktion laßt
sich am besten mit Wasser allein eluieren, Nach b Trocknung durch Verdampfen beträgt
das Gewicht dieser letzten Fraktion ungefähr 750 lug: ihre Farbe ist rot, sie besitzt
einige mikrobiologisch nachzuweisend@ Vitamin-B12-Aktivität. kann jedoch nicht zur
Kristallisation gebracht werden, Beisip piel III 322 mg ines roten Vitamin-B12-Konzentrates
werden auf eine Säule von 20 g neutralem Aluminiumoxyd gehyacht. die mit wasserfreiem
Aceton vorgespult worden ist. Man spült mit wasserfreiem Aceton nach und ersetzt
daraufhin das Aceton durch Aevton-Methanol-Gemische, wobei die Konzentration des
Methanols mit Sprüngen von beispielsweise 5% erhöht wird, Es zeigt sich nun, daß
mit einem Cemisch von 70% Aceton und 30% Methanol eine geringe Verschiebung eines
gelben Bandes auftritt. Durch Eluicren mit einem Gemisch von 55% Aceton und 45%
Methanol kann die gelbe Fraktion, verunreinigt mit ein wenig rotem Stoff, aufgefangen
werden, Sofort darauf folgt bei Anwendung desselben Eluierungsmittels eine rote
Fraktion, im vorliegenden Fall über einen großen Teil der Säule verstreut. Wenn
die Säule von dieser Fraktion befreit ist, sieht man oben in der Säule ein breites
hraunes Band, das zurückgebliehen ist.
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Letzteres kann mit Wasser eluiert werden.
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Die rote Fraktion. die mikrobiologisch ungefähr 750/0 der gesamten
Anfangsaktivität besitzt, kann sofort zur Kristallisation gebracht werden und liefert
27 mg Kristalle. Die mit Wasser eluierte Fraktion hat ein Trockengewicht von 2/3
mg, besitzt eine dunkelrote Farbe und ist amorph.