FI61490B - Foerfarande foer rening av insulin dess analoger och derivat - Google Patents

Description

KBvl W utlä%Tn61490 jpV9 c uLK** r :N·!NQ’SKw" i9.!".

• (45) Patent scad: lat 's (51) Kv.ik?/int.ci.3 C 07 G 7/00, C 07 o 103/52 SUOMI-FINLAND (21) PMunttlhakumu*— PttMitaiw6ltnlng 772023 (22) Hak*ml*p»lvl — Aiu&knlngtdag 2 9 · θ6.7 7 (23) Alkupilvi — Glltighatidag 29.06.77 (41) Tullut JulkfMk·! — BUvit offentllg 02.01.78

Patentti· ja rekisterihallitut .... . ... .

_ (44) NlhUvtktlpanon |a kuuL|ullul*un pvm. — , „

Patent- och registerstyrelsen Aiuökm uttmgd och uti.>kdft«n pubikarad 30. Oi .82 (32)(33)(31) Pyydetty ttuolkmis —Buglrd piioritat 01.07» 76

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken

Tyskland(DE) P 2629568.1 (71) Hoechst Aktiengesellschaft, 6230 Frankfurt/Main 80, Saksan Liittotasa valta- Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Manfred Zoltobrocki, Frankfurt/Main, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepub-liken Tyskland(DE) (Jk) Qy Kolster Ab (5i) Menetelmä insuliinin, sen analogien ja johdannaisten puhdistamiseksi -Förfarande för rening av insulin, dess analoger och derivat

Keksintö koskee menetelmää insuliinin, sen analogien ja johdannaisten puhdistamiseksi vesipitoisissa, puskuroiduissa liuottimissa ioninvaihtokromatografian avulla, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että käytetään emäksistä ioninvaihtajaa ja että puskuroitu liuotin sisältää vähintään yhtä ei-ionista detergenttiä.

On tunnettua, että emäksisyydeltään tai happamuudeltaan erilaiset peptidit, joilla on sama tai lähes sama molekyylipaino, voidaan erottaa ioninvaihtajilla. Tämä menetelmä ei kuitenkaan toimi silloin kun eri peptidit muodostavat keskenään komplekseja, jotka ioninvaihtokromatografian aikana ovat pysyviä. Näiden vaikeuksien välttämiseksi on eluointiaineella oltava dissosioivat ominaisuudet* Tähän asti on tätä tarkoitusta varten liuotettu eluointiin käytettyihin puskureihin esim. joko ureaa tai ureajohdannaisia suurina pitoisuuksina (5M-9M), tai on työskennelty veden kanssa sekoittuvilla orgaanisilla liuottimilla. Niinpä esim. insuliinia on kromatografoitu ioninvaihtajalla, Amberlite IRC 50 fosfaattipuskurissa, jossa on 5M-8M ureaa (R.D. Cole, J. Biol. Chem. 235, 2 294 (1960). Englantilaisesta patenttijulkaisusta GB 881 855 tunnetaan veden kanssa sekoittuvan orgaanisen liuotti- 2 61490 men, esim. etanolin käyttö. Suuresti neutraalista poikkeavat pH-arvot, jotka myös vaikuttavat dissosioivasti, eivät ole käyttökelpoisia peptidien herkkyyden vuoksi sellaisissa olosuhteissa. Tunnetuilla menetelmillä on kuitenkin erilaisia haittoja. Niinpä on aineiden erottaminen ureapitoisista puskuriaineista vaikeaa ja aikaavievää. Lisäksi voi urea sisältää epäpuhtauksia, jotka reagoivat peptidien kuten insuliinin kanssa. Etanolin käyttö orgaanisena liuottimena aiheuttaa ongelmia käytettäessä ioninvaihtajaa uudelleen ja lisäksi ioninvaihtokromato-grafiassa peptidihäviö, esim. insuliinihäviö on suuri. Lopuksi on olemassa vaara suurimolekyylisten peptidien denaturoitumisesta orgaanisissa liuottimissa kuten tapahtuu insuliinille 60-prosenttisessa alkoholissa pH-arvossa 7.

Yllättäen on nyt huomattu, että nämä vaikeudet voidaan välttää käyttämällä ei-ionisia detergenttejä peptidien dissosioimiseksi. Ioninvaihtajaa voidaan käyttää uudelleen ilman vaikeuksia. Peptidien denaturoitumista ei ole havaittavissa ja ne voidaan yksinkertaisesti eristää saostamalla sopivilla saostusaineilla ja sen jälkeen mahdollisesti kiteyttämällä. Saanto on selvästi suurempi kuin käytettäessä orgaanisia liuottimia dissosioivana aineena.

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan puhdistaa kaikkia insuliinilajeja myös ihmisen insuliinia, insuliinianalogeja esim. Des-Phe-Bl-insuliinia ja insuliinijohdannaisia esim. insuliini-B-ketju-sulfonaattia.

Lähtöaineena oleva insuliini voi olla suhteellisen epäpuhdasta tai myös esipuhdistettua (esim. geelikromatografialla). Insuliinissa on vielä usean kiteyttämisen ja myös geelikromatografoinnin jälkeen insuliinin tapaisia epäpuhtauksia, joilla on lähes sama molekyylipaino, ja jotka määrätyssä PH-arvossa eroavat varauksen suhteen toisistaan ja insuliinista, mutta muodostavat insuliinin kanssa komplekseja. Esimerkkejä sellaisista aineista ovat: desamido-, arginiini- ja diarginiini-insuliini, insuliinietyyliesteri yms. Niitä ei voida erottaa insuliinista geelikromatografialla eikä ioninvaihtokromatografiällä ei-dis-sosioivassa eluointiaineessa.

Sopivia ioninvaihtajia insuliinin ja insuliinianalogien puhdistamista varten ovat: Dowex 1® QAE-Sephadex®, Biogel Dl® DEAE-Sephadex®, Amberlyst A 21® ja A 29®» DEAE-Sepharose CL DEAE-sellu- loosaR. Erikoisen hyvin insuliinin, insuliinianalogien ja iftsuliini-johdannaisten puhdistamiseen soveltuvat dekstraaniin perustuvat emäksiset ioninvaihtajat, kuten DEAE-Sephade^^ tai QAE-Sephade^S).

61490

Ioninvaihtoprosessi suoritetaan puskuroidussa, vesipitoisessa liuottimessa, johon on liuotettu vähintään yhtä ei-ionista detergenttiä.

Sellaisina mainittakoon esim.: palmityylisorbitaanipolyetyleeni-glykolieetteri, stearyylisorbitaanipolyetyleeniglykolieetteri, oleyyli-sorbitaanipolyetyleeniglykolieetteri, nonyylifenolipolyglykolieetteri (10-30 moolia etyleenioksidia/mooli nonyylifenolia), propyleenioksidin ja etyleenioksidin polymerointituotteet (10-80 % etyleenioksidia), rasva-alkoholipolyglykolieetteri ja synteettisten rasva-alkoholien polyglyko-lieetteri.

Erikoisen edullisia ovat rasva-alkoholipolyglykolieetterit, sillä ne ovat tehokkaita ja helposti saatavissa. Ne eivät osoita UV-absorptiota aromaattisten peptidien absorptioalueella, mikä helpottaa peptidien tunnistamista eluaatissa. Sitäpaitsi nämä yhdisteet ovat biologisesti täysin hajoavia, mikä näyttää tekevän niiden käytön ympäristön kuormitusta ajatellen ongelmattomaksi.

Eluointiaineet sisältävät aina puskuria eluointiaineen pH-arvon säätelemiseksi. On edullista työskennellä vakio pH-arvolla. Anionivaih-tajaa käytettäessä voidaan pH-arvona käyttää 5,5-10, edullisesti 6-9.

Sopivat puskurit ovat tunnettuja kirjallisuudesta. Ioninvaihto-kromatografiän aikana lämpötila täytyy pitää vakiona, ja se on välillä 0-50°C, edullisesti 15-30°C. Eluointiin käytetyt liuokset sisältävät paitsi puskuria ja detergenttiä vielä elektrolyyttiä, edullisesti neutraalisuolaa, kuten NaCl, konsentraatioina välillä 0,01 M-0,5 M, edullisesti 0,05 M-0,3 M. Eluointi voidaan myös suorittaa käyttäen elektrolyyttigradienttiä sekoittamalla jatkuvasti elektrolyyttipitois-ta puskuria eluointipuskurin, joka ei sisällä elektrolyyttiä, mutta jonka koostumus on muuten sama, jolloin käytetyn elektrolyytin konsent-raatio nousee eluointitilavuuden funktiona edullisesti lineaarisesti. Elektrolyytin loppukonsentraatio on välillä 0,1 M-l M, edullisesti välillä 0,3 M-0,8 M.

Keksinnön mukaista menetelmää havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä käytetyt detergentit ovat Hoechst AG:n valmistamia kaupallisia tuotteita. Käytetyt ioninväihtajät ovat yhtiön Pharmacia fine Chemicals valmistamia kaupallisia tuotteita.

Esimerkki 1

Valmistetaan puskuri, jonka koostumus on seuraava: 0,1 M Tris-(hydroksimetyyli)-aminometaania,:1 % Genapol® SE 150 (rasva-alkoholi-polyglykolieetteri) pH säädetään HClillä arvoon 7,0.

Osa edellämainitusta puskurista sekoitetaan 0,5 moolia/1 NaCl kanssa. 450 DEAE-Sephadex A 2^ turvotetaan edellämainitussa puskurissa ja saadulla suspensiolla täytetään sen jälkeen 0 5 cm ja 100 cm pitkä kolonna.· 4 61490

Kolonni saatetaan tasapainoon puskurilla. 5 g insuliinia, joka on kiteytetty sitraattipuskurista, 1luotetaan 75 millilitraan edellämainittua puskuria (ilman NaCl). Loppu-pH on 8,3. Kirkas liuos syötetään kolonniin ja eluoidaan 25°C:n lämpötilassa nopeudella 320 ml/h edellämainitun puskurin (pH 7,0) kanssa, jolloin lineaarinen NaCl-gradientti säädetään siten, että NaCl-pitoisuus eluaatissa nousee 5,5 l:n puskuri-määrän läpijuoksuttamisen jälkeen arvosta nolla arvoon 0,33 M. Kootaan 22 ml fraktioita. Eluaatista mitataan ja rekisteröidään jatkuvasti UV-ekstinktio 278 nm kohdalla. Insuliinihuipun keskiosan (0,1-0,24 M NaCl) (1 540 ml) fraktiot otetaan talteen ja sekoitetaan 70 ml:n kanssa 1 % ZnClj-liuosta. Amorfisena saostunut insuliini sentrifugoidaan ja kiteytetään sen jälkeen sinänsä tunnetulla tavalla asetonia sisältävästä sitraattipuskurista. Puhtaan insuliinin saanto on 3,76 g (75,2 %).

Esimerkki 2

Valmistetaan puskuri, jonka koostumus on seuraava: 0,1 M Tris-(hydroksimetyyli)-aminometaania, 0,12 M NaCl, 1 % Genapo]^ (ZDM 110 suoraketjuisten synteettisten rasva-alkoholien polyglykolieetteri (keskimääräinen molekyylipaino 190) , jossa on 11 moolia etyyleenioksi-dia/mooli rasva-alkoholia), pH säädetään HCl:llä arvoon 7,0 13 g QAE-Sephadex A 2f^paisutetaan edellämainitussa puskurissa ja suspensiolla täytetään 0 1,5 cm kolonni, jonka pituus on 30 cm. Kolonni tasapainotetaan puskurilla. 300 mg insuliinia, josta kiteyttämisen jälkeen suuri osa suurimolekyylisistä aineosista on poistettu sinänsä tunnetulla tavalla geelikromatografoimalla käyttäen Sephadex G 5(® liuotetaan 15 millilitraan edellämainittua puskuria (loppu-pH 8,2). Kirkas liuos syötetään kolonniin ja eluoidaan 25°C:n lämpötilassa nopeudella 48 ml/h edellämainitun puskurin (pH 7) kanssa. Kootaan 7 ml:n fraktioita. Eluaatista mitataan ja rekisteröidään jatkuvasti UV-ekstinktio 278 nm kohdalla. Insuliinihuipun keskiosan (620 ml) fraktiot otetaan talteen ja sekoitetaan 18 ml:n kanssa 1 % ZnC^-liuosta. Amorfisena saostunut insuliini sentrifugoidaan ja kiteytetään sen jälkeen sinänsä tunnetulla tavalla asetonia sisältävästä sitraattipuskurista. Puhtaan insuliinin saanto on 185 mg (61,6 %).

Esimerkki 3

Valmistetaan puskuri, jonka koostumus on seuraava: 0,1 M Trls-(hydroksimetyyli)-aminometaania, 2 % Genapoi^SE 150 (ks. esimerkki 1), pH säädetään HCl:llä arvoon 7,0.

Osia tästä puskurista sekoitetaan 0,05 moolia/1, 0,1 moolia/1, 0,2 moolia/1 ja 0,3 moolia/1 NaCl kanssa.

5 61490 450 g DEAE-SEphadex A 2^^paisutetaan edellämainitussa 0,05 M NaCl sisältävässä puskurissa ja suspensiolla täytetään sen jälkeen φ 5 cm kolonni, jonka pituus on 100 cm. Kolonni tasapainotetaan puskurilla .

5 g insuliinia (ks. esimerkki 2) liuotetaan 100 millilitraan edellämainittua puskuria (0,05 M NaCl) (loppu-pH 8,4), syötetään kolonniin ja eluoidaan 25°C:n lämpötilassa nopeudella 290 ml/h. Kootaan 28 ml:n fraktioita. Läpijuoksutetaan 1,82 1 puskuria, jossa on 0,05 M NaCl, minkä jälkeen lisätään 4,76 1 puskuria, jossa on 0,1 M NaCl, 2,24 1, jossa on 0,2 M NaCl, ja lopuksi 5,3 1, jossa on 0,3 M NaCl. Eluaatin UV-ekstinktio mitataan ja rekisteröidään jatkuvasti.

Insuliinin pääosan eluointi tapahtuu 0,3 M MaCl sisältävän puskurin lisäämisen jälkeen. Insuliinihuipun keskiosan (820 ml) fraktiot otetaan talteen ja sekoitetaan 37 ml:n kanssa 1 % ZnClj-liuosta. Amorfinen sakka sentrifugoidaan ja insuliini kiteytetään sitten sinänsä tunnetulla tavalla asetonia sisältävästä sitraattipuskurista. Puhtaan insuliinin saanto on 2,84 g (56,8 %).

Esimerkki 4

Valmistetaan puskuri, jonka koostumus on seuraava: 0,1 M Tris-(hydroksimetyyli)-aminometaania, 5 % Genapol®SE 100 (rasva-alkoholi-polyglykolieetteri), pH säädetään HClrllä arvoon 7,0.

Osa tästä puskurista sekoitetaan 0,5 moolia/1 NaCl kanssa.

13 g DEAE Sephadex A 2$ paisutetaan edellämainitussa puskurissa (ilman NaCl) ja suspensiolla täytetään sen jälkeen 0 1,5 cm kolonni, jonka pituus on 30 cm. Kolonni tasapainotetaan puskurilla. 300 mg insuliinia (katso esimerkki 2) liuotetaan 15 millilitraan edellämainittua puskuria (ilman NaCl) (loppu-pH 8,3) . Kirkas liuos syötetään kolonniin ja eluoidaan 25°C:n lämpötilassa nopeudella 48 ml/h, jolloin lineaarinen NaCl-gradientti säädetään siten, että NaCl-pitoisuus eluaatissa nousee 500 ml:n puskurimäärän läpijuoksuttamisen aikana arvosta nolla arvoon 0,5 M. Kootaan 7 ml:n fraktioita. Eluaatista mitataan ja rekisteröidään UV-ekstinktio jatkuvasti 278 nm kohdalla. Insuliinihuipun keskiosan (0,09 M-0,22 M NaCl) (100 ml) fraktiot otetaan talteen ja sekoitetaan 4,6 ml:n kanssa 1% ZnCl2-liuosta. Amorfisena saostunut insuliini sentrifugoidaan ja kiteytetään sen jälkeen sinänsä tunnetulla tavalla asetonia sisältävästä sitraattipuskurista. Puhtaan insuliinin saanto on 160 mg (53,3 %).

Esimerkki 5

Menetellään kuten esimerkissä 4, mutta käyttäen detergenttinä 6 61490 1 % Arkopa®N 100 (nonyylifenolipolyglykolieetteri, jossa on 10 moolia etyleenioksidia/mooli nonyylifenolia).

Jatkuva UV-mittaus täytyy suorittaa ArkopajP^ N 100 itseismateri-aaliabsorption vuoksi erotusmittauksena. Puhtaan insuliinin saanto on 214 mg (71,3 %).

Esimerkki 6

Menetellään kuten esimerkissä 4, mutta käyttäen 2 % Arkopai^ N 300 (nonyylifenolipolyglykolieetteri, jossa on 30 moolia etyleenioksidia/mooli nonyylifenolia) detergenttinä ja QAE-Sephadex A 25 ionin-vaihtajana. Puhtaan insuliinin tuotos on 156 mg (52 %).

Jatkuva UV-mittaus tulee suorittaa Arkopa^ N 300 itseismateri-aaliabsorption vuoksi erotusmittauksena.