DE3511269A1 - Verfahren zur reinigung von insulin - Google Patents
Verfahren zur reinigung von insulinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feinreinigung von Insulin unter Einsatz von Ionenaustauschern mit hydrophober
Matrix.
Ein technisch in großem Maßstab angewendetes Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus tierischem und menschlichem Ausgangsmaterial
ist die Extraktion von Pankreas mit lösungsmittelhaltigen Gemischen. Die Extrakte lassen sich durch Zusatz von
Salzen und pH-Umstellungen sowie Abkühlen auf niedrige Temperaturen
von einem großen Teil der vorhandenen Ballast-Substanzen befreien· Nach dem schonenden Abtrennen der zur Extraktion
benutzten Lösungsmittel erhält man wäßrige, insulin ha It ige
Lösungen, aus denen das Insulin in unreiner Form, zum Beispiel durch Aussalzen in fester Form, abgetrennt werden kann·
Durch fraktionierte Fällung mit Kochsalz oder Ammoniumsulfat
und/oder durch Fällung des Insulins in der Nähe seines Isoelektrischen Punktes erhält man Niederschläge, aus denen sioh Insulin
in relativ, reiner Form durch Kristallisation gewinnen läßt. Analysiert man das so gewonnene Produkt mit empfindlichen Methoden
wie der Disk-Elektrophorese oder der HPLC, so zeigt
sioh, daß neben einer oder zweier Hauptkomponenten eine Reihe von Neb en komponenten vorhanden ist.
So konnte gezeigt werden, daß solche Komponenten, die biochemische Synthesevorstufen des Insuline sind, in dem nach oben
beschriebenen Verfahren gewonnenen Insulin stets in beträchtlicher Menge vorhanden sind·
Umfangreiche biologische, pharmakologische und medizinische Untersuchungen haben ergeben, daß solche Nebenkomponenten mit
einer beträchtlich höheren Molmasse als das Insulin für störende Nebenwirkungen der aus solchen Insulinen hergestellten pharmazeutischen
Spezialitäten verantwortlich sind· Für die Herstellung besonders hochwertiger Insulinspezialitäten
wurden Methoden zur Abtrennung solcher Verunreinigungen entwickelt.
In der GB-PS 1 285 024 wird ein Verfahren zur chromatografischen
Reinigung von Insulin an Anionen-Austauschern in Gegenwart wassermischbarer, organischer Lösungsmittel bei einem pH-Bereich
von 6-10 vorgeschlagen· Nachteilig bei diesem Verfahren ist der relativ hohe Bedarf von Austauschern (mindestens 30/1
Austauscher/Insulin) und die geringen Insulinausbeuten (maximal 60 %).
Als Alternative wird in den DD-PS 119 216 und 119 217 entsprechend
DE-PS 2 505 306/307 die Reinigung von Ammonium- oder Alkaliinsulin durch Gelfiltration vorgeschlagen. Neben dem
hohen Aufwand an Gel (1000 ml/4,5 g Insulin), der mechanischen und chemischen Instabilität des Gelbettes, besonders im pH-Bereich
über 7>0 ist der relativ hohe Gehalt an Proinsulin ein Nachteil dieses Verfahrens. Weiterhin ist störend, daß nur gering
konzentrierte Insulin lösung en nach der Chromatografie erhalten
werden können.
In der DB OS 2 701 092 wird ein Verfahren zur Herstellung von reinem Insulin vorgeschlagen, das während des gesamten Prozesses
der Gewinnung das Insulin ohne Phasenänderung in gelöstem Zustand hält. Nachteilig ist hier der Einsatz aufwendiger Techniken
wie z. B· der umgekehrten Osmose und die Anwendung sehr tiefer Temperaturen. Außerdem gibt diese OS keine Lehre zur
Reinigung von unreinem Kristallinsulin.
Die DE-OS 2 757 377 bevorzugt die Einbeziehung des Reinigungsverfahrens
an Kationen- und Anionenaustausohern zur Erzielung
reiner Insuline schon in den Stufen des Pankreasextraktes·
Nachteilig ist hierbei unter anderem der sehr hohe Bedarf an Ionenaustauschern sowie der Einsatz von Kationen- und Anionenaustauschern.
Trotz dieses Aufwandes ist eine abschließende Feinreinigung mittels Gelohromatografie notwendig·
35 τ
In der DS-OS 2 629 568 wird die Reinigung von Peptiden, besonders
Insulin, durch. Ionenaustauschchromatografie in Gegenwart nichtionischer Detergentien vorgeschlagen. Nachteilig sind hier
neben dem Einsatz relativ teurer und schwer zugänglicher Hilfsstoffe,
die geringe Konzentration des Insulins in den nach Chromatografie erhaltenen Fraktionen (z. B. 0,35 #) sowie die
geringen Insulinausbeuten.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Reinigung von Insulin aufzuzeigen, das die vorstehend beschriebenen
Mangel weitgehend vermeidet.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren aufzuzeigen,
das die Reinigung von Insulin ermöglicht, ohne daß hohe Verluste an Insulin eintreten oder teure oder mechanisch
und/oder chemisch instabile Systeme angewendet werden. Weiter sollen die Ziele der Erfindung mit leicht zugänglichen Hilfsstoffen
erreioht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren, das mit mechanisch. und chemisch weitgehend stabilen Ionenaustauschern bei einer
hohen Beladbarkeit eine einfache und effektive Reinigungsmöglichkeit für Insulin bei hohen Ausbeuten ermöglicht, aufzuzeigen.
Außerdem soll die erfindungsgemäße Lösung eine direkte Kristallisation aus den bei der Reinigung erhaltenen Insulinlösungen
ermöglichen. Obwohl die eingesetzten Rohstoffe billig sind, ist es möglich, sie mit geringem Aufwand zurückzugewinnen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß das Insulin und seine Verunreinigungen an einem schwach sauren
Ionenaustauscher mit hydrophober Matrix im sauren pH-Bereich bei unterschiedlichen Lösungsraittelkonzentrationen gegebenenfalls
unter Zusatz von aromatischen Substanzen sowie Salzen fraktioniert wird.
überraschend ist dabei, daß neben einer Fraktionierung nach
der Ladung auch eine Fraktionierung nach der Molekülgröße
erreioht wird·
Geeignete Ionenaustauscher sind solche makroporösen Kopolymere, die aus Aorylsäurederivaten mit Diviiiy !benzol und Funktionalis
ierung gewonnen werden (z. B· kommerzielle Wofatite^ '
des CKB).
Geeignete organische Lösungsmittel sind flüssige, aliphatische Alkohole wie z. B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol,
flüssige, niedrigsiedende, aliphatische Ketone wie z. B. Aceton, Halbaoetale wie z. B. Methylal und wenigstens teilweise
mit V/asser mischbare Ester wie z. B. EssigsäureethyI-ester
sowie Mischungen daraus·
Geeignete Säuren zur Einstellung der pH-Werte sind organische Säuren wie z· B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure,
Zitronensäure, anorganische Säuren wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure sowie saure Salze dieser Säuren·
Geeignete Salze sind Alkali- und Ammoniumsalze der oben genannten angegebenen Säuren wie z. B. Natriumaoetat, Ammoniumphosphat
zur pH-Einstellung·
Geeignete Salze sind Alkali- und Ammoniumsalze der oben genannten angegebenen Säuren wie z. B. Natriumacetat, Ammoniumphosphat
zur pH-Einstellung·
Geeignete aromatische Substanzen sind Benzol und seine Derivate·
Die Abtrennung der Verunreinigungen des Insulins kann sowohl im "batehtt-Verfahren wie auch im Säulenverfahren erfolgen.
Dabei findet das "batch"-Verfahren zweckmäßig Anwendung zur
Vorreinigung, Säulenverfahren zu einer Feinreinigung Anwendung.
Während bekannte Verfahren zur Reinigung von Insulin auf einer
Veränderung der Ionenstärke oder/und des pH-Wertes beruhen, werden bei der vorgeschlagenen Lösung die diesen Methoden anhaftenden
Nachteile wie z. B. eine Verunreinigung der Eluate
mit Salzen und eine Umladung des Ionenaustauschers daduroh vermieden, daß die Fraktionierung durch stufenweise oder kontinuierliche
Veränderung der Lösungsmittelkonzentration bei der Elution erreioht wird.
Das Verfahren wird im allgemeinen so durchgeführt, daß aus geeigneten
Lösungen Insulin hinreichender Reinheit wie z. B. verunreinigtes Zristallinsulin der Struktur der menschlichen
35 1 1 2 5mÄc ho ereicht] η
oder tierischen Insuline oder technologische Vorstufen wie
Aussalzungsnieder3chläge oder isoelektrische Fällungen an den
Ionenaustauscher ±n einem Durchflußreaktor gebunden werden.
Anschließend erfolgt als eigentlicher Reinigungsschritt die Elution mit sauren Wasser-Lösungsmittelgemisohen mit pH-Werten
von 1,3-5,0 bei !Temperaturen von 0,27-0,32 EE bei steigender Lösungsmittelkonzentration. Dabei läßt sich Insulin frei von
hochmolekularen Verunreinigungen eluieren· Durch Variation
der Beladung des Austauschers und der Durchflußgesohwindigkeit läßt sich weiter eine Fraktionierung des Insulins in
eine in der Disk-Elektrophorese praktisch einheitliche Insulinkomponente
sowie in Fraktionen, die an sauren Insulinkomponenten wie den desamidierten Formen und Fraktionen, die an
basischen Insulinkomponenten wie den Arg in in-Derivat en oder
Insulinestern angereichert sind, erreichen. Neben dieser Form der Fraktionierung durch einen Desorptionsprozeß
führt auch die analoge Form der Adsorption von Verunreinigungen am Austauscher im »batch" bei solchen Lösungsmittelkonzentrationen,
die gerade zur Verhinderung der Insulinadsorption ausreichen, zu einem Reinigungseffekt.
ORIGINAL INSPECTED
· Auf eine Säule von 300 mm Höhe und 80 mm Breite mit einem Volumen von 1,5 1, in der sich 900 ml Wofatit befinden,
werden 90 g Schweineinsulin, gelöst in 1800 ml 1 N Essigsäure, mit einer Geschwindigkeit von 600 ml/h aufgetragen·
Anschließend wird die Säule mit einem Lösungsmittelgradienten von 0-60 <& Isopropanol, 1 N an Essigsäure eluiert.
Das isolierte Insulin 1st frei von Proinsulin (PAAGE, pH 8,4; Coomassie-Blau).
Die Ausbeute beträgt 72 g.
Die Ausbeute beträgt 72 g.
2. Auf eine Säule von 300 mm Höhe und 80 mm Breite werden auf 900 ml Wofatit CA 20 90 g Insulin, in 1800 ml 0,02 N Salzsäure
gelöst und mit einer Geschwindigkeit von 600 ml/h aufgetragen· Insulin wird mit 9 1 0,02 N Salzsäure gesättigt,
mit Essigester/Benzol eluiert·
3. Auf eine Säule von 150 mm Länge und 9 mm Breite (Volumen
9,5 ml) werden 500 mg Insulin, gelöst in 10 ml Essigsäure, mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h aufgetragen und mit
einem Eochsalzgradienten von 0-0,2 N Natriumchlorid; 25 #
Methylal, 1 N an Essigsäure eluiert· Die Elution wurde in
Fraktionen aufgefangen, die Extinktion gemessen und die einzelnen Komponenten aufgearbeitet·
4. Auf eine Säule von 150 mm Länge, 9 mm Breite (V = 9,5 ml)
werden 500 mg Insulin, gelöst in 10 ml 1 N Essigsäure, mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h aufgetragen und mit
250 ml 1 N Essigsäure, 25 # Ethanol, 0,05 N an Natriumchlorid eluiert. Naoh Kristallisation wurden 400 mg gereinigtes
Insulin gewonnen·
5. Auf eine Säule von 300 mm Höhe, 80 mm Breite (V = 1,5 1)
werden 90 g Insulin, gelöst in 1800 ml 0,03 N Phosphorsäure, aufgetragen und mit einem Gradienten von 0,03 N
Phosphorsäure, 40 f> Aceton von jeweils 12 1 eluiert·
Das iusulinhaltige Eluat wird mit Zitronensäure auf eine
Konzentration von 0,5 Ί» eingestellt und in Gegenwart von
Zinksalzen direkt kristallisiert.
Die Ausbeute beträgt 85 #.
Die Ausbeute beträgt 85 #.
6. Auf eine Säule von 150 mm Länge und 9 mm Breite (Y = 9,5 ml
Wofatit CP) werden 500 mg Humaninsulin, gelöst in 10 ml
1 N Essigsäure, aufgetragen. Nach Waschen der Säule wird das Insulin mit 60 # Ethanol, 1 N an Essigsäure und 0,1 N
an Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/h eluiert.
7. 1 g Schweineinsulin wird in 100 ml 45 tigern Ethanol, 1 N
an Essigsäure, gelöst und an 10 ml in 45 # Ethanol, 1 N
an Essigsäure, äcLUilibriertem Amber lite IRC-50 adsorbiert.
Nach 3stündigem Rühren bei 40 0C ist der Gleichgewichtszustand
erreicht·
Der Ionenaustauscher wird abfiltriert und gewaschen. Das Filtrat enthält die von hochmolekularen Bestandteilen
freie C-Eomponente des Insulins. Die Aufarbeitung des Insulins erfolgt über Destillation und anschließende
Kristallisation.
Claims (24)
1. Verfahren zur Reinigung von Insulin an schwach sauren Kationenaustauschern
in Gegenwart von wassermischbaren organischen Lösungsmitteln, gekennzeichnet dadurch, daß eine Fraktionierung
durch Veränderung der Lösungsmittelkonzentration im sauren pH-Bereich durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß makroporöse Ionenaustauscher hydrophober Matrix auf Acrylatbasis
mit Diviny!benzol, seinen Derivaten oder anderen Vernetzern
verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Lösungsmittel aliphatische Alkohole, aliphatisch^ Ketone,
Halbaoetale sowie Ester aus aliphatischen Karbonsäuren und aliphatischen Alkoholen oder Mischungen hiervon verwendet
werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß zu den Lösungsmitteln aromatische Substanzen zugesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Alkohol Methanol verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Alkohol Ethanol verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Alkohol n-Propanol verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Alkohol i-Propanol verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Eeton Aceton verwendet wird»
10. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Ester Essigsäureethylester verwendet wird.
11· Verfahren nach. Anspruch 1 bis 10, gekennzeichnet daduroh,
daß die Lösungsmittelkonzentration zwischen 3 und. 70 #
beträgt·
beträgt·
12· Verfahren nach Anspruch. 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch,
daß die Lösungsmittelfconzentration kontinuierlich verändert
wird.
13. Verfahren nach Anspruch. 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch,
daß die Lösungsmittelkonzentration stufenweise verändert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Lösungsmittel-Wassergemische Salze enthalten.
15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, gekennzeichnet dadurch,
daß die Salze Puffersubstanzen sind.
16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, gekennzeichnet dadurch,
daß als Salze die Alkalisalze oder Ammoniumsalze der zur pH-Einstellung benutzten Säuren verwendet werden.
17· Verfahren nach Anspruch. 1 bis 16, gekennzeichnet daduroh,
daß durch die Fraktionierung hochmolekulare Verunreinigungen
des Insulins entfernt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, gekennzeichnet dadurch, daß Insulin frei von Nebenkomponenten erhalten wird.
19. Verfahren nach Anspruoh 1 bis 18, gekennzeichnet dadurch, daß die Fraktionierung auf säulenchromatografischem
Wege erfolgt.
Wege erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, gekennzeichnet dadurch,
daß die Fraktionierung im batch-Prozeß erfolgt.
21· Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, gekennzeichnet dadurch,
daß die Fraktionierung im pH-Bereich von 1,5 bis 5,5
erfolgt.
erfolgt.
. 3-
3δ112θν
22. Verfahren nach ,Anspruch 1 bis 21, gekennzeichnet dadurch,
daß die Fraktionierung vorzugsweise im pH-Bereich von 1,7 bis 3,0 erfolgt.
23. Verfahren nach Anspruch 1 bis 22, gekennzeichnet dadurch, daß zur pH-Einstellung Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure,
Zitronensäure, Salzsäure, Phosphorsäure verwendet werden.
24. Verfahren nach Anspruch 1 bis 23, gekennzeichnet dadurch,
daß das Insulin aus dem Bluat direkt ohne weitere Isolierung
kristallisiert wird·
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